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Page 1: TESIS de Stevia Rebaudiana

RESUMEN

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RESUMEN

Stevia rebaudiana Bert. (yerba dulce), es una

planta arbustiva semiperenne, originaria del noreste del

Paraguay, perteneciente a la familia de las compuestas.

Su importancia económica radica en que, en sus hojas,

posee una sustancia, denominada esteviósido, constituida

por una mezcla de por lo menos seis glucósidos

diterpénicos, que es 100 a 400 veces más dulce que la

sacarosa y que por sus características físico-químicas y

toxicológicas permite su inclusión en la dieta humana

para ser utilizada como un edulcorante dietético

natural, sin efectos colaterales.

Su inclusión en el código alimentario nacional

(Resolución 101 del 22-2-1993) y la posibilidad de

exportación ha incrementado el interés en esta especie

por parte de los productores.

Naturalmente se propaga por aquenios, pero el bajo

valor cultural de las semillas (10 al 15 %) y la

heterogeneidad de las poblaciones resultantes indican la

necesidad de desarrollar y/o ajustar técnicas

alternativas, sencillas y económicas, que permitan la

propagación masiva de genotipos selectos.

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El objetivo del presente trabajo de intensificación

es estudiar algunos factores que afectan la propagación

vegetativa de esta especie, para lo cual se utilizaron

estacas apicales y subapicales, provenientes de plantas

clonadas, de origen japonés, que se encuentran en el

campo experimental de nuestra facultad, las que se

trataron con una solución rizogénica de ácido

indolbutírico (25 mg/l durante 24 horas), plantándose

posteriormente en bandejas de plástico, sobre un

sustrato de turba y humus de lombriz (1:1) ó turba y

arena (1:1). A las cuatro semanas, se evaluó, porcentaje

de enraizamiento, longitud y peso de raíces y peso de la

parte aérea.

Esta experiencia se repitió a lo largo del período

de crecimiento anual (desde primavera a fin de otoño),

siempre que en el stand de plantas madres, los vástagos

alcancen un tamaño que permita extraer estacas apicales

y subapicales.

Se realizó un ensayo factorial con medidas

repetidas en el tiempo, con un diseño de bloques al azar

y los resultados se evaluaron a través de un análisis de

varianza.

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INTRODUCCION

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INTRODUCCIÓN:

De los cuatro sabores básicos: dulce, salado,

amargo y agrio, el primero es el que produce mayor

placer fisiológico, al ser humano. Tradicionalmente,

este sabor estaba íntimamente relacionado con la

sacarosa y aún hoy, el sabor de este compuesto se

utiliza como patrón de comparación de la calidad e

intensidad del sabor dulce de un producto. Además de su

sabor, la sacarosa presenta una serie de propiedades

físicas, químicas y biológicas que la convierten en un

ingrediente ideal para la industria de la alimentación y

la cocina familiar.

Lamentablemente, existen motivos por los cuales su

uso debe ser limitado y/o eliminado de la dieta de

muchas personas (ejemplo: diabetes, obesidad), y sin

embargo, el hombre no parece dispuesto a renunciar al

placer que le produce el sabor dulce, por lo que ha

buscado sustancias naturales o artificiales capaces de

sustituir al azúcar.

A pesar de la gran cantidad de sustancias que

poseen sabor dulce, muy pocas de ellas se utilizan en

forma extensiva como edulcorantes. Las razones que

limitan su uso son de diversa índole: legales,

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económicas, toxicológicas, etc.; y es por ello que en la

actualidad existen pocos edulcorantes que se utilizan en

forma extensiva y cuya comercialización alcance un

volumen apreciable. Los más importantes son: sacarina,

ciclamato, aspartamo, acesulfame-K y esteviósido

(Cardozo y Rodríguez, 1986).

El poder edulcorante de estas sustancias varía

entre si y para la cuantificación del sabor dulce de las

mismas se recurre a métodos de carácter subjetivo,

basados en la degustación. Los resultados obtenidos con

estas sustancias puras y estos métodos no pueden ser

extrapolados para predecir su comportamiento en la

formulación de un alimento

Al producirse la mezcla de un edulcorante con las

demás sustancias componentes de la formulación de un

alimento, normalmente se producen interacciones y

cambios más o menos profundos en el sabor. Algunos de

estos cambios pueden ser favorables y aprovecharse para

mejorar la calidad o el poder de los edulcorantes, ya

que en los mismos, al mezclarse, se produce una

expansión del sabor dulce, es decir, se consigue una

dulzura superior a la simple aditividad de los poderes

de ambos edulcorantes por separado (Morita, 1977).

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Por lo general, el sabor dulce de un edulcorante

nunca es "puro" como en la sacarosa, ya que normalmente

viene acompañado de sabores secundarios no deseados. El

caso más común de sabor secundario es el amargo y/o

metálico, debido a que los centros receptores del mismo

se hallan localizados en las vecindades de los del sabor

dulce. Existen sustancias, que adicionadas en pequeñas

cantidades, son capaces de suprimir o disminuir algunos

sabores indeseables, utilizándose ampliamente en la

formulación de los alimentos. Ejemplo: la mezcla

ciclamato-sacarina en la relación 10:1.

Asimismo, existen otras sustancias que, adicionadas

en pequeñas cantidades, aumentan la intensidad de

determinados sabores de la mezcla, por ejemplo, el

cloruro de sodio y los condimentos (Morita, 1977).

1 - Propiedades de un edulcorante ideal:

Un edulcorante "ideal" deberá satisfacer los

siguientes requerimientos: (Ishima y Kakayama, 1976).

- Tener el sabor dulce de la sacarosa, sin

componentes secundarios indeseables.

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- Tener bajo contenido calórico, referido a una

misma base de poder edulcorante. Esta condición

puede ser satisfecha bien por poseer un alto

poder edulcorante o por no ser metabolizado por

organismo.

- Poseer propiedades físicas similares a la

sacarosa: resistencia a las temperaturas

elevadas y a los ph comunes en los alimentos,

ser soluble en agua, poseer similares

características de textura y viscosidad que la

sacarosa en iguales condiciones, no ser

higroscópico, etc.

- Ser inerte con respecto a las sustancias

presentes en la formulación de alimentos y no

interferir en sus sabores.

- No ser tóxico por si mismo, ni producir

sustancias tóxicas por descomposición o

reacción.

- Ser estable y mantener sus características con

el tiempo.

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- No poseer propiedades carcinógenicas

En la práctica, no existe ninguna sustancia que

satisfaga todas estas condiciones, lo que obliga, en

algunos casos a limitar el uso de un edulcorante dado

para algunas aplicaciones o recurrir a mezclas de

edulcorantes, uso de aditivos, etc.

2 - Caracterización de los edulcorantes de uso

extensivo: (Ishima y Kakayama, 1976)

2.1 - Sacarina:

Este compuesto es ácido y poco soluble en agua, por

lo que normalmente se utiliza como sal de sodio o

calcio. Es un producto de síntesis. Su poder

edulcorante, referido a la sacarosa, varía de 200 a 700,

dependiendo de la concentración (300 en sus usos más

comunes).

La mayor limitación para su uso es su sabor amargo

y metálico, muy difícil de enmascarar hasta la aparición

del ciclamato. Asimismo, en los últimos años, el uso de

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la sacarina se ha cuestionado duramente, por comprobarse

que producía tumores malignos, en mezclas con ciclamato,

prohibiéndose su uso en EE.UU. y Canadá.

Actualmente, se comercializa en Argentina,

Australia, Austria, Bélgica, Brasil, Francia, Holanda,

Italia, Japón, México, Portugal, Sudáfrica, Reino Unido,

EE.UU., España y Alemania.

2.2 - Ciclamato:

Normalmente se usa como sal sódica o cálcica, y es

muy soluble en agua. El poder edulcorante referido a la

sacarosa es de 30 en las concentraciones más utilizadas.

La calidad del sabor es muy diferente al de la sacarosa,

ya que además de estar acompañado de sabores agrio y

amargo, tiene distintas velocidades de percepción y de

duración de sabor. Es un producto de síntesis.

En 1969, se descubrieron las propiedades

carcinogénicas de la ciclohexilamina, producto de la

metabolización del ciclamato, siendo prohibido su uso en

EE.UU., Canadá y Reino Unido.

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Actualmente se utiliza en: Argentina, Bélgica,

Brasil, Francia, Italia, Holanda, Alemania, México,

Portugal, España y Sudáfrica.

2.3 - Aspartame:

Presenta una solubilidad del 1% a 20ºC; se produce

industrialmente a partir de aminoácidos por diversos

caminos. El poder edulcorante se encuentra entre 100 y

400, aunque a las concentraciones habituales varía entre

150 y 200.

Su sabor es muy parecido al de la sacarosa, hasta

el punto que algunas personas prefieren su sabor al de

la misma.

Es un edulcorante muy adecuado para una gran

variedad de alimentos, debido a la similitud de su

sabor con la sacarosa, aunque debe evitarse su

utilización en los casos de cocción o calentamientos

prolongados.

Actualmente está permitido en Argentina, Francia,

Bélgica, Luxemburgo, Filipinas, Brasil y EE.UU.

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2.4 - Acesulfame-K:

Es la sal potásica de un derivado de la

oxatiazinona. Tiene un poder edulcorante de 170 a 300.

Presenta buen sabor y buenas propiedades de mezcla.

3 - Características edulcorantes del esteviósido:

3.1 - La Stevia rebaudiana Bert contiene en sus hojas,

principios edulcorantes que han sido reconocidos y

utilizados por siglos por las poblaciones nativas que

viven en la zona de origen de esta especie (Paraguay)

(Sumida, 1980).

La designación de esteviósido, principio

edulcorante de la especie, se debe a los investigadores

franceses Bridel y Lavielle que en 1931 cristalizaron el

principio edulcorante y determinaron que es 300 veces

más dulce que el azúcar, y que no posee efectos tóxicos

al realizar pruebas de laboratorio con animales (Bridel

y Lavielle, 1931).

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Asimismo, se demostró que el esteviósido es el

edulcorante natural no nitrogenado más dulce que se

encuentra en la naturaleza y que está compuesto

solamente de carbono, hidrogeno y oxígeno, siendo su

formula C38 H60 O18.

En 1952 un equipo de investigadores americano del

National Institute of Arthritis and Metabolic Diseases,

dirigidos por el Doctor Hewit y Fletcher jr.,

determinaron la estructura química del esteviósido; el

que resultó ser un glucósido diterpénico con un aglycon

denominado steviol (Mosetting y Nes, 1955).

Durante la década de 1970, investigadores

japoneses de las Universidades de Hiroshima y Hokkaido

identificaron otros principios edulcorantes en las hojas

de Stevia: Rebaudiósidos A, B, C, D y E, Dulcósidos A y

B y otros de menor importancia. El rebaudiósido A es el

que presenta el mayor grado de dulzor (aproximadamente

350-400 veces más dulce que el azúcar) y, es por ello

que, se procura seleccionar individuos con altos

contenidos de este componente (Kohda, 1976).

3.2 - Propiedades físico-químicas del esteviósido de

interés en el procesado de alimentos:

(Fujita, 1979)

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-Resistencia al calor: presenta estabilidad a las

temperaturas habituales en el procesado de

alimentos. Se funde a 238 º C.

-Alteración del color: no se observa

oscurecimiento, aún en las condiciones más

rigurosas de procesado de alimentos.

-Solubilidad: es altamente soluble en agua, alcohol

etílico y metílico e insoluble en éter.

-Resistencia al ph: es suficientemente estable

entre ph 3 a 9.

-Contenido de calorías: no es metabolizado por el

organismo, por lo tanto se convierte en no

calórico, y es adecuado para usos dietéticos.

-Capacidad osmótica: presenta buenas propiedades

osmóticas para la preparación de pikles dulces

(Japón).

-Fermentabilidad: no es fermentable, ni atacado por

las bacterias orales. No es hidrolizable por

Aspergilus níger, ni por el fermento seco de

levaduras. Se hidroliza con ácido sulfúrico

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diluido y por diastazas.

Otras propiedades:

Dentro de la medicina popular paraguaya se utiliza

como hipoglicemiante (Miquel, 1977), digestivo,

cardiotónico, diurético, antiácido, etc (Jordán Molero,

1984; Yang et al, 1979).

