Practica Nº4 Determinación De La Actividad De Las Enzimas Transaminasas PropósitoDeterminar la actividad de la enzima GPT en suero humano.

Marco TeóricoLos aminoácidos tienen un rol fundamental en los seres vivientes, ya que constituyen proteínas y son precursores de algunas hormonas y otros compuestos de interés biológico (neurotransmisores, histamina, anillos porfirínicos, nucleótidos, etc.). El organismo puede sintetizar una parte de los α-aminoácidos para el suplemento proteico y otra parte proviene de la dieta (aminoácidos esenciales).Las transaminaciones son reacciones de intercambio de un grupo amino entre dos grupos carbonados, siendo reemplazado el grupo amino por una función cetona. El papel de las transaminaciones es doble:

1. Permiten realizar la interconversión de los aminoácidos.2. Posibilitan la separación de la parte nitrogenada de los aminoácidos apartados en exceso, constituyendo el

primer paso de catabolismo de aminoácidos.Las transaminasas son enzimas que cumplen la función de catalizar las transaminaciones para la producción de los aminoácidos necesarios para la síntesis de proteínas en el hígado. La Aspartato Aminotransferasa o Glutámico Oxalacético Transaminasa (AST o GOT) se localiza sobre todo en la mitocondria y está presente en otros órganos además del hígado, como son: el miocardio, musculo esquelético, riñones, cerebro, páncreas, pulmón, leucocitos y eritrocitos. Por el contrario la Alanino Aminotransferasa o Glutámico Pirúvico Transaminasa (ALT o GPT) se localiza fundamentalmente a nivel citosólico o en el hepatocito, lo que explica su mayor especificidad.

Determinaciones RANDOXMétodo colorimétrico (Reitman y Frankel) para la determinación de transaminasas en suero. La actividad de las transaminasas es proporcional a la cantidad de oxaloacetato y piruvato formados en un tiempo prefijado, medidos colorimétricamente por la acción de la 2,4-dinitrofenil-hidrazina (DNFH) en un medio alcalino (tampón fosfatos:

100mmolL

en GOT; 150mmolL

en GPT).

GOT/AST GPT/ALTLa AST/GOT, cataliza la transferencia del grupo amino del aspartato al oxoglutarato, con la formación de glutamato y oxaloacetato. Se mide por la monitorización de la concentración de oxaloacetato hidrazona formado con 2,4-dinitrofenil-hidrazinina.

L−aspartato+α−oxoglutarato ASTpH 7.4

>L−gluma¿+oxaloacetato

La ALT/GPT, cataliza la transferencia del grupo amino de la alanina al oxoglutarato, con la formación de glutamato y piruvato. Se mide por la monitorización de la concentración de piruvato hidrazona compuesto de 2.4-dinitrofenil-hidrazina.

L−alanina+α−oxoglutarato ALTpH 7.4

>L−gluma¿+ piruvato

Valores NormalesEl valor de transaminasas disminuye:

En caso de embarazo. Insuficiencia vitamina B6.

El valor de transaminas aumenta debido a: Anomalías hepáticas: hepatitis virales, infecciosas o toxicas, cáncer de hígado

o cualquier otra enfermedad que cause destrucción de las células hepáticas. Otras patologías: enfermedades autoinmunes, obesidad, sobrepeso,

alcoholismo, miopatías, infarto al miocardio, parasitosis y pancreatitis. Esfuerzos musculares y traumatismos. Edad: personas mayores de 60 años pueden presentar niveles muy elevados

de transaminasas.

GOT/ASP Hombres Mujeres 8-30

UIL

6-25UIL

GPT/ALT Hombres Mujeres 8-35

UIL

6-25UIL

Diagrama de Flujo

Extraer 2-3mL de sangre venosa y colocar en un tubo

con heparina.

Centrifguar por 15 minutos a 2000rpm.

Obtener el plasma sanguineo sin hemolizacion.

Kit ALT/GPT

Blanco

Añadir 100μL de agua destilada y 500μL del

tampon (R1).

Muestra

Añadir 100μL de muestra y 500μL del tampon (R1).

Mezclar e incubar a 37ºC por 30min.

Añadir 500μL 2,4-DNFH (R2).

Mezclar y reposar a 20-25ºC por 20 min.

Añadir 5mL de NaOH (R3).

Mezclar y leer la absorbancia de la

muestra a 546nm frente al reactivo blanco al

cabo de 5min.

