Química de los Flavonoides, Aislamiento y caracterización de
Isoflavonas y su Actividad Biológica
Q.F Heinz Jungbluth Ganoza
Lima, UIGV, Junio 2013
Introducción
• Pigmentos naturales con una estructura carbonada C3-C6-C3 o mas, específicamente con un grupo fenilbenzopirano, dependiendo de la unión del grupo aromático con el núcleo benzopirano (cromano) serán, flavonoides 2-fenilbenzopirano, isoflavonoides 3-benzopirano, neoflavonoides 4-benzopirano
2-fenil Benzopirano
Isoflavonoides
Neoflavonoides
Flavonoides Minoritarios
Botánica
Isoflavonas
• Distribución: Las Isoflavonas se hayan presentes mayoritariamente en la familia de las leguminosas (Fabaceae) , preferentemente en la subfamilia papilionideae, existen grandes revisiones de investigaciones sobre la presencia de Isoflavonas en esta subfamilia como la de Veitch (2007, 2009). Se encuentran presentes en los frutos de esta familia (Legumbre) y en las raíces o rizomas (mecanismo de fijacion de Nitrogeno)
Química
Isoflavonas
• Características químicas resaltantes: Las isoflavonas difieren de sus respectivos flavonoides por la migración de un anillo aromático de C2 a C3. Mayores cambios en la estructura dependerán de su Hidroxilacion, metoxilacion, o metilendioxisustitucion, prenilacion y Glicosilacion.
Isoflavonas
Biosíntesis
BiosíntesisLas Isoflavonas proceden de la ruta de los Fenilpropanoides, pero el paso crucial para convertirse en Isoflavonas esta en la conversión de la respectiva flavanona en una Isoflavona, la enzima que realiza este proceso es la 2-hidroxiisoflavanona sintetasa (2HIS) luego se produce una dehidratación mediante la 2-hidroxiisoflavona dehidrasa convirtiéndola en una Isoflavona( todas estas enzimas ya han sido caracterizadas convenientemente)
Biosíntesis• Regulación: • La vía del ácido shikímico es dependiente de la luz.• La acción de la fenilalanina amonioliasa, que inicia la vía biosintética de los
flavonoides, es fundamental para la vida de las plantas y por ello está estrictamente regulada. Entre otros factores, la fenilalanina amonioliasa es activada por la luz, y depende además de la concentración de diferentes hormonas vegetales. La actividad de la fenilalanina amonioliasa suele aumentar cuando a los vegetales se les somete a situaciones de estrés, como puede ser la falta de agua ("estrés hídrico"), infecciones fúngicas o bacterianas, radiaciones UV, y el frío (por esto último las plantas sometidas a bajas temperaturas suelen presentar coloraciones rojizas en tallos y hojas, y cuando los inviernos son muy fríos, las flores desarrollan colores muy intensos en la primavera siguiente).
• Hay isozimas dedicadas a la producción de flavonoides diferentes en respuesta a señales ambientales diferentes
Fitoquímica
OBTENCION DELMATERIAL
SECUENCIA DE INVESTIGACION
- Colectar planta completa, flor y fruto.- Por duplicado.- Anotar nombre vernáculo y científico.- Hábitat, tamaño, aspecto y color de los órganos recogidos- Clima, altitud, abundancia o escasez de la especie.- Una foto.
IDENTIFICACION
- Por un botánico de experiencia- Buen manejo de literatura- Guardar muestra herborizada
DESECACION
- Para eliminar H2O y evitar alteración.- Hacerle gradualmente-- cambios de lugares.- Aire libre, en el sol sobre papel que se cambia diariamente.- Estufa: temperatura controlada+ aire forzado
Obtención del material vegetal
Desecación y conservación
(estabilización)
Identificación taxonómica y
sus partes
Tamizaje fitoquimico
Extraccion P. activos
Aislamiento y caracterización
del P. A
Formulación
PROCESO DE INVESTIGACION FITOQUIMICA
Aislamiento
• Existen muchas vias de aislar y separar una isoflavonas, lo mas importante es reconocer el material del cual se esta extrayendo (material vegetal, muestra biológica, Alimento), la presencia de carbohidratos y compuestos lipofilicos, afectara el desarrollo del metodo.
