Javier Seorns
Anlisis Instrumental y Sensorial de Alimentos
Grado en Nutricin Humana y Diettica 1
Tema 2. La preparacin de la muestra
F. Javier Seorns RodrguezSeccin Departamental de Ciencias de la AlimentacinM - 08 despacho 502 E-mail: [email protected]
Pgina web: www.uam.es/javier.senorans
Asignatura de Anlisis Instrumental y Sensorial de AlimentosGrado en Nutricin Humana y Diettica
Tema 2. La preparacin de la muestraAislamiento y concentracin de compuestos en alimentos. Tcnicas de muestreo de la fase vapor: el anlisis del espacio de cabeza (mtodo esttico y mtodo dinmico). Tcnicas actuales de concentracin del espacio de cabeza.La microextraccin en fase slida (SPME).La extraccin en fase slida (SPE). La extraccin supercrtica analtica (SFE).La extraccin acelerada con disolventes (ASE). La extraccin asistida por microondas (MAE). Aplicaciones al anlisis del aroma de alimentos y al anlisis de residuos.
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La mayora de las muestras de alimentos que se analizan por mtodos instrumentales de separacin son demasiado complejas, estn demasiado diluidas o son incompatibles con el sistema cromatogrfico, lo que impide su introduccin directa
Nuevas tcnicas de preparacin de la muestra
se necesita preparar la muestra antes de su introduccin en el sistema,mediante fraccionamiento, extraccin o pre-separacin.
Consecuencia:
PREPARACINDE MUESTRA
PROBLEMA PREPARACIN DE MUESTRA
CROMATOGRAFA DE GASES CON COLUMNAS CAPILARES
ALTA RESOLUCIN
MUESTRA GC
MUESTRA GC
Nuevas tcnicas de preparacin de la muestra
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Problemas actuales de mtodos oficiales y tradicionales:
lentitud y laboriosidad empleo de grandes cantidades de disolventes txicos
poca selectividad poco rendimiento
Mtodos tradicionales de preparacin de la muestra:-ms de 2/3 del tiempo del analista-responsable de al menos 1/3 del error en el anlisis-enorme volumen de disolventes
Necesidad de nuevas tcnicas de preparacin demuestras de alimentos
posibilidad de automatizacintcnicas limpias y selectivasmayor rapidez y eficaciafiabilidad
Metas
Idealmente, adems, baratas, sencillas, sin disolventes txicos
Creciente demanda de :
mayor productividad en los laboratoriosanlisis ms rpidosmtodos ms automatizados
Necesidad de nuevas tcnicas de preparacin demuestras de alimentos
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Posibilidades clsicas: CristalizacinDestilacinPrecipitacinExtraccin con disolventes
LLE, Soxhlet, etc.
Otras: Dilisis y microdilisisFiltracinUltrafiltracinSeparaciones con membranas
Tcnicas instrumentales de preparacin de muestrasde alimentos
Cromatografa en capa fina (TLC)Cromatografa en columnas abiertas (flash)LC prep. cromatografa preparativaAcoplamiento LC-GC SFC preparativa
Tcnicas instrumentales de preparacin de muestrasde alimentos
Tcnicas basadas en la cromatografa:
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Extraccin Slido-liquidoExtraccin Lquido-lquidoExtracciones modernas (ASE, MAE, SFE, etc.)SPE, SPME, etc.
Tcnicas instrumentales de preparacin de muestrasde alimentos
Tcnicas basadas en la extraccin
Fundamento
La cromatografa en capa fina al igual que otras tcnicascromatogrficas se basa en la retencin y elucin debidoa la diferente interaccin del analito entre una fase sliday otra lquida.
La placa se introduce en un recipiente que contiene la fase mvil y alineada con una tira de papel adsorbente. El disolvente asciende por capilaridad y la separacin se basa en la diferente velocidad a la que los distintosanalitos presentes en la muestra ascienden por la placa.
Fundamentos de la Cromatografa en capa fina(TLC, Thin Layer Chromatography)
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Clculo de los Factores de Retencin (RF)Para ello se emplea la siguiente formula
siendo DA la distancia recorrida por el analito y DS la distancia recorrida por el disolvente o frente del disolvente.
