UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA
FACULTAD DE FARMACIA
DEPARTAMENTO DE QUIMICA ORGANICA
Análogos rígidos del resveratrol con interés
neuro y cardioprotector. Diseño, síntesis y
evaluación farmacológica
Memoria para optar al grado de
Doctor en Farmacia presenta
Maria Carmen Picciau
Santiago de Compostela, 2010
D. Eugenio Uriarte Villares, Catedrático de Química Orgánica, Dña. Lourdes
Santana Penín, Profesora Titular de Química Orgánica y D. Elías Quezada González,
Investigador contratado dentro del Programa Ángeles Alvariño en el Departamento de
Química Orgánica de la Universidad de Santiago de Compostela
CERTIFICAN:
Que la memoria titulada ANÁLOGOS RÍGIDOS DEL RESVERATROL CON
INTERÉS NEURO Y CARDIOPROTECTOR. DISEÑO, SÍNTESIS Y EVALUACIÓN
FARMACOLÓGICA, que para optar al grado de Doctora en Farmacia presenta
MARIA CARMEN PICCIAU, ha sido realizada bajo nuestra dirección, en el
Departamento de Química Orgánica de la Facultad de Farmacia de la Universidad de
Santiago de Compostela y en el Departamento Fármaco Químico Tecnológico de la
Universidad de Cagliari.
Y considerando que el trabajo constituye tema y labor de Tesis Doctoral,
autorizamos su presentación en la Universidad de Santiago de Compostela. Y para que conste, expedimos el presente certificado en Santiago de Compostela
a cinco de Octubre de dos mil diez.
Fdo. Eugenio Uriarte Villares Fdo. Lourdes Santana Penín
Fdo. Elías Quezada González
AGRADECIMIENTOS
A Eugenio, Lourdes, Elias per avermi dato la possibilità di realizzare questo dottorato,
per il supporto, l’ affetto e l’ incoraggiamento che mi hanno sempre trasmesso e per la
squisita ospitalità e amicizia durante i periodi trascorsi a Santiago
Al Prof. Gianni Podda per avermi sempre appoggiato in questi anni, per i suoi consigli e
la sua disponibilità.
Alla carissima Giovanna per il suo aiuto nella realizzazione di questo progetto, ma
soprattutto per la sua amicizia sincera, la sua presenza, il suo affetto.
Alla cara Maria Joao per la sua amicizia, l’indispensabile aiuto nella stesura della tesi,
l’affetto e la sua grande disponibilità in ogni circostanza.
A Dolo per la preziosa collaborazione per i saggi biologici della parte farmacologica
A tutti gli amici e colleghi di laboratorio che mi hanno accompagnato in questi anni a
Cagliari e Santiago : Graziella, Michela, Silvana, Valeria, Silvia, Tati, Gabriele, Giulio,
Riccardo, Chachy, Humberto, Fran, per i bei momenti passati insieme.
Ai tanti amici e persone care che porto nel cuore.
Ai miei cari genitori per essermi sempre vicini, per tutto l’appoggio e l’amore che mi
hanno sempre dato.
Alla mia adorata Cristina, il mio angelo.
Ai miei amatissimi Luigi e Stefano, mia famiglia e luce dei miei occhi.