Aislamiento
• SPE: (Solid Phase Extraction): Para poder evitar la mayor cantidad de interrupciones en la matriz, como medio de purificación podemos utilizar cartuchos de SPE C1; eluyendo el extracto en el cartucho y luego pasando a través del mismo MeOH con pequeñas concentraciones de Acido acético.
Aislamiento
• Partiendo de una muestra vegetal: La utilización de Material Seco, podría hacer decrecer la presencia de Isoflavonas, de preferencia utilizar material fresco. Flavonoides altamente acilados suelen ser lábiles a temperaturas muy altas y frecuentemente son degradados durante el proceso de secado.
Aislamiento
• Si estamos buscando agliconas en el material vegetal, podemos realizar un lavado con solventes no polares como el caso de cloruro de Metileno, éter di etílico, acetato de etilo. (aunque se encuentra raramente bajo la forma de agliconas)
• Normalmente la extracción podemos realizarla bajo un equipo soxhlet a 60 C durante 2 horas y comprobar la presencia de Agliconas en dicho extracto.
• Luego podemos proceder a realizar una extracción con mezclas de MeOH: H2O, la eficiencia de la extracción puede mejorar con sonificacion del material vegetal
Aislamiento
• Los flavonoides en el material vegetal se encuentran siempre conjugados con o-glic o c-glic, raramente se encuentra bajo la forma de aglicona.
• Para casos practico de aislamiento sera necesario separar estos glucósidos del esqueleto de los flavonoides, para esto se propone una hidrolizar acida.
Aislamiento
Sistemas Cromatográficos para la extracción: existen varios sistemas para la extracción de las Isoflavonas mediante columnas Cromatográficas.Fases estacionarias: Poliamida, Sephadex LH20, C18 RPFases Móviles: Migración y mixturas de compuestos Polares a Hidrófobicos
Solventes de desarrollo
Serie eluotropa
El poder eluyente aumenta con la
Polaridad del disolvente
-Hexano-Tetracloruro de carbono-Benceno-Diclorometano-Cloroformo-Eter dietilico -Acetato de etilo-Acetona-Isopropanol-Etanol-Metanol-Agua
Aumenta el poder eluyente
Polaridadcreciente
Extracción de Flavonoides
Maceración lixiviación
Filtración
Separación por resina AMBERLITE XAD2
Recuperar en MeOH
Rotaevaporar a 40C
Disolver en Agua
Aglicona
Someter a Hidrólisis acida a 60C
Glicosidos
Extraer en BuOH y redisolver en MeOH
Caracterización
• Son moléculas difíciles de caracterizar, normalmente se determinan bajo el brillo en presencia de fluorescencia, de color azul intenso, que cambia a Marrón intenso en presencia de vapores de amoniaco.
Características espectrales de las Isoflavonas
Espectroscopia UV
La banda II de absorción de las Isoflavonas normalmente ocurre en la región de 245-270 nm y generalmente no es afectada por el incremento de la Hidroxilacion del anillo B, pero si es desplazada bato crómicamente por Hidroxilacion del anillo A
Características de las espectroscópicas:• Isoflavonas Polioxigenadas, que tengan la banda II de
absorción, entre 265 y 270 generalmente son trioxigenadas en el anillo A.
• La metilación o Glicosilacion de 7 o 4’-OH tiene un pequeño o muy pequeño efecto sobre el espectro UV, Mientras que una sustitución en el 5-OH causa un ligero desplazamiento Hipsocromico.
Espectroscopia uv
Reactivos de Desplazamiento
Técnicas Espectrométricas
• Los tipos de análisis mas importantes para el trabajo con flavonoides, son los relacionados con la Espectrometría de MS, MS/MS y la RMN 1H y RMN 13C.
• El trabajo con IR no ayuda en gran manera, debido a la cantidad de señales iguales, que se solaparían.