Fundamentos de la Cromatografa en capa fina
Frente del disolventePosicin del analito
tras la cromatografa
origen
DS
DARF =
Cromatografa en columna
Fundamento
La cromatografa en columna al igual que otras tcnicas cromatogrficas se basa en la retencin y elucin debido a la diferente interaccin del analito entre una fase slida querellena una columna abierta y otra lquida (normalmente un disolvente orgnico o una mezclade disolventes).
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Esquema Tema 2. La preparacin de la muestra
Introduccin a las tcnicas de preparacin de muestra
Extraccin lquido-lquido
Extraccin Asistida por Microondas (MAE, MicrowaveAssisted Extraction)
Extraccin Acelerada con Disolventes (ASE, AcceleratedSolvent Extraction)
Cromatografa en capa fina y cromatografa en columna
Extraccin slido-lquido
Extraccin en Fase Slida (SPE, Solid Phase Extraction)
Micro-Extraccin en Fase Slida (SPME, Solid PhaseMicro-Extraction)
Muestras slidas de alimentos:
Componentes mayoritarios y minoritarios de todo tipo de alimentos(ej: vitaminas, carotenoides, polifenoles)Residuos y contaminantes en alimentos
MAE ASESFE
Aroma y compuestos voltilesde alimentos y bebidas cuyo aroma o sabor es importante: vinos, quesos, aceites esenciales, etc
Espacio de cabeza
SPME
Diferentes tcnicas para problemas distintos
Componentes naturales o contaminantes de alimentos lquidos:zumos y bebidas, aceites, leche, etc.
Extraccin en fase slida
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Determinacin de compuestos voltiles en muestras de
alimentos
Cromatografa de gases
Tcnicas de aislamiento y concentracin de compuestos
voltiles de la matriz
Problemas:
trazas
aislamiento compuestos voltiles del alimento o del producto a analizar
se requieren grandes cantidades de producto para obtener la adecuada cantidad para anlisis por CG o CG-EM
Tcnicas de aislamiento y concentracin de compuestos voltiles de la matriz
Nuevas tcnicas basadas en el anlisis del espacio de cabeza
- se basan en la preconcentracin, para posterior anlisis y determinacin, de los compuestos voltiles que se desprenden del alimento slido o lquido
Objetivos:
extraer analitos de inters lo ms concentrados posible elevada recuperacin cuantitativa mnimas interferencias
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Micro-extraccin en fase slida (SPME)
Se basa en la adsorcin de los compuestos orgnicos del alimento por una fase slida inmovilizada sobre una fibra de slice fundida.
Una vez alcanzado el equilibrio, los compuestos adsorbidos se desorben trmicamente en el inyector de un cromatgrafo de gases
La matriz puede ser aire, agua, muestras lquidas, etc.
Alternativamente, tambin se puede disolver el extracto en un disolvente orgnico para analizarlo por HPLC.
Principios de la Tcnica
Microextraccin en fase slida (SPME)
SPME es una nueva tcnica de extraccin para compuestosorgnicos, que se basa en la adsorcin de los analitos de la matriz(aire, agua, muestras lquidas, etc.) por una fase slida inmovilizadasobre una fibra de slice fundida.
Si se emplea un recubrimiento polimrico, la cantidad de analitoadsorbida por el recubrimiento en equilibrio est relacionadadirectamente con la concentracin en la muestra.
Principios de la Tcnica
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Esquema del sistema para SPME y detalle de la fibra adsorbente.
La fibra es de slice fundida recubierta de un polmero adsorbente selectivo.
Microextraccin en fase slida (SPME)
KfhVfVsCo
KfhVf+Vs
n =
n: masa de analito adsorbida por el recubrimiento
Vf,Vs: Volumen de recubrimiento y de muestra
K : coeficiente de reparto del analito entre el recubrimiento y la muestra; [K = f ( T, fibra)]
Co: concentracin inicial del analito en la muestra
Microextraccin en fase slida (SPME)Principio Terico
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Microextraccin en fase slida (SPME)En relacin al reparto de los analitos.......