3.3 - Propiedades edulcorantes: (Fujita, 1979)

La mayor parte de los autores coinciden en que el

esteviósido es 300 veces más dulce que la sacarosa y el

rebaudiósido A, 400. Pero debido a las extraordinarias

características de potenciar su dulzura por la acción de

diversas sustancias comunes en la formulación de

alimentos, tales como cloruro de sodio, leche, ácidos,

etc., se puede fijar como valores razonables de poder

edulcorante para la mezcla natural de glucósidos, un

rango de 100 a 400, dependiendo de cada alimento.

3.3.1 - Calidad del sabor dulce:

Conjuntamente con el sabor dulce, el esteviósido

presenta un sabor secundario, persistente, definido como

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sabor a regaliz-mentol, detectable a altas

concentraciones. Este sabor secundario es evidente en el

extracto natural. El rebaudiósido A posee un sabor dulce

más puro.

Este sabor no deseado se puede enmascarar con la

utilización de combinaciones de otras sustancias

edulcorantes. Los mejores resultados se obtienen con

sacarosa y glucosa, siguiéndoles la fructuosa, sorbitol

y malitol.

Con respecto a la velocidad de percepción del sabor

del esteviósido, se observó que la curva de intensidad

percibida en función del tiempo, tiene una gran

similitud con la correspondiente a la sacarosa en lo que

respecta a la ubicación del máximo, pero presenta una

diferencia en la duración o persistencia del sabor,

siendo menor, aunque la similitud es superior a la de

cualquier otro edulcorante actualmente utilizado.

Con el fin de suavizar la persistencia del sabor

dulce, se obtienen buenos resultados con el agregado de

fructuosa, glucosa, péptidos, aminoácidos, ácidos

cítrico, acético, láctico, málico y tartárico.

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El esteviósido presenta sinergismo con el

aspartame, sacarina, glucosa, fructuosa y muchas otras

sustancias edulcorantes.

4 - Inocuidad del esteviósido:

La primera prueba de inocuidad del esteviósido es

la utilización de las hojas de Stevia por los indígenas

guaraníes durante varios siglos, y por los habitantes de

Paraguay, hasta la actualidad, sin observarse efectos

colaterales. Ya aislados los principios activos de la

Stevia, comenzaron los ensayos de laboratorio con el fin

de detectar posibles efectos toxicológicos. En 1931,

Poniaret y Lavielle, observaron que tras la

administración subcutánea del mismo en cobayos, no se

producían afecciones hemolíticas ni otros efectos

tóxicos (Felippe, 1982).

En 1968, Plana y Kuc , informaron que suministrando

una solución de esteviósido a ratas, se observaba una

reducción del 20 al 30 % de la fertilidad.

Posteriormente, Persinos y Whistler, y más tarde,

Doffmmann y Nes demostraron que dicho efecto no se debía

al esteviósido sino al dihidroesteviol, compuesto

inexistente en las hojas de Stevia y producido durante

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la extracción o purificación defectuosas (Felippe,

1982).

En Japón, previo a la utilización masiva del

esteviósido, se realizaron rigurosos ensayos que

probaron su inocuidad. El Ministerio de Salud de Japón,

coordinó un amplió estudio en el cual nueve grupos

científicos estudiaron en forma independiente la acción

del esteviósido. Por unanimidad se concluyó que el

esteviósido, con un 90 % de pureza, no poseía actividad

mutagénica o teratogénica, coincidiendo, además, con

otros estudios realizados anteriormente (Fujita, 1979)

Por otra parte, se observaron efectos beneficiosos

de esta sustancia en la prevención de caries dentales,

no sólo por la disminución de azúcares en la boca, sino

que, además se demostró que el mismo inhibe el

desarrollo de bacterias orales cariogénicas (Felippe,

1977; Sakaguchi y Kan, 1982).

5 - Utilización actual del esteviósido:

La rápida y amplia aceptación que ha tenido el

esteviósido en Japón (consumo aproximado de 4000 ton/año

(CEPEX, 1982)), demuestra significativamente sus

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potencialidades. Se debe recordar que los productos

edulcorantes que dominan el mercado mundial (sacarina,

ciclamato), cuentan con serios cuestionamientos por sus

propiedades nocivas para la salud (Felippe, 1977;

Sakaguchi y Kan, 1982; Jordán Molero, 1984), y debe

adicionarse el atractivo que, en la actualidad, para la

opinión pública, tiene el origen natural y edulcorante

del esteviósido.

Además del Japón otros países del Lejano Oriente

donde se produce el esteviósido son Corea del Sur y

Taiwan (CEPEX, 1982).

En Latinoamérica su consumo es habitual en dos

países. En Paraguay se utiliza, en hojas, desde siempre,

y desde 1988 en Brasil, ya que en Maringá (Paraná), se

comenzó la industrialización del mismo (Marcavillaca y

Divo de Sesar, 1993).

Países interesados en la producción y/o

industrialización de Stevia rebaudiana Bert., incluyen a

Alemania, Canadá y EE.UU., lo que implica, que se

necesitarán grandes cantidades de materia prima para

abastecer la demanda.

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Actualmente los usos más destacados del esteviósido

son en: bebidas, gomas de mascar, helados y cremas

heladas, alimentos de bajo contenido calórico, pikles,

salsas y otros productos de sabor delicado (CEPEX,

1985).

6 - Formas de comercialización: (CEPEX, 1982)

En el mercado japonés se encuentran muchos

productos a base de esteviósido o extracto purificado de

stevia, comercializados bajo diversas denominaciones o

marcas comerciales. En su composición únicamente

participan compuestos de origen natural, considerándose

que puede satisfacer las necesidades de cualquier tipo

de producto alimenticio.

7 - Otros campos de aplicación: (CEPEX, 1982)

En el caso de que la sustitución del azúcar por el

esteviósido se hiciere con vistas únicamente a una

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disminución de costos, la proporción recomendada es

sustituir el 30 % de la sacarosa, ya que así se obtiene

el máximo de sinergismo, sin que se note el sabor

característico del esteviósido.

8 - Mercado mundial de edulcorantes: (CEPEX, 1989)

La situación presentada por el mercado mundial de

edulacorantes de alto poder ha presentado muchos cambios

fundamentales debido a las prohibiciones o

cuestionamientos a que fueron sometidos los más

importantes, y a que los efectos indeseables tuvieron

diversa incidencia en los distintos países.

A continuación se analizará la situación aproximada

del mercado para fines de la década de 1980.

8.1 - Sacarina:

Es el edulcorante más utilizado. El consumo y la

producción puede ser desglosado de la siguiente manera:

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Consumo(kg/año) Producción(kg/año)

EE.UU. 3.500.000 2.270.000

Europa 2.000.000 -

Japón 800.000 2.800.000

Otros 2.700.000 3.930.000

Total 9.000.000 9.000.000

El precio actual de la sacarina sódica en EE.UU. es

de 8,42 U$S/kg.

8.2 - Ciclamato:

Antes de su prohibición en EE.UU., se había

constituido en el edulcorante más utilizado en volumen,

ya que solamente en EE.UU. su producción había alcanzado

los 9.500.000 kg/año. En la actualidad, se sigue

produciendo en dicho país, pero en una escala reducida y

para exportación. No se conoce el consumo mundial. El

consumo en Europa alcanzó los 1.300.000 kg en 1982. Su

precio fue de 9,90 U$S/kg.

8.3 - Aspartame:

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Se considera que su producción aproximada fue de

1.000.000 kg, en 1983. Este volumen es considerable,

teniendo en cuenta que la aprobación de uso era muy

reciente, y con muchas limitaciones, en EE.UU., Gran

Bretaña, Francia, Bélgica y otros países. Su precio en

dicho año fue de 152 U$S/kg.

8.4 - Esteviósido:

En Japón, en 1979, la producción y consumo fue de

140.000 kg, aunque se consideraba que en dicho año el

mercado japonés podía absorber 1.400.000 kg, equivalente

al 10 % del consumo de sacarosa en poder edulcorante. En

ese mismo año la producción mundial era de

aproximadamente 700.000 kg, incluyendo Japón, China

Popular y Corea. No se cuenta con información oficial

respecto a precios, pero se estima en alrededor 120

U$S/kg (Marcavillaca, comunicación personal).

9 - Perspectivas del esteviósido:

9.1 - Mercado mundial:

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El mercado total de edulcorantes de alto poder y

bajo contenido calórico, es equivalente a entre 12 a 15

millones de kg de esteviósido por año. La conquista de

una pequeña fracción de este volumen, por el

esteviósido, representaría cifras significativas.

Teniendo en cuenta que los tres productos

edulcorantes que dominan el mercado mundial,

especialmente en los países occidentales, cuentan con

serios cuestionamientos por sus propiedades nocivas para

la salud, las posibilidades del esteviósido como

sustituto de los mismos son buenas, presentándose como

su principal limitación la imposibilidad de provisión de

materia prima en tan gran escala. Además, antes de

entrar a competir en el mundo occidental

industrializado, deberá pasar por todas las pruebas

previas a su aprobación, especialmente las de la Food

and Drug Administration de EE.UU. En este organismo, se

encuentra actualmente en los próximos 10 productos en

ser aprobados (Marcavillaca, comunicación personal).

10 - Evolución histórica:(Marcavillaca y Divo de Sesar,

1993)

1887- Se tuvo la primera referencia de la especie,

llegando la noticia al naturalista Dr. Moisés Bertoni, a

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Page 25: TESIS de Stevia Rebaudiana

través de mineros e indios de la región de Caaguazú y

Monday de la República del Paraguay.

1899- El Dr. Bertoni describe a la planta como

Eupatorium.

1900- El químico paraguayo Ovidio Rebaudi, realiza

los primeros estudios del componente dulce de la hoja.

1904- Bertoni verifica que la planta pertenece al

género Stevia.

1905- Se registra como Stevia rebaudiana Bertoni en

los libros internacionales.

1908- Juan B. Aranda Jiménez en Puerto Bertoni-Alto

Paraná, realiza el primer cultivo extensivo, obteniendo

1000 kg/ha de hoja seca. P. Rasennack (Alemania) realiza

los primeros análisis químicos y cristaliza el

componente dulce de la hoja.

1909- Karl Dietrich (Alemania) aísla dos sustancias

dulces de la muestra enviada por Aranda Jimenéz y las

denomina eupatrina y rebaudina.

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Page 26: TESIS de Stevia Rebaudiana

1913- Aranda Jimenéz envía muestras a Europa a los

laboratorios de Amberes, Wiesbadenn y Hamburgo, donde se

aíslan también los mismos compuestos.

1915- Kobert considera a la eupatrina como una

saponina y concluye que existen dos tipos: una ácida y

otra neutra con propiedades hemolíticas.

1919- Se envían muestras a la Facultad de Agronomía

y Veterinaria de la República Argentina, donde se

realizan análisis y estudios de las hojas, llegándose a

la conclusión que se trata de una especie de alto valor

económico por su poder endulzante.

1921- El Dr. Bertoni pide que el cristal denominado

eupatorino sea designado con un nombre que recuerde el

género de la planta, para lo cual propuso stevina y la

Unión Internacional de Química lo adoptó como

esteviósido.

1931- Bridel y Lavielle, químicos franceses,

cristalizan el esteviósido con un 6 % de rendimiento y

determinaron que su poder endulzante era 300 veces mayor

que el azúcar de caña y rectificaron la fórmula,

quedando finalmente en C38H60O18. Pomaret y Lavielle

refutan el trabajo de Kobert, demostrando que el

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Page 27: TESIS de Stevia Rebaudiana

esteviósido no tenía relación con la saponina y que la

propiedad hemolítica era debido a las impurezas

presentes, además encontraron que el esteviósido no es

asimilado por el organismo, siendo eliminado en su forma

original.

1942- Es publicado en Inglaterra un artículo que

presenta al esteviósido como sustituto del azúcar.

1945- El Instituto Biológico Argentino ensaya y

obtiene algunos preparados para diabéticos.

1946- Una expedición encabezada por Aranda Jimenéz,

contratada por el Servicio Técnico Interamericano de

Cooperación Agrícola, se dirigió al lugar de origen en

la zona de Amanbay y llegó a traer 780 plantitas que

plantaron en el Instituto Agronómico de Caacupé.

1951- Nuevamente, Aranda Jimenéz y Arturo Florentín

del Ministerio de Agricultura y Ganadería recolectaron

en el mismo lugar, 350 plantas, que plantaron en el

Colegio de Agricultura "Mariscal Estigarribia" de San

Lorenzo.

