TÉCNICAS MOLECULARES UTILIZADAS EN
EL DIAGNÓSTICO GENÉTICO I. Mapas de
restricción. Marcadores moleculares: RFLP,
SSLP, VNTR (minisatélites y microsatélites),
SNP. Secuenciación. Hibridación. Obtención
de sondas. Transferencia Northern y
Southern. ADNc. PCR. Microarray.
• FRAGMENTACIÓN DEL ADN
• CLONACIÓN
• AMPLIFICACIÓN DEL ADN
• SECUENCIACIÓN DEL ADN
• HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLÉICOS
TÉCNICAS DE GENÉTICA MOLECULAR
FRAGMENTACIÓN DEL ADN
CLONACIÓN EN PROCARIOTAS
Aislar y multiplicar en tubo de ensayo un
determinado gen o, en general, un trozo de
ADN
CLONACIÓN DEL ADN
ADN donante
Vector recombinante con el inserto 1 o 2
RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS: El plásmido que contiene el gen de la
proteína de interés también contiene un gen de resistencia a un
antibiótico
BACTERIAS “COLOREADAS”: El gen de nuestra proteína se inserta
en el plásmido interrumpiendo al gen de una enzima que produce
color azul
IDENTIFICACIÓN DE LAS BACTERIAS RECOMBINANTES
ELECTROFORESIS
ELECTROFORESIS
ELECTROFORESIS
TIPOS DE GELES
•POLIACRILAMINA: para fragmentos de ADN
menores de 500 nucleótidos
•AGAROSA: para fragmentos de ADN mayores
de 500 nucleótidos
•CAMPO PULSANTE (agarosa): fragmentos
grandes de ADN, incluso cromosomas
completos
MAPAS DE RESTRICCIÓN
MAPAS DE RESTRICCIÓN
PCR: Reacción en cadena de la polimerasa
* Método Químico de Maxam y Gilbert
* Método Enzimático de Sanger
SECUENCIACIÓN DE UN
FRAGMENTO PURIFICADO DE ADN
MÉTODO ENZIMÁTICO DE SANGER
Secuenciador
Automático (+700 nt)
A C G T
Autorradiografía
(300 nt)
ACGT
MÉTODO ENZIMÁTICO DE SANGER
• Síntesis in vitro de ADN en presencia de
nucleótidos trifosfato terminadores de cadena
CROMATOGRAMA DE SECUENCIA
MÉTODO QUÍMICO DE MAXAM Y GILBERT
HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
La hibridación se produce
sólomente entre cadenas
complementarias
HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
SONDA: secuencia conocida de ADN o de
ARN que es complementaria a la secuencia
de interés y que se apareará con ella; se
utiliza para localizar secuencias específicas
de ADN
• Marcaje de fragmentos de ADN:
• sondas altamente marcadas
• sondas marcadas en 5´
• Tipo de marcaje:
• radiactivo: p32
• químico: fosfatasa alcalina, biotina, etc.
SONDAS
Marcaje de fragmento de DNA (Obtención de sondas):
Sondas altamente marcadas o marcadas en 5´. Marcaje radiactivo o químico.
Marcaje de fragmento de DNA (Obtención de sondas):
Sondas altamente marcadas o marcadas en 5´. Marcaje radiactivo o químico.
Altamente Marcadas Marcadas en 5´Altamente Marcadas Marcadas en 5´SONDAS
ADNc
Hibridación “in situ”En un corte histológico para detectar la expresión de un gen concreto. Localiza los ARNm en las posiciones precisas que ocupan en las células o tejidos
Hibridación “in situ” con fluorescenciaFISH
SOUTHERN BLOT
Microarrays
MARCADOR MOLECULAR
SNP (polimorfismo de un solo nucleótido): sustitución de un nucleótido por otro
SSLP (polimorfismos en la longitud de secuencias simples): variación en el tamaño del fragmento por inserción/deleción
VNRT (número variable de repeticiones en tándem):
Minisatétiles (centrómeros y telómeros)
Microsatétiles (distribuidos por todo el genoma)
Sitio de heterocigosidad de ADN, no asociado necesariamente a una variación fenotípica, que se utiliza como una etiqueta de un locus cromosómico particular
LOS POLIMORFISMOS SE COMPORTAN COMO ALELOS
(dos alelos por individuo)
RFLP (polimorfismo en la longitud de los fragmentos
de restricción):
Método para la detección de los distintos
polimorfismos, mediante la utilización de enzimas de
restricción
DETECCIÓN DE SNPs MEDIANTE RFLP
ER ER
ER ERER
2, 21, 21, 1
SNP
1
2
DETECCIÓN DE SNPs MEDIANTE RFLP
ER ERER
ERER ERERERER ER
SNP
2, 21, 21, 11
2
PADRE MADRE
HIJO
Padre Madre Hijo
DETECCIÓN DE VNTR MEDIANTE RFLP
11
22
11 22ER ER
ER ER
ER ER
ER ER
VNTR-microsatélites (2-5 pb)