A Luigi e Stefano
Ai miei genitori
A Cristina
I.-Indice
I.-Ìndice
III
I. ÍNDICE………………………………………………………………………….. III II. RELACIÓN DE ABREVIATURAS…………………………………………… VII III. RELACIÓN DE COMPUESTOS FINALES OBTENIDOS………………….. XI 1. INTRODUCCIÓN………………………………………………………………. 1 1.1 Las cumarinas………………………………………………………………... 3 1.1.1. Actividad biológica de cumarinas…………………………………………. 4 1.1.2. Síntesis de cumarinas……………………………………………………… 5 1.2. El resveratrol………………………………………………………………… 6 1.2.1. Actividad biológica del resveratrol………………………………………... 7 2. OBJETIVOS……………………………………………………………………. 9 3. DISCUSIÓN DE RESULTADOS……………………………………………… 13 3.1 Síntesis y evaluación farmacológica de híbridos cumarina-resveratrol……... 15 3.2 Síntesis y evaluación farmacológica de híbridos benzofurano-resveratrol….. 22 4. CONCLUSIONES………………………………………………………………. 25 5. PARTE EXPERIMENTAL……………………………………………………... 29 3-Fenil-6-metilcumarina (1)…………………………………………………….. 33 6-Metil-3-(4’-metoxifenil)cumarina (2)………………………………………... 35 3-(3’,5’-Dimetoxifenil)-6-metilcumarina (3)…………………………………… 37 6-Metil-3-(3’,4’,5’-trimetoxifenil)cumarina (4)……………………………….. 39 6-Metil-3-(2’-metoxifenil)cumarina (5)………………………………………... 41 6-Metil-3-(3’-metoxifenil)cumarina (6)............................................................... 43 6-Cloro-3-(2’-metoxifenil)cumarina (7).............................................................. 45 6-Cloro-3-(4’-metoxifenil)cumarina (8).............................................................. 47 6-Cloro-3-(3’-metoxifenil)cumarina (9).............................................................. 49 6-Bromo-3-(2’-metoxifenil)cumarina (10).......................................................... 51 6-Bromo-3-(4’-metoxifenil)cumarina (11).......................................................... 53 6-Bromo-3-(3’-metoxifenil)cumarina (12).......................................................... 55 6-Cloro-3-(2’-hidroxifenil)cumarina (7a)........................................................... 57 6-Cloro-3-(4’-hidroxifenil)cumarina (8a)........................................................... 59 6-Cloro-3-(3’-hidroxifenil)cumarina (9a)........................................................... 61 6-Bromo-3-(2’-hidroxifenil)cumarina (10a)........................................................ 63 6-Bromo-3-(4’-hidroxifenil)cumarina (11a)....................................................... 65 6-Bromo-3-(3’-hidroxifenil)cumarina (12a)....................................................... 67 3-(2-Tienil)cumarina (13a)……………………………………………………… 69 3-(3-Tienil)cumarina (13b).................................................................................. 71 3-(3-Indolil)cumarina (13c)................................................................................. 73 7- Metoxi-3-(2-tienil)cumarina (14a).................................................................. 75 7- Metoxi-3-(3-tienil)cumarina (14b).................................................................. 77 3-(3-Indolil)-7-metoxicumarina (14c)………………………………………….. 79 6- Metoxi-3-(2-tienil)cumarina (15a).................................................................. 81 6- Metoxi-3-(3-tienil)cumarina (15b).................................................................. 83 3-(3-Indolil)-6-metoxicumarina (15c)................................................................. 85 5,7-Dimetoxi-3-(2-tienil)cumarina (16a)............................................................. 87 5,7-Dimetoxi-3-(3-tienil)cumarina (16b)............................................................. 89 5,7-Dimetoxi-3-(3-indolil)cumarina (16c)........................................................... 91 2-Fenil-6-metoxibenzofurano (18) y 3-Fenil-7-metoxi-2H-cromeno (19)......... 93 2-Acetoniloxi-3-metoxibenzaldehido (20)……………………………………… 95 Acetato de 2-hidroxi-3-metoxibencilo (21)…………………………………….. 97
I.-Ìndice
IV