1952- The National Institute of Arthritis and

Metabolic Diseases en Bethesda, Maryland, EE.UU.,

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Page 28: TESIS de Stevia Rebaudiana

estudia la estructura química y hace investigaciones con

el esteviósido.

1953- El Dr. Miguel Ovidio de Paraguay, concluye un

estudio sobre el esteviósido y su efecto sobre la

glucemia.

1954- El químico inglés F. Bell después de varios

estudios describe al esteviósido como el único

edulcorante, comparado con los demás conocidos.

1959- Se planta en el Jardín Botánico de Río de

Janeiro la especie, y en el mismo año el botánico José

Correa Gomez lleva nuevas plantas desde Paraguay al

Instituto de Botánica de San Pablo. Durante la década

del 50 se realizaron numerosos estudios en los distintos

laboratorios del mundo despertando gran interés el

edulcorante presente en Stevia.

1961- Luis Enrique De Gásperi inicia un cultivo

extensivo en Horqueta (Concepción), con plantitas

multiplicadas en la zona de Capitán Bado.

1962- Ángel Gonzaléz Aranda y Hnos. en la Colonia

Ex-Combatientes de Horqueta (Concepción), instala un

vivero y cultivo extensivo con plantitas traídas de la

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Page 29: TESIS de Stevia Rebaudiana

zona de Capitán Bado, lugar denominado Cerro Cuatía,

sobre el arroyo Taracá

1963- Ruddat, Lang y Mosetting, encontraron que el

steviol ejerce la misma función que la Giberelina A3.

1966- Se inicia en Paraguay la venta de ka´á-he´é

en forma natural bajo la denominación de "Dulce té del

Paraguay" del señor De Gasperi. Se registra la Patente

de Invención al señor De Gásperi sobre "Utilización de

Ramas y Tallos de Stevia" y otra sobre "Extracto de la

hoja".

1967- Se inicia la investigación de la stevia en

Kosakoka, Japón, con muestras llevadas desde Paraguay.

Von Schmelling estudió el método de aislamiento del

esteviósido y su uso como edulcorante no calórico.

1969- Sumida lleva la especie al Japón y Tayomenka

Kaisha Ltda. empezó a investigar sobre muestras enviadas

del Paraguay por Akira Suggi donde identificaron otra

sustancia, el rebaudiósido. El prof. Derek Bonton

(Premio Nobel de Química) en el Colegio Imperial de

Ciencia y Tecnología de Londres expone un trabajo sobre

stevia.

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Page 30: TESIS de Stevia Rebaudiana

1970- Los japoneses llevan nuevas plantas al Japón

y la industrial Química Shuda comienza el cultivo y la

investigación. La Compañía Tamasei inicia el cultivo

experimental en chacras del Ministerio de Salud. Carlos

Oviedo, paraguayo, concluye un estudio sobre "Acción

hipoglicemiante de la Stevia". Se inician

investigaciones con stevia en Brasil, en distintos

institutos.

1971- El Ministerio de Agricultura y Producción

Acuática del Japón inicia el cultivo experimental de

stevia. Haku Miura de la Universidad de Hokaido comienza

la investigación y el análisis de la planta. La firma

Química Industrial Shuda realiza la primera

comercialización del producto con el nombre de

"Steviarol". En la colonia japonesa Yguazú se realizan

trabajos de investigación de Stevia rebaudiana Bertoni.

1972- La Compañía Química Tamasei obtiene el primer

éxito en el Japón en la comercialización del

esteviósido.

1973- Se inicia el cultivo experimental de la

stevia en las 50 dependencias del Ministerio de

Agricultura del Japón en las distintas zonas del país.

30

Page 31: TESIS de Stevia Rebaudiana

1974- Isao Ohira, en Pedro Juan Caballero,

Paraguay, instala un vivero e inicia un cultivo

extensivo de stevia. La Cía. Química Tamasei registra

como marcas comerciales "Stevicus y Steviosin".

1975- En Japón se organiza una organización de la

stevia, formada por las compañías Shuda, Tamasei,

Química Nikkon, Celulosa Yamasaki Kokokiku, Química

Ikeda, Kosho Kagaku y otras para realizar todos los

estudios sobre el cultivo, la industrialización y

comercialización del esteviósido.

1976- En Paraguay, aparece la marca "Pirungá" del

señor Ángel González para la venta de la yerba dulce en

todas sus formas, autorizados por el Ministerio de

Salud. En el 6º Congreso Latinoamericano de

Farmacología, realizado en Buenos Aires, se presentan

los siguientes trabajos preparados por el Centro de

Investigación de la Stevia en San Pablo: "El efecto

inductor de la pérdida de peso corporal y la obesidad" y

"Los efectos antiarrítmicos reguladores del corazón". La

Dra. Gila Anmaral de Von Schmellings en la 28º. Reunión

Anual para el progreso de la Ciencia, presenta el

trabajo "Stevia rebaudiana Bertoni y sus efectos

hipoglicemiantes en conejos alexamizados", corroborando

el efecto antidiabético de la planta. Se inicia la

31

Page 32: TESIS de Stevia Rebaudiana

primera reunión general de la Sociedad de la Stevia en

el Japón. Ishima y Katayama, experimentan mezclas con

diversos azúcares y esteviósido, obteniendo buenas

respuestas y/o resultados en sabor en relación con la

fructuosa. Se crea en San Pablo, Brasil, el Centro de

Investigaciones de la Stevia. Se incrementa la

producción en otros países del Sudoeste Asiático (Corea,

Taiwan, Filipinas, Indonesia y Malasia).

1977- La Compañía Química Shuda, obtiene el

registro del producto rebaudiósido. Se inicia la

exportación masiva de hoja seca de Ka´a-he´e desde

Paraguay a Japón.

1978- Se incorpora a la Sociedad Química Maruzen,

Química Vegetal Zyomu. En un estudio realizado por la

Sociedad de la Stevia del Japón, se demostró que no es

tóxica, que no afecta al embarazo y el efecto negativo

anticoncepcional. Maruzen Kasei S.A. revela que los

ácidos tartárico, láctico, cítrico, acético y málico

disminuyen el efecto residual del esteviósido.

1979- Se inicia la provisión masiva de hoja al

Japón proveniente de Taiwan, Corea, Filipinas y otros

países. El Dr. Mauro Alvarez del Departamento de

Farmacia y Bioquímica de la Universidad de Maringá-

32

Page 33: TESIS de Stevia Rebaudiana

Brasil, obtiene una metodología para la extracción y

cristalización del esteviósido. Se crea la Cooperativa

de Productores de Ka´á-He´é Ltda., para el fomento,

producción y comercialización de la especie en Paraguay.

En la Universidad de California, en Davis, Clinton C.

Shock realiza investigaciones con semilla llevada de

Paraguay.

1980- Una misión oficial de la Cooperativa de

Productores de Ka´á-He´é de Paraguay, con el apoyo del

Ministerio de Agricultura y Ganadería viajan al Japón, a

fin de investigar el cultivo y su industrialización. Se

incorporan la Compañía Farmacéutica Oriental y la

Química Industrial Gran Japón INKI a la Sociedad

Japonesa de Stevia. La producción de Japón llega a 60

toneladas de hoja. Por decreto Nº 15.595 del 5 de mayo

de 1980, la Cooperativa de Productores de Ka´á-He´é del

Paraguay obtiene la personería jurídica y es inscripta

bajo el Nº 163 de Cooperativismo del M.A.G. que está

regulada por la Ley 349/72 y por el Decreto Nº 27.348

que lo reglamenta.

1981- Se incorporan las Compañía Fuji Furu, Química

Industrial Kyosui y Kokubum a la Sociedad. Se inicia el

estudio sobre aspectos crónicos a largo plazo del

esteviósido. Se realiza el Primer Seminario Brasilero

33

Page 34: TESIS de Stevia Rebaudiana

sobre Stevia, organizado por el Instituto de Tecnología

de Alimentos (ITAL). Se instala un vivero en la Colonia

Pte. Stroessner-Alto Paraná, Ruta internacional Nº 7 km

28.

1982- Se instala el Vivero La Fortuna en el km 296

de la Ruta Internacional Nº 7 (Colonia Pte. Stroessner-

Alto Paraná), con variedades mejoradas y se inicia

promoción del cultivo en dicha zona. Se inicia el

Segundo Seminario Brasilero de la Stevia organizado por

ITAL. El Ministerio de Agricultura y Ganadería por

resolución 23/05-02-82, declara de interés para el

desarrollo agrícola al ka´a-he´e y el fomento de su

cultivo. Se instala una planta piloto de extracción del

esteviósido en la universidad Estadual de Maringá,

Brasil. Shoch, Clinton (EE.UU.), expresa que los

compuestos químicos de la especie de mayor interés son

el esteviósido y el rebaudiósido A, aunque existan otros

seis componentes dulces.

1983- Se realiza el Primer Simposio Nacional de la

Stevia en Asunción-Paraguay, organizado por la Coop.

Productores de la especie. Inicia su producción la

planta piloto instalada en la Universidad de Maringá con

10 kg/día de esteviósido. Francisco Jordán Molero,

introduce en el Instituto Agronómico Nacional de Caacupé

34

Page 35: TESIS de Stevia Rebaudiana

una colección de plantas procedentes de distintos

lugares del Paraguay y del Brasil.

1984- Finaliza los estudios la Sociedad de Stevia

del Japón, concluyendo que el edulcorante es apto para

el consumo humano sin efectos colaterales. La Dra. Laura

Fracchia del I.N.T.N. de Paraguay, obtiene un método de

cristalización del esteviósido en el laboratorio de la

Institución.

1985- En el Instituto de Fisiología de I.N.T.A.-

Castelar, el Ing. Agr. Manuel C. Marcavillaca inicia sus

estudios sobre la acción giberélica de stevia y realiza

ensayos sobre propagación vegetativa de la especie.

1986- INGA Stevia Industrial S.A. (Brasil) empresa

formada para la explotación agrícola, industrial y

comercial de la stevia, firma contrato con la

Universidad Estadual de Maringá y el Banco Do Brasil,

para la explotación de la licencia y patente del

esteviósido a nivel industrial. El Ministerio de Salud

del Brasil, autoriza el uso del esteviósido como

edulcorante natural en alimentos y bebidas dietéticas.

Se realiza el Tercer Seminario Brasilero, organizado por

ITAL. La empresa Phoenix Agrícola S.A. del Paraguay en

su planta piloto llega a la cristalización del

35

Page 36: TESIS de Stevia Rebaudiana

esteviósido, rebaudiósido y separa, con tecnología

nacional la clorofila.

1987- Se constituye la Sociedad Fortuna Stevia del

Paraguay S.R.L., empresa dedicada a la promoción,

cultivo, acopio, industrialización y comercialización de

Ka´á-He´é que, con tecnología propia elabora el extracto

acuoso de la hoja. El Ing. Agr. Marcavillaca (Argentina)

logra las primeras plantas de stevia micropropagadas e

integra ensayos en laboratorio y a campo con el objetivo

de establecer las condiciones óptimas de manejo del

cultivo.

1988- INGA Stevia Industrial S.A. inaugura la

primera industria en Occidente el 8 de agosto de 1988 en

Maringá-Brasil, con una capacidad instalada de 9

toneladas por día de procesamiento de hoja, y que en la

primera fase solamente utilizará 3.000 kg/día, por falta

de materia prima, obteniendo un rendimiento del 10 % en

esteviósido.

1993- Se incorpora el esteviósido al Código

Alimentario Nacional (Resolución 101 del 22 de febrero

de 1993).

36

Page 37: TESIS de Stevia Rebaudiana

11 - Caracterización de la Stevia rebaudiana Bert.:

11.1 - Origen y distribución:

La mayoría de los estudiosos admiten que el ka´á-he

´é es una planta auténticamente paraguaya, originaria de

la Región Oriental del país, donde era utilizada por los

indios como edulcorante y para fines medicinales (Shock,

1982).