Kit AST/GOT

Blanco

Añadir 100μL de agua destilada y 500μL del

tampon (R1).

Muestra

Añadir 100μL de muestra y 500μL del tampon (R1).

Mezclar e incubar a 37ºC por 30min.

Añadir 500μL 2,4-DNFH (R2).

Mezclar y reposar a 20-25ºC por 20 min.

Añadir 5mL de NaOH (R3).

Mezclar y leer la absorbancia de la

muestra a 546nm frente al reactivo blanco al

cabo de 5min.

Con un ayuno no menor a 8 hrs y no mayor a

12hrs.

R1. Tampon GOTTampon fosfatoL-aspartatoα-oxoglutaratoR2. 2.a-dinitrofenilhidrazinaR3. NaOH

R1. TamponTampon fosfatoL-alaninaα-oxoglutaratoR2. 2.a-dinitrofenilhidrazinaR3. NaOH

Disposición de Residuos Inactivar con hipoclorito de sodio y desechar en la tarja.

Resultados Valores de Referencia Kit RANDOXLectura absorbancia ALT: 0.105 ALT U/L AST U/LLectura absorbancia AST: 0.025 0.025 4 0.020 7

0.050 8 0.030 10Paciente: -- 0.075 12 0.040 13Sexo: Femenino Edad: 20 años 0.100 17 0.050 16Valor ALT: 8.33 U/L Valor AST: 17.85* U/L Valores Normales en suero: hasta 12U/L para ALT y AST.

ConclusionesEl procedimiento a seguir para la determinación de actividad de transaminasas, así como los valores normales, dependen del Kit a usar. Aunque la mayoría de los Kits manejan una técnica colorimétrica, los reactivos, como las concentraciones y los cálculos pueden variar, por lo cual es de suma importancia indicar el Kit que se usó y manejar los valores de referencia y normales que vienen indicados, para evitar algún error en la determinación.En este caso, el valor de ALT se encuentra dentro del límite indicado, mientras que el valor de AST lo rebasa. Aunque el alto valor de AST puede ser causado por alguna patología, cabe destacar que la paciente no se encontraba en ayuno, por lo cual el valor obtenido de AST pudo ser afectado, también puede ser debido a un error de toma de tiempos en las incubaciones.

Cuestionario1. Escriba la reacción de la transaminasa TGP

L−alanina+α−oxoglutarat o ALTpH 7.4

>L−gluma¿+ piruvato

Piruvato+NADH+¿+H+¿ LDH

❑>L−lactato+NAD

+¿+H2O ¿

¿¿

2. ¿Cuáles son los valores de referencia de la TGP?Los valores normales de la TGP: 5 - 35 U/mL

3. ¿Cuál es el fundamento de la reacción?La enzima ALT cataliza la transferencia de un grupo amino desde el aminoácido L-alanina hacia el α-cetoglutarato resultando de esta reacción la formación de piruvato y L-glutamato. La enzima lactato deshidrogenasa cataliza la reducción del piruvato y la oxidación simultánea de NADH a NAD+. La velocidad resultante de la disminución de la absorbancia a 340 nm es directamente proporcional a la actividad de la ALT. La transaminasa glutámica pirúvica (TGP) del suero, llamada alanina aminotransferasa (ALT) es una de las enzimas que catalizan el intercambio de grupos amino y oxo entre los α-aminoácidos y los α-oxo ácidos.

4. ¿Dónde se encuentran la TGP en el organismo humano?TGP (ALT o SGPT o GPT) es encontrado en su mayor parte en el hígado. Este no es producido exclusivamente por el hígado, pero es donde se encuentra más concentrado. Es liberado en la circulación sanguínea como resultado de daño hepático. Sirve entonces como un indicador bastante específico del estado del hígado.

5. ¿Qué significado tiene una elevación en la concentración de la TGP?TGP y TGO son indicadores sensibles de daño hepático en diferentes tipos de enfermedades. Más debe ser enfatizado que tener niveles más altos que lo normal de estas enzimas no indica, necesariamente, una enfermedad hepática establecida. Ellas pueden indicar algún problema o no. La interpretación de los niveles altos de TGO e TGP depende del cuadro clínico en general y así lo mejor es que esto sea determinado por médicos experimentados en hepatología. Los niveles de estas enzimas no miden a extensión de daño en el hígado o muestran un pronóstico de la marcha futura. Así, los niveles de TGO y TGP no pueden ser usados para determinar el grado de daño hepático o indicar el futuro. En

pacientes con hepatitis A aguda, las TGO y TGP son muy altos (algunas veces alcanzan millares de unidades), pero la mayoría de estos pacientes con la hepatitis A recupera completamente el hígado, no quedando ningún daño. En la hepatitis C solo es observada una pequeña elevación en las TGO y TGP, siendo que algunos de estos pacientes pueden haber avanzado para una enfermedad crónica con fibrosis o cirrosis.