Bromuro de 2-hidroxi-3-metoxibenciltrifenilfosfonio (22)…………………… 99 7-Metoxi-2-(3’,4’,5’-trimetoxifenil)benzofurano (23)....................................... 101 2-(3’,5’-Dimetoxifenil)-7-metoxibenzofurano (24)…………………………….. 103 7-Metoxi-2-(4’-metoxifenil)benzofurano (25)…………………………………. 105 7-Metoxi-2-(3’,4’,5’-trimetoxifenil)dihidrobenzofurano (26)......................... 107 Bromuro de 2-hidroxibenciltrifenilfosfonio (27)……………………………… 109 2-(3’,4’,5’-Trimetoxifenil)benzofurano (28)…………………………………… 111 2-(3’,5’-Dimetoxifenil)benzofurano (29)……………………………………….. 113 2-(4’-Metoxifenil)benzofurano (30)…………………………………………….. 115 Alcohol 2-hidroxi-5-metilbencílico (31)………………………………………... 117 Bromuro de 2-hidroxi-5-metilbenciltrifenilfosfonio (32)……………………... 119 5-Metil-2-(4’-metoxifenil)benzofurano (33)…………………………………… 121 2-(3’,5’-Dimetoxifenil)-5-metilbenzofurano (34)............................................... 123 5-Metil-2-(3’,4’,5’-trimetoxifenil)benzofurano (35).......................................... 125 Alcohol 5-bromo-2-hidroxibencílico (36)……………………………………… 127 Bromuro de 5-bromo-2-hidroxibenciltrifenilfosfonio (37)…………………… 129 5-Bromo-2-(3’,4’,5’-trimetoxifenil)benzofurano (38)....................................... 131 5-Bromo-2-(3’,5’-dimetoxifenil)benzofurano (39)…………………………….. 133 5-Bromo-2-(4’-metoxifenil)benzofurano (40)………………………………….. 135 Alcohol 3-etoxi-2-hidroxibencílico (41)………………………………………… 137 Bromuro de 3-etoxi-2-hidroxibenciltrifenilfosfonio (42)……………………... 139 7-Etoxi-2-(3’,4’,5’-trimetoxifenil)benzofurano (43).......................................... 141 2-(3’,5’-Dimetoxifenil)-7-etoxibenzofurano (44)............................................... 143 7-Etoxi-2-(4’-metoxifenil)benzofurano (45)…………………………………… 145 6. Anexo: Publicaciones............................................................................................ 147
II.-Relación de abreviaturas
II.-Relación de Abreviaturas
VII
Å angstrom AcOEt acetato de etilo AcOH ácido acético ADN ácido desoxirribonucleico Ar argón ºC grados Celsius δ desplazamiento químico en ppm d doblete DCC diciclohexilcarbodiimida dd doble doblete DEA dietilanilina DIBAL-H diisobutilaluminio hidruro DMAP dimetilaminopiridina DMF N,N-dimetilformamida DMSO dimetilsulfóxido EtOH etanol g gramo μg microgramo h hora Hz hertzio J constante de acoplamiento m multiplete M molaridad μM micromolar MAO monoaminooxidasa MeOH metanol mg milígramo min minuto mL mililitro mmol milimol m/z relación masa/carga μL microlitros N normalidad NA noradrenalina PE fenilefrina P.f. punto de fusión ppm partes por millón RMN resonancia magnética nuclear s singlete sa singlete ancho t triplete THF tetrahidrofurano TMS tetrametilsilano U unidades de trombina
III.-Relación de compuestos finales obtenidos
III.-Relación de Compuestos Finales Obtenidos
XI
O O
OMe
2
6O O
OMeO O
MeO
5
O O
OMe
OMe
OMe
4O O
OMe
OMe
3O O1
7
O O
Cl
MeO
8
O O
Cl
OMe
9O O
Cl
10O O
Br
MeO
11O O
Br
OMe
12O O
Br
OMe
7a
O O
Cl
HO
8aO O
Cl
OH
9aO O
Cl
OH
10a
O O
Br
HO
11aO O
Br
OH
12aO O
Br
OH
OMe
13aO
S
O
13bO
S
O
13cO
NH
O14a
O
S
OMeO14b
O
S
OMeO14cO
NH
OMeO
15aO
S
O
MeO
15bO
S
O
MeO
15cO
NH
O
MeO
16aO
S
O
OMe
MeO
16bO
S
O
OMe
MeO16cO
NH
O
OMe
MeO
III.-Relación de Compuestos Finales Obtenidos
XII
OMeO
18 19
OMeO
OMe
OMe
OMeO
OMe23
OMe
OMeO
OMe24
25
OOMe
OMeO
OMe
OMe
OMe
OMe26
O
OMe
OMe
OMe28
O
OMe
OMe29
OOMe
30 33
OOMe
O
OMe
OMe34 35
O
OMe
OMe
OMe
O
BrOMe
OMe
OMe
38 39O
BrOMe
OMeO
BrOMe
40
O
OMe
OMe
OMe
O43
O
OMe
OMeO44
OOMe
O45
1.- Introducción
1.-Introducción
3
Las cumarinas son una clase de compuestos de origen natural ó sintético con
actividades farmacológicas y terapéuticas muy diferentes. En los últimos años las
cumarinas han sido aisladas en más de 700 especies de diferentes familias de
Angiosperamae, Umbelliferae, Apiaceae, Rutaceae, donde se pueden encontrar de
forma libre o glicosilada en las hojas, raíces, semillas y frutos. El esqueleto básico de
esta familia de compuestos es la cumarina (2H-1-benzopiran-2-ona) (Figura 1), aislada
por primera vez en el año 1820 de las semillas de Coumarona Odorata Aube (Dpterix
Odorata).1 Desde el punto de vista estructural, las cumarinas se pueden clasificar en
cumarinas simples, o asociadas a otros anillos como por ejemplo: furanocumarinas,
piranocumarinas, biscumarinas, triscumarinas o cumarinolignanos.2
O O
O OO O OO
OR
OR
O O
O OHO
RO
O O
O OHO
RO
OO
O
O OO
O
RO
Ar
R
Cumarina (2H-1-benzopiran-2-ona)
FurocumarinasPiranocumarinas
Biscumarinas Triscumarinas
Cumarinolignanos
Figura 1
1 Soine, T. O.; J. Pharm. Sci. 1964, 53, 231. 2 (a) Borges, F.; Roleira, F.; Milhazes, N.; Santana, L.; Uriarte, E., Current Medicinal Chemistry 2005, 12, 887; (b) Santana, L.; Uriarte, E; Roleira, F.; Milhazes, N.; Borges, F., Current Medicinal Chemistry 2004, 11, 3239; (c) Borges, F.; Roleira, F.; Milhazes, N.; Santana, L.; Uriarte, E. Frontiers in Medicinal Chemistry, 2009, 4, 23. (d) Surya K. De; Richard A. Gibas, Synthesis 2005, 8, 1231.
