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E N I N G E N I E R ~ TECNOLOG~AS V N Z D S
U P I I T A
Síntesis de Nanopartículas Semiconductoras
para su Biofuncionalización
Para obtener el título de:
Ingeniero en Biónica
Presentan:
Carolina Melchor Andrés
Eladio Jeset Velázquez Fragoso
Asesores:
Dr . en C. José Francisco Sánchez Ramírez
M é x i c o D .F . Jun iofO ío
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E N I N G E N I E R Í A Y T E C N O L O G ~ A SAVANZADAS
U P I I T
Síntesis de Nanopartículas Semiconductoras
para su Biofuncionalización
Para obtener el título de:
Ingeniero en Biónica
Presentan:
Carolina Melchor Andrés
Eladio Jeset Velázquez Fragoso
inodales
ing Carlos Ríos Ramírez
Secretario
Asesor Asesor
M é x i c o D.F. Junio2OlO
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Unidad Profesional lnterdisciplinaria en Ingeniería
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Agradecimientos especiales
Al Instituto Politécnico Nacional.
A la Unidad Profesional Interdisciplinaria e n Ingeniera y Tecnologías Avanzadas
A la Benemérita Universidad Autónoma de Puebla
Al Cen tro de Investigación en Cienc ia Aplicada
y
Tecnología Avanzada Unidad Legaria
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gradecimientos
Agradezco al Instituto Politécnico Nacional la formación académica recibida a lo largo de los
últimos ocho año s desde mis estudios de nivel medio superior hasta la fecha. También quiero
agradecer el tiempo y dedicación de mis profesores de la Unidad Profesional Interdisciplinaria
en Ingeniería y T ecnologías Avanzadas.
A nuestros asesores Dra. en
C.
Lilia Martinez y Dr. en
C.
José Francisco Sánchez por su
tiempo
y
conocimientos com partidos con nosotros durante un año.
A mi compañero Eladio porque formamos un equipo caracterizado por el respeto y el
compromiso.
Dedicatorias
Dedico este trabajo a mi familia porque siempre me apoyaron desde mi niñez hasta mis
estudios superiores. Les agradezco a mis padres Jerónimo Melchor González y Victoria
Andrés Santiago su apoyo cariño. Gracias por creer en mi y por quererme así com o soy.
A mi hermano Jorge con quien en ocasiones no me llevé bien pero siempre me ha alentado a
seguir adelante. Por ayudarme cada vez que acudo a él por un consejo. Desde pequeños
convivir con él ha sido una las mejores cosas de la vida.
A mi hermana Marycruz por haber sido y seguir siendo un gran apoyo para nuestra fam ilia es
una de las mujeres que más admiro por su valentía y por no rendirse cuando se enfrenta a
situaciones adversas.
A Raúl por compartir tu tiempo conmigo. Por dejarme formar parte de tu vida. Gracias por
acompañarme cuando salía tarde de la escuela. Gracias por tu cariño comprensión y apoyo
incondicional. Todo s los mom entos que hemos pasado juntos los atesoraré en mi corazón.
A mis amigos: Jenny José Manuel Enrique Ahuizotl y Daniel por brindarme su cariño. Por
alentarme cuando me encontraba en situaciones adversas. Por apoyarme incondicionalmente.
Gracias por compartir su tiempo conmigo y por sus consejos. También gracias por compartir
sus momentos felices y tristes conmigo por confiar en
mí.
Carolina
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Agradezco a Dios por darme la oportunidad de disfrutar de esta vida y este periodo que de una u otra
manera marca toda mi existencia, tanto por lo vivido en la UPIITA como fuera de ella, y pem~iteener otras
visiones del mundo en el cual estoy inmerso.
Agradezco a mis padres. en primer lugar por haberme dado la vida, por haber cuidado de mi d urante tantos
años, por brindarme las facilidades de estudiar una carrera que si bien al principio no sabía ni de que se
trataba, me ha llenado d e satisfacciones personales, es perando lleguen pronto las profesionales; gracias por
la comprensión mostrada hacía mi carrera, por los desvelos derivados de la misma; gracias les doy por ser
su hijo; los quiero aunque no se pa com o demostrárselos.
Dedico este trabajo, y la parte q ue me haya correspondido hacer a mi.farnilia a quien quiero profundamente
pero en ocasiones no lo demuestro. Y lo dedico también a ti mi a mor, a ti, Erandy Selene Morales G onzólez
a quien debo agradecer en mucho el final satisfactorio de este periodo, pues cuando pensaba que no había
salida, tu siempre estuviste ahí para mostrarme las opciones que yo no podía ver; porque estuviste cuando
más te necesitaba y no quería ni sentía pudiera confiar en nadie más, porque he aprendido much o de
t i
y no
solo personalmente, si no también profesionalmente; porque me has mostrado otra cara de la vida. A ti con
quien he comp artido momentos dificiles para ambos. Con todo mi amor y respeto.
A mis hermanas a quienes en ocasiones dejaba de ver hasta por varios días a pesar de vivir en la misma
casa, quienes me hacían reír cuando no quería o estaban ahí para escucharme cuando me dignaba a hablar,
ja ja. Gracias a
Belem
por ser mi confidente de muchas cosas. Gracias a
Ayde
por el apoyo mostrado
siempre. Gracias a Iris por ayudarme siempre que te lo pedía, y a t i Rogelio gracias por cuidar de mi
hermana y hacerla feliz aunque haya sido poco tiempo, porque sé que juntos me hubieran ay udad o a buscar
trabajo no, no es cierto), pero sé que estarías ahí dispuesto a ayudar si lo necesitaba.
Agradezco también a mis asesores.
A
la Dra. Lilia por el apoyo incondicional brindado siempre, y al Dr.
José Francisco por sus conocimientos transmitidos y para realizar nuestro trabajo, además de hacerme
pensar en mu chas cosas ajenas al Trabajo Terminal.
Gracias a mis amigos Carolina, César, Cynthia, Lidia, Sunaina, Silvia, Sonia, Pablo. Esther, Jesús, por
mostrarme las bondades del trabajo en equipo y brindanne su amistad. Gracias a Caro por soportarme todo
un año y juntos lograr esta meta.
Al M. en C. Lucas Bravo, le tengo gran respeto y agradecimiento por su bondad, y ayudarme cua ndo más lo
necesitaba. Al profesor Valentino por ayudarme de igual manera en un momento difícil. Al profesor
Ricardo Horta por mostrarme un camino a seguir profesionalmente. Agradezco a mis profesores de cuarto
semestre Noé , David, Victor) quienes me brindaron grandes ideas e hicieron nacieran en mi muchas
pasiones por el conocimiento. A los maestros cuyas materias me fueron difíciles, por enseñarme que
siempre que uno q uiera se puede superar cualquier obstáculo.
Agradezco a Pablo por mostrarme el valor del íraba.jo, y el valor de la confianza en uno mismo. Doy gracias
igualmente a la U PllTA en general, por ser como es. Dificil en muchas oca siones pero no imposible.
Y
por último, quiero agradecer a una persona que siempre estuvo conmigo en todo momento y si no hera
por él no estuviera escribiendo esto. Me ha llenado de conocimiento, de satisfacciones, también de
decepciones, pero siempre me ha ayudado a seguir adelante y lograr los objetivos propuestos, así como
mostrarme qu e com o decía mi abuelito) las cosas no mand an, que hay que pelear por lo que se desea, que
querer es poder, que si te caes hay que levantarse, y que siempre hay otros caminos. Te agradezco y te
dedico esto Eladio. A ti, o sea a mi.