Principales variables que influyen en el proceso de reparto:
constante de distribucin temperatura de la muestra y tipo de calentamiento
25 C
130 C
200 C
Es una tcnica rpida y relativamente sencilla
Existen diferentes fibras adsorbentes disponibles en el mercado que permiten cierta selectividad
Se puede acoplar fcilmente a otras tcnicas de separacin (GC y HPLC)
No requiere ningn disolvente
SPME es una tcnica econmica (reutilizable)
Est limitada a muestras lquidas o compuestos voltiles (espacio de cabeza)
No permite conservar el extracto para otros anlisis
Ventajas y desventajas de la Microextraccin en faseslida
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Deteccin de enranciamiento de aceites por SPME de aldehdos y otros subproductos de la oxidacin
Anlisis de aromas naturales y extraos de alimentos
Aromas de vinos, bebidas espirituosas, zumos y otras bebidas
Diferenciacin de tipos de caf, origen, tueste, etc.
Compuestos azufrados en cerveza y otras bebidas alcohlicas
Caracterizacin y control de calidad de alimentos de alto valor: jamones, trufas, pats, etc.
Microextraccin en fase slida (SPME)Aplicaciones:
Micro-Extraccin en Fase Slida (SPME)
Ejemplo de anlisis de compuestos voltiles en un zumo de fruta sin usar ningn disolvente txico
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Muestras slidas de alimentos:
Componentes mayoritarios y minoritarios de todo tipo de alimentos(ej: vitaminas, carotenoides, polifenoles)Residuos y contaminantes en alimentos
MAE ASESFE
Aroma y compuestos voltilesde alimentos y bebidas cuyo aroma o sabor es importante: vinos, quesos, aceites esenciales, etc
Espacio de cabeza
SPME
Diferentes tcnicas para problemas distintos
Componentes naturales o contaminantes de alimentos lquidos:zumos y bebidas, aceites, leche, etc.
Extraccin en fase slida
Tcnicas de Purga y Trampa y Desorcin Trmica
Procedimiento
arrastre continuo de la muestra por medio de un flujo de gas inerte (He o N2) captura o adsorcin de los compuestos voltiles en una trampa adsorbente desorcin, mediante calentamiento, de los compuestos retenidos
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Tcnica de Purga y Trampa
Arrastre y captura:
1
3
2
4
5
MS GCP&T
Gas inerte: para no alterar componentes de la muestra Temperatura ambiente
Tcnica de Purga y Trampa
Realiza, de forma automtica, las etapas de arrastre, captura y desorcin
Elevada reproducibilidad
Evita manipulacin de muestra
No requiere ningn disolvente
Elevada sensibilidad
No existen interferencias de compuestos no voltiles de la matriz
Optimizacin de todas las variables en conjunto
Ventajas y desventajas P&T:
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Muestras slidas de alimentos:
Componentes mayoritarios y minoritarios de todo tipo de alimentos(ej: vitaminas, carotenoides, polifenoles)Residuos y contaminantes en alimentos
MAE ASESFE
Aroma y compuestos voltilesde alimentos y bebidas cuyo aroma o sabor es importante: vinos, quesos, aceites esenciales, etc
Espacio de cabeza
SPME
Diferentes tcnicas para problemas distintos
Componentes naturales o contaminantes de alimentos lquidos:zumos y bebidas, aceites, leche, etc.
Extraccin en fase slida
Esquema Tema 2. AISA Introduccin a las tcnicas de preparacin de muestra
Extraccin lquido-lquido
Extraccin Asistida por Microondas (MAE, MicrowaveAssisted Extraction)
Extraccin Acelerada con Disolventes (ASE, AcceleratedSolvent Extraction)
Cromatografa en capa fina y cromatografa en columna
Extraccin slido-lquido
Extraccin en Fase Slida (SPE, Solid Phase Extraction)
Micro-Extraccin en Fase Slida (SPME, Solid PhaseMicro-Extraction)
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Aroma y compuestos voltilesde alimentos y bebidas cuyo aroma o sabor es importante: vinos, quesos, aceites esenciales, etc
Espacio de cabeza
SPME
Diferentes tcnicas para problemas distintos
Componentes naturales o contaminantes de alimentos lquidos:zumos y bebidas, aceites, leche, etc.