1.-Introducción
4
1.1.1. Actividad biológica de las cumarinas
Muchas son las actividades biológicas asociadas a las cumarinas: antimicrobianas,
antivirales, inhibidores enzimáticos (como es el caso de la MAO), anticoagulantes,
vasodilatadores y antioxidantes, entre otras.2,3,4
La Warfarina, el Carbocromeno y el Sintrón (Figura 2) son tres conocidos ejemplos
de la familia de las cumarinas con actividad cardioprotectora, debido a su acción
vasodilatadora e inhibidora de la agregación plaquetaria.4
O OO
N CH3
H3C
O
O
H3C O O
Warfarina
OH
O
CH3
Carbocromeno
O O
OH
O
CH3
NO2
Sintrón
Figura 2
Una serie de derivados sintéticos cumarinicos han sido identificados como
inhibidores de la MAO (iMAO). La MAO es una enzima que presenta dos conocidas
isoformas –MAO-A y MAO-B– y que interviene en la degradación de aminas, teniendo
un papel fisiológico muy importante en la desaminación de la adrenalina, noradrenalina
y serotonina (preferentemente la MAO-A) y en la desaminación de la ß-feniletilamina y
bencilamina (preferentemente la MAO-B).5
Los iMAO son una clase de compuestos que actúan bloqueando la acción enzimática
de la MAO de manera que los iMAO-A pueden ser efectivos en el tratamiento de la
depresión y los iMAO-B útiles en el tratamiento del Parkinson.6
Además de estas actividades, algunas cumarinas han mostrado actividad inhibitoria
frente a la tirosinasa. La tirosinasa es un enzima clave en la vía de biosíntesis de la
melanina y cataliza la conversión limitante inicial de tirosina a DOPA.7 Esta enzima
está presente en plantas, animales, hongos y bacterias.8,9 Es una enzima dependiente del
cobre, con dos sitios de unión al mismo.7 Además de su función principal como 3 Leiro, J.; Álvarez, E.; Arranz, J.A.; Laguna, R.; Uriarte, E. y Orallo, F. J. Leukoc. Biol. 2004, 75, 1156. 4 Orallo, F.; Álvarez, E.; Camiña, M; Leiro, J.M.; Gómez, E. y Fernández, P., Mol. Pharmacol. 2002, 61, 294. 5Grimsby, J.; Lan, N.C.; Neve, R.; Chen, K.; Shih, J.C. J. Neurochem. 1990, 55, 1166. 6 Harfenist, H.; Heuseur, D.J.; Joyner, C.T.; Batchelor, J.F.; White, H.L. Journal of Medicinal Chemistry 1996, 39, 1857. 7 Lerch, K. Life Chem. Rep. 1987, 5, 221-234. 8 Whitaker, J. R., In Food Enzymes: Structure and Function, ed. D. Wong. Chapman and Hall 1995, p. 284. 9 Kowalski, S. P.; Eannetta, N. T.; Hirzel, A. T.; Steffens, J. C. Solanum berthaultii. Plant Physiol. 1992, 100, 677.