Según distintas fuentes se encuentra desde las

sierras del Mbaracayú, Campos Altos del Amambay hasta el

Monday, zonas de San Pedro, Capitán Bado, Yhú, Bella

Vista, San Salvador, Vacá Retá, entre el río Ypané e

Ybyraró, próximo al Cerro Cuarepotí, en Itacuí y en

Campos de Cerro Cuatía (Shock, 1982). La región se

encuentra entre 22-26º sur y 54-57º oeste. Los

Departamentos de Amambay, Concepción, San Pedro,

Canendiyú, Alto Paraná y Caaguazú estarían representados

en la zona mencionada. Otros autores indican que la

planta es autóctona de las fronteras del Paraguay con

Brasil (Pagliosa, 1982) encontrándose en el suroeste del

Brasil en la región de Amambay, división del Paraguay

con Matto Grosso do Sul. ha sido colectada en Ponta Porá

(Felippe, 1982). Monteiro (1982) menciona estudios de

37

Page 38: TESIS de Stevia Rebaudiana

especies brasileñas de Stevia y su interrelación con el

ka´á-he´é y de revisión taxonómica - morfológica de la

serie Multiaristatae de Stevia en Brasil. Sumida (1980)

observa que Stevia crece naturalmente o es cultivada en

los distritos de Amambay e Iguazú, frontera de Brasil,

Paraguay y Argentina (latitud 25ºS). Se ha naturalizado

en todo el Noreste Argentino. Se cultiva en Brasil en

Santa Catarina, Paraná, Sao Paulo, Matto Grosso do Sul y

Goias; en Paraguay en el Alto Paraná, Horquetas, Pedro

Juan Caballero, Capitán Bado, Quiindy, Coronel Oviedo y

la región del Chaco.

Actualmente Japón, China, Brasil y Paraguay parecen

ser los principales productores. Del Japón se ha

extendido a todo el sudeste asiático (Jordán Molero,

1984).

11.2 - Descripción botánica:

Stevia rebaudiana Bert. (yerba dulce), es una

planta arbustiva originaria del noreste de Paraguay,

perteneciente a la familia de las compuestas, que crece

en estado silvestre en forma de planta aislada. Fue

descripta botánicamente en 1905, por el naturalista

38

Page 39: TESIS de Stevia Rebaudiana

Moisés Santiago Bertoni, como una planta herbácea de 40

a 80 cm de altura.

La raíz es fibrosa, filiforme y perenne, formando

abundante cepa que apenas ramifica y no profundiza,

distribuyéndose cerca de la superficie; es el único

órgano de la planta que no contiene el esteviósido (De

Vargas, 1980). En plantas que se propagan asexualmente

por pedazos de tallos en arena gruesa, se ha observado

abundante ramificación del sistema radicular. Sumida

(1980) observó que las raíces finas abundan en la

superficie y las gruesas en las zonas más profundas del

suelo.

El tallo es anual, subleñoso, más o menos

pubescente, con tendencia a inclinarse, es más o menos

ramificado. Durante su desarrollo inicial no posee

ramificaciones, tornándose multicaule después del primer

ciclo vegetativo llegando a producir hasta 20 tallos en

3 a 4 años. En condiciones óptimas, el tallo puede

llegar hasta un metro y medio de altura (Sagakuchi,

1982).

Las hojas son elípticas oval o lanceoladas,

pequeñas, simples; borde o margen dentado; a veces en

39

Page 40: TESIS de Stevia Rebaudiana

verticilos; algo velludas. La hoja es el órgano con

mayor contenido del edulcorante (C.C.N., 1980).

Una planta tarda más de un mes en producir todas

sus flores. En Paraguay florece en octubre, diciembre y

marzo pero se clasifica como una planta de día corto,

situando el fotoperíodo crítico en 12 - 13 horas según

el ecotipo. La flor es hermafrodita pequeña y

blanquecina, en capítulos pequeños terminales o

axilares, agrupados en panículas corimbosas (Shock,

1982).

La polinización es entomófila; se dice que la

planta es autoincompatible (protandria) de tipo

esporofítico y clasificada como apomíctica obligatoria

(Monteiro, 1982).

El fruto es un aquenio que es diseminado por el

viento. Se clasifica en: claro estéril, oscuro fértil y

oscuro estéril (Gattoni, 1945).

El género Stevia tiene más de 100 especies en el

continente americano, de donde es originaria, pero

Stevia rebaudiana Bert. es la única especie con

principios edulcorantes en las hojas (Grashoff, 1972).

40

Page 41: TESIS de Stevia Rebaudiana

En el Paraguay es conocida con su denominación: Ka'á-

He'é, que significa yerba dulce en español.

11.3 - Ecotipos:

Esta especie presenta numerosos ecotipos.

Mitsuhashi (1975), seleccionó 28 ecotipos diferentes.

Para diferenciarlos se basó principalmente en sus

características morfológicas. Al determinar el contenido

de esteviósidos estos variaron entre 2,07 y 18,34 %.

Sumida (1980) describe una serie de experimentos donde

22 variedades de Stevia rebaudiana Bert. fueron

estudiadas para correlacionar, varias características de

la planta con la heredabilidad. Se observó 11

características morfológicas y 6 características de

contenido. De estas 17 características, solamente el

peso seco de hojas mostró una baja correlación con la

heredabilidad. Sumida, concluyó, que características

morfológicas y de contenido, principalmente de

principios activos, tienen efecto seleccionador

evidente.

11.4 - Citología:

41

Page 42: TESIS de Stevia Rebaudiana

Observaciones de Brucher (1974), revelan que la

planta es diploide, conteniendo 22 cromosomas.

Estudios de poliploídia fueron realizados por

Brucher (1974), por Utsunomiya (1977) y Sato y Kawakami

(1975). Estos últimos investigadores obtuvieron

variedades de alta calidad. La poliploídia puede

resultar un buen método para obtener aumentos de

productividad en términos de masa foliar y contenido de

principio activo, reduciendo el área plantada y por ello

los costos (Handro, 1984).

11.5 - Clima:

La región donde crece el ka´a-he´e es subtropical,

semihúmeda, con 1.400 a 1.800 mm. de lluvia, que se

distribuyen regularmente durante todo el año y

temperaturas extremas de -6º a 43ºC, con promedio de

24ºC. Según Sakaguchi (1982) la temperatura más

apropiada para Stevia es de 15 a 30ºC con un límite

inferior de -3ºC. Soporta medias mínimas de 5ºC.

42

Page 43: TESIS de Stevia Rebaudiana

La habilidad para resistir inviernos, aparentemente

es determinada por la temperatura del suelo. La amplitud

crítica está entre 0 a 2ºC. Mudas de 5 cms. con 10 hojas

soportaron temperaturas de -5ºC por 70 minutos

(Sagacuchi, 1982), lo que implica que las áreas

potenciales de producción de la especie podría

extenderse a latitudes mayores. En nuestra facultad

existe una pequeña parcela, con 50 plantas desde hace

aproximadamente 2 años. Durante el invierno su parte

aérea se seca, rebrotando desde la base en primavera.

La planta resiste la humedad pero no la sequía, y

esto puede explicarse por la morfología de su sistema

radicular.

Desarrolla mejor donde la estación de crecimiento

es larga, donde la intensidad de luz es alta, con

temperaturas tibias, riesgos mínimos de heladas luego de

la brotación y sin períodos de larga sequía. Los

fotoperíodos largos aumentan la longitud de los

entrenudos, área foliar, peso seco y aceleran la

aparición de hojas. La materia seca se reduce a la mitad

con fotoperíodos, de días cortos. Azúcares, proteínas y

esteviósidos aumentan tanto en valores absolutos como

relativos en días largos (Sagacuchi, 1982).

43

Page 44: TESIS de Stevia Rebaudiana

Para la producción de mudas (propagación) es

necesario temperaturas por sobre los 15ºC.

11.6 - Suelos:

Se la puede cultivar en suelos muy variados. En su

estado natural, la planta crece en suelos tanto de baja

fertilidad, ácidos, de tipo arenoso como hasta orgánicos

y con alta humedad (Shock, 1982). Algunos autores

recomiendan tierras areno-arcillo-humífera-ferruginosa o

simplemente arena humífera. Se desarrolla bien en suelos

colorados del Alto Paraná. La tierra ideal es la areno-

arcillosa con regular proporción de humus. Se adapta

bien a suelos arcillosos con buen drenaje, no así a

lugares con exceso de humedad. Prospera bien en suelos

de desmonte, no así en tierras recién desmontadas, con

mucha materia orgánica, por problemas de enfermedades

(C.C.N., 1980). La planta crece naturalmente en suelos

de ph 4-5, pero crece bien entre 6.5-7.5 siempre que no

sean salinos (Shock, 1982).

12 - Características agronómicas:

44

Page 45: TESIS de Stevia Rebaudiana

Stevia rebaudiana Bert. es una especie semiperenne

que en cultivo puede durar entre 5 y 6 años, con 2 o 3

cortes anuales; el rendimiento anual de hoja seca en

Paraguay oscila entre 1500 y 2500 kg/ha, en condiciones

de secano y alrededor de 4300 kg/ha con riego (Jordán

Molero, 1984).

En Japón, en 1 o 2 cosechas por año, el rendimiento

de hoja seca varía entre 3000 y 3500 kg/ha en el primer

año, 4000 a 4500 kg/ha en el segundo, 4000 a 6000 kg/ha

en el tercero, disminuyendo a 4000 kg/ha en el cuarto

(Sumida, 1980).

Según distintos autores la densidad de plantación

puede variar entre 20.000 a 400.000 pl/ha, en hileras

sencillas, dobles o triples. Altas densidades, reducen

el desarrollo de ramas laterales y el rendimiento en

peso seco por planta, aumentando el número de plantas

muertas luego de la cosecha y las dificultades en la

misma (Sakaguchi, 1982).

Se estima que la densidad optima de 88000 pl/ha, se

da a distancias de 75 cm entre hileras y 15 cm dentro de

la misma (Jordán Molero, 1984).

45

Page 46: TESIS de Stevia Rebaudiana

12.1 - Propagación sexual de Stevia rebaudiana (Bert):

Se reproduce sexualmente por aquenios, observándose

alta heterogeneidad en las poblaciones resultantes. La

planta es de polinización cruzada y gran parte de sus

aquenios son estériles; son livianos y de fácil

dispersión por el viento. La floración no es uniforme,

lo mismo que la maduración de la semilla, siendo la

recolección lenta y difícil. Para mejorar la calidad de

las semillas se recomienda incorporar apiarios en la

plantación. El porcentaje de germinación varia entre 10

y 38 %. La longevidad de los aquenios es corta y ya a

los 4 meses el potencial de germinación se reduce un 40-

70 %, después de 8 meses es casi nulo. Las semillas

deben guardarse en condiciones de baja humedad, baja

temperatura, preferentemente en la oscuridad y en

envases herméticos (Felippe et al., 1971; De Vargas,

1980; Sagakuchi et al., 1982; Jordán Molero, 1984).

12.2 - Propagación vegetativa de Stevia rebaudiana

(Bert):

Esta especie puede propagarse vegetativamente por

separación de hijuelos. Este método sólo puede

46

Page 47: TESIS de Stevia Rebaudiana

utilizarse para pequeñas plantaciones, ya que el número

de mudas producidas es reducido.

En la base del tallo, o bajo tierra, en la

primavera temprana aparecen pequeños vástagos, muchos

con sus respectivas raíces que pueden separarse y

plantarse en el lugar definitivo (Jordán Molero, 1984).

Otra forma de propagación vegetativa es a través de

estacas; método que convenientemente ajustado podría ser

usado a escala comercial.

Diferentes autores obtuvieron respuestas variables

al utilizar estacas apicales o subapicales, con diversos

sustratos, en distintas épocas del año y al incluir

tratamiento rizogénico (Felippe, 1977; De Vargas, 1980;

Sumida, 1980; Shock, 1982; Jordán Molero, !983 y 1984).

El cultivo de tejidos es otro método de propagación

vegetativa que permite obtener plantaciones más

uniformes, además de la rápida multiplicación clonal

(Yang, 1979 y 1981; Marcavillaca, 1985).

Marcavillaca et al (1993) proponen la combinación

de macro y micropropagación; las plantas micropropagadas

se utilizan como banco de plantas madres y en sólo 3

47

Page 48: TESIS de Stevia Rebaudiana

ciclos de multiplicación (1 de micro y 2 de

macropropagación), se lograría a partir de una sola

planta, material para cultivar 3 ha (225.000 plantas).

