IntroducciónRelación del crecimiento de la población mundial incremento de bioespecímenes
Rápido incremento del acceso a tecnologías de “próxima generación”
Tejido congelado
Ventajas y desventajas del uso de tejidos congelados a bajas temperaturas y FFPE
Tejido congelado FFPE
Histología Inferior Superior
DNA y RNA Mayor peso molecular y sin enlaces entrecruzados
Menor peso molecular y con enlaces entrecruzados
Proteínas Proteínas bien conservadas, incluyendo actividad enzimática
Proteínas con enlaces entrecruzados, actividad enzimática inexistente
Organismos infecciosos Podrían permanecer viables -
Costos Más costosos Menos costoso
Manipulación con nitrógeno líquido
Graves riesgos Menos riesgo
Materiales y métodosBúsqueda bibliográfica Biobancos
Biorepositorios
Bioespecímenes
Congelación (congelado)
Tejido
Sangre
Obtención
Contenedor
Control de calidad
Aseguramiento de la calidad
¿Cuán rápido debemos congelar los bioespecímenes?
¿Es el freezer de -80° C realmente adecuado para estabilizar un bioespecímen o es el almacenamiento a -150° C superior?
¿Cuánto afectan a las muestras biológicas los ciclos de congelamiento/descongelamiento?
¿Cuáles son las bases de los procedimientos de control de calidad comúnmente en uso?
Consideraciones en la obtención de tejido y muestras de sangre
Generación de manuales de buenas prácticas por instituciones internacionales: Society for Biological and Environmental Repositories (ISBER), National Cancer Institute (NCI) y otros
POEs de colección y almacenamiento de tejido humano fijado y no fijado están en continúo desarrollo
Obtención de tejido
Intervenciones quirúrgicas
Autopsias
Procesos pre-mortem pueden tener impactos negativos en la integridad de la muestra
Duración de la cirugía
Isquemia tibia: es medida como la cantidad de tiempo que el tejido está a temperatura ambiente después de ser resecado desde el cuerpo humano hasta ser estabilizado
La isquemia caliente no es anotada durante la cirugía debido al ambiente ocupado que se genera en la habitación debido a la preocupación del cuidado del paciente
Biopsia y técnico
Evaluación del tejido a temperatura ambiente
Mantener tejido en hielo mientras tanto
Isquemia fría
Obtención de tejidoRNA
Existen estudios que han demostrado la no degradación del RNA en algunos tejidos por varias horas y otros que han demostrado la degradación desde la resección hasta el congelamiento
Proteínas
Fosforilación de proteínas y proteólisis post mortem en muestras de corazón congelación rápida
Variabilidad en la preservación de acuerdo al tipo de tejido
Obtención de sangre• Es uno de los bioespecímenes más comúnes usado en clínica e
investigación traslacional
Sangre completa
Plasma
Suero
Leucocitos
Eritrocitos
Suero: se necesita un tubo que contenga un acelerador de la coagulación, como sílica o trombina
Sangre anticoagulada para obtención de plasma, buffy coat y RBCs
Colección en tubos que contengan EDTA
• La sangre se puede almacenar completa o en sus componentes
Obtención de sangre
Suero y plasma estudios e analitos, como proteínas, lípidos y pequeñas moléculas y como fuente de obtención de ácidos nucleicos libres de células
Concentrados celulares citometría de flujo, cultivos, o como fuente de ácidos nucleicos
Células vivas son estables por 48 horas, pero deben ser cultivadas o criopreservadas a -150° C para mantener su viabilidad
• Transcurrido tiempo entre la colección y el procesamiento, con las muestras mantenidas a temperatura ambiente o incluso a 4° C (por más de 24 horas) puede resultar en alteración de algunas proteínas
Obtención de sangre
Se requiere una separación inmediata de plasma y células… Un lapso de tiempo de 24 horas es aceptable, con un almacenamiento transitorio a 4° C
Temperaturas óptimas de almacenamiento para bioespecímenes congelados
Almacenamiento de tejido
Almacenamiento a -20° C fue comúnmente usado en el pasado
Temperaturas ultra bajas han llegado a covertirse en el estándar para el almacenamiento a largo plazo (-80° C a -150° C)
Se sugiere el almacenamiento bajo los -137° C, ya que esta temperatura es la de transición vítrea del agua, la cual deja inerte los procesos bioquímicos que podrían dañar el contenido intracelular
Nitrógeno líquido: fase de vapor y fase líquida
Almacenamiento de tejido• Almacenamiento de hígado humano a -25° C vs. -80° C y -150° C (por
7 años)• Reducción de integridad de RNA en bioespecímenes almacenados a -
70° C y -80° C por 5 años o más• DNA permanece sin cambios por almacenamiento por largo tiempo a
-80° C• Proteoma permanece sin cambios a -70° C o más bajo• Bioespecímenes deben ser almacenados al menos a -80° C
Almacenamiento de sangreLa temperatura y el periodo de tiempo de almacenaje depende de el analito, marcador, o molécula de interés.