1.-Introducción
5
tirosinahidroxilasa, la tirosinasa humana tiene actividad DOPA oxidasa, 5,6-
dihidroxiindol oxidasa, y quizá 5,6-dihidroxiindol-2-ácido carboxílico oxidasa, y regula
varias de las etapas de esta vía. El estudio de los inhibidores de la tirosinasa tiene hoy
en día un fuerte impacto en la industria y la economía. Recientemente Masamoto et al.
han estudiado la relación estructura-actividad de 18 cumarinas por su actividad
inhibitoria frente a la tirosinasa de hongo, encontrando que la esculetina tiene la más
fuerte actividad inhibidora de todos los compuestos estudiados.10 En contraste con este
estudio, Sollai et al. han demostrado que la esculetina es un substrato de la tirosinasa
más que un inhibidor, y la umbelliferona es un inhibidor de dicha enzima.11
O O
HO
HO O OHO
Esculetina Umbeliferona
1.1.2. Síntesis de cumarinas
La síntesis de las cumarinas y de sus derivados es una área de gran interés por el gran
número de compuestos tanto de origen natural como sintéticos, que contienen este
núcleo heterocíclico y porque son muchas veces utilizadas en la síntesis de otros
productos como piranocumarinas, furocumarinas, 2-acil-resorcinoles, etc.12
Los primeros métodos de síntesis para la obtención de estos compuestos presentaban
demasiados pasos y en general bajos rendimientos,13 pero hoy en día las rutas sintéticas
más utilizadas recurren a reacciones de condensación de Pechman, Perkin,
Knoevenagel, Reformatsky o Wittig. La primera es, sin duda, la más usada por la
simplicidad de los materiales de partida y por los elevados rendimientos obtenidos.14,15
Los procedimientos sinteticos referidos anteriormente, han sido ampliamente
descritos en la bibliografía.2
10 Masamoto, Y.; Murata, Y.; Baba, K.; Shimoishi, Y.; Tada, M.; Takahata, K. Biol. Pharm. Bull. 2004, 27, 422. 11 Sollai, F.; Zucca, P.; Sanjust, E.; Steri, D.; Rescigno, A. Biol. Pharm. Bull. 2008, 31, 2187. 12 Singh, Pankajkumar R.; Singh, De Vendrapratap U.; Samant, Shriniwas D., Synlett 2004, 11, 1909. 13 Roman, Joc; Kozhkov, V.; Larock, Andrichard C., J. Org. Chem. 2003, 68, 6314. 14 Surya K. De; Richard A. Gibbs, Synthesis 2005, 8, 1231. 15 Pankajkumar, R. Singh; Devendrapratap, U. Singh; Shriniwas, D. Samant., Synlett 2004, 11, 1909.
1.-Introducción
6
1.2. El resveratrol
El resveratrol es un compuesto polifenólico de origen natural producido por algunas
especies de espermatofitas,16 como las vides, en respuesta a un daño sufrido por ejemplo
una infección por hongos o exposición a la radiación UV. Se encuentra en la piel de la
uva y no en la pulpa, por lo cual existe en mayor concentración en el vino tinto que en el
vino blanco (donde el tiempo de contacto con la piel de la uva en la fermentación es
mucho más grande – mayor tiempo de maceración). El interés por este compuesto y sus
derivados empezó cuando los estudios epidemiológicos establecieron una relación
inversa entre el consumo de vino tinto y la incidencia de enfermedades
cardiovasculares,13 además de las propiedades hemostáticas y del aumento del HDL
circulante descrita para el etanol.17 A partir de este momento las propiedades del
resveratrol así como de análogos fenólicos, la mayoría de estructura flavonoide, han
sido extensamente estudiadas.
Estructuralmente el resveratrol es el 3,4’,5-trihidroxiestilbeno que, debido a la
presencia del doble enlace, puede asumir las dos formas isoméricas cis y trans (Figura
3).
HO
OH
OH
HO
OHtrans-resveratrol cis-resveratrol
OH
Figura 3
La forma trans del resveratrol, parece ser la responsable de las principales
propiedades farmacológicas de esta molécula. Es, hoy en día, un producto comercial
común, a partir del que se puede obtener por irradiación UV la forma cis.13
Además del resveratrol, han sido aislados y identificados en muchas especies de
plantas algunos de sus productos de oxidación, oligómeros llamados viniferinas; entre
estas en particular la ε- y la δ-viniferina (Figura 4) y la α-, β-, y γ-viniferina,
respectivamente, trímero, tetrámero y un oligómero polimerizados.
16 Orsini, Fulvia; Pelizzoni, Francesca; Verotta, Luisella; Aburjai, Talal, J. Nat. Prod. 1997, 60, 1082. 17 Leger, A.S.; Cochrane, A.L.; Moore, F., Lancet 1979, 1, 1017.
1.-Introducción
7
Su biosíntesis está siempre correlacionada a situaciones de estrés o a infecciones y
han demostrado poseer actividad biológica contra un amplio rango de agentes
patógenos18. También están presentes en el vino y en algunos alimentos aunque su papel
ha sido menos estudiado.