Eladio Jeset Velázquez Fragoso
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Índice eneral
RESUMEN i11
ABSTRACT x
ABREVIATURAS x
GLOSARIO x11
Capítulo 1 INTRODUCCIÓN
1.1
Estado del Arte 3
.1.2 Nanobiónica 5
1.1.3 Tipos de nanopartículas biomédicas 5
1.1.4 Imagen tumoral in vivo 7
Capítu lo 11
OBJETIVOS 9
2.1 Objetivo General 10
2.2 Objetivos Específicos 10
Capítulo PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
apítulo IV
J U S T I F I C A C I ~ N
E LA
INVESTIGACION
13
Capítulo V MARCO TEÓ RICO 15
5.1 Técnicas de crecimiento de nanopartículas metálicas 16
5.2 M étodos y condiciones ex perimentales de preparación 6
5.2.1 Dispersiones Coloidales de Nanopartículas de oro 16
5.3 Nucleación y crecimiento 18
5.4 Estabilidad de nanoparticulas 19
5.5 Síntesis de nanopartículas semiconductoras 19
5.6 Antic uerpos 21
5.6.1 Meca nismo de acción de los anticuerpos 22
5.6.2 Anticuerpos monoclonales 23
5.7 Aptám ero 24
Capítulo VI DESARRO LLO EXPERIME NTAL 26
6.1 Preparación de dispersiones coloidales de 27
nanopartículas de oro a diferentes razones molares
6.2 Preparación de dispersiones coloidales de nanopartículas 1
semiconductoras InP. 111-V)
6.2.1 Preparación de Mirista to de Indio In MA)3 34
6.2.2 Síntesis de nanocristales de InP 36
6.3 Biof~~ncionalizacióne nanop artícula s sem icondu ctoras InP, 111-V) 37
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Capítulo VI1 RESULT ADO S 3 8
7.1 Nanopartículas coloidales de Oro 39
7.2 Estabilidad
47
7 3
Estabilidad electroestática
48
7.4
Nanopartículas semiconductoras de
InP
50
Capítulo VIII CON CLUSIO NES 52
apítulo IX REFERENCIA
Capítulo X APEN DICE 59
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Índice de iguras
1 1 Seña les de fluorescencia
5.1 Ilustración esquemática de los métodos de preparación de partículas 17
metálicas de tamaño nan ométrico
5.2 Ilustración esquemática del proceso de síntesis de nanopartículas 17
metálicas de oro
5.3 Ilustración esquemática de los tipos de estabilización 19
5.4 Estructura de un anticuerpo 21
5.5 Regiones CDR de un anticuerpo responsables del reconocimiento 22
de antígenos
5.6 Etapas del proceso de eliminación de agentes extraños 23
6.1 Arreglo experimental de la síntesis de nanop artícula s de oro 27
6.2 Imágenes de diferentes tiempos de reacción de dispersiones coloidales 0
de nanopartículas de oro a una razón molar de [CS] 1 [HAuC14] 2.25
6.3 Dispersiones coloidales de oro a obtenidas con diferente razones 31
molares de [CS] 1 [HAuC14]
.4 Instalaciones del laboratorio de Ingeniería Ambiental de la BUAP
33
6.5 Lavado de materiallmaterial limpio 33
6.6 Colocación del material en la cámara lateral de la caja de guante s 34
6.7 Síntesis del precursor 35
6.8 Nanopartículas despué s del proceso de centrifugado 36
7.1 Espectro de absorció n en la región UV -Vis de la solució n de oro con una 39
razón molar [CS]
/
[HAuCI4] 0.25
7.2 Espectros de absorción en la región UV-V is de las solución de oro 42
con diferente razón molar de [CS]/ [HAuC14]
7.3 Posición de la RPS en función de la razón [CS] / [HAuC14] 42
7.4 Micrografias de TEM 43
7.5 Histogramas de frecuencias 45
7.6 Espectros de absorción de las soluciones iónicas de Au en diferentes 7
tiempos de reacción
.7 Espectros de absorción en la región UV -Vis de las soluciones de o ro
48
.8 Presentación del cartel: Efecto de la Concentrac ión de Citrato en el
49
Control del Tam año de Na nopartículas de Oro
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7 9
Constancias de la presentación del cartel en el er. Congreso Nac ional.. 50
de Ciencia e Ingeniería en Materiales
7.10 Constancias de la asistencia al curso Microscopia E lectrónica de .. ...................50
Barrido y Microanálisis
7.1 Espectro de absorción de la dispersió n coloidal de las nanop artículas ..
................
51
de InP
7.12 Nanopartículas de InP, después del centrifugad o..
.......................................
.51
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Índ ice de
Tablas
1 Propiedades físicas de los diferentes reactivos utilizados para síntesis de 28
nanopartículas de Oro
NAu)
6 2
Estabilidad
y
razón molar de las diferentes síntesis realizad as 3
1
3 Propiedades físicas de los diferentes reactivos utilizados para sínte sis
32
de NInP
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R SUM N
El presente Trabajo Terminal presenta el m étodo para obtener nanopartículas metálicas de oro
por la ruta coloidal así com o el control de su tam año por medio de la variación en la
concentración de Citrato de Sodio esto como un primer acercamiento para sintetizar
nanopartículas semiconductoras del grupo
111-V.
Se propone un m étodo para realizar la biofuncionalización de nanopartículas semiconductoras
para utilizar aptámeros.
Palabras
clave Aptám ero nanopartíczrla bioniarcador marca dores biológicos
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BSTR CT
his
Terminal Work
presents a method
of
synthesis of metallic gold nanoparticles
y
the colloidal
route and their control size through the variation in the concentration of sodium citrate this as a first
approach to synthesize semiconductor nanoparticles of group Ill-V.
W e propose a method for the semiconductor nanoparticles biofunctionalization to use aptamers
Keywords
Aptam er nanop article bioma rker biological mai-lcer
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BREVI TUR S
Au
CDR
COOH
C S
DDT
Fab
Fc
HAuC14
Ig
InAs
In MA)
InP
R
M
MA
mmol
NH2
nm
NPB
NInP
O D
ODE
PDGF
P TMS13
Oro
Complem entary Determining Regions
Carboxilo
Citrato de Sodio
Dodecanotiol
Antigen Binding Fragment
Crystallizable Fragment
Ácido cloroáurico
Inmunoglobulina
Arseniuro d e Indio
Miristato de Indio
Fosfüro de Indio
Infrarrojo
Molar
Ácido Mirístico
Milimoles
Amino
Nanómetros
Nanopartículas biofuncionalizadas
Nanopartículas de Fosfuro de Indio
Unidades de Densidad Ó ptica
Octadeceno
Factor de crecimiento derivado d e plaquetas
Tris Trimethy1silyl)Phosphine
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QD Quantum Dots
RPS Surface Plasmon Resonance
SELEX
Systematic Evolution o f Ligands by Exponential Enrichrnent
TEM Microscopia Electrónica de Transmisión
UV Ultravioleta
ZnS Sulfüro de Zinc
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GLOSARIO
Absorbancia
La absorbancia,A, es la cantidad de intensidad de luz que absorbe una
determinada muestra. Está definida como:
siendo la intensidad después de haber ocurrido la absorción e
1
la intensidad de la luz qu e se
hace incidir en la muestra.
Aptámero Los aptámeros son macromoléculas de ácidos oligonucleótidos o moléculas
péptido. que se unen a molécu las objetivo específicas.
Biomarcador Sustancia sintetizada por el propio organismo presente en la sangre, en los
tejidos o en o tros líquidos corporales qu e se utiliza para diagno sticar alguna enfermedad.
Bioconjugación Modificación o acoplamiento de nanopartículas con moléculas selectivas.
Sucede después de la biofuncionalización.
Biofuncionalización La biofuncionalización es la adición d e grupos funciona les bioafines en
la superficie de un material por métod os de síntesis química.
Fotodegradación Rom pimiento d e moléculas por acción de la luz.
Fluorescencia La fluorescencia es la propiedad de una sustancia para emitir luz cuando es
expuesta a radiaciones del tipo ultravioleta, rayos catódicos o rayos
X.
Nanobiónica Es una fusión de la biología e ingeniería utilizando los avances de la
nanotecnología.
Nanopartícula Unidades más grandes que los átomos y las moléculas
1
a 100 nanómetros .
No obedecen a
l
química cuántica, ni a las leyes de la física clásica, poseyendo características
propias.
x
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Introducción
Un término usado recientemente en el área de la nanotecnología es el de nanobiónica [l], que
ha empezad o a postularse c omo una de las áreas prioritarias de desarrollo dentro de la misma
nanotecnología.