13 - Propagación vegetativa:

La historia de la producción vegetal se ha

caracterizado por el desarrollo de tecnologías de

avanzada que facilitan y optimizan la propagación

vegetativa. La posibilidad de controlar el ambiente (uso

de nieblas, calefactores, termostatos, serenos, etc),

amplia el espectro de especies que pueden seleccionarse

y multiplicarse de esta forma (Marsden, 1955).

La propagación vegetativa o asexual se utiliza para

producir una planta que posea el mismo genotipo que la

planta madre (planta donadora) y esto es posible porque

todas las células de una planta poseen la información

necesaria y/o suficiente para reproducir la planta

entera (Hartmann et al., 1992).

En la multiplicación por estacas solo es necesario

que un nuevo sistema de raíces adventicias se

desarrolle, ya que la estaca posee yemas con aptitud

48

Page 49: TESIS de Stevia Rebaudiana

potencial para desarrollar nuevos vástagos (Hartmann et

al., 1992).

Las raíces adventicias son de dos tipos: raíces

preformadas y raíces de herida (inducidas). Las raíces

preformadas se forman naturalmente durante los primeros

periodos de desarrollo del vástago, pudiendo emerger

antes de la realización de estacas o permaneciendo en

dormición hasta que se realicen las mismas y sean

colocadas en condiciones ambientales favorables. Las

raíces de herida desarrollan sólo después que la estaca

es cortada, por efecto de la herida producida en la

preparación de la misma. Estas raíces, son consideradas

como formadas de novo (nueva formación)(Davies y

Hartmann, 1988).

Cuando se prepara una estaca, las células más

cercanas a la superficie son lesionadas y expuestas,

comenzando la respuesta de cicatrización de la herida

(Cline y Neely, 1983). En el proceso de regeneración de

raíces, ocurren los siguientes tres pasos:

- A medida que las células externas, lesionadas,

se mueren, se forma una lámina necrótica que

sella la herida con un material suberoso y se

49

Page 50: TESIS de Stevia Rebaudiana

tapona el xilema con gomas. Esta lámina ayuda a

proteger la superficie del corte de

desecamientos y patógenos.

- Por detrás de la lámina, células vivas comienzan

a dividirse después de algunos días y una capa

de células parenquimatosas (callo), forma una

peridermis.

- Ciertas células, en la vecindad del cambium

vascular y floema, comienzan a dividirse e

inician la formación de raíces adventicias.

13.1 - Bases fisiológicas de la iniciación de raíces

adventicias:

Varias clases de reguladores de crecimiento, tales

como auxinas, cytokininas, giberelinas y etileno e

inhibidores, como el ácido abscísico y fenólico,

influyen sobre la iniciación de raíces. De ellas, la

auxina es la que tiene el mayor efecto sobre la

formación de raíces en estacas (Hartmann et al., 1992).

50

Page 51: TESIS de Stevia Rebaudiana

13.1.1 - Efecto de las hojas sobre el enraizamiento:

(Hartmann et al., 1992)

Es ampliamente conocido que la presencia de las

hojas en la estaca, ejerce una fuerte influencia,

estimulando la iniciación de raíces.

La traslocación de carbohidratos desde las hojas

sin duda contribuye, a la formación de raíces, sin

embargo, la mayor promoción del enraizamiento por efecto

de las hojas y yemas, es posiblemente resultado de otros

factores más directos (Breen, 1974). Hojas y yemas, son

conocidas como poderosos centros productores de auxinas,

y los efectos son observados directamente por debajo de

ellos, demostrando el transporte polar, desde el ápice a

la base. Estacas de ciertas especies son fácilmente

enraizadas, mientras que estacas de otras enraízan con

mayor dificultad.

13.1.2 - Fotosíntesis de las estacas:

La fotosíntesis de las estacas no es un

requerimiento absoluto para la formación de raíces. Esto

puede ser observado en estacas con muchas hojas, que se

llevan a un sitio oscuro y con estacas deshojadas

51

Page 52: TESIS de Stevia Rebaudiana

(nofotosíntetizantes), que enraízan (Davis y Potter,

1981). Pero puede generalizarse que, la fotosíntesis en

estacas, es probablemente más importante después de la

iniciación de raíces y ayudaría en el desarrollo y

crecimiento más rápido de las raíces (Davis, 1989).

13.2 - Factores que afectan la multiplicación por

estacas:

13.2.1 - Diferencias entre plantas individuales

procedentes de semilla:

Al enraizar estacas tomadas de plantas individuales

de una especie, que de ordinario se propaga por

semillas, la experiencia ha demostrado que pueden

existir amplias diferencias entre estacas tomadas de

ellas (efectos y/o variabilidad del genotipo )(Hartmann

et al., 1992).

13.2.2 - Diferencias entre las zonas apicales y básales

de la rama: (Hartmann et al., 1992)

52

Page 53: TESIS de Stevia Rebaudiana

En la composición química de las ramas hay marcadas

diferencias de la base a la punta. En las estacas

tomadas de distintas partes de las ramas en ocasiones se

observa variabilidad en la producción de raíces y en

muchos casos el mayor porcentaje de enraíce se obtiene

en estacas procedentes de la porción basal de la rama.

Puede ocurrir que en tallos de un año o más de

edad, los carbohidratos se hayan acumulado en la base de

las ramas y tal vez se han formado algunas iniciales de

raíz, posiblemente bajo la influencia de sustancias

promotoras de raíces procedentes de yemas y de hojas, y

por lo tanto el mejor material para estacas puede

provenir de la porción basal de esas ramas.

Pero, el mejor enraizamiento de las estacas

apicales podría explicarse por la posibilidad de que en

el ápice se encuentre una mayor concentración de

sustancias endógenas promotoras del enraizamiento ya que

las mismas se originan en las secciones apicales (yemas

apicales). También, las estacas apicales son más jóvenes

y en consecuencia, hay más células capaces de volverse

meristemáticas. En las especies que enraízan fácilmente,

este factor es de poca importancia, cualquiera sea la

posición de la estaca en la rama.

53

Page 54: TESIS de Stevia Rebaudiana

13.2.3 - Estado reproductivo o vegetativo:

En la mayoría de las plantas se pueden hacer

estacas de ramas en condición vegetativa o en condición

reproductiva. Nuevamente, en especies que enraízan

fácilmente no existen grandes diferencias entre

distintos estados fenológicos en que se encuentre la

planta, pero en especies que enraízan con dificultad,

éste puede ser un factor de importancia. Por ejemplo, en

dalia, las estacas que portan yemas florales tienen

mayor dificultad para enraizar que las estacas que

tienen solamente yemas foliares (Biran y Halevy, 1973).

13.3 - Sustratos para el enraizamiento:

Hay diversos medios y mezclas de éstos que se usan

con el fin de hacer enraizar estacas. Para obtener

buenos resultados se requieren las siguientes

características (Richards; Warneke y Aljibury, 1964):

- El medio debe ser lo suficientemente firme y

denso para mantener las estacas en su sitio

54

Page 55: TESIS de Stevia Rebaudiana

durante el enraíce; su volumen no debe variar

mucho, ya sea seco o mojado; resulta perjudicial

que tenga un encogimiento excesivo al secarse.

- Debe retener la suficiente humedad para que no

sea necesario regarlo con mucha frecuencia.

- Debe ser lo suficientemente poroso, de modo que

se escurra el exceso de agua y permita una

aireación adecuada.

- Debe estar libre de malezas, nemátodos y otros

patógenos.

- No debe tener un nivel excesivo de salinidad.

- Debe poderse esterilizar con vapor o químicos

sin que sufra efectos nocivos.

- Debe existir una adecuadada provisión de

nutrientes para todo el período, aunque

suplementaciones con fertilizantes de lenta

liberación son frecuentemente recomendados.

55

Page 56: TESIS de Stevia Rebaudiana

Un medio ideal de propagación, debe estar provisto

de suficiente porosidad para permitir una buena

aireación y una alta capacidad de retención de agua,

debe tener un buen drenaje y estar libre de patógenos

(Hartmann et al., 1992).

13.3.1 - Arena:

La arena está formada por pequeños granos de

piedra, de alrededor de 0.05 a 2 mm de diámetro,

dependiendo su composición mineral de la que tenga la

roca madre. En propagación, generalmente, se emplea

arena de cuarzo. De preferencia se debe fumigar o tratar

con calor antes de usarla para esterilizarla.

Virtualmente no contiene nutrientes minerales y no tiene

capacidad amotiguadora (Buffer) o capacidad de

intercambio cationico. Casi siempre se usa en

combinación con algún material orgánico (Hartmann et

al., 1992).

13.3.2 - Turba:

56

Page 57: TESIS de Stevia Rebaudiana

La turba se forma con restos de vegetación

acuática, de marismas, ciénagas o pantanos, que se ha

preservado bajo el agua en un estado de descomposición

parcial.

La turba de pantanos esta formada por restos de

pastos, juncos y otras plantas de pantanos. Este tipo de

turba es variable en su composición y color. Su pH varía

alrededor de 4 a 7.5 y su capacidad de retención de

humedad es de 10 veces su peso seco (Hartmann et al.,

1992).

13.3.3 - Humus de lombriz:

El humus de lombriz con forma de restos vegetales,

restos animales (no deben utilizarse crudos) y restos

domiciliarios orgánicos, que acumulados, forman un

compost, y con el agregado de lombrices que digieren la

materia orgánica, resulta en un producto final, llamado

vermicompuesto, semejante al humus, atóxico para los

vegetales y excelente mejorador de suelos.

Algunas características del humus de lombriz

modifican las propiedades físico - químicas y

microbiologicas del suelo: a)- le comunica al suelo

57

Page 58: TESIS de Stevia Rebaudiana

mayor porosidad y aireación, mejorando también la

infiltración y favoreciendo el desarrollo radical; b)-

se liberan gradualmente los nutrientes que las plantas

necesitan, pues al mantener el pH dentro de un rango

cercano a la neutralidad (6-7)( con gran poder buffer) ,

les permite una mayor solubilidad. El tenor de

microelementos: Cu, Mn, Mo y Zn, es elevado; c)-

contiene los mismos microorganismos benéficos que tiene

el suelo, pero en mayor cantidad, destacándose los que

transforman la celulosa y los que intervienen en la

asimilación de nitrógeno y fósforo; d)- aumento de la

velocidad de emergencia de las plántulas; e)- permite

una larga permanencia de ciertos hongos benéficos del

suelo. Estos microorganismos que suelen ser efectivos

para controlar hongos dañinos del suelo, suelen tener en

él poca durabilidad. El humus de lombriz les permite un

buen desarrollo tórnadolo efectivo en la lucha, por

ejemplo contra dampig off ( Mirabelli, 1995).

13.4 - Mezclas de suelo para cultivo en maceta:

(Hartmann et al., 1992)

En los sistemas de propagación, las estacas

enraizadas algunas veces se plantan directamente en el

campo, pero por lo general, esto no es satisfactorio

58

Page 59: TESIS de Stevia Rebaudiana

para la sobrevivencia de las mismas, por ello con

frecuencia se les inicia en una mezcla de suelo en

diversos recipientes.

Para lograr mezclas de suelo más uniformes y de

mejor textura para macetas, a veces se añade arena a la

tierra y algo de materia orgánica, en forma de turba,

viruta de madera o corteza desmenuzada. También se usan

otras mezclas, sin el agregado de tierra, para la

propagación y cultivo de plantas. Pueden citarse mezclas

de turba y perlita o turba y arena, pero al ser pobres

en nutrientes, necesitan el agregado de fertilizantes.

El humus de lombriz puede utilizarse satisfactoriamente

por todas las buenas características que presenta.

59

Page 60: TESIS de Stevia Rebaudiana

JUSTIFICACION OBJETIVO HIPOTESIS

60

Page 61: TESIS de Stevia Rebaudiana

JUSTIFICACIÓN:

La inclusión del esteviósido en el Código

Alimentario Nacional (Resolución 101 del 22-2-93) y la

posibilidad de exportación ha incrementado el interés en

esta especie por parte de productores.

El bajo valor cultural de las semillas (10 al 15 %)

(Felippe et al, 1971) y la heterogeneidad de las

poblaciones resultantes (Pagliosa, 1982), indican la

necesidad de desarrollar y/o ajustar técnicas

alternativas, sencillas y económicas, que permitan la

propagación masiva de genotipos selectos (Marcavillaca

et al, 1993).