Se ha demostrado que el DNA puede ser extraído con un rendimiento aceptable y de buena calidad desde muestra de sangre almacenadas a TA, 4° C y -20° C por máximo de 1 mes posteriormente a eso, la tasa de destrucción de eritrocitos y leucocitos es más alta
DNA a es estable por semanas a 4° C, por meses a -20° C y por años a -80° C, el RNA se degrada más rápido a temperaturas más altas que -80° C.
MicroRNA es mantenido por años en muestras de plasma almacenado a -80° C
Efecto de la congelación/descongelación en la calidad del bioespecímenEfectos de la congelación/descongelación en tejido congelado
RNA
Estudios en tumor ovárico y cerebral humano no mostraron alteraciones en la calidad del RNA, perfiles de expresión génica o expresión proteica (desde 3 a 6 ciclos)En otros estudios bastó con 2 ciclos para reducir la calidad del RNALas diferencias pueden estar en el tipo de tejido y las condiciones de descongelamiento
Efectos de congelación/descongelación de muestras de sangre
En un estudio, solo un ciclo de descongelación bastó para disminuir en un 25% la calidad del DNA, pero no disminuyó la concentración de mRNA en suero y plasma
Kopreski y cols. observaron que al tercer ciclo de descongelamiento de suero, se promovía rápidamente la degradación del mRNA con amplificación indetectable, algo similar ocurrió con el proteoma
Control de calidad y herramientas de control de calidadControl de calidad histológica
En el pasado se realizaba el cálculo del porcentaje que ocupaba el tumor en el área total del tejido Engañoso
Una alta densidad de células tumorales en una pequeña área tumoral puede producir un alto y adecuado porcentaje de DNA
Gran área de tejido de células tumorales dispersas, producirán un bajo porcentaje de DNA tumoral
Razón de núcleos tumorales frente a
totalidad de núcleos
70%
Control de calidad histológicaCuando las muestras no reúnen los criterios, las áreas no neoplásicas pueden ser removidas con la finalidad de enriquecer el tejido tumoral
80% de núcleos tumorales para glioblastoma multiforme y 60-70% para otros cánceres
Exclusión de los casos con más de 20-50% de necrosis
Evaluación de la calidad del DNAEvaluación del rendimiento y pureza de DNA extraído de células y tejidos
Determinación de la densidad óptica, por lectura en espectrofotómetro, 260 y 280 nm
Razón 260/280 óptima = 1.8
Evaluación de la integridad del DNA por electroforesis en un gel de agarosa del 1-1.5% p/v
Evaluación de utilidad del DNA por reacción en cadena de la polimerasa
Evaluación de la calidad del RNA• RNA es importante para la evaluación de la expresión génica pero las
Rnasas pueden degradar rápidamente el RNA
Evaluaciones a distintas longitudes de onda
Longitud de onda Información 240 nm Absorción del background y posibles
contaminantes como EDTA
260 nm Contenido de ácido nucleico
280 nm Contenido de proteínas
320 nm Absorción de background y compuestos orgánicos como fenol, azúcares y alcohol
Razones
260/280 Un valor de 1.8 o más se considera aceptable con respecto a pureza
260/240 Indicadores de otros contaminantes
260/320
Evaluación de la calidad del RNAEvaluación de integridad
Lo tradicional es la evaluación de la razón del RNA ribosomal 28S y 18S
Banda de 28S es aproximadamente dos veces más intensa que la de 18S
Razón de 28S/18S = 2 o más
Número de integridad del RNA (RIN): cálculo a través de un software de las trazas electroforéticas de un electroferograma. Scores van desde 1 a 10.
Valores de RIN Aplicaciones
Superior a 8.05 Análisis por microarray
Preferiblemente 8.0 qRT-PCR
Evaluación de la calidad proteica• El estudio de las proteínas nos entrega información útil para el estudio de
vías patológicas o biomarcadores relacionadas a una enfermedad particular
Etapa pre-analítica
Evaluación histológica al momento de la obtención de los bioespecímenes
Evaluación con ensayos colorimétricos: BCA, Lowry o Bradford
Evaluaciones dependiendo del número de clientes
Tinciones inmunohistoquímicas para evaluación de antígenos
Evaluación de la calidad proteica• Integridad del proteona geles SDS-PAGE teñidos con Coomassie
Blue• Realización de Western blot para evaluación de proteínas, incluyendo
las fosforiladas.
Hincapié en el rol del patólogo o citopatólogo en la evaluación de bioespecímenes para el Biobanco
Costos de infraestructura incluyendo backup de emergencias y una adecuada refrigeración de la habitación.
Un freezer de -80° C puede almacenar más bioespecíemenes que su contraparte de -150° C
Top Related