La nanobiónica es una fusión de la biología e ingeniería utilizando los avances de la
nanotecnología. Su principal objetivo es la búsqueda de la mimetización de sistemas
biológicos para la construcción de nanodispositivos que ayuden a mejorar las condiciones de
vida. El interés por desarrollar esta nueva tecnología, está impulsando la creación y
explotación de biomateriales a escala nanométrica con propiedades diferentes hasta las
conocidas actualmente. Uno de estos biomateriales son las llamadas nanopartículas
biofuncionalizadas
NPB)
cuyas propiedades físicas, químicas y biológicas son, en la mayoría,
diferentes a las existentes de los mism os materiales en bulto y atómic o [2-91. Las
NPB
son
definidas como identidades cristalinas o amorfas con tamaños en el intervalo de a 100
nm
con formas variadas que van desde esféricas hasta irregulares y con superficies modificadas
vía moléculas orgánicas y10 biológicas selectivas para generar su interacción con células
específicas. Para la biocon-jugación directa con células biológicas. las nanopartículas deben
presentar en su superficie, grupos reactivos tales como amino
-NH2),
carboxilo -COO H) o
mercapto -SH). De esta manera, las nanopartículas pueden conju garse con los ligandos
partículas de un compuesto adhesivo que ligan y mantienen unidos d os elementos) bioafines
tales como anticuerpos monoclonales, péptidos, enzimas, ácidos nucleicos o pequeñas
moléculas inhibidoras, formando híbridos inorgánico-orgánicos [lo -1
31
Con el término biomaterial
[ 4]
se designa a los materiales utilizados en la fabricación
de dispositivos que interactúan con sistemas biológicos
y
que se aplican en diversas ramas de
la medicina y biología. Su utilización va desde transportadores de agentes bioactivos hasta su
empleo en sistemas que incrementen o reemplacen tejidos, órganos o miembros del cuerpo
humano.
En particular, las NPB tipo semiconductor del grupo 111-V son una clase de
biomateriales que presentan brillantez, resistencia a la fotodegradación, espectro de emisión
agudo, emisión multicolor en el infrarrojo cercano y alta biocompatibilidad, que hacen de este
tipo de biomateriales fuertes candidatos para el desarrollo de nuevos marcadores biológicos
fluorescentes para la detección d e enfermedad es como el cáncer.
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Las
NPB
del grupo 111-V presentan un potencial de propiedades para resolver las
actuales limitaciones encontradas (menor detectabilidad en comparación con los marcadores
radioinmunológicos, toxicidad, ruido de fondo presente en las m ediciones de fluorescencia) en
los tradicionales marcadores fluorescentes orgánicos (por ejemplo: fluoresceína y los
derivados de la rodamina) y proteínas desarrolladas genéticamente. Actualmente las
NPB
tipo
semiconductor están siendo utilizadas en una extensa variedad de aplicaciones biológicas y
clínicas [l5-231.
En el campo de la síntesis, la habilidad para manipular controladamente el tamaño de
las nanopartículas, por métodos simples y sencillos, es actualmente uno de los principales
desafíos de la nanotecnologia. Controlar su funcionalidad superficial (modificación para
conseguir diferentes propiedades físicas o químicas), sin em bargo, es de vital importancia para
desarrollar una nueva clase de marcadores biológicos fluorescentes para aplicaciones en los
camp os de la biología y m edicina
[24-261.
Aunque ya existen marcadores biológicos fluorescentes que emiten en las regiones
espectrales ultravioleta y visible, estos presentan problemas de interferencia espectral cuando
se desea la detección in vivo Estas interferencias incluyen la atenuación, inhibición o
extinción de la señal por la absorción de los te-jidos y líquidos circundantes, fotodegradación,
florescencia de fondo y descomposición debido a reacciones fotoquímicas con el medio
circundante. Una solución a estos problemas de interferencia es la utilización de marcadores
activos (excitación y detección) en la región del infrarrojo-cercano (650-900 nm). En esta
ventana transparente , la absorción debido a los líquidos biológicos y la autofluorescencia
celular no es significante.
1 1
stado del arte
El cáncer es uno de los principales problemas de salud pública. De acuerdo con la
Organización Mundial de la Salud, esta situación se ha tornado crítica y de no implantarse
diferentes estrategias de prevención, para el año 2030 se estima se presentarán m undialmen te
1 8 millones de muertes por esa causa [27 ].
Las técnicas empleadas actualmente para el diagnóstico de cánceres en clínica son:
obtención de imágenes (Rayos X, Resonancia Magnética Nuclear, Colposcopía), biopsia de
los tejidos y análisis bioanalítico de los fluidos corporales. Sin embargo, todos ellos, por lo
regular, no son suficientemente sensibles y10 específicos para una detección temprana de la
mayoría de los cánceres y sobre todo de los estados precancerígenos. Además. es difícil de
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hacer el diagnóstico de los cánceres analizando únicamente las alteraciones morfológicas en
las células y tejidos. Algunos tumores sólidos solamente se detectan cuando su tamaño es de 1
cm. o más de diámetro, lo que significa que su masa constituye millones de células y hay
posibilidad de metástasis en otros órganos.
Actualmente, en los análisis clínicos para producir las imágenes ópticas, se utilizan
materiales fluoroforo s por lo regular compu estos orgánicos, lantánidos, etc). Cuando un
fluroforo se excita con un cuanto de energía especifica fotón). sus electrones cambian del
nivel básico de energía a uno más alto. Durante este proceso el electrón pierde una parte de
energía obtenida, generalmente debido a emisión de un fonón y como resultado se emite un
fotón de energía m ás baja. Debido a este proceso de em isión de luz, el electrón de un estado de
energía elevada vuelve a su estado normal. Los fluoroforos se dividen en dos categorías
amplias: endógenos los que se usan directamente in vivo y exógenos los que se usan in
vitro .
Al
segundo grupo pertenecen agentes contrastantes basados en nanopartículas
[28]
1 1 1 Marcadores fluorescentes
Para una detección óptima, el marcador d ebe cum plir los siguientes requisitos:
La fluorescencia emitida debe poseer una elevada potencia radiante y se ha de
distinguir claramente del ruido de fondo.
La unión del marcador al anticuerpo o al antígeno no debe tener ningún efecto sobre
sus propiedades inmunológicas.
El coeficiente de absorción molar del marcador ha de ser lo más grande posible y el
rendimiento cuántico en el solvente utilizado debe ser lo mayor posible o aproximarse a la
unidad, mientras que el ruido de fondo de la mayoría de las muestras s e debe a la d ispersión de
la luz y a la fluorescencia d e longitud de onda corta del sue ro o antisuero.
La mayoría de los fluoróforos o compuestos fluorescentes son compuestos orgánicos
con una estructura cíclica.
Un ejemplo de esto es la fluoresceína, sin embargo, a pesar de cumplir con los
requisitos mencionados para s er un buen m arcador, es bastante susceptible a las interferencias
por el ruido de fondo y la dispersión de la luz provocadas por la muestra.
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1 1 2 Nanob iónica
Los nanomateriales, que miden
1 1
000 nm ., permiten la interacción con sistem as
biológicos a nivel molecular. También pueden facilitar importantes avances en la detección,
diagnóstico y tratamiento d e los cánceres hum anos, dando lugar a una nueva disciplina: la
nano-oncología [2 9,30 ].
Las nanopartículas se están desarrollando activamente para obtener imágenes de
tumores in vivo perfiles biomoleculares de biomarcadores de cáncer y suministro específico
de medicamentos. Estas técnicas basadas en la nanotecnología pueden ser aplicadas
ampliam ente en el tratamiento d e diferentes enfermedades m alignas.
El uso de nanopartículas no sólo los puntos cuánticos de diferentes tamañ os sino
también las nanopartículas de oro), permiten la detección y cuantificación simultánea de varias
proteínas en pequeñas muestras de tumores, que finalmente permitirá la adaptación del
tratamiento contra el cáncer específico de cada paciente a un perfil de proteínas específicas del
tumor [311
Diferentes aplicaciones de la nanotecnología se están investigando activamente en el
diagnóstico de cáncer por medio de im ágenes.
Varios ámbitos de la nanotecnologia se han utilizado para mejorar la transmisión de los
agentes de quimioterapia a las células cancerosas con el objetivo de minimizar los efectos
tóxicos en los tejidos sanos.
1 1 3 Tipos de nanopartículas biomédicas
Aunque el número de diferentes tipos de nanopartículas está au mentan do rápidamente,
la mayoría se pueden clasificar en dos tipos principales:
Partículas que contienen moléculas orgánicas como principal material constituyente.
Partículas que utilizan elementos inorgánicos, por lo general los metales, como un
núcleo.
Liposomas, dendrímeros, los nanotubos de carbo no, emulsiones,
y
otros polímeros son
un grupo importante y bien establecido de partículas orgánicas. El uso de estas nanopartículas
orgánicas ya ha producido resultados interesantes. Los liposomas se están utilizando como
vehículos para la administración de fármacos en diferentes tumores humanos, incluyendo el
cáncer de mama.
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Dendrímeros, utilizados en la Imagen por Resonancia Magnética como agentes de
contraste, han ayudado a la visualización de los diversos procesos patológicos. Conjugados
con agentes fannacológicos y las moléculas de orientación, los nanovectores orgánicos son
potentes vehículos para suministrar fármacos y proporcionar una imagen selectiva de los
diferentes tipos de cáncer hum ano.