O
OH
HO
HO
HO
OH
O
HO
HO
OH
HO
OH
trans-δ-viniferina trans-ε-viniferina
Figura 4
1.2.1. Actividad biológica del resveratrol
Muchas son las actividades biológicas asociadas a este compuesto19, entre ellas:
antioxidante, antiinflamatoria, vasorelaxante, antiagregante plaquetaria, antitumoral e
inhibidora enzimática. Como antiinflamatorio es capaz de discriminar entre las dos
diferentes isoformas de ciclooxigenasa (COX) y es un potente inhibidor de la COX1.20
Las dos isoformas del resveratrol resultan capaces de inhibir la actividad de la MAO. El
cis-resveratrol es menos eficaz que el trans como inhibidor de la MAO-A y de la MAO-
B.21 La actividad inhibitoria de hidroxiestilbenos frente a la tirosinasa de hongo ha sido
también evaluada.22 El resveratrol ha mostrado actividad inhibitoria DOPA oxidasa más
fuerte que el ácido kojico.23
18 Jeandet, P. et al. J. Agric. Food Chem. 2002, 50, 2731. 19 Aggarwal, B.B.; Bhardwaj, A.; Aggarwal, R.S.; Seeram, N.P.; Shishodia, S.; Takada, Y. Anticancer Res. 2004, 24, 2783.; Orallo, F. Biological effects of cis-versus trans-resveratrol. En: Resveratrol in Health and Disease. Editores Aggarwal, B.B., Shishodia, S. University of Texas M.D. Anderson Cancer Center, Houston, USA. CRC Press, Boca Raton, USA, 2005, pág. 577-600.; Orallo, F. Curr. Med. Chem. 2008, 15, 1887. 20 Szewczuk, L.M.; Forti, L.; Stivala, L.A.; Penning, T. M. J. Biol. Chem. 2004, 279, 22727. 21 Yánez, M.; Fraiz, N.; Cano, E.; Orallo, F. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2006, 344, 688. 22 Likhitwitayawuid, K. Stilbene with tyrosinase inhibitory activity. Curr. Sci. 2008, 94, 44. 23 Likhitwitayawuid, K.; Sritularak, B.; De-Eknamkul, W. Tyrosinase inhibitors from Artocarpus gomezianus. Planta Med. 2000, 66, 275.
2.- Objetivos
2.-Objetivos
11
Desde hace tiempo nuestro grupo de Química Farmacéutica de la Facultad de
Farmacia se ocupa de la síntesis, caracterización y estudio de compuestos con
estructura cumarínica. En el presente trabajo nos hemos planteado los siguientes
objetivos fundamentales:
1. El diseño y la síntesis de nuevas series de híbridos cumarina-resveratrol en los
cuales el anillo cumarínico comparte el anillo bencénico y el doble enlace con el
resveratrol de forma que este queda bloqueado como isómero trans. Algunos
derivados obtenidos previamente ya han sido sometidos a los correspondientes
ensayos farmacológicos demostrando no solo una muy buena actividad
vasodilatadora e inhibidora de la agregación plaquetaria,1a sino también una
interesante actividad como inhibidores de la MAO1b,1c y de la tirosinasa.2
(Figura 5).
O O
R
R
Figura 5
2. El diseño y la síntesis de 3-heteroarilcumarinas. Son análogos de los compuestos
anteriores en los que uno de los anillos bencénicos del resveratrol se sustituye
por un heterociclo aromático.
3. El diseño y la síntesis de 2-aril-benzofuranos. Estas moléculas también
incorporan el fragmento estilbénico del trans-resveratrol, si bien en este caso es
distinta la posición relativa de ambos anillos aromáticos. También se pretende la
reducción del doble enlace del anillo del furano para obtener una serie de 2-aril-
dihidrobenzofuranos, moléculas análogas a las viniferinas, como ya
mencionamos dímeros del resveratrol (Figura 6).
1 a) Vilar, S.; Quezada, E.; Santana, L.; Uriarte, E.; Yanez, M.; Fraiz, N.; Alcaide, C.; Cano, E. and Orallo, F. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2006, 16, 257; b) Joao Matos, M.; Viña, D.; Quezada, E.; Picciau, C.; Delogu, G.; Orallo, F.; Santana, L.; Uriarte, E. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2009, 19, 3268; c) Joao Matos, M.; Viña, D.; Picciau, C.; Delogu, G.; Orallo, F.; Santana, L.; Uriarte, E. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2009, 19, 5053. 2 Fais, A.; Corda, M.; Era, B.; Fadda, M.B.; Matos, M.J.; Quezada, E.; Santana, L.; Picciau, C.; Podda, G. And Delogu, G. Molecules 2009, 14, 2514.