Espectrometría de masas
Es una técnica instrumental sofisticada que separa y detecta
iones en fase gaseosa. Se basa en ionizar moléculas gaseosas
convirtiéndolas en iones (generalmente cationes), que se
separan al ser acelerados por un analizador de masa: la
separación se basa en la distinta relación m/z de los iones.
Espectrometría de masas
ESPECTRÓMETRO DE MASAS
Componentes del instrumento
Introducción de la muestra
Fuente de ionización
Separador de masas
Detector iónico
Procesador de señal
Registrador
El acoplamiento entre CG y HPLC con EM se analizará más adelante
Ionización por impacto electrónico
Ionización química
Fuente de bombardeo con átomos rápidos
Desorción con láser
Ionización a presión atmosférica:
- Electronebulización asistida con un gas: electrospray
- Ionización química a presión atmosférica
- Fotoionización a presión atmosférica
Fuentes de ionización
HPLC
Ionización por impacto electrónico
placa de repulsión
placas focalizadoras
haz de electrones (70 eV)
moléculas neutrasmoléculas neutras
placas aceleradoras (4000 V)
filamento de W
iones
M + e M.+ + 2e
ion molecular
Fragmentación del ion molecular
Molécula hipotética ABCD (A, B, C y D = átomos)
Fragmentación del ion molecular
ABCD.+ + ABCD (ABCD)2.+ BCD. + ABCDA+
Colisión seguida de fragmentación
ABCD.+ ADBC.+BC. + AD+
AD. + BC+
Reordenamiento seguido de fragmentación
ABCD + e ABCD.+ + 2 e
ABCD.+ A+ + BCD.
A. + BCD+ BC+ + D
CD. + AB+
AB. + CD+
B + A+
A + B+
D + C+
C + D+
Ionización química
CH4+ + CH4 CH5
+ + CH3
CH3+ + CH4 C2H5
+ + H2
CH5+ + MH MH2
+ + CH4
C2H5+ + MH M+ + C2H6
CH4 + e (alta energía) CH4+ y CH3
+
Gas reactivo metano, isobutano, amoníaco (cámara de ionización de “alta” presión a 10 torr)
Transferencia protónica entre molécula reactiva y analito
Espectrómetro de masas de sector magnético
Espectrómetro de masas de cuadrupolo
Espectrómetro de masas de tiempo de vuelo
Espectrómetro de masas de trampa iónica
Separador de masas
Espectrómetro de masas de sector magnético
¿cómo se separan los iones de distinta masa?
m : masa v : velocidad de la partículam : masa z : cargaV : diferencia de potencial
FM = Bzv
FC = mv2/r
mv2/r = Bzv
v = Bzr/m
FM : fuerza centrípetaFC : fuerza centrífuga B : campo magnético r : radio de curvatura
Bzr/m = (2zV/m)½
m/z = B2r2/2V
Ecinética = ½ mv2 = zV
v = (2zV/m)½
Espectrómetro de masas de cuadrupolo
Ø = 6 mm
Espectrómetro de masas de cuadrupolo
Pot
enci
al c
orrie
nte
dire
cta
tiempomasa
Pot
enci
al d
e ra
diof
recu
enci
a
Relación de voltajes durante un barrido de masa con un analizador cuadrupolo
EM de tiempo de vuelo (TOF: time of flight)
pulsos de 300 V, 3.000-20.000 veces/s
Espectrómetro de masas de trampa iónica
electrodo anular central
tapatapa
Vrf
Esquema detector de trampa iónica (ITP)
Espectros de masas
Energía de ionización de la molécula
Grupos funcionales de la molécula
Método de ionización
Presión y temperatura de trabajo
Diseño instrumental
Dependen de:
Espectros de masas obtenidos por impacto electrónico
En este ejemplo el pico base se forma por pérdida de CH3
Etilbencenopico base
ion molecular (ion “parent”)
M+ → fragmento de mayor masa
molécula con número par de N → M+ con masa par
molécula con número impar de N→ M+ con masa impar
4 H → M-4 F → M-19CH3→ M-15 HF → M-20NH3 → M-17 C2H2 → M-26H2O → M-18
Átomos y grupos frecuentemente desplazados
Espectros de masas de cloruro de metileno
13C1H235Cl2 (m= 85)
12C1H235Cl37Cl (m= 86)
13C1H235Cl37Cl (m= 87)
12C1H237Cl2 (m= 88)
Picos isotópicos12C1H2