La mayoría d e las nanopartículas inorgánicas comp arten la misma estructura básica, un
núcleo central que define la fluorescencia y las propiedades ópticas, magnéticas y eléctricas d e
la partícula, con un recubrimiento orgánico de protección en la superficie. Esta capa exterior
proteg e al núcleo de la degradación en un entorno fisiológico agresivo y puede formar enlaces
covalentes o electrostáticos, o ambos, con agentes de carga positiva y las biomoléculas de los
grupo s funcionales básicos, tales como las am inas y tioles.
Los puntos cuánticos son nanopartículas fluorescentes con tamaños de 1-1 nm, que
contienen un núcleo de cientos de miles de átomos de los elementos del grupo 11 y VI por
ejemplo, el Cadmio, el Teluro, el Zinc y Selenio)
y
grupo 111 por ejemplo, Tántalo)
y
elementos del grupo V por ejemplo, Indio). Los puntos cuánticos pertenecen a una nueva
clase de marcadores biológicos luminescentes, que superan las limitaciones de los marcadores
orgánicos convencionales. La longitud de onda de la fluorescencia color) depende del tamañ o
de la nanopartícula. Además, los puntos cuánticos de semiconductores son extremadamente
estables y pueden estar expuestos a ciclos de excitación y fluorescencia durante varias horas
sin pérdida de su eficiencia.
Algunas de sus más importantes características son: anchos específicos de excitación y
estrechos espectros de emisión, resistencia a degradación metabólica, altos coeficientes de
extinción y habilidad para ser conjugados con biomoléculas. Recientemente, los puntos
cuánticos de semiconductores están siendo utilizados en estudios biológicos para producir
imágenes luminescentes de células o reacciones bioquimicas. por ejemplo, la reacción
antígeno-anticuerpo para el estudio de cánceres. Estas imágenes se producen de células
biológicas bajo iluminación con luz ultravioleta
UV) o visible y se pueden observar a través
del microscopio óptico ver Figura 1.1).
Las nanopartículas supermagn éticas contienen un núcleo de metal por ejemplo, hierro,
cobalto o níquel), que es magnéticamente activo, y se utilizan como agentes de realce de
contraste para mejorar la sensibilidad de la Resonancia Magnética. Cuando las partículas
magnéticas están cubiertas con una capa exterior orgánica, también pued en ser conjugadas co n
las biomoléculas y se utilizan para suministrar los fármacos en el tratamiento del cáncer. Los
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materiales magnéticos basados en Óxido de Hierro han sido ampliamente utilizados en la
práctica clínica como agentes de resonancia magnética
y
en los estudios de expresión génica,
las imágenes de la angiogénesis,
y
el tráfico celular.
Nanopartículas metálicas, en combinación con moléculas fluorescentes activas pueden
ser utilizadas para obtener im ágenes mediante la resonancia m agnética.
1 1 4 magen tumoral in
vivo
En la actualidad, las nanopartículas magnéticas están llamando la atención d ebido a si1
uso potencial como agentes de contraste para resonancia m agnética. Las venta-jas clave d e las
nanopartículas magnéticas son: baja toxicidad, biocompatibilidad
y
elevado nivel de
acumulación en el tejido objetivo. Aunque las partículas de metal como cobalto y níquel se
han propuesto, las nanopartículas magn éticas que contiene un núcleo de óxido de hierro se han
utilizado con más frecuencia.
Las nanopartículas supermagnéticas 3-1 nm) han sido desarrolladas como agentes de
contraste para resonancia magnética y utilizadas en el diagnóstico clínico como un contraste
negativo por sus efectos en la reducción de la señal en una imagen ponderada en
T2
tiempo
de relajación transversal). Nanopartículas basadas en Bismuto han mejorado en los agentes de
contraste utilizado para la tomografia computarizada, se utiliza un recubrimiento externo de
polímero para proteger de la degradación a las partículas y por lo tanto evitar los efectos
citotóxicos del bismuto. Estas nanopartículas mostraron largo tiempo de circulación en vivo
es decir, más de 2 h)
[32].
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¡¡fa
igura
1.1
A) Señales de fluorescencia roja-naranja muestran un tiimor de próstata en ratones vivos en la
imagen superpuesta izquierda) y un punto cuántico sin mezclar a la derecha). B) Aproximadamente
2
millones de puntos cuanticos de luz verde, amarillo o rojo derecho) fueron inyectados por vía subcutánea en tres
localidades adyacentes en el ratón y visualizadas con una lámpara de excitación de tungsteno o mercurio de a la
izquierda) [32].
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Objetivos
2 1 Objetivo General
Síntesis de nanopartículas semiconductoras del gurpo 111-V
y
proponer un método para
bioconjugarlas potenciando su uso com o marcador biológico de cáncer.
2 2 Objetivos specíficos
.
Realizar síntesis de nanopartículas metálicas de Au y su caracterización.
2.-
Realizar síntesis de nanopartículas semiconductoras de InP
3.- Proponer un método para bioconjugar nanopartículas semiconductoras de InP con el
5 -
tiol-modyfied aptamer para su potencial uso como marcador biológico de cáncer.
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lanteamiento del problema
Las actuales dem andas, en el área d e biología y medicina, para obtener informac ión específica
dentro de mezclas biológicas complejas e in vivo es decir, en el paciente), ha conducido a
científicos a desarrollar biomateriales de identificación fluorescente con mejores propiedades
de sensibilidad, selectividad, estabilidad, operatividad y biocompatibilidad, manteniendo un
alto rendimiento d e procesamiento. A unque las nanopartículas semiconductoras del grupo III-
V son ideales para este gran desafío, su utilización está restringida por la falta de propied ades
superficiales adecuadas que les permita conjugarse con ligandos bioafines como anticuerpos
monoclonales, péptidos, enzimas, ácido nucléico o pequeñas moléculas inhibidoras) formando
híbridos inorgánico-orgánico.
A
pesar de los recientes progresos, todavía queda mucho trabajo
por hacer para lograr la funcionalización superficial específica de nanopartículas
semiconductoras.
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Justificación de la nvestigación
El objetivo principal de la nanobiónica es la búsqueda de la mimetización de sistemas
biológicos para la construcción de nanodispositivos que mejoren la calidad de vida. El interés
por desarrollar esta nueva tecnología, está impulsando la creación y explotación de
biomateriales a escala nanométrica con propiedades diferentes hasta las hoy conocidas. Uno
de estos biomateriales son las llamadas nanopartículas biofuncionalizadas NPB). Com o
resultado de este trabajo s e pretende obtener nano partículas biofuncionalizadas, destinadas a la
detección de cáncer de mam a.
Por otro lado las actuales demandas de imagen biológica en las áreas de investigación
biología) y medicina hospitales) ha inducido el desarrollo de mejores y menos costosas
técnicas de pruebas biomoleculares y agentes de contraste con una mayor sensibilidad,
selectividad, estabilidad, biocompatibilidad
y sobre todo que no presenten problemas de
interferencia cuando se desea la detección
in vivo.
Aunque ya se han realizado diferentes
aproximaciones de desarrollos en esta línea, los biomateriales compuestos de nanocristales
semiconductores del grupo 111-V biofuncionalizados representan una alternativa para resolver
esté desafío. Con el control de las propiedades ópticas y de biofuncionalización de las NPB se
desarrollará tecnología de marcadores biológicos fluorescentes en la región del infrarrojo
cercano para su aplicación en el área biomédica, como son el estudio de procesos
intracelulares a nivel de moléculas individuales
y
para observaciones por tiem pos prolongados
in vivo
de eventos de tráfico celular. En medicina. en la detección de tumores tempranos
como el cáncer de mama) y para el desarrollo de nuevos métodos de diagnóstico que
permitan en un fututo próximo el diseño de nuevos tratamientos terapéuticos en personas.
Todo lo anterior tendrá un impacto científico y sobre todo social, tanto por lo que hace
referencia a la ciencia básica como por su gran variedad de aplicaciones tecnológicas.
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Marco Teórico
5 1 T é c n i c a s d e c r e c i m i e n t o d e n a n o p a r t í c u la s m e t á l i ca s
Recientes avanc es en la química coloidal han generado nuevo s procesos sintéticos para obtene r
agrupaciones de átomos y10 moléculas a escala nanométrica. Por ejemplo, partículas metálicas
son obtenidas a partir de la reducción d e iones metálicos en presencia d e diferentes solventes y
materiales orgánicos ligantes, surfactantes o polímeros) que han permitido restringir su
crecimiento en la escala nanométrica. Pero, el control del tamaño, forma, homogeneidad,
composición y estructura cristalina de tales nanoestructuras sigue siendo una de las principales
metas de la investigación para el actual desarrollo de la nanotecnología.