Ejercicios de integración1. Haga un diagrama en el que exponga la participación de la Glutamato deshidrogenasa y la Glutamino

sintetasa para producir glutamina a partir de amoniaco y α-cetoglutarato

2. En general, ¿Qué categorías de aminoácidos son esenciales en los humanos y cuáles no lo son? Los aminoácidos esenciales (histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptófano y valina) son requeridos en la dieta.

La arginina y cantidades suplementarias de histidina son requeridas durante periodos de crecimiento. Los aminoácidos no esenciales pueden ser sintetizados en el organismo. El esqueleto carbonado de 10 de los

aminoácidos no esenciales puede ser derivado de la glucosa. La cisteína deriva su azufre del aminoácido esencial metionina. La tirosina se produce por hidroxilación del aminoácido esencial fenilalanina. Los aminoácidos son utilizados para la síntesis de muchos otros compuestos nitrogenados, tales como las bases

púricas y pirimídicas, hemo, creatina, nicotinamida, tiroxina, epinefrina y otras aminas nitrogenadas, melanina, y esfíngosina.3. Haga una lista de los aminoácidos esenciales para un adulto fenilcetonúrico y compárelos con los

requerimientos de un adulto normalLa fenilcetonuria impide al organismo procesar adecuadamente la fenilalanina, uno de los aminoácidos esenciales que se encuentran en los alimentos que contienen proteínas: carne, pescado, aves, huevos, leche y productos lácteos.

Adulto Normal

Adulto Fenilcetonúrico

LeucinaIsoleucina

ValinaLisina

TreoninaMetionina

FenilalaninaTriptófano

LeucinaIsoleucina

ValinaLisina

TreoninaMetionina

--Triptófano

4. ¿Cuántos α-aminoácidos participan en el Ciclo de la Urea?

3: Glutamina, Alanina, ácido glutámico5. Con base en la respuesta anterior ¿Cuántos pueden usarse para la síntesis de proteínas?

Se conoce como síntesis de proteínas al proceso por el cual se componen nuevas proteínas a partir de los veinte aminoácidos esenciales. En este proceso, se transcribe el ADN en ARN. La síntesis de proteínas se realiza en los ribosomas situados en el citoplasma celular. Entonces los 3 pueden usarse.

Referencias “Catabolismo De Los Aminoácidos: Transaminaciones”

file:///C:Users/Kiddo/Downloads/16589242.TP%20N%C2%BA%202%”=Metabolismo%20de%20Prote%C3%ADnas%20y%20AAs%20-%20Enzimas%20Transaminasas.pdfConsultado 09/09/2014

“Transaminasas: GOT y GPT”http://salud.kioskea.net/faq/2161-transsaminasas-got-y-gptConsultado 09/09/2014

“GOT/GPT Color- LINEAR CHEMICALS”http://www.linear.es/ficheros/archivos/1130010C.pdfConsultado 09/09/2014

“El Paciente Con Transaminasas Altas”http://www3.caes.es/archivos_pdf/download/panda/modulo5/REVI5.PDFConsultado 09/09/2014

“Las Transaminasas AST o TGO - ALT o TGP”http://hepato.com/p_transaminases/011_transamin_esp.phpConsultado 23/09/2014

“Procedimiento De ALT (TGP) Para La Determinación Cuantitativa De Alanina Aminotransferasa En Suero UV”http://www.cimascientific.com/2250S.htmConsultado 23/09/2014

“Metabolismo De Aminoácidos: Degradación, Síntesis, Utilización”http://docencia.izt.uam.mx/japg/RedVirtualJAP/CursoDRosado/4_Metabolismo/3-Aminoacidos/1-MetabolismodeAminoacidos.pdfConsultado 23/09/2014

“Las Proteínas”http://proteinas.org.es/sintesis-proteinasConsultado 23/09/2014