35Cl2 (m= 84)
pico base → pérdida de Cl
Impacto electrónico
El ion molecular (m/z = 226) prácticamente no se distingue
Impacto electrónico
Espectros de masas de pentobarbital (sedante)
Ionización química
Espectros de masas de 1-decanol (PM = 158)
Ionización química
Impacto electrónico
Sistemas de acople
Cromatografía Gaseosa – Espectrometría de Masas
Separador de chorro (columnas rellenas)
desde el CG
constricción de salida
tubo de vidrio poroso
cámara de evacuación
hacia la bomba
collarín que se atornilla en el receptáculo de fuente iónica
constricción de entrada
A cámara de
ionización
Ensamblaje con columnas capilares
Sistema de acople
Cromatografía Líquida – Espectrometría de Masas
Sistema de ionización
Formación de iones gaseosos a partir de analitos en solución
Electronebulización asistida con un gas: electrospray (ESI)
Ionización química a presión atmosférica (APCI)
Fotoionización a presión atmosférica (APPI)
Ionización a presión atmosférica
Electronebulización asistida con un gas
Electrospray (ESI)
Electrospray (ESI)
1. La fase móvil y el analito se nebulizan (dispersados en pequeñas gotas)
2. El solvente de la fase móvil se evapora de las gotas (desolvatación)
3. La densidad de carga en las gotas aumenta hasta alcanzar el límite Raleigh (10e8 V/cm3) y luego la gota sufre explosiones de Coulomb y se rompe en gotas más pequeñas.
4. Bajo la influencia de potenciales electrostáticos en la cámara de spray (nube), el ion analito se desorbe de la gota.
Electrospray
líquido
aerosol
¿Cuándo es apropiado trabajar en ESI?
- Solutos ionizables de alto y bajo peso molecular. El analito de interés debe ser
capaz de portar carga en solución
Ejemplos:
a) Muestras que contienen heteroátomos: carbamatos, benzodiacepinas
b) Ácidos o bases
c) Especies iónicas: fosfatos, conjugados con grupos sulfato, aminas, etc
d) Muestras que se multi-cargan en solución (ej: péptidos, proteinas,
oligonucleotidos)
e) Compuestos que pueden aceptar carga inducida
A evitar: muestras con grupos no polares en los que la inducción de carga no
sea un proceso eficiente
Ionización química a presión atmosférica
APCI
Ionización química a presión atmosférica (APCI)
1. La fase móvil y el analito se nebulizan (dispersados en pequeñas gotas)
2. Las gotas se evaporan.
3. Las moléculas de fase móvil se ionizan por electrones provenientes de una descarga eléctrica.
4. Las moléculas de analito se ionizan por los iones de la fase móvil.
•La muestra y el solvente vaporizados entran en la región corona entre la aguja y el capilar
•Las moléculas de solvente se ionizan en la región corona de descarga, transformándose en iones gaseosos reactivos
•Estos iones reactivos reaccionan con las moléculas de muestra, ionizándolas
Ionización química a presión atmosférica
H3O+(H2O)16
¿Cuándo es apropiado trabajar en APCI?
Muestras: Compuestos de peso molecular/polaridad intermedias: PAHs, PCBs,
ácidos grasos, ftalatos.
Compuestos que no contienen grupos ácidos/básicos (ej: hidrocarburos,
alcoholes, aldehidos, cetonas y esteres)
Muestras con heteroátomos: ureas, benzodiacepinas, carbamatos
Muestras que exhiben un mal comportamiento ESI
Parámetros en solución
Mucho menos sensible a las condiciones de disolución que ESI
Tolera mayores flujos que ESI
Acomoda algunos solventes no compatibles normalmente con ESI
Muestras a Evitar
Debido a la evaporación previa: muestras térmicamente lábiles,
muestras cargadas en solución, biomoléculas (habitualmente no volátiles).