A continuación se describen los métodos experimentales utilizados para obtener
nanopartículas de oro Au) en estado coloidal sin la presencia d e algún tipo de estabilizador
orgánico. Se describen brevemente las técnicas de caracterización utilizadas para tales
nanoestructuras. Para la preparación de nanoestructuras de oro se utilizó el proceso ya
establecido de reducción química utilizando al citrato de
sodio como agente reductor y
estabilizador.
5 2 Métodos
y
Condiciones Experimen tales de Preparación
5 2 1
Dispersiones Coloidales de Nanopartículas de oro
En general, se pueden seguir dos rutas para obtener nanopartículas metálicas de oro,
como se muestra en la Figura 5 1
a) métodos físicos
b)
métodos químicos
Los métodos físicos, tales como espurreo catódico, evaporación térmica, trituración mecánica
y ablación láser involucran la subdivisión del oro en bulto hasta la escala nanométrica
[33]
Aun que esto s métodos son utilizados para preparar diferentes tipos de nanopartículas, tienen la
desventaja de ser poco efectivos para el control del tamaño, forma, homogeneidad, estructura
y composición.
En contraste, los métodos químicos como la reducción química, reducción fotolítica y
reducción radiolítica, juegan un m ejor papel en la síntesis de las nanoestructuras metálicas de
oro con propiedades específicas. Además, su versatilidad y sencillez para controlar el tamañ o,
forma, homogeneidad, estructura interna y composición por medio de la variación de las
cond iciones experimentales, los hacen interesantes para este trabajo de investigación.
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Para preparar los precursores atómicos que son subsecuentemente ag regados a tamaños
nanométricos, comúnmente se usan soluciones de iones de oro los cuales son reducidos
empleando diferentes agentes reductores para reducir los iones a átomos en estado metálico.
Michael Faraday fue el primero en dar a conocer este método químico de preparación.
Figrira 5 1 Ilustración esquemática de los inétodos de pieparacióri de partículas metálicas de tama ño
nanométrico.
La reducción de los iones de las correspondientes sales metálicas en átomos con
valencia cero es un método práctico para sintetizar nanopartículas de oro en un líquido base.
La reducción de iones metálicos por agentes reductores
en
sistemas coloidales, es un de los
mejores métodos para la preparación de nanopartículas de oro. El método de Turkevich ha
sido ya un procedimiento estándar para preparar nanopartículas de oro en agua. Este método
involucra a) la reducción de los iones a átom os metálicos con citrato de sodio, b) la
formación de núcleos, y b) un posterior proceso de crecimiento como se muestra en la Figura
5.2.
Ión itrato de
Metálico Sodio
,
Átomos on
valcncili cero
C?
e
$
úcleo
Creclrnlento
*
Nanopartícula
M e a c a
Figura
5
2
Ilustración esquemática del proceso de sintesis de nanopartículas metálicas dc oro.
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5 3 Nucleación y Crecimiento
La formación de núcleos y el sucesivo crecimiento, son dos procesos independientes en
que se basa la síntesis de las partículas nanométricas
y
son los principales responsables de los
cambios en parámetros como estructura, forma, tamaño, homogeneidad, composición y
consecuentemente en las propiedades ópticas, térmicas, electrónicas y catalíticas de tales
nanoestructuras. Las velocidades de nucleación
y
crecimiento son determinadas básicamente
por las probab ilidades d e colisiones entre:
La primera clase es la responsable del proceso de nucleación y las dos últimas del
proceso de crecimiento. Cuando la velocidad de reducción es tan alta que casi todos los iones
son reducidos antes de la formación de los núcleos, y las probabilidades de colisiones entre
átomo-átomo son mayores que las otras dos, el tamaño de las partículas resultantes es
monodisperso y determinado por el número de núcleos formados al inicio de la reacción. Así,
todos los parám etros de reacción temperatura, tiempo, concentración de los reactantes, orden
en la cual los reactantes son adicionados a la solución, impurezas, por citar solo algunas) que
promuevan la creación de un gran número de núcleos y que reduzcan la velocidad de
crecimiento, facilitarán la formación de partículas coloidales de oro monodispersas y d e
tamaño nanométrico. Por ejemplo, sistemas reductores con alta afinidad a los iones metálicos
son efectivos para increm entar la velocidad de nucleación. En camb io, sistemas reductores con
baja afinidad hacia los iones metálicos, son ideales para dism inuir la velocidad de crecim iento.
Habitualmente, para que las partículas finales tengan tamaños pequeños y características
uniformes, de be satisfacerse la siguiente condición general: la nucleación y crecim iento deben
ser procesos comp letamente separa dos en el tiempo.
Las ventajas del método de reducción química son:
Es reproducible.
Las partículas obtenidas son nanométricas y homogéneas.
La estructura, tamaño y forma de las particulas pueden ser controladas variando
simplemente las condiciones experimentales de preparación, tales como: el tipo y
concentración d e reductor, contenid o de los iones metálicos, temperatura, y agitación.
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Las dispersiones coloidales son estables por meses y presentan extraordinarias
propiedades para diversas aplicaciones.
Se pueden preparar partículas monometálicas
y
bimetálicas.
5 4
stabilidad de nan opartículas
La estabilidad de un sistema coloidal de nanopartículas puede darse por dos tipos Figura 5.3 :
Estabilidad estérica. Esta ocurre mediante la absorción de moléculas de cadena larga
en la superfic ie de la partícula ejem plo polím eros), la cual dificulta la floculación por
aumento de estabilidad.
Estabilidad por carga o electrostática. Este tipo de estabilidad ocurre cuando por
absorción de cargas iones) en la superficie de la partícula, la estabilidad d e un sistema
puede ser alterada, tan solo modificando la concentración de sales disueltas o variando
el
pH de la solución.
2 * 1
9r
d
t
a
: . r o
g
stabilidad estérica stabilidad electroestática
Figiira
5 3 Ilustración esquemática de los tipos de estabilización.
5 5 Síntesis nanopartículas semiconductoras
Las síntesis de nanopartículas de InAs e InP son análogas. Todos los pasos de la
reacción y la manipulación de los reactivos se llevan a cabo bajo atmósfera controlada de gas
Argón o en una caja seca. Los nanocristales producidos son cristalinos y altamente solubles en
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una variedad d e disolventes orgánicos. com o hexano, tolueno y piridina. Las partículas tienen
diámetros que van de 2-1 nm., con estrechas distribuciones de tamaño. Las superficies de los
nanocristales pueden ser modificadas con una variedad de ligandos incluyendo las aminas,
tioles y fosfinas
[35]
La aplicación más prometedora de los nanocristales semiconductores coloidales
(quantum dots o q-dots) es com o emisores en el etiquetado biomédico.
Quantum dots de Cd-Se (Cadmio-Selenio) han sido desarrollados para tales usos. Sin
embargo, CdSe es restringido en el medio ambiente y tiene poco futuro en la industria. Entre
todos los semiconductores 11-VI y 111-V, el Fosfuro de Indio es probablemente el único que
puede ofrecer un compatible, o incluso más amp lio, rango de emisión d e color similar al d e los
quantum dots de CdSe, pero sin toxicidad intrínseca ya que el InP no tiene ni lo s elementos d e
clase A (Cd y Hg), ni los elementos d e clase B (A s y Se). Los problemas respecto a la calidad
de quantum dots de InP incluyen la baja eficiencia de emisión, mal control en la distribución
del tamaño, ba-ja estabilidad. Además, el procedimiento de síntesis para quantum dots de InP
es más com plicado que el de los nanocristales de CdS e.
Los esquemas existentes para la síntesis de quantum dots de InP y de otros del grupo
111-V son comple.jos y no flexibles. Dicha complejidad podría jugar un papel clave en la
determinación de las propiedades deficientes de los quantum dots de InP. En esquemas típicos
de síntesis de quantum dots de InP, la mezcla de reacción de be ser bombeada al vacío durante
varias horas.
La reacción también necesitaría varios días, o los quantum d ots resultantes tendrían un
rango de tamaño limitado. Cuando los ácidos grasos fueron usados como ligandos, la longitud
de la cadena y la concentración de ligandos de ácidos grasos fueron limitadas en un rango
estrecho, y generalmente la temperatura de la reacción necesitaba ser mayor a
250 .