2.-Objetivos
12
RO
OR
OOR
RO
OR
OOR
O
OH
OH
OH
HO
OH
trans-ε-viniferina
Figura 6
4. Las series de moléculas de ambos tipos estructurales que se sintetizarán serán
seleccionados con el objetivo de su estudio en diferentes campos
farmacológicos. Inicialmente dirigidos al estudio de su actividad i-MAO y
efecto cardioprotector.
3.-Discusión de resultados
3.-Discusión de Resultados
15
3.1 Síntesis y evaluación farmacológica de híbridos cumarina-resveratrol
La síntesis de los híbridos cumarina-resveratrol se llevó a cabo utilizando como
reacción clave la reacción de Perkin,1a,1b a partir de un salicilaldehido y un ácido
fenilacético oportunamente sustituidos, utilizando DCC como agente deshidratante en
DMSO a reflujo, durante 24 h (Esquema 1). Los rendimientos obtenidos son entre 50-
70 % y los productos sólidos se purifican fácilmente por cromatografía en columna,
utilizando como disolvente Hexano/AcOEt.
CHO
OH
COOH
O O
XR1
R2R3
X
R1
R2R3
d X=Cle X=Br
a R1 = MeO; R2 = R3 = Hb R2 = MeO; R1 = R3 = Hc R3 = MeO; R1 = R2 = H
7: X = Cl; R1 = MeO; R2 = R3 = H8: X = Cl; R3 = MeO; R1 = R2 = H9: X = Cl; R2 = MeO; R1 = R3 = H10: X = Br; R1= MeO; R2 = R3 = H11: X = Br; R3= MeO; R1 = R2 = H12: X = Br; R2= MeO; R1 = R3 = H
O O
X
R1
R2R3
7a: X = Cl; R1 = OH; R2 = R3 = H8a: X = Cl; R3 = OH; R1 = R2 = H9a: X = Cl; R2 =OH; R1 = R3 = H10a: X = Br; R1= OH; R2 = R3 = H11a: X = Br; R3= OH; R1 = R2 = H12a: X = Br; R2= OH; R1 = R3 = H
DCC, DMSO
110ºC, 24h
HI/AcOH/Ac2Oreflujo, 24h
Esquema 1
Los derivados metoxilados fueron hidrolizados por tratamiento con HI 57 % en
presencia de ácido acético y anhídrido acético. La reacción fue llevada a cabo a reflujo,
durante 24 h, con rendimientos satisfactorios.
1 a)Hans, N.; Singhi, M.; Sharma, V.; Grover, S.K. Ind. J. Chem. 1996, 35B, 1159; b) Vilar, S.; Quezada, E.; Santana, L.; Uriarte, E.; Yanez, M.; Fraiz, N.; Alcaide, C.; Cano, E. and Orallo, F. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2006, 16, 257; c) Vilar, S.; Quezada, E.; Alcaide, C.; Orallo, F.; Santana, L.; Uriarte, E. QSAR Comb. Sci. 2007, 26, 317.
3.-Discusión de Resultados
16
Algunas 3-arilcumarinas con grupos metoxilos o hidroxilos que fueron sintetizadas,
han sido evaluadas como vasodilatadores y antiagregantes plaquetarios, obteniéndose
muy buenos resultados en los ensayos biológicos realizados, mostrando algunas una
actividad superior al trans-resveratrol.1b,1c
Los efectos vasorelajantes de los compuestos 7a-12a fueron estudiados en anillos
precontraídos de aorta de rata, en presencia de endotelio.2 La adición acumulativa del t-
RESV o de los nuevos compuestos (1-100 μM) causa la relajación dependiente de la
concentración de las contracciones inducidas por fenilefrina (PE, 1 μM) en los anillos.
Los valores de IC50 son mostrados en la Tabla 1.