Extraccin en fase slida
Muestras slidas de alimentos:
Componentes mayoritarios y minoritarios de todo tipo de alimentos(ej: vitaminas, carotenoides, polifenoles)Residuos y contaminantes en alimentos
MAE ASESFE
Extraccin slido-lquido: Extraccin de alimentosslidos con disolventes
Mtodo tradicional de extraccin
disolvente orgnico (lquido) caliente, en ebullicin, en contacto conmuestra de alimento (slido)
(ej. Soxhlet)
Temperatura mxima del Disolvente== Punto de ebullicin (60-80C)
Disolvente
Disolvente+ extracto
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Necesidad de nuevas tcnicas de extraccin dealimentos slidos
Mtodos tradicionales de extraccin slido-lquido : lquido en ebullicin en contacto con muestra slida
difusividad del disolvente lentaintercambio de energa poco eficazprocesos estticos o semi-estticos
Extraccin lenta y poco eficaz
disolventes convencionales calor como nica energa
Extraccin lenta y poco selectiva
Pasos previos:Homogeneizar la muestraReducir su tamaoEvitar cambios en la muestra:
Inactivacin enzimticaProteccin de lpidosInhibicin del crecimiento microbianoCambios fsicos, agua, estructura, etc.
Congelacin, secado, tratamiento trmico, conservantes qumicos (o una combinacin de varios de ellos)
Tcnicas instrumentales de preparacin de muestrasde alimentos
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Extractor Soxhlet
Mtodo tradicional, muy aceptado y extendido
Lento
Esquema Tema 2. La preparacin de la muestra
Introduccin a las tcnicas de preparacin de muestra
Extraccin lquido-lquido
Extraccin Asistida por Microondas (MAE, MicrowaveAssisted Extraction)
Extraccin Acelerada con Disolventes (ASE, AcceleratedSolvent Extraction)
Cromatografa en capa fina y cromatografa en columna
Extraccin slido-lquido
Extraccin en Fase Slida (SPE, Solid Phase Extraction)
Micro-Extraccin en Fase Slida (SPME, Solid PhaseMicro-Extraction)
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Principios comunes a las nuevas tcnicas de extraccin:
Extraccin asistida por microondas (MAE).Extraccin acelerada con disolventes (ASE).Extraccin supercrtica analtica (SFE).
Se emplean disolventes de alta difusividad elevando la temperaturay controlando la presin
Debido a los mayores coeficientes de difusin, las extracciones seaceleran considerablemente
Tcnicas instrumentales de extraccin de muestras slidas de alimentos
Extracciones de slidoscon mayor rapidez y eficacia
Lquidos a alta TFluidos Supercrticos
SFE ASEMAE
Presinelevada
Energa localizada
selectividad rendimiento
Tcnicas avanzadas de preparacin de muestrasde alimentos slidos
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Principios de la Extraccin Asistida porMicroondas (MAE)Se extrae la muestra aplicando energa de microondas en un disolvente adecuado.
Energa de microondas: calienta selectivamente unas especies qumicas frente a otras produce extracciones rpidas y con cierta selectividad.
El calentamiento producido depende de la naturaleza qumica de la matriz y del disolvente
Cuanto mayor es la constante dielctrica, mayor es la absorcin de energa.
Extraccin Asistida por Microondas (MAE)
Cuando el disolvente absorbe energa microondas:
La muestra se coloca en un recipiente cerrado
se calienta a temperaturas mayores que su punto de
ebullicin durante un tiempo muy corto (aumenta la presin)despus se enfra y se despresuriza
se separa o filtra el extracto
Procedimiento habitual
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Extraccin Asistida por Microondas (MAE)
Esquema de una celda comercial con control de presin y de temperatura para MAE
Equipo necesario: Microondas Celdas apropiadas
Caractersticas de las celdas no absorber microondas, ser inertes,fciles de abrir y cerrarreutilizables resistentes a altas P y temperaturas
Extraccin Asistida por Microondas (MAE)Principales variables:
Relativas a la muestra
Tiempo de irradiacin y extraccin
Potencia de irradiacin
Caudal de disolvente (en procesos continuos)
Disolvente: composicin y propiedadesconstante dielctrica
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Extraccin Asistida por Microondas (MAE)
MAE es ms rpida (30 seg.-10 min) y emplea menos disolvente (1-15 mL) que la extraccin lquida tradicional
La energa esta localizada y se aprovecha mejor (menor consumo)
El tamao de muestra puede ser muy variado MAE es una tcnica robusta y fcil de usar Se pueden extraer varias muestras a la vez No hace falta deshidratar o procesar la muestra
Ventajas
Extraccin Asistida por Microondas (MAE)
MAE depende de la matriz y limita los disolventes que se pueden utilizar
MAE plantea problemas de seguridad El extracto queda en contacto con la muestra al acabar la
extraccin y necesita una posterior filtracin o separacin MAE es difcil de automatizar o acoplar a tcnicas de
anlisis Degradacin de compuestos trmicamente lbiles Poca selectividad en la extraccin
Desventajas
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Extraccin Asistida por Microondas (MAE)
Esquema de un extractor asistido por microondas
Extraccin de grasa de carne, huevo y slidos lcteos
Extraccin de oleorresina de pimentn
Extraccin de monoterpenoles de mostos para anlisis por GC
Extraccin de contaminantes (residuos de pesticidas, PAHs, PCBs, etc.)