Si la síntesis pudiera llevarse a una temperatura inferior, se podría realizar la síntesis
sin este proceso de desgasificación tan tedioso. La síntesis usando una temperatura menor de
reacción resulta bastante favorable desde un punto de vista operativo y también es más
eficiente en el uso de la energía. Para hacer que el carboxilo de Indio reaccione lo suficiente
para la formación de Fosfuro de Indio. son necesarios los reactivos de activación. Aminas
grasas han sido utilizadas como reactivos comunes de activación y ligando para me-jorar
propiedades de emisión de quantum dots del grupo 11-VI. Por otra parte, las aminas serían
necesarias para el crecimiento eficiente de la coraza de
ZnS en la superficie del InP. Sin
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embargo sólo las aminas grasas con una cadena pueden ser utilizadas debida a la baja
temperatura requerida. Las amin as grasas se han introdu cido junto con P(TMS)3 para suprim ir
aún más la formación de In203 .
5 6
nticuerpos
Los anticuerpos o inmunoglobulinas (Ig) son un tipo de proteínas denominadas
glicoproteínas. Funcionan como la parte específica del denominado complejo receptor de
células B (BCR) reconociendo al antígeno a nivel de la membrana del linfocito B, y como
moléculas circulantes secretadas por las células plasmáticas procedentes de la activación,
proliferación y diferenciación de células B.
Estructuralmente están formados por dos cadenas polipeptídicas pesadas H (del
término anglosajón Heavy , pesado) y dos cadenas ligeras
L
(del tén nin o anglosajón Light ,
ligero) unidas entre sí mediante enlaces covalentes (ver Figura 5.4). Las cadenas ligeras
consisten en una región variable (VL ) y una constante (CL ) mientras que las pesadas presentan
una región variable (VH)
y
tres constantes (CHl, CH2, CH3). Funcionalmente podemos
distinguir dos porciones en los anticuerpos: una de ellas implicada en el reconocimiento y
unión al antígeno denominada región Fab (por sus siglas en inglés antigen binding Fragrnent)
y otra implicada en las funciones de los anticuerpos y en su vida media en sangre, llamada
región Fc (por sus sig las en inglés crystallizable Fragrnent).
Figura 5 4 Estructura de un anticuerpo
Existen cinco clases diferentes de anticuerpos, que se diferencian entre sí por una serie de
cam bios estructurales qu e les confieren diferentes funciones en el organismo.
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5 6 1 Mecanismo de acción de los nticuerpos
La principal función biológica de los anticuerpos es unirse a cualquier sustancia
extraña o antígeno, que haya entrado al organismo, con el fin de facilitar su eliminación. Las
regiones de un antígeno que son reconocidas específicamente por los anticuerpos se
denominan determinantes antigénicos o epítopos. Un antígeno puede presentar diferentes
epítopos y por tanto provocará la producción de una amplia gama de anticuerpos por parte de
diferentes linfocitos B.
Las regiones concretas donde s e produce el reconocimiento por parte de un anticuerpo
hacia un epítopo concreto, se llaman regiones CDR Complem entary Determining Regions).
Hay tres regiones CDR regiones determinantes de complem entariedad o hipervariables)
denominadas CDRI, CDR2 y CDR3 y se localizan todas ellas en las regiones o dominios
variables de cada cadena ligera y pesada) del anticuerpo. Figura 5.4
Las regiones CDR confieren a las inrnunoglobulinas una enorme especificidad y diversidad.
Figura 5 5 Regiones CDR de u anticuerpo responsables del reconociniieiito de antigenos
Los anticuerpos realizan una doble función dentro de la respuesta inmune del
organismo cuanto lo invade un agente externo. Por un lado, se unen específicamente a una
amplia variedad de antígenos y, por otro lado, se unen a un número limitado de moléculas y
células efectoras del Sistema Inmune.
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. .
c:
>< .
.
Figiira 5 6
Etapas del proceso de eliminación de agentes extraños.
En el mecanismo de eliminación de agentes extraños al organismo, los anticuerpos
tienen como función el reconocimiento específico de los antígenos ver Figura 5 3 ,
provoca ndo la respuesta inmun e etapa 3 , y el reclutamiento d e diferentes células y m oléculas
del organismo que serán capaces de destruir y eliminar al antígeno etapa 4 . Un solo antígeno
puede presentar diferentes epítopos en su superficie, es decir, puede estimular la producción
de diferentes anticuerpos, cada uno de los cuales es específico para un epítopo concreto. Una
sustancia extraña que contenga diferentes epítopos al entrar en el organismo provocará la
producción de anticuerpos procedentes de diferentes clones de linfocitos
B.
Este tipo de
anticuerpos con diferente capacidad de reconocer y unirse al antígeno se denominan
anticuerpos policlonales. Mientras que los anticuerpos monoclonales son específicos para un
solo epítopo y están producidos por un único clon celular. Gracias a los avances que han
experimentado disciplinas como la Proteómica y la Genómica, ha sido posible identificar y
caracterizar nuevas moléculas que desempeñan fiinciones importantes en el desarrollo de
ciertas enfermedades autoinmunes, víricas e incluso el cáncer. Las características de los
anticuerpos monoclonales hacen d e ellos unos agentes terapéuticos potentes y prometedores.
5.6.2
Anticuerpos Monoclonales
Hasta el desarrollo de los anticuerpos monoclonales en el año
1975,
el uso de los
anticuerpos en diagnóstico y10 terapia se centraba únicamente en la utilización de sueros
inmunes convencionales. Estos sueros son obtenidos a partir de distintas especies animales y
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contienen, entre otros much os compuestos, una mezcla de anticuerpos producidos por distintos
clones d e linfocitos
B,
por lo que se denominan anticuerpos policlonales. Estos anticuerpos
reconocen en mayor o menor medida el antígeno pero con distinta especificidad y afinidad
cada uno de ellos. En cambio, los anticuerpos específicos para un solo epitopo y producidos
por un único linfocito B y su s clones, se denominan anticuerpos monoclonales.
Un anticuerpo monoclonal es aquel que reconoce específicamente una parte del
antígeno, es decir un epítopo concreto, y que es producido por un clon de linfocitos
B.
Por las propiedades que poseen los anticuerpos, han sido empleados en terapia desde
que la FD en 1986 aprobó el primer anticuerpo mon oclonal para el tratamiento del rechazo
del transplante de riñón. Los anticuerpos monoclonales, por tanto, son empleados en terapia
para el tratamiento de diversas enfermedades formando la familia de fármacos denominados
anticuerpos monoclonales terapéuticos. Debido a la especificidad de unión que poseen los
anticuerpos, son em pleados en la localización y eliminación de patógenos infecciosos como el
virus respiratorio sincitial VR S). Tam bién se utilizan como terapia en la detección de células
concretas del organismo como por ejemplo células tumorales, incluso en la inhibición de
procesos inflamatorios.
5 7 ptámero
Los aptámeros son macromoléculas de ácidos oligonucleótidos o moléculas péptido,
que se unen a moléculas dianas específicas. Los aptám eros normalmente se crean mediante la
selección aleatoria de
15
a
7
nucleótidos de longitud, pero también existen aptámeros
naturales en riboswitches. Los aptámeros pueden ser utilizados tanto en la investigación básica
y clínica con fines como los medicamentos macromoleculares. También se pueden combinar
con ribozimas a hendirse a si mismo en presencia de su molécula objetivo. Estas moléculas
compuestas tienen una investigación adicional, industrial y aplicaciones clínicas.
Los aptám eros pueden ser clasificados como:
a) Aptáme ro ADN o ARN Se componen de líneas generalmente cortas d e oligonucleótidos.
b) Aptámero péptido Se componen de un dominio péptido variable corto, que se adjunta en
amb os extremos a una proteína de andamiaje.
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Los péptidos s e diferencian de las proteínas en que son más pequeños tienen menos de
diez mil o doce m il Daltons)
y
que las proteínas pueden estar formadas por la unión de varios
polipéptidos
y
a veces grupos prostéticos. Un ejemplo de polipéptido es la insulina, compuesta
de
55
aminoácidos y conocida como una hormona de acuerdo a la función que tiene en el
organismo d e los seres humanos.
Una de las propiedades de aptámeros ARN es la capacidad de formar estructuras
complejas. Mediante la fornlación única
y
de estructuras secundarias que confiere alto grado
de especificidad de su molécula objetivo. Ellos son capaces de detectar cambios estructurales
muy pequeños en su molécula objetivo, tales como la presencia o ausencia de metilo o un
grupo hidroxilo. La selección de aptámeros es un proceso in Vitro llamado Evolución
Sistemática de Ligandos por Enriquecimiento Exponencial SELEX por sus siglas en inglés).
