Primeros pasos: Extracción, separación, identificación…
Prof. Ricardo Riguera Vega
Departamento de Química Orgánica y CIQUS, Universidad de San<ago de Compostela. ESPAÑA
[email protected] http://www.usc.es/gi1608/
PROMETEO ECUADOR, Noviembre
2013
-‐Drogas de abuso mas frecuentes en análisis forense
-‐Tóxicos más frecuentemente encontrados:
Monóxido de carbono, metanol, glicol, escopolamina, estricnina, plaguicidas, insec<cidas, ra<cidas… METALES: Pb, Hg, As, Sb, Cr, Cu…
Metodología
1º: Análisis inicial por CCF, reacciones coloreadas, inmunoensayos, UV, IR…
para detectar/presumir la presencia de familias de drogas / sustancias (p. Eje.
Alcaloides). Son procedimientos baratos y rápidos que en el caso de dar
”posiQvo” deben confirmarse por técnicas de mayor precisión.
Tambien CG y HPLC
2º Análisis Confirmatorio: CG-‐MS, HPLC-‐MS y MS/MS
1.-‐Toma de muestra, extracción, conservación, y preparación para análisis
2.-‐ Dos aproximaciones: Buscar determinada sustancia o análisis mulQanalito
La validez del análisis forense depende de la garan\a ofrecida por el laboratorio
y requiere controles periódicos y documentados de sensibilidad, precisión etc .
Deben seguirse los protocolos aceptados por la comunidad cien\fica y/o forense para los análisis de drogas de abuso, fármacos, tóxicos etc
Protocolos específicos según la matriz: suero, plasma, sangre, humor vítreo, orina, pelo etc Valores del analito caracterísQcos para cada matriz: DisQntos fluídos dan disQnto valor para una misma exposición del organismo. DisQntas matrices representan disQnta exposición temporal al analito. P. Eje. en pelo puede relacionarse con exposición a fármacos/drogas en meses anteriores Deben conocerse los límites de detección de la técnica uQlizada y los valores significaQvos en cada matriz.
- Extracción selectiva del analito/s o extracción general seguida de fraccionamientos posteriores.
- con disolventes en frio, percolando, con soxhlet, a reflujo… - con gases supercríticos. - en fase sólida (adsorción)
- Basado en la afinidad de los componentes por los disolventes según su polaridad, coeficiente de reparto, propiedades ácido / base. -Conservación del extracto: congelación, liofilización, atmósfera inerte.
En matrices muy complejas (órganos de animales) la gran abundancia de algunos componentes (grasas…) hace difícil aislar directamente los componentes muy minoritarios. Además, los mayoritarios pueden “arrastrar” a los minoritarios.
Primeros Pasos: Extracción y fraccionamiento
General isolaQon strategy of natural products:
n Extract the dried and ground plant material with a suitable solvent. n Concentrate the extract. n Separate and purify each component. n structural determina<on
Soxhlet
SEPARACIÓN POR TAMAÑO MOLECULAR
Moléculas pequeñas: fármacos, drogas, terpenos, lípidos, metabolitos secundarios… Macromoléculas: Proteinas, Ácidos nucleicos, Polisacáridos Un extracto general puede contener moléculas pequeñas y
macromoléculas.
- El estudio de las pequeñas requiere en general eliminar las
macromoléculas por precipitación, ultrafiltración, diálisis,
cromatografia de exclusión, C. de gel etc..
SEPARACIÓN POR SOLUBILIDAD: Mezcla conteniendo Hidrosolubles y Liposolubles
-Fraccionar la mezcla entre agua y disolvente orgánico inmiscible. Los
liposolubles quedarán en la fase orgánica y los hidrosolubles -sales,
azúcares, aminoácidos, saponinas…- en el agua.
- Evaporación “cuidadosa” del disolvente proporciona los compuestos.
PERO:
- Concentración la fase acuosa puede dar problemas (sales, calor, pH…).
- Con disolventes orgánicos evitar material de plástico.
Otras soluciones para la fase acuosa:
Liofilización, diálisis, cromatografia de afinidad y/o reparto…
Ejemplo 1: un extracto animal/vegetal se puede fraccionar entre agua y
un disolvente orgánico. Al agua van los azúcares, aminoácidos, sales y
otros componentes muy polares, (hidrofílicos) mientras que los
terpenos, lípidos, ceras, esteroides… (poco polares) se van al hexano,
cloroformo, etc.