Fotoionización a presión atmosférica
APPI
APPI (modo positivo)
El solvente y la muestra se nebulizan y son completamente vaporizados por calefacción.
• La ionización del solvente y la muestra ocurre por bombardeo con fotones a partir de una lámpara UV
La molécula de analito M se ioniza a ion molecular (si el potencial de ionización del analito es menor a la energía del fotón).
El ion M.+ puede extraer un hidrógeno del solvente para formar [M+H]+
Un dopante fotoionizable en exceso y rinde muchos iones moleculares.
El analito se ioniza por transferencia protónica a partir del dopante o solvente
El ión molecular del dopante ioniza al analito por transferencia electrónica
¿Cuándo usar APPI?
• Puede ionizar compuestos que no se ionizan bien con ESI o APCI (ej: PAHs).
• Tiene mejor sensibilidad global para algunos compuestos (THC-tetrahidrocanabinol, ácido benzoico, vitaminas no hidrosolubles).
• Tiene mejor sensibilidad a bajas velocidades de flujo que APCI.
• Es robusto y altamente reproducible.
Selección del sistema CL/EM
1.000
No polar Muy polar
10.000
100.000
Pes
o m
olec
ular
Polaridad del analito
ESI
APCI
APPI
Registros gráficos CG-EM y CL-EM
Cromatograma de corriente iónica total
Cromatograma de ión seleccionado
Arreglo tridimensional: señal en función del tiempo (información cromatográfica) y en función de la relación m/z (información espectroscópica)
CH3(CH2)3OH + Br- CH3(CH2)3Br + OH-
Síntesis de 1Br-butano a partir de butanol (CG-EM)
cromatograma EM pico 1 EM pico 2
1-butanol
1-bromobutano
Combustión de tela tratada con producto ignífugo
Cromatograma de corriente iónica total (TIC)
EM de pico 12 (benceno)
Confirmación presencia de cocaína en orina por CG-masa
Cromatograma de corriente iónica total
EM del pico a 11.5 min
EM de testigo de cocaína (m = 303) a igual tiempo de elución
Cromatograma convencional con detección UV
Mezcla de 6 herbicidas resuelta por HPLC-masas
Cromatograma de masas de corriente iónica total
Detección de un ion seleccionado m/z = 312 (corresponde a MH+ formado a partir de imazaquina de masa = 311)
Representación de la estructura tridimensional de datos CG-EM en modo barrido completo (full-scan)
Se obtiene: el cromatograma iónico total, el cromatograma iónico de un ión seleccionado (a determinada masa) y los espectros de masas (a determinados tiempos de retención)
MS en Flavonoides
• Cantidad de muestra necesaria: Menos de un 1mg, esta técnica junto con el análisis UV y los reactivos de desplazamiento.
• La técnica a escoger puede variar dependiendo de la matriz y tipo de flavonoides a analizar. (FAB, MALDI, TOF, EI)
• El análisis se debe llevar a cabo siempre con agliconas, esto debido a que los glucósidos son altamente termolábiles, incluso existiendo una gran presión de vacío (3 x10-5 Torr)
RMN
• Esta tecnica es muy usada para el analisis de flavonoides, especialmente en las isoflavonas, al ser estructuras altamente metiladas.
• Ademas de ser muy solubles en el solvente que se utiliza para la RMN CDCL3, sin embargo otra vez se observa que el analisis de los glicosidos, disminuye la solubilidad en CDCL3
• Sin embargo el uso de DMSO d6, facilita de sobremanera el analisis de glicosidos.
• La utilizacion de TMS tambie es apropiada para el analisis de Flavonoides, ya que generan rapidamente derivados de estos.