Ejemplos de Aplicaciones:
Extraccin de esencias de vainilla, menta, ginseng, ctricos, etc.
Ejemplo de Extraccin Asistida por Microondas (MAE)
Extraccin de grasa de carne, huevo y slidos lcteos
Homogeneizacin de la muestra
Se aade el disolvente: ter de petrleo o hexano
La muestra se coloca en un recipiente abierto adecuado
Se irradia a 300 W durante 60 + 90 segundos
El extracto se filtra a vaco para separar la muestra del disolvente
Se concentra el extracto, evaporando el disolvente en rotavapor
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Extracciones de slidoscon mayor rapidez y eficacia
Lquidos a alta TFluidos Supercrticos
SFE ASEMAE
Presinelevada
Energa localizada
selectividad rendimiento
Tcnicas avanzadas de preparacin de muestrasde alimentos slidos
Extraccin Acelerada con Disolventes (ASE)
nueva tcnica de extraccin disolventes habituales presiones y temperaturas elevadas extracciones rpidas y efectivas de muestras slidas
Principios de la Tcnica
Temperaturas: 30 - 200 CPresiones: 100 - 140 atm
Disolventes: orgnicos, agua, mezclas, etc.
Muestras: slidas
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Extraccin Acelerada con Disolventes (ASE)
nueva tcnica de extraccin disolventes habituales presiones y temperaturas elevadas extracciones rpidas y efectivas de muestras slidas
Principios de la Tcnica
Efectos interesantes que se producen a temperaturas elevadas: mejores solubilidades de los analitos en lquidos aumento de las cinticas de desorcin de los compuestos de la matriz
Extraccin Acelerada con Disolventes (ASE)
La muestra slida se coloca en un recipiente que se sella Se llena con disolvente y se calienta a temperatura mayor que el punto de ebullicin del disolvente, provocando un gran aumento de la presin en la celda.
Durante el tiempo de extraccin parte del lquido es liberado y recogido en un vial.
Al final de la extraccin, el extracto se expulsa de la celda con nitrgeno y se transfiere automticamente a un vial.
Procedimiento
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Principales variables:
Relativas a la muestra
Tiempo de extraccin
Temperatura de extraccin
Nmero de ciclos
Disolvente o mezcla de disolventes
Extraccin Acelerada con Disolventes (ASE)
Disolvente
Bomba
Nitrgeno
Vlvula de purga
Vial colector
Horno
Celda de Extraccin
Vlvula Esttica
Vial de desecho
Vlvula de presin
Salidaaire
Extraccin Acelerada con Disolventes (ASE)
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Imagen de un extractor con disolventes presurizados (ASE)
Extraccin de grasa de carne, huevo y slidos lcteos
Pesticidas en harinas, piensos, etc.
Micotoxinas en cereales y frutos secos
Extraccin de contaminantes (residuos de pesticidas, dioxinas, PCBs, etc.)
Ejemplos de Aplicaciones:
Extraccin de productos naturales
Extraccin Acelerada con Disolventes (ASE)
Extraccin Acelerada con Disolventes (ASE)de alimentos
ASETM es ms rpida que los procedimientos de extraccin lquida tradicionales
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Extraccin Acelerada con Disolventes (ASE)de alimentos
Las extracciones son ms completas, pero menos selectivas
ASE requiere el empleo de temperaturas ms altas que en SFE
El equipo tiene un precio elevado
Desventajas
Extracciones de slidoscon mayor rapidez y eficacia
Lquidos a alta TFluidos Supercrticos
SFE ASEMAE
Presinelevada
Energa localizada
selectividad rendimiento
Tcnicas avanzadas de preparacin de muestrasde alimentos slidos
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Extraccin Analtica con Fluidos Supercrticos (SFE)
Se extrae con un fluido a presiones y temperaturas mayores que las de su punto crtico
extrae rpida y selectivamente algunos compuestos
Variando la presin (la densidad del fluido) se controla la solubilidad de los analitos en dicho fluido.