OBJETIVO:

El objetivo del presente trabajo de intensificación

es estudiar, como el origen de la estaca, la época del

año y/o estado fenológico, el sustrato de enraizamiento

y la presencia de sustancias rizogénicas, afectan la

propagación vegetativa de Stevia rebaudiana Bert.

HIPÓTESIS:

61

Page 62: TESIS de Stevia Rebaudiana

- Las respuestas en el enraizamiento de Stevia

rebaudiana Bert. están condicionada por la

posición de la estaca en la planta (estaca

apical vs estaca subapical).

- El tipo de sustrato afecta la longitud y peso

de las raíces formadas.

- Durante el período de crecimiento anual (desde

primavera a fines de otoño), pueden realizarse

varios ciclos de multiplicación (cortes de

estacas), con el mismo stand de plantas madres

con porcentajes de enraizamiento razonables.

62

Page 63: TESIS de Stevia Rebaudiana

MATERIALES Y METODOS

63

Page 64: TESIS de Stevia Rebaudiana

MATERIALES Y MÉTODOS:

Estas experiencias se realizaron con material

extraído de plantas de Stevia rebaudiana Bert. (tres

clones: A-B-C), de origen japonés, que se mantienen en

el campo experimental de la Facultad de Agronomía (UBA)

(fotografía), las que se riegan y fertilizan

periódicamente; los ensayos se iniciaron luego del

rebrote primaveral cuando el crecimiento en la mayoría

de los vástagos fue tal que permitió extraer estacas

apicales (Ap) y subapicales (Sap) de aproximadamente 10-

12 cm (2 o 3 nudos).

Las bases de las estacas (2 cm), apicales (Ap) y

subapicales (Sap) se trataron durante 24 hs, en una

solución de ácido indolbutírico (IBA)(25 mg/l, en

solución alcohólica al 10 %) (Marcavillaca et al, 1993).

Previamente, a las mismas, se les disminuyó el número de

hojas presentes en los nudos inferiores, para disminuir

la superficie de transpiración (Hartmann et al, 1992).

Posteriormente se plantaron en bandejas de plástico

(32 por 32 por 18 cm), sobre un sustrato de turba y

arena (Ta)(1:1) ó turba y humus de lombriz (Tl)(1:1), y

colocando 36 estacas por bandeja (12 estacas de cada

clon), realizándose tres repeticiones de cada

64

Page 65: TESIS de Stevia Rebaudiana

tratamiento. Sobre las bandejas se construyó un armazón

de alambre, abovedado y se cubrió con una lámina de

polietileno, para crear una cámara húmeda, manteniéndose

las mismas a la sombra. Al comienzo del ensayo y a las

dos semanas se pulverizó con Captan (1,5 gr/l de

solución), para disminuir la posibilidad de enfermedades

fúngicas. A las cuatro semanas se contabilizó el número

de estacas muertas y enraizadas, determinándose,

porcentaje de enraizamiento (%E), longitud de raíces

(LgR) por el método de Tennant (1975)(ver anexo) y peso

seco de raíces (PSR) y parte aérea (PSA).

Este primer ensayo se inició el 29 de noviembre de

1994 (F1) y se repitió durante todo el período anual de

crecimiento, cada vez que los vástagos de las plantas

madres alcanzaron una longitud tal que permitió el corte

de estacas apicales y subapicales; el segundo se realizó

el 12 de enero de 1995 (F2); el tercero el 2 de marzo de

1995 (F3) y el cuarto el 6 de abril de 1995 (F4) y las

evaluaciones se iniciaron el 29 de diciembre de 1994, el

15 de febrero de 1995, el 4 de abril de 1995 y 9 de mayo

1995, respectivamente.

En el ensayo iniciado el 12 de enero de 1995 (F2),

a las estacas correspondientes al clon A se les incluyó

otro factor: con y sin tratamiento hormonal (IBA y

65

Page 66: TESIS de Stevia Rebaudiana

noIBA), factor que también fue estudiado en las fechas

restantes (F3 y F4) para los tres clones (A, B, C),

tipos de estaca (Ap y Sap) y sustratos (Ta y Tl) (Tabla

1).

En cada una de las fechas de los ensayos se tomaron

muestras de estacas (n=10) apicales (Ap) y subapicales

(Sap) y se estimó peso seco de las mismas.

Para evaluar peso seco se separaban las raíces de

la parte aérea. En por lo menos cinco estacas de cada

tratamiento, se determinó la longitud de las raíces y

luego se secó todo el material enraizado en estufa a

50ºC, durante 72 hs, pesándose posteriormente en balanza

analítica (precisión: 10-4 gr). El peso de la parte

aérea se ajustó según:

Crecimiento de la parte aérea (CpA)= Peso seco aéreo

total - media del peso seco inicial de cada fecha y tipo

de estaca.

Se realizó un ensayo factorial, con medidas

repetidas en el tiempo, con un diseño de bloques al azar

y los resultados se evaluaron a través de un análisis de

varianza, para el mismo se utilizó el programa

estadístico Number Cruncher Statistical System (NCSS)

66

Page 67: TESIS de Stevia Rebaudiana

(Hintze, 1991). Las variables estudiadas fueron:

porcentaje de enraizamiento (%E), longitud de raíces

(LgR), peso seco de raíces (PSR) y peso seco de la parte

aérea (PSA) y relación peso de las raíces/peso total

(rPSR/PT) con:

Peso total= Crecimiento de la parte aérea (CpA) + peso

de las raíces (PSR).

Cuando las variables analizadas son porcentaje de

enraizamiento o relación peso de raíces/peso total,

previamente se realizó transformación de datos

(arcoseno).

67

Page 68: TESIS de Stevia Rebaudiana

RESULTADOS Y DISCUSION

68

Page 69: TESIS de Stevia Rebaudiana

RESULTADOS Y DISCUSIÓN:

Durante las realizaciones del ensayo al

contabilizar el número de individuos muertos, a los 15 y

28 días se observó que el número de los mismos era mayor

en los tratamientos de turba y arena. Sobre un total de

432, 462 y 576 estacas para cada una de las fechas, las

pérdidas fueron en la primer fecha 61 y 70, segunda

fecha 46 y 53 y en la tercer fecha 40 y 75, para turba y

humus de lombriz y turba y arena respectivamente;

valores que implican 22% de perdida total para las tres

fechas juntas.

La cuarta fecha (F4), se excluyó del análisis de

los datos ya que sólo esporádicamente algunas estacas

subapicales enraizaron. A comienzos del mes de marzo,

con fotoperiódos de 13 1/2 hs comienza la floración en

los tres clones. Se ha postulado la hipótesis de la

existencia de un complejo hormonal complementario de la

floración, y las giberelinas, que se sintetizan en esta

etapa, serían las responsables esenciales de la

formación y crecimiento de los tallos florales (Barceló

Coll et al, 1983).

Se ha observado que las giberelinas, en

concentraciones relativamente elevadas, de manera

69

Page 70: TESIS de Stevia Rebaudiana

consistente han inhibido la formación de raíces

adventicias (Sircar, 1974). Esta inhibición sería un

efecto local directo que impediría la división temprana

de las células que intervienen en la transformación de

tejido maduro a una condición meristemática (Brian et

al, 1960). En estacas de hoja de Begonia se observó que

el ácido giberélico inhibía la formación, tanto de yemas

como de raíces adventicias, probablemente, bloqueando

las divisiones celulares organizadas, que inician la

formación de los primordios de yemas y de raíces (Heide,

1969).

En la mayoría de las plantas se pueden hacer

estacas de ramas en condición vegetativa o en condición

reproductiva. En especies que enraízan fácilmente no

existen grandes diferencias entre los distintos estados

fenológicos en que se encuentre la planta, pero en

especies que enraízan con dificultad, éste puede ser un

factor de importancia. Por ejemplo, en el arándano azul

(Vaccinium atrococcum), las estacas de madera dura

conteniendo yemas florales no enraízan tan bien como las

que sólo tienen yemas foliares. Cuando se usó madera

vegetativa, enraizó un 39% de las estacas, pero cuando

las estacas contenían una o más yemas florales, ninguna

enraizó (Hartmann et al., 1992). En dalia, las estacas

que portan yemas florales tienen mayor dificultad para

70

Page 71: TESIS de Stevia Rebaudiana

enraizar que las estacas que tienen solamente yemas

foliares (Biran y Halevy, 1973). En los rododendros, la

remoción temprana de las yemas florales potenciales

aumentó el enraizamiento, presumiblemente debido a la

eliminación de un estímulo promotor de la floración

antagonista del enraizamiento. La remoción posterior de

las yemas florales todavía aumentó el enraíce, tal vez

eliminando la competencia por los materiales necesarios

para la formación de raíces (Hartmann et al., 1992). La

floración es un fenómeno complejo que puede disminuir

la competencia entre destinos en perjuicio del

enraizamiento. En nuestro caso en F4 solo enraizaron

algunas estacas subapicales las cuales poseen muy pocas

yemas florales. Manchado de Carvalho y Zaidan (1995)

también observaron en esta especie bajos a nulos

porcentajes de enraizamiento cuando las plantas madres

se encuentran en estado reproductivo. Con muchas

especies ornamentales (Abelia, Ligustrum, Ilex, etc)

cuando se trabaja en escala comercial, se remueven yemas

florales en las estacas para un desarrollo de raíces más

rápido, un crecimiento vegetativo temprano y una mayor

eficiencia en la producción de la cicatrización

(Hartmann et al., 1992).

71

Page 72: TESIS de Stevia Rebaudiana

Porcentaje de enraizamiento:

Los resultados obtenidos se observaron en las

figuras 1, 2, y 3 y las tablas 2, 3 y 4. Se encontraron

diferencias altamente significativas entre clones (F**

14,47) y entre sustratos (F** 66,68) y no significativas

(ns) entre tipo de estaca y entre fechas de corte

(figura 1 y tabla 2). Los porcentajes de enraizamiento

fueron siempre altos, variando entre 55 y 75% (tabla 2).

Al estudiar la tercer fecha, con inclusión de

tratamiento rizogénico (figura 2 y tabla 3), se hallaron

diferencias significativas (F* 5,62) entre estacas y

altamente significativas entre sustratos (F** 47,75) y

entre tratamientos hormonales (F** 12,83). Los

porcentajes de enraizamiento variaron entre 35 y 74%

(tabla 3). Al estudiar el clon A (figura 3 y tabla 4)

incluyendo tratamiento con y sin hormona (IBA-noIBA), se

encontraron diferencias altamente significativas entre

sustratos (F** 47,75) y entre tratamientos rizogénicos

(F** 12,83) y significativas al 8% entre estacas (F*

3,07). Los porcentajes de enraizamiento variaron entre

41 y 90% (tabla 4).

72

Page 73: TESIS de Stevia Rebaudiana

Longitud de raíces:

Los resultados obtenidos se observan en las figuras

4, 5, y 6 y las tablas 5, 6 y 7. Se encontraron

diferencias altamente significativas entre fechas (F**

7,08), entre clones (F** 10,09), entre estacas

(F**27,13) y entre sustratos (F** 294,29) (figura 4 y

tabla 5) y entre las interacciones Fecha x Estaca (F**

8,39) (tabla 5.1), Clon x Estaca (F** 8,45) (tabla 5.2)

y significativas entre Fecha x Clon (F* 4,09) (tabla

5.3), las longitudes variaron entre 75 y 225 cm (tabla

5). Al analizar la tercer fecha, con inclusión de

tratamiento rizogénico (figura 5 y tabla 6) se

encontraron diferencias altamente significativas entre

sustratos (F** 75,25) y entre hormonas (F** 14,04) y

significativas entre estacas (F* 3,33) y entre clones

(F* 3,4). Las medias variaron entre 66 y 189 cm (tabla

6). Al estudiar el clon A durante dos fechas (F2 y F3),

se encontraron diferencias altamente significativas

entre sustratos (F** 58,74), entre tratamientos

hormonales (F** 8,85) y las longitudes extremas fueron

51 y 222 cm (figura 6 y tabla 7).