Para la elucidación de la estructura tomaremos en cuenta los siguientes puntos:• Protones del Anillo A• Protones del Anillo B• Protones del Anillo C• Protones del
Glucósido• Metoxi y Acetoxi
Protones• Protones del
carbono 6 y 8
Nota: Tener en cuenta si se usa TMS, todos los OH terminales seran Trimetilsilil esteres.
Los protones de los carbonos 6 y 8 de las isoflavonas que contengan sustituciones en los carbonos 5 y 7, presentaran 2 dobletes (J: 2.5cps) en el rango de 6.0 y 6.5. Los dobletes correspondientes a H-6 ocurren consistentemente mas altos que los del 8-H, cuando existen azucares en el C-7 la señal se desplaza en el espectro
Otro caso común es que la isoflavona presente una sustitución en el C-7 Cuando R=H, tenemos que los hidrogenos del carbono 5 genera un doblete entre 7.9 y 8.2, El carbonos 6 generara un cuarteto entre 6.7 y 7.1 y el carbono 8 un doblete entre 6.7 y 7.0, cuando la sustitución es diferente a la de un H, todos los desplazamientos se ven reducidos.
Anillo B: para nuestro interés en las isoflavonas, los desplazamientos como dobletes entre 7.2 y 7.5 y 6.5 y 7.1, nos darán la explicación de un enlace =C-C= en la posición 3, corroborando la presencia de la estructura correspondiente a las Isoflavonas.
Farmacología
Isoflavonas
• Las Isoflavonas presentan una gran cantidad de actividades, aunque cabe resaltar que la mayor cantidad de Isoflavonas presentar actividad estrogénica, de ahí que reciben el nombre de Fitoestrógenos.
• Estos compuestos presentan una estructura estérica muy similar a la de esteroidal de los estrógenos, por lo cual se unen fácilmente a los receptores estrogénicos. De ahí que produces una infinidad de efectos estrogénicos o anti estrogénicos.
Absorción, Metabolismo y excreción
• Las isoflavonas son absorbidas a nivel de la parte superior del intestino delgado. Pasan la barrera hematica alrededor de una hora después de haber sido ingeridas.
• Son absorbidas bajo la forma de aglicona, por lo que previamente se realizada un hidrolisis enzimática, por la B-glicosidasa de la flora bacteriana o por la enzima instestinal, lactasa-florizina hidrolasa.
Absorción, metabolismo y excreción
• Posteriormente a nivel de la mucosa intestinal son convertidas a la forma de B-glucoronico por la enzima UDP-Glucoroniltransferasa , convertida luego bajo la forma de sulfato catalizado por PAPS. Estos procesos ocurren a nivel del Hígado.
• Luego estos son excretados a nivel biliar, y reabsorbido en la porción final del intestino delgado, creando un ciclo entero-hepatico.
• Para ser luego excretado vía urinaria, bajo la forma de DMA (desmethylangolensin).
Mecanismo de AcciónSíntomas Menopaúsicos:Las isoflavonas con su estructura estérica similar a la del estrógeno, se une a sitio receptor de estrógenos, produciendo efectos vasomotores importantes, diversos estudios clínicos, dan como dosis diaria 135 mg de Isoflavonas expresadas como mg de Genisteina.
Efectos Benéficos
• Anticancerígeno: Uno de las posibles explicaciones, o modelos de mecanismo de acción es tan indicados a que las isoflavonas, evitan la proliferación de células cancerígenas activando las vías de apoptosis, inhibición de la Tirosina Quinasa, y regulación de los ciclos hormonales.
Efectos Benéficos
• Efectos sobre la cognición: El hecho de activar receptores hormonales, da como resultado un incremento en la producción de neurotransmisores, lo cuales van a producir una mayor actividad cerebral, llegando a mejorar los procesos cognitivos del cerebro.
Practica de Laboratorio
• Traer: • Mta problema (planta, material vegetal,
materia biologico), que contenga una cantidad y molecula conocida de Isoflavonas.
• Jeringas de 10 ml• Guantes• Guardapolvos• Muchas Ganas de trabajar
FIN
Gracias
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