Principios de la Tcnica
Diagrama de fases
Presin
Temperatura
Lquido
Gas
Slido
FluidoSupercrtico
Qu es un Fluido Supercrtico?
Punto Crtico
(Para CO2 es 31.3C y 72.9 atm)
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Moderadas presin (72.9 atm) y temperatura (31.3C) crticas Gas a temperatura ambiente, no deja residuos No es txico ni inflamable Precio moderado y sin problemas de eliminacin Baja polaridad, se pueden aadir modificadores en pequea proporcin para extraer compuestos polares
Propiedades del dixido de carbono
Extraccin Analtica con Fluidos Supercrticos (SFE)
El fluido supercrtico ms utilizado es el dixido de carbono (CO2)
Muestras slidas de alimentos:
Componentes mayoritarios y minoritarios de todo tipo de alimentos(ej: vitaminas, carotenoides, polifenoles)Residuos y contaminantes en alimentos
MAE ASESFE
Aroma y compuestos voltilesde alimentos y bebidas cuyo flavor es importante: vinos, quesos, aceites esenciales, etc
Espacio de cabeza
SPME
Componentes naturales o contaminantes de alimentos lquidos:zumos y bebidas, aceites, leche, etc.
Extraccin en fase slida
Diferentes tcnicas para problemas distintos
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Fundamentos de la Extraccin Lquido-Lquido
Particin de los componentes de una mezclaentre dos lquidos inmiscibles de diferente densidad
Extraccin en fase slida (SPE)
SPE es una tcnica de extraccin que se basa en la retencin sobre un adsorbente slido de los compuestos deseados disueltos en una muestra lquida. La adicin de un eluyente permite eliminar los componentes de la matriz que interfieren, para despus eluir y concentrar los analitos de inters.La extraccin en fase slida sustituye a la extraccin lquido-lquido clsica.
Principios de la Tcnica
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Procedimiento de la Extraccin en Fase Slida (SPE)
Muestra Acondicio-namiento
Adicin de muestra
Lavado Elucin del analito
Extraccin en Fase Slida (SPE)
Ejemplos de Aplicaciones: Eliminacin de pigmentos de
vegetales y hortalizas Retencin de antocianinas y otras
interferencias en anlisis de pesticidas en vinos
Vitaminas en zumos Residuos de antibiticos en leches
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Extraccin en Fase Slida (SPE)
Imagen de un colector mltiple para SPE con aspiracin a vaco.
Permite la extraccin simultnea de 20 tubos con muestra.
Equipo automtico para SPE con microplacas de 96 / 384
Ventajas y desventajas de SPE
Es una tcnica muy sencilla y rpida Existen numerosos adsorbentes disponibles en el
mercado para SPE Se puede acoplar a otras tcnicas de separacin Emplea poco o ningn disolvente SPE es muy efectiva para extraer compuestos
polares o apolares de muestras lquidas Se puede automatizar Est limitada a muestras lquidas
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Sumario de propiedades de nuevas tcnicas deextraccin
Rpidas: tiempos de extraccin de 1 - 30 minutos
Ninguna tcnica es ideal para todos los analitos de todas las matrices
Las nuevas tcnicas son cada vez ms comunes y van a continuar su expansin debido a sus numerosas ventajas
Posibilidad de automatizacin
Eficaces y selectivas
Libros sobre Anlisis Instrumental incluyendo preparacin de muestra:Rubinson K.A., Rubinson J.F. (2001). Anlisis Instrumental.Prentice Hall-Pearson. Madrid.
Matissek R., Schnepel F.M., Steiner G. (1998). Anlisis de losAlimentos. Fundamentos, Mtodos, Aplicaciones. Acribia.Zaragoza.
Skoog D.A., Holler F.J., Nieman T.A. (2001). Principios de AnlisisInstrumental. [Quinta Edicin] McGraw-Hill. Madrid.
Bibliografa recomendada
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