RECUPERACIÓN: por concentración/ evaporación del disolvente
Extracción. -Algunos disolventes (Etanol, THF, Dioxano…) son muy generales y extraen prácticamente todo tipo de componentes. Proporcionan extractos muy complejos que requieren fraccionamientos posteriores. - Mezclas cloroformo-metanol se utilizan para extraer conjuntamente todos los compuestos de baja y media polaridad (p. eje. Lípidos). - Agua, Metanol, Acetona, THF, n-butanol y sus mezclas se utilizan para hidrosolubles muy polares
SEPARACIÓN POR ÁCIDO-BASE: Mezclas conteniendo: compuestos neutros además de
aminas, alcaloides, ácidos, fenoles... -Fraccionar la mezcla entre un disolvente orgánico y agua a cierto pH.
-Los componentes neutros quedarán en la fase orgánica y evaporación
del disolvente proporciona los compuestos neutros.
- Los componentes básicos y/o ácidos serán hidrosolubles al pH
adecuado y quedarán en la fase acuosa en forma de sales.
- Aminas y alcaloides básicos pasan a la fase acusa a pH ácido (p. Eje.
ClH 5-10%) donde los alcaloides estan como hidrocloruros.
- Ácidos y Fenoles pasan a la fase acusa a pH básico ( eje. NaOH o NH3
5-10%), donde estan en forma de sales sódicas o amónicas.
Ejemplo 2. Extracción selectiva ácido-base.
Al fraccionar una muestra biológica con un disolvente orgánico
(Cl4C, Cl3CH…) en presencia de ClH aq., los componentes neutros y
acidos se irán a la capa orgánica mientras que los alcaloides/aminas
se protonan y forman sales que se van al agua.
-Recuperación: Los alcaloides/aminas se pueden aislar a
continuación basificando la capa acuosa y extrayéndolos con
disolvente orgánico.
Ejemplo 3: Al fraccionar una muestra biológica con un disolvente
orgánico (Cl4C, Cl3CH…) en presencia de NaOH aq., los componentes
neutros y básicos se irán a la capa orgánica mientras que los ácidos
carboxílicos y fenoles se transforman en sales sódicas que pasan a la
capa acuosa.
Recuperación: Los ácidos carboxílicos y fenoles se pueden
recuperar acidulando la capa acuosa básica y extrayéndolos con
disolvente orgánico.
Debido a su carácter acido/base, la extracción de Aminoácidos es
muy sensible al pH (forman sales tanto en medio acido como básico)
Separation of a crude extract into fractions of low, medium and high polarity
ACTIVE CRUDE EXTRACT
1. MeOH/H2O 9:12. Hexane
Hexane
1. MeOH/H2O 8:22. CCl4
1. MeOH/H2O 6:42. CH2Cl2
1. H2O 100%2. n-BuOH
Increasing polarity
LOW / MEDIUM POLARITY HIGH POLARITY
ACTIVITY MONITORING: % inhibition at mg / mL, etc
ISOLATION PROCEDURE (I)
Solvent partition:
CCl4
CH2Cl2
n-BuOHH2O
ISOLATION PROCEDURE (II)
LOW / MEDIUM POLARITY FRACTIONS HIGH POLARITY FRACTIONS
1) CC: normal or reversed phase (adsortion, partition, affinity ...)2) MPLC: if necesary3) HPLC: normal or reversed phase
Pure active compound
ACTIVITYMONITORING
1. H2O 2. MeOH
1) CC: Amberlite XAD
Mineral salts
ACTIVITYMONITORING
1) CC: Sephadex LH-202) DCCC3) HPLC: C18, amino, cyano, ...
Organic materiali.e., terpenes, acetogenins, steroids, polypropionates, peptides, etc
Pure active compound
i.e., saponins, alkaloid salts, aminoacids, polyhydroxysteroids, etc
MeOHH2O
3º) Droplet Countercurrent Chromatography (DCCC): coeficiente de reparto entre dos fases
2º) Cromatografía de filtración en gel (shephadex LH-20) de dextrano que separa por reparto entre agua-MeOH
1º) Separación a través de una columna de Amberlite XAD-2 (copolímero de estireno) que adsorbe los compuestos orgánicos y eluye las sales inorgánicas y azúcares pequeños.
4º) Cromatografía líquida de alta eficacia o High performance liquid chromatography (HPLC) en fase reversa ( MeOH/agua o MeCN/agua)
Técnicas útiles para la separación y purificación de compuestos hidrosolubles
Main methods for structural determination
STRUCTURALDETERMINATION
Spectroscopicmethods
Chemicalmethods
MS
NMR 1H , 13C, DEPT COSY, TOCSY, ROESY
Absolutestereochemistry
FAB: (+), (-)CI, EILC-MS: ES, TSMS/MS
ReactivityDegradation studiesSynthesis
X-RayCDNMR
HMQC, HMBC
Main methods for analytical identification CG, HPLC y su acoplamiento con E. de masas y MS/MS Espectroscopia UV, IR, Raman; Absorción atómica, ICP Comparación con Bases de Datos
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