Aptámeros de
ARN
pueden ser generados para cualquier objetivo de proteínas, debido a esto,
el
procedimiento SELEX no depende de un sistema in vivo
y
muchas complicaciones con el
sistema animal pueden ser resueltas.
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Desarrollo Experimental
6 1 Preparación d e dispersiones coloidales de nanopartículas de oro a diferentes razones
molares
La síntesis de las dispersiones coloidales de nanopartículas de oro fueron preparadas por el
método de reducción química utilizando al citrato de sodio com o sistema reductor el cual ha
mostrado ser un método d e bajo costo puesto qu e no necesita de equipos de alto vacío o de
algún otro a ditamento sofisticado.
El arreglo experimental de la síntesis de nanopartículas de Au como s e muestra en la
Figura 6.1 consta de una pa nilla de calentamiento la cual posee un regulador q ue controla la
velocidad de agitación y la temperatur a en el reactor. En un extremo se suspende un
termómetro que mide la temperatura alcanzada en el sistema de reacción. Un matraz de bola
con tres bocas es utilizado como reactor. En un extremo es colocado un termómetro que mide
la temperatura de la reacción. El otro extremo es utilizado para introducir la solución
reductora y finalmente en el centro del matraz se coloca un sistema refrigerante necesario
para el proceso de reflujo. Los componentes del reactor siempre fueron limpiados tenazmente
antes de ser usados.
Figura
6.1
Arreglo experimental de la síntesis de nanopartículas d e oro
7
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Utilizando este arreglo experimental se prepararon las dispersiones coloidales de
nanopartículas de oro a diferentes razones en número de moles de [CS]
/
[HA uCI4] sin la
presencia de algú n agente estabilizador.
Las propiedades físicas y10 q uímica s de los reactivos utilizados en la preparación de las
nanopartículas de oro se resumen en la Tabla
6.1
o cloroá
Citrato
de
sodio
Alfa Aes
dilipore
2
Agui
Tab l a 6 1 Propiedades físicas de los diferentes reactivos utilizados para síntesis de N ii
Para llevar a cabo la síntesis de dispersiones coloidales de nanopartículas de A u se
utilizó el método de reducción química. Para tal efecto, se preparó una solución precursora de
ácido cloroáurico (0.033 mmol HAuC14 en 300 m1 de agua) disolviendo los cristales de
HAuC14 en agua. La solución iónica, inicialmente presentó un color am arillo, como se mu estra
en la Figura 6.2 (a). 50 m1 de solución precursora fueron puestos a reflujo a 100 C y en
agitación sobre una parrilla de calentam iento como se muestra en la Figura 6 1 Entonces
2
m1
de una so lución de CS a diferentes concentraciones fu e adicionada y puesta en reflujo por h.
Inmediatamente al inicio de la reacción, la solución se torno incolora solo por algunos
instantes. En aproximadamente 10 seg. la coloración de la solución cambio a azul y luego a
color púrpura indicando la formación de los núcleos de oro. En unos pocos minutos la
solución presentó un color rojo-rubí característico de dispersiones coloidales de partículas de
Au de tamaño nanométrico [34]. La terminación de la reacción toma unos minutos o decenas
de minutos dependiendo de la concentración del CS utilizado. Estas características de cambio
de color fueron observadas para razones molare s de [CS] [HAuC14] en el intervalo de 0.25 a
2.25 y se presentan en la Figura 6 2 Estos resultados son consistentes con los obtenidos por
1.2.3.4
otros autores Para may ores valores de razones mo lares no se observó la presencia del
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color azul
y
púrpura durante la formación de las nanoestructuras. Para determinar las
cantidades de reactivos en gramos realizamos los siguientes cálculos:
Para determinar la cantidad de C itrato de sodio necesario utilizamos la siguiente fórmula:
peso
=
peso molecular
Donde:
n= número de moles= 3) 0.033 mmol)= 0.099 mmol
y
el peso m olecular del Citrato de Sodio es: 258.0 1795
Por lo tanto el peso de C itrato de Sodio es:
peso= n*peso molecular
peso= 0.099) 258.0 1795)= 25.549 mg
m .
d. .
a
al
Natzrre 1 9 7 3 2 4 / 2 0 .
J. Phys Chem 1985 89 1074.
4
J. Colloid Interface Sci 1994 16 5 97.
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Figura 6 2 Imágenes de diferentes tiempos de reacción de dispersiones coloidales de nanopartículas de oro a una
razón molar de [CS] [HAuC14]
2.25
: a) solución de HAuCI?, b) O segundos inicio de la reacción), c) 3 seg,
cc) 9 seg. formación de núcleos de oro),
d) 12 seg,
15
seg. proces o de coarsening)
y e) 20
minutos formación
de nanopartículas de oro).
Para estudiar el efecto de la razón molar [CS ] [HA uCI4] en las propiedades de las
dispersiones coloidales de nanopartículas de oro, se prepararon diferentes soluciones
coloidales de Au, ver Tabla 6.2, manteniendo siempre constante el contenido de iones
metálicos. Las soluciones resultantes fueron entonces puestas a reflujo a 100 O por h con la
razón de concentración de CS correspondiente. Las dispersiones coloidales así obtenidas son
homogéneas y estables por meses. Para una razón de [HAuCId]
1
[CS] 110.25 no se presenta
la formación de nanoestructuras de Au. En la Figura 6.3 se presentan las imágenes de las
correspondientes dispersiones coloidales de Au. S e puede observar claramente la variación d e
color violeta+ rojo rubi+azulado) con el aum ento del conten ido del CS utilizado en la
reacción. Esta variación del color es indicativa de la formación de nanopartículas con
diferentes tamafios 1361.
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, ,
La formación y estabilidad a la aglomeración de las partículas coloidales es mostrada como
estable) o inestable).
2 31
7
[HAuCl,]
[Citrato
de Sodio]
-
-
Tnninfio tle
P:irticula
i abla
6.2 Estabilidad y razón molar de las diferentes síntesis realizadas.
Figura
6 3
Dispersiones coloidales de oro a obtenidas con diferente razones molares d e [HAuC14]/[CS].
6.2 Prepara ción de dispersiones coloidales de nanopartículas semicond uctoras InP,
I I I
V)
La síntesis de nano cristales semicondu ctores se realizó en las instalaciones del laboratorio de
Ingeniería Ambiental perteneciente a la Benemérita Universidad Autónoma de Puebla. Se
utilizó una caja de guantes para poner tener una atmósfera controlada inerte), mediante gas
Argón. Tam bién fue necesaria una bom ba de vacío para realizar el intercambio y control de la
atmósfera dentro de la caja de guantes ver Figura 6.4).
El esquema de síntesis utilizado está basado en el presentado por Liang Li y Peter
Reiss
[ 3 7 ] Dicho esquema fue desarrollado para quantum dots de InP a temperaturas
relativamente bajas y es muy similar a los desarrollados para nanocristales de Cd-Se,
incluyendo el disolvente, ligandos, los precursores, y la, no necesaria, desgasificación a fondo.
La posición del pico d e absorción del inP podría estar continuamente entre 390 y 7 2 0 nm bajo
este régimen de síntesis. El rango de tamaño accesible de una reacción fue sintonizado con
facilidad por la concentración de las aminas, la concentración y la longitud d e la cadena de los
ácidos grasos uti l izados para disolver I~ I A C ) ~Acetato de Indio), y la temperatura d e reacción
por debajo de
200 C).
Las propiedades físicas y10 químicas de los reactivos utilizados en la
preparación de las nanopartículas de InP, se resume n en la Tabla 6 2
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Acetato de Indio
-
Ácid
sigma
Aldrich
225 37
Sigma-
Aldrich
ico
Aldrich
Aldrich
1-dodecanoiol
-0ctadecenc
stearato de
zinc H ? C H ~ ) I ~ C O O I ? ~
abla 6.3 Propiedades físicas de lo s diferentes reactivos utilizados
para
síntesis de
NInP
97
90
9
Sigrna-
Sigma-
Aldrich
Riedel de
Haen
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F i g u ra
6 4
a Instalaciones del Laboratorio de Ingeniería Ambiental BUA P. b Instalación de alimentación de
Argón.
c
Caja de Guantes. d Bomba de Vacío.
F igura
6 5
Izquierda: lavado de material. D erecha: material limpio.