73

Page 74: TESIS de Stevia Rebaudiana

Peso de raíces:

Los resultados obtenidos se observan en las figuras

7, 8 y 9 y las tablas 8, 9 y 10. Se encontraron

diferencias altamente significativas entre clones (F**

5,7) y entre sustratos (F** 165,8) y significativas

entre fechas (F* 2.90), con medias que variaron entre 7

y 31 mg (figura 7 y tabla 8). Al analizar la tercer

fecha con inclusión de tratamiento rizogénico (figura 8

y tabla 9), se encontraron diferencias altamente

significativas entre sustrato (F** 31,86) y entre

tratamientos rizogénicos (IBA-noIBA) (F** 6,33) y los

pesos variaron entre 8 y 23 mg (tabla 9). Estudiando el

clon A durante dos fechas (F2 y F3) se observaron

diferencias altamente significativas entre sustratos

(F** 31,31) y significativas entre hormonas (F* 4,23) y

los pesos de todos los tratamientos variaron entre 5 y

19 mg (tabla 10).

Peso de parte aérea:

En esta parte del ensayo se analiza el crecimiento

verificado de la parte aérea, por encima del peso

inicial de las estacas iniciales, durante el

enraizamiento. Los datos observados se muestran en las

74

Page 75: TESIS de Stevia Rebaudiana

figuras 10, 11 y 12 y las tablas 11, 12 y 13. Se

encontraron diferencias significativas entre fechas (F**

122,72), entre clones (F** 5,37), entre estacas (F**

13,29) y entre sustratos (F** 9,71) y significativas en

la interacciones Fecha x Clon (F* 3,85) (figura 10 y

tablas 11 y 11.1) y los pesos variaron entre 31 y 64 mg.

Al analizar la tercer fecha se encontraron diferencias

altamente significativas entre sustratos y hormonas (F**

7.29 y 5,63 respectivamente) y significativas entre

clones (F* 3,76) y estacas (F* 4,08), con pesos que

variaron entre 14 y 26 mg (tabla 12). Cuando se estudió

el clon A durante dos fechas (F2 y F3) con respecto a

estas variables se encontraron diferencias altamente

significativas entre sustratos (F** 6,22) y

significativas entre estacas (F** 4,75) (figura 12), con

pesos que variaron entre 15 y 26 mg (tabla 13).

Relación peso de raíces parte aérea:

Los datos observados se muestran en las figuras 13,

14 y 15 y las tablas 14, 15 y 16. Se encontraron,

diferencias altamente significativas entre fechas (F**

26,73), entre estacas (F** 12,10) y entre sustratos (F**

36,32) y las mismas variaron entre 0,04 y 0,15 (tabla

14). Al analizar la tercer fecha con tratamiento

75

Page 76: TESIS de Stevia Rebaudiana

rizogénico, se observaron diferencias altamente

significativas entre sustratos (F** 10,1) y entre

estacas (F** 6,08) y significativas entre clones (F*

2.64) (figura 14) y las estacas variaron entre 0,12 y

0,21 (tabla 16). Al analizar al clon A durante dos

fechas (F2 y F3), se encontraron diferencias altamente

significativas entre fechas (F** 7,27) y significativas

entre sustratos (F* 4,23), entre estacas (F* 3,78) y

entre hormonas (F* 4,25) (figura 15), mientras que las

medias variaron entre 0,1 y 0,18 (tabla 16).

Al analizar en conjunto las distintas variables

(porcentaje de enraizamiento, longitud de raíces, peso

de raíces, peso de la parte aérea y relación peso de

raíces/peso total), surge de inmediato la superiodidad

del sustrato humus de lombriz y turba, sobre turba y

arena, ya que en todos los ensayos se observaron mayores

valores que sobre cualquier tratamiento (tablas 2 a 16),

incluso al estudiar el largo de raíces y/o peso

correspondientes a los tratamientos sin hormona, eran

mayores que los de turba y arena con hormona (tablas 6.1

y 9.1). Es evidente que las características físico-

químicas del mismo lo convierten, en un sustrato

altamente recomendable para la propagación a escala

comercial de distintas especies, ya que por su

76

Page 77: TESIS de Stevia Rebaudiana

consistencia y tamaño de partículas, permite un anclaje

adecuado de las estacas, el mantenimiento de altos

tenores de humedad, sin disminuir la porosidad y

aireación que facilitan el intercambio gaseoso,

liberando gradualmente los nutrientes necesarios.

Asimismo, podría postularse que los menores porcentajes

de pérdidas con este sustrato serían consecuencia de la

presencia en el mismo de poblaciones de microorganismos

benéficos.

En la mayoría de los ensayos se encontraron

diferencias significativas entre clones, lo que da idea

de la variabilidad existente entre los mismos. Se

esperaba encontrar menor heterogeneidad entre ellos, ya

que a pesar de ser clones, las semillas que los

originaron provenían de una misma planta. La

heterogeneidad de las poblaciones resultantes de la

multiplicación sexual, señalan la necesidad de trabajar

con material seleccionado y propagado vegetativamente

(Marcavillaca y Divo de Sesar, 1993). Al evaluar

porcentajes de enraizamiento en la tercer fecha no hubo

diferencias entre clones (figura 2 y tabla 3), pero si

en la calidad de las raíces formadas (longitud y peso,

figuras 5 y 8 y tablas 6 y 9). La aptitud para

diferenciar raíces de especies herbáceas suele ser alta

y es por ello que las diferencias genotípicas suelen ser

77

Page 78: TESIS de Stevia Rebaudiana

menos evidentes. En los clones A y C siempre se

encontraron mejores respuestas que en el B. Entre A y C

las diferencias son menos notorias e incluso, al

analizar una misma variable, se observan diferencias

particulares estacionales (interacción Clon x Fecha).

Cuando se estudian las tres fechas siempre es superior

el clon A (peso de raíces y parte aérea, figuras 7 y 10

y tablas 8 y 11), pero en la tercer fecha, C supera a A

(longitud y peso de raíces, figuras 5 y 8 y tablas 6 y

9), lo que indicaría una mejor aptitud de este clon para

climas más frescos. Las temperaturas medias de cada una

de las fechas de corte fueron 25, 24 y 21 1/2ºC.

Al analizar el factor fecha, se observan que aunque

no se encontraron diferencias significativas en todas

las variables, la tendencia indicaría que la mejor fecha

fue la segunda, luego la tercera y por último la

primera. Durante la primer fecha (29 de noviembre al 29

de diciembre de 1994), las temperaturas estuvieron muy

por encima de las habituales (mínima media 20ºC y máxima

media 30,2ºC), lo que implica que las estacas, a pesar

de estar en la sombra, debieron registrar algún tipo de

éstres. Las únicas variables que fueron superiores en

esta fecha fueron peso de la parte aérea y de raíces.

Altas temperaturas tienden a promover el desarrollo y/o

crecimiento de las yemas, en detrimento del desarrollo

78

Page 79: TESIS de Stevia Rebaudiana

radicular (Hartmann et al, 1992)(figuras 7 y 10 y tablas

8 y 11). También hubo crecimiento importante de las

raíces pero el de la parte aérea fue mucho mayor. En la

relación peso de raíces/peso total (figura 13 y tabla

14), las diferencias son altamente significativas y en

la primer fecha la partición hacia raíces fue mucho

menor. Las temperaturas de las fechas restantes fueron

mínima media 19.3 y 16,9ºC y máxima media 29,2 y 27,2ºC

respectivamente. Temperaturas diurnas del aire entre 21

y 27ºC, con temperaturas nocturnas cercanas a 15ºC son

satisfactorias para la mayoría de las especies de clima

templado cálido (Marcavillaca y Divo de Sesar, 1993). La

iniciación de raíces en estacas está regulada por la

temperatura, pero el crecimiento de las mismas es

fuertemente dependiente de los carbohidratos

disponibles. Las estacas iniciales de la segunda y

tercer fecha fueron más livianas que las de la primera,

pero la relación peso de raíces/peso total fue mucho

mayor en estas dos fechas (figura 13 y tabla 14). La

respiración se redujo probablemente como consecuencia de

las menores temperaturas, permitiendo una mayor

partición de los fotosintatos hacia las raíces. Los

resultados estacionales obtenidos en estos ensayos son

válidos para latitudes similares a las nuestras; en

Campinas, Estado de San Pablo, Brasil, los mejores meses

para el enraizamiento de estacas van de Mayo a

79

Page 80: TESIS de Stevia Rebaudiana

Septiembre, época en que a nuestras latitudes la

especie entra en reposo vegetativo (Machado de Carvalho

y Zaidan, 1995). Asimismo, los resultados obtenidos por

los autores son mucho menores a los nuestros (65% vs

31%).

En las estacas apicales se observan mejores

respuestas en las variables, longitud de raíces, peso de

las mismas y relación peso de raíces/peso total (figuras

4, 5, 6, 7, 8, 13, 14 y 15 y tablas 5, 6, 7, 8, 9, 14,

15 y 16). La mejor aptitud para el enraizamiento de las

estacas apicales, podría explicarse por la probabilidad

de mayores concentraciones de sustancias endógenas

promotoras del enraizamiento sintetizadas en las yemas

apicales. Asimismo las estacas apicales son más jóvenes

y por consiguiente existe mayor cantidad de células

meristemáticas (Hartmann et al, 1992). Sin embargo en el

porcentaje de enraizamiento se observó mejores

resultados con las estacas subapicales (figuras 1, 2 y 3

y tablas 2, 3 y 4), en este caso al ser más pesadas

podría haberse favorecido la acumulación de

carbohidratos, promoviendo el enraizamiento. Machado de

Carvalho y Zaidan (1995), rechazan el enraizamineto de

estacas subapicales, pues no logran respuestas

adecuadas.

80

Page 81: TESIS de Stevia Rebaudiana

Todas las variables relativas al enraizamiento se

ven favorecidas con la inclusión de tratamiento

rizogénico (figuras 2, 3, 5, 6, 8, 9, 14 y 15 y tablas

3, 4, 6, 7, 9, 10, 15 y 16), por lo que podríamos

afirmar que los mismos, no solo favorecen el porcentaje

de enraizamiento (inducción de raíces), sino la calidad

de las mismas, longitud (en número y tamaño), ya que el

mismo, era mayor en los tratamientos con IBA (datos no

presentados); además estos tratamientos estimulan el

desarrollo de las raíces formadas, favoreciendo la

partición de carbohidratos hacia las mismas (relación

peso de raíces/peso total, figuras 14 y 15 y tablas 15 y

16)

81

Page 82: TESIS de Stevia Rebaudiana

CONCLUSIONES Y CONSIDERACIONES FINALES

82

Page 83: TESIS de Stevia Rebaudiana

CONCLUSIONES

- Los mejores resultados cuantitativos de las

distintas variables (longitud de raíces, pesos

de raíces y parte aérea y relación peso de

raíces/peso total) en el enraizamiento de

estacas se observan con estacas apicales, pero

asimismo se logran respuestas adecuadas con

estacas subapicales.

- Los tratamientos rizogénicos afectan los

porcentajes de enraizamiento, mejorando la

calidad de las raíces formadas (número, largo y

peso).

- El enraizamiento es posible durante todo el

ciclo vegetativo.

- El humus de lombriz y turba es un sustrato

altamente conveniente para ser utilizado en

la propagación.

- Las diferencias encontradas en los clones

utilizados sugiere que la heterogeneidad de

una población de Stevia rebaudiana Bert.

permite la selección de distintos genotipos

83

Page 84: TESIS de Stevia Rebaudiana

para caracteres determinados.

CONSIDERACIONES FINALES

Stevia rebaudiana Bert. se presenta a nivel

mundial, como muy promisoria, para la producción de

edulcorantes naturales de bajo contenido calórico. Si un

pequeño porcentaje del mercado de edulcorantes, pudiera

ser ocupado por el esteviósido, serían necesarias

grandes cantidades de materia prima.

Debido a la heterogeneidad de las poblaciones en

cuanto al contenido de esteviósido, es imprescindible

partir de material seleccionado el cual debería ser

forzosamente propagado vegetativamente. Por lo tanto, es

indispensable contar con métodos de enraizamiento que

empleando técnicas sencillas y económicas puedan ser

utilizado a escala industrial.

Los resultados observados en esta experiencia

contribuirán al mejoramiento de los ya existentes.

Podría sugerirse que la continuidad de estos ensayos,

incluyan otros que estudien la posibilidad de prolongar

el período de propagación inhibiendo de algún modo la

84

Page 85: TESIS de Stevia Rebaudiana

floración. Asimismo, sería interesante establecer el

tiempo mínimo necesario para la formación de raíces.