3
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Se lavó el material
y
se limpió el equipo necesario espátula, 2 vasos de precipitados de
20 ml, reactor, enfriador, balanza, soporte universal, pinzas de sujeción, parrilla de
calentamiento, termómetro, matraz con tapón, probeta graduada de 20 ml., vaso de
precipitados de 100ml) ver Figura 6.5. A continuación se colocó este material, así como los
reactivos, dentro d e la cámara lateral de la caja de g uantes; posteriormente se eliminó el aíre
atmosférico de la cámara mediante la bomba de vacío, para eliminar cualquier impureza que
pudiera afectar la reacción; una vez realizado lo anterior, se procede a llenar la cámara con gas
Argón, para homogeneizar la atmósfera con la caja de guantes
y
poder pasar los materiales y
reactivos a la misma. Esta operación se realizó tantas veces fue necesario, debido al tamaño d e
la cámara lateral, que no permite introducir todos lo necesario en un solo paso. Figura 6.6.
Figura 6 6 Colocación del material en la cámara lateral de la caja de guantes.
Una vez teniendo el material, el equipo y los reactivos dentro de la caja de guantes, se
inició con la mezcla de reactivos, para lo cual se pesaron los reactivos necesarios para la
síntesis del precursor: Mirista to de Indio.
6.2.1
Preparación de Miristato de Indio III M A )~
2 mmol de acetato de Indio fueron mezclados ba-jo una atmósfera inerte con mmol d e
ácido mirístico MA ) y 20 m1 de ODE 1-octadeceno) en un matraz de 2 cuellos de 50 m1
equipado con un condensador. La mezcla fu e calentada a 100- 120°C y puesta a reflujo por una
hora al vacío para obtener una solución ópticamente clara; posteriormente el vacio se llenó con
Argón siendo enfriado a tem peratura ambiente. Figura 6.7.
Para determinar la cantidad en gramos de los reactivos se procedió de l siguiente
forma para calcularla, utilizando para ello los pesos moleculares referidos en la tabla 6.2.
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Para determinar la cantidad en gram os de Acetato de Indio:
1mmol AcIn 291.95 mg
2 mmol AcIn
X1
X I (2 mmol)( 291.95 mg)/(l mmol) 0.5839mg
Para determinar la cantidad en gram os de ácido mirístico:
mmol MA 228.37 mg
5 mmol AcIn X2
X2= 5 mmo l)( 228.37 m /(
l
mmol) 1.1438mg
igiira 6 7 a) Pesando los reactivos; b) Colocación del ácid o mirístico y el -0ctadeceno en l reactor; c) Síntesis
del precursor; d) Aplicación d e vacío a la cámara d e guantes
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6 2 2
Síntesis
de
nanocristales de
InP
Para la síntesis se requirieron 0.1 mmol de miristato de Indio, preparado a partir de
acetato de indio y ácido mirístico
MA),
0.1 mm ol de estearato de zinc, 0.1 mmol de
dodecanotiol DDT ), 0.1 mmo l de
tris trimetilsi1il)fosfina
P TMS)3
y
8 ml de 1-octadeceno
mezclados bajo una atmósfera inerte en un matraz de 2 bocas equipado con un condensador.
La mezcla fue calentada a una temperatura entre 230°C-300°C. La temperatura se mantu vo
durante un tiempo determinado 5 min 2 hrs) para hacer crecer los nanocristales de InP con
coraza de ZnS. Durante el incremento de temperatura, se observó un cambio de color de
incoloro a verde a 60-80°C, indicando que P TM S)3 comenzó a reaccionar con el precursor de
Indio. Para aislar los nanocristales, la mezcla de la reacción fue enfriada hasta temperatura
ambiente, y un volumen equivalente de una mezcla de cloroformo/metanol 1 : vol:vol) así
como 10 equivalentes de etanol fueron añadidos; posteriormente se centrifugó a 14000 rpm,
colocando la solución en cinco vieles se colocó uno extra con agua para com pensar al
mom ento de centrifugar). Una vez centrifugadas las nanopartículas, se decantó la solución. Se
agregaron 2 m1 de etanol por viel; se trataron en el limpiador ultrasónico para disolver las
partículas en el etanol
y
se volvió a centrifugar. Este proceso se realizó por tres ocasiones, de
manera que se fueron limpiando las muestras. El precipitado resultante fácilmente podría estar
disperso en diferentes disolventes orgánicos, incluido el hexano, tolueno o cloroformo. Figura
6.8.
Figura 6 8
Nanopartículas después del proceso de centrifugado
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6.3 Biofuncion alización de nanop artículas semicond uctoras InP, 111-V)
Después de realizar la lectura detallada de artículos sobre biofuncionalización y
bioconjugación de quantum dots para realizar marcadores biológicos, se compararon las
ventajas
y
desventajas del uso de anticuerpos
y
de aptámeros. Optamos por plantear el
siguiente procedim iento para biofuncionalizar las nanopartículas semicondu ctoras:
Las sondas de nanopartículas de InP fueron sintetizadas por la derivación de 5ml de
solución de etanol de nanopartículas semiconductoras de InP con 2.5 OD de alcanotiol-
oligonucleótido (la concentración final del oligonucleótido es 3.6pM, disuelto en agua), la
mezcla heterogénea se pone a reflujo durante 15 minutos, posteriormente se deja en reposo y
una vez que las fases sean separables y se retiran las moléculas hirofílicas (Nanopartículas
InP-aptámeros). Después de reposar durante 16 horas, la solución es puesta a 0.1 M d e NaC1,
buffer d e 1OmM de fosfato (pH=7)
y
se deja reposar durante 40 h, seguida de centrifugación
por lo menos unos
25
minutos a 14000 revoluciones por minuto para remover el exceso de
reactivos. Despu és de retirar el supernatante, el precipitado rojo aceitoso es lavado con 5 m1 d e
una so lución d e stock de 0.1 M d e NaCl
y
10 mmol buffer fosfato se ce ntrih ga
y
se decanta; se
le agrega 5 m1 de una solución d e 0.3 M de NaCl
y
10 mmol d e buffer fosfato (pH=7), 0.01
solución ácida.
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Resultados
7.1 Nanopartículas coloidales de oro.
Los espectro de absorción en la región UV-Vis de la soluciones de sal metálica de
HAuCI4 en H 2 0 es presentada en la Figura
7.1.
La presencia de los iones de oro es revelada
por el pico de alrededor 216 nm. Con la adición del sistema reductor citrato de sodio, el pico
de absorción a 216 nrn decrece y desaparece como consecuencia de la reducción d e los iones
de oro a átomos metálicos. En este periodo, en general la solución se vuelve transparente y
después se torna azulado-violeta-rojo intenso debido a la formación de partículas de oro de
escala nanométrica. El espectro obtenido al final del proceso de crecimiento presenta una
banda característica alrededor de
520
nm dependiendo de la razón
[CS]
[HAuC14]
correspo ndiente a la resonan cia del plasmon superficial RP S) resultado de la oscilación
colectiva de los electrones de conducción del oro en las nanopartículas.
[Citrato] [HAuCI,] 0 25
1 0
Iones de oro
2 16 nm)
Longitud de onda nm)
Figura
7.1
Espectro de absorción en la región UV Vis de la solución de oro con una razón molar
[ SII [HAuCI ]
0.25
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La Figura 7.2 muestra los espec tros de absorción visible de las dispersiones coloidales
de nanopartículas de Au obtenidas a diferentes razones molares de [CS] [HAuC14]. Para
todos los valores de razones de concentración, se observo un solo má ximo de ab sorción. Estas
características, confirma la formación de partículas esféricas de oro de escala nanométrica.
[Citrato] [HAuC14]= 0.5
PS 530 nm
[Citrato] [HAuCIJ
= 0 75
0.50
/ PS 525 nm
i
V
m
.
-
0.25
P
2
-0
d
300 400 500 600 700 800
Longitud de onda nm)
Longitud de onda nm)
Longitud de onda nm)
Longitud de onda
nrn)
[Citrato] / [HAuC14]= 1 0 [Citrato] [HAuCI4]
=
1.3
0.50
RPS 523 nin
/
m
-
0.25
P
3
<
0.50
m
V
m
U
S
4 0.25
3
<
300 400 500 600 700 S00 300 400 500 600 700 800
Longitud de onda m )
Longitud de onda m )
[Citrato] [HAuCI,] = 1.7
[Citrato] / [HAuCI,]
= 2 0
0.50 0.50
/
P S 5 1 8 n 1 n
r
V
m
U
m
.
U
4 0.25
0.25
V
d
D
<
0.00
RPS 524
nm
/
?
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