Hemos observado, que utilizando humus de lombriz y

turba, no solo se mejoran las variables concernientes a

la calidad de las raíces, sino que además también se

afecta la velocidad en que las mismas se forman. La

etapa de enraizamiento se fijó en cuatro semanas porque

las estacas de turba y arena solo comienzan a enraizar a

partir de los 21 días. Mientras que las de turba y humus

de lombriz, ya habían comenzado la formación de raíces a

los 15 días. Acortamientos de esta etapa permitirían una

mayor rotación y eficiencia en el uso de los recursos

(ciclos, instalaciones, etc), factores que deben ser

tenidos en cuenta al diseñar un sistema de propagación a

escala industrial.

85

Page 86: TESIS de Stevia Rebaudiana

FIGURAS Y TABLAS

86

Page 87: TESIS de Stevia Rebaudiana

87

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110

Page 111: TESIS de Stevia Rebaudiana

111

Page 112: TESIS de Stevia Rebaudiana

FOTOGRAFIA

112

Page 113: TESIS de Stevia Rebaudiana

FOTOGRAFIA: Planta de Stevia rebaudiana Bert. del

Banco de Plantas Madres de la

Facultad de Agronomía (UBA).

113

Page 114: TESIS de Stevia Rebaudiana

ANEXO

114

Page 115: TESIS de Stevia Rebaudiana

ANEXO

Medición de raíces. Método de Tennant:

En las fechas de evaluación correspondientes se

cortaron las raíces a ras del tallo, se lavaron y se

midieron siguiendo el siguiente método:

Se construyó una grilla cuadriculada (0,5 cm),

plastificándose posteriormente. Las raíces de cada una

de las plantas muestreadas se distribuyó sobre la grilla

al azar y con ayuda de una lupa de mano (2,5 veces de

aumento), se contabilizó el número total de

intersecciones horizontales y verticales que cada

porción de raíz cruzaba.

El largo total de las raíces de cada una de las

plantas se obtuvo utilizando la siguiente fórmula de

transformación:

Largo de raíz= 11/14 * número de intersecciones * unidad

de grilla (cm.).

Unidad de grilla correspondiente= 0,5 cm.

115

Page 116: TESIS de Stevia Rebaudiana

BIBLIOGRAFIA

116

Page 117: TESIS de Stevia Rebaudiana

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125

Page 126: TESIS de Stevia Rebaudiana

ÍNDICE

Pág.

- Resumen ...........................................1

- Introducción ......................................4

1 - Propiedades de un edulcorante ideal ...........7

2 - Características de los edulcorantes de uso

extensivo .....................................9

2.1 - Sacarina ...................................9

2.2 - Ciclamato .................................10

2.3 - Aspartame .................................11

2.4 - Acesulfame-K ..............................12

3 - Características edulcorantes del esteviósido .12

3.1 - Introducción ..............................12

3.2 - Propiedades físico-químicas de interés

en el procesado de alimentos ..............14

3.3 - Propiedades edulcorantes ..................15

3.3.1 - Calidad del sabor dulce ................16

4 - Inocuidad del esteviósido ....................17

5 - Utilización actual del esteviósido ...........19

6 - Formas de comercialización ...................20

7 - Otros campos de aplicación ...................21

8 - Mercado mundial de edulcorantes ..............21

8.1 - Sacarina ..................................22

8.2 - Ciclamato .................................22

8.2 - Aspartame .................................23

8.4 - Esteviósido ...............................23

126

Page 127: TESIS de Stevia Rebaudiana

Pág.

9 - Perspectivas del esteviósido .................24

9.1 - Mercado mundial ...........................24

10 - Evolución histórica ..........................25

11 - Caracterización de la Stevia rebaudiana Bert..37

11.1 - Origen y distribución .....................37

11.2 - Descripción botánica ......................39

11.3 - Ecotipos ..................................41

11.4 - Citología .................................42

11.5 - Clima .....................................43

11.6 - Suelos ....................................44

12 - Características agronómicas ..................45

12.1 - Propagación sexual de Stevia rebaudiana

Bert. .....................................46

12.2 - Propagación vegetativa de Stevia rebaudiana

Bert. .....................................47

13 - Propagación vegetativa .......................48

13.1 - Bases fisiológicas de la iniciación de

raíces adventicia..........................51

13.1.1 - Efecto de las hojas sobre el

enraizamiento ..........................51

13.1.2 - Fotosíntesis de las estacas ............52

13.2 - Factores que afectan la multiplicación por

estacas ...................................53

13.2.1 - Diferencias entre plantas individuales

procedentes de semilla .................53

127

Page 128: TESIS de Stevia Rebaudiana

Pág.

13.2.2 - Diferencias entre las zonas apicales y

basales de la rama .....................53

13.2.3 - Estado reproductivo o vegetativo .......54

13.3 - Sustratos para el enraizamineto ...........55

13.3.1 - Arena ..................................57

13.3.2 - Turba ..................................57

13.3.3 - Humus de lombriz .......................58

13.4 - Mezclas de suelo para cultivo en maceta ...59

- Justificación, Objetivo e Hipótesis ..............61

- Materiales y métodos .............................64

- Resultados y discusión ...........................69

- Figuras y tablas .................................87

- Fotografía ......................................113

- Anexo. Método de Tennant ........................115

- Bibliografía ....................................117

128

Page 129: TESIS de Stevia Rebaudiana

ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS

Figura Pág.

1- Porcentaje de enraizamiento, de 3 fechas (F1-

F2-F3),para los distintos factores (fecha,

clon, estaca y sustrato) .......................88

2- Porcentaje de enraizamiento, de la tercer

fecha (F3), para los distintos factores

(clon, estaca, sustrato y hormona) .............89

3- Porcentaje de enraizamiento, del clon A, para

2 fechas (F2-F3), de los distintos factores

(fecha, estaca, sustrato y hormona) ............90

4- Longitud de raíces, de 3 fechas(F1-F2-F3),para

los distintos factores (fecha, clon, estaca y

sustrato) ......................................91

5- Longitud de raíces, de la tercer fecha (F3),

para los distintos factores (clon, estaca,

sustrato y hormona) ............................92

6- Longitud de raíces, del clon A, para 2 fechas

(F2-F3), de los distintos factores (fecha,

estaca,sustrato y hormona) .....................93

7- Peso de raíces, de 3 fechas (F1-F2-F3), para

los distintos factores (fecha, clon, estaca y

sustrato) ......................................94

8- Peso de raíces, de la tercer fecha (F3), para

los distintos factores (clon, estaca, sustrato

y hormona) .....................................95

129

Page 130: TESIS de Stevia Rebaudiana

Pág.

9- Peso de raíces, del clon A, para 2 fechas

(F2-F3), de los distintos factores (fecha,

estaca, sustrato y hormona) .....................96

10- Peso de la parte aérea, de 3 fechas (F1-F2-F3),

para los distintos factores (fecha, clon,

estaca y sustrato) ..............................97

11- Peso de la parte aérea, de la tercer fecha

(F3), para los distintos factores (clon,

estaca, sustrato y hormona) ...................98

12- Peso de la parte aérea, del clon A, para 2

fechas (F2-F3), de los distintos factores

(fecha, estaca, sustrato y hormona) ............99

13- Relación Peso de raíces/Peso total, de 3

fechas (F1-F2-F3), para los distintos

factores (fecha, clon, estaca y sustrato) .....100

14- Relación Peso de raíces/Peso total, de la

tercer fecha (F3), para los distintos factores

(clon, estaca, sustrato y hormona) ............101

15- Relación Peso de raíces/Peso total, del clon

A, para 2 fechas (F2-F3), de los distintos

factores (fecha, estaca, sustrato y hormona) ..102

130

Page 131: TESIS de Stevia Rebaudiana

Tabla Pág.

1- Resumen de los factores ensayados .............103

2- Porcentaje de enraizamiento, de 3 fechas (F1-

F2-F3),para los distintos factores (fecha,

clon, estaca y sustrato) ......................104

3- Porcentaje de enraizamiento, de la tercer

fecha (F3), para los distintos factores

(clon, estaca, sustrato y hormona) ............104

4- Porcentaje de enraizamiento, del clon A, para

2 fechas (F2-F3), de los distintos factores

(fecha, estaca, sustrato y hormona) ...........104

5- Longitud de raíces, de 3 fechas(F1-F2-F3),para

los distintos factores (fecha, clon, estaca y

sustrato) .....................................105

5.1- Longitud de raíces, de 3 fechas(F1-F2-F3),

interación Fecha x Estaca (F1-F2-F3 x

Ap-Sap) ......................................106

5.2- Longitud de raíces, de 3 fechas(F1-F2-F3),

interación Clon x Estaca (A-B-C x Ap-Sap) ....106

5.3- Longitud de raíces, de 3 fechas(F1-F2-F3),

interación Fecha x Clon (F1-F2-F3 x A-B-C) ...106

6- Longitud de raíces, de la tercer fecha (F3),

para los distintos factores (clon, estaca,

sustrato y hormona) ...........................105

131

Page 132: TESIS de Stevia Rebaudiana

Pág.

6.1- Longitud de raíces, de la tercer fecha (F3),

interación Sustrato x Hormona (Tl-Ta x

IBA-noIBA) ...................................107

7- Longitud de raíces, del clon A, para 2 fechas

(F2-F3), de los distintos factores (fecha,

estaca, sustrato y hormona) ...................105

8- Peso de raíces, de 3 fechas (F1-F2-F3), para los

distintos factores (fecha, clon, estaca y

sustrato) .....................................108

9- Peso de raíces, de la tercer fecha (F3), para

los distintos factores (clon, estaca, sustrato

y hormona) ....................................108

9.1- Peso de raíces, de la tercer fecha (F3),

interación Sustrato x Hormona (Tl-Ta x

IBA-noIBA) ...................................109

10- Peso de raíces, del clon A, para 2 fechas

(F2-F3), de los distintos factores (fecha,

estaca, sustrato y hormona) ...................108

11- Peso de la parte aérea, de 3 fechas (F1-F2-F3),

para los distintos factores (fecha, clon,

estaca y sustrato) ............................110

11.1- Peso de la parte aérea, de 3 fechas (F1-F2-F3),

interación Fecha x Clon (F1-F2-F3 x A-B-C) ..111

132

Page 133: TESIS de Stevia Rebaudiana

Pág.

12- Peso de la parte aérea, de la tercer fecha (F3),

para los distintos factores (clon, estaca,

sustrato y hormona) ...........................110

13- Peso de la parte aérea, del clon A, para 2

fechas (F2-F3), de los distintos factores

(fecha, estaca, sustrato y hormona) ...........110

14- Relación Peso de raíces/Peso total, de 3 fechas

(F1-F2-F3), para los distintos factores (fecha,

clon, estaca y sustrato) ......................112

15- Relación Peso de raíces/Peso total, de la tercer

fecha (F3), para los distintos factores (clon,

estaca, sustrato y hormona) ...................112

16- Relación Peso de raíces/Peso total, del clon A,

para 2 fechas (F2-F3), de los distintos

factores (fecha, estaca, sustrato y hormona) ..112

133

Page 134: TESIS de Stevia Rebaudiana

AGRADECIMIENTOS

- Al Ing. Agr. Manuel C. Marcavillaca, que cedió el

material inicial de propagación, que posibilitó la

realización de este trabajo de intensificación y me

permitió el acceso a su bibliografía personal.

- A la Ing. Agr. Marta Divo de Sesar, por dedicarme su

tiempo y conocimientos, por inculcarme orden y

prolijidad, tanto en el trabajo como en la escritura y

presentación de este trabajo de intensificación.

- A los Ing. Agr. Fernando Vilella, Pablo Pristupa y al

Técnico Agrícola Emilio Mirabelli, por los consejos y

aportes brindados durante este trabajo.

- A los responsables del Laboratorio de Semillas, por

brindarme las instalaciones y equipos del mismo.

134

Page 135: TESIS de Stevia Rebaudiana

A mis padres

135

Page 136: TESIS de Stevia Rebaudiana

PROPAGACION VEGETATIVA DE

STEVIA REBAUDIANA BERTONI

Trabajo de Intensificación para optar al título de

Ingeniero Agrónomo.

Alumno: DARÍO R. TAIARIOL

Tutor: Ing. Agr. FERNANDO VILELLA

Facultad de Agronomía. Universidad de Buenos Aires.

1995

136