Tabla 1. Actividad vasorelajante de los compuestos evaluados
Compuesto PE (1μM)
7a 36.63 ± 2.46*
8a **
9a 57.63 ± 3.87*
10a 48.79 ± 3.27*
11a **
12a 46.67 ± 3.13*
t-resv 3.12 ± 0.26 * P<0.01 versus el correspondiente valor de IC50 del t-resv
** Inactivo a 100 μM (más alta concentración evaluada). A concentraciones más altas el compuesto precipita.
Todos los compuestos sintetizados resultan menos activos que el trans-resveratrol y
la introducción de un grupo hidroxilo en la posición 4 del anillo bencénico de la
posición 3 de la cumarina causa la inactividad del compuesto.
Los ensayos de la actividad antiagregante plaquetaria fueron llevados a cabo
utilizando trombina (0.25 μM) como agente estimulante. Los compuestos 7a, 9a y 11a
resultan más activos que el trans-resveratrol. (Tabla 2).
2 a) Orallo, F.; Alvarez, E.; Camina, M.; Leiro, J.M.; Gomez, E.; Fernandez, P. Mol. Pharmacol 2002, 61, 294; b) Chimenti, F.; Secci, D.; Bolasco, A.; Chimenti, P.; Granese, A.; Befani, O.; Turini, P.; Alcaro, S.; Ortuso, F. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2004, 14, 3697.
3.-Discusión de Resultados
17
Tabla 2. Actividad antiagregante plaquetaria de los compuestos evaluados
Compuesto Trombina (0.25
U/mL)
7a 91.36 ± 6.13*
8a **
9a 6.41 ± 2.15*
10a **
11a 20.1 ± 1.35*
12a **
t-resv 195.50 ± 13.82 * P<0.01 versus el correspondiente valor de IC50 del t-resv
** Inactivo a 100 μM (más alta concentración evaluada) A concentraciones más altas el compuesto precipita
Experimentos posteriores en estos momentos están en curso, con objeto de clarificar
el mecanismo preciso por el cual los derivados híbridos cumarina-resveratrol producen
efectos de vasodilatación y antiagregación plaquetaria.
Sobre la base de resultados previos obtenidos por nuestro grupo, una serie de nuevos
compuestos han sido sintetizados con el objetivo de estudiar la influencia de distintos
sustituyentes en varias posiciones en la actividad inhibitoria de la MAO. Se trata de una
serie de híbridos cumarina-resveratrol que presentan un grupo metilo en la posicion 6 de
la cumarina y grupos metoxilos en el anillo bencénico de la cumarina en la posición 3,
para compararla con el análogo no substituido (Esquema 2).
O O
H3C
R1R2
R3
1 : R1 = R2 = R3 = R4 = H2 : R1 = R3 = R4 = H R2 = OCH33 : R1 = R3 = OCH3 R2 = R4 = H4 : R1 = R2 = R3 = OCH3 R4 =H5 : R1 = R2 = R3 =H R4 = OCH36 : R1 = R2 = R4 =H R3 = OCH3
R4
Esquema 2
3.-Discusión de Resultados
18
La actividad i-MAO de nuestros compuestos fue evaluada in vitro utilizando como
compuestos de referencia el R-(-)-Deprenilo y la Iproniazida. (Tabla 3).
Tabla 3. Actividad i-MAO
Compuestos MAO-A (CI50) MAO-B (CI50) Indice
Selectividad
1 ** 283.75 ± 0.98 nMa >352b
2 ** 13.05 ± 0.90 nMa >7663b
3 ** 8.98 ± 1.42 nMa >11,136b
4 ** 160.64 ± 1.01 nMa >623b
5 ** ***
6 ** 802.60 ± 53.75 pM >124,688b
R-(-)-Deprenilo 67.25 ± 1.02 μMa 19.60 ± 0.86 nMa 3431
Iproniazida 6.56 ± 0.76 μM 7.54 ± 0.36 μMa 0.87
**inactivo a 100 μM (mas alta concentración testada) A concentración más altas el compuesto precipita
a P<0.01 los correspondientes valores IC50 obtenidos contra la Mao-B
b Valores obtenidos asumiendo que los correspondientes IC50 contra Mao-A es la más alta concentración testada
Todos los compuestos sintetizados son potentes inhibidores selectivos de la MAO-B.
Los valores de IC50 de los compuestos son mostrados en la Tabla 3, encontrándose
muchos de ellos en el rango de bajo nanomolar y picomolar. El compuesto 2 tiene una
IC50 MAO-B similar al R-(-)deprenilo y es más selectivo de este. El compuesto más
activo es el 6 que lleva un metoxilo en la posición 3’ y es activo en el rango picomolar.
Ninguno de los compuestos muestra actividad inhibitoria MAO-A. La presencia de
sustituyentes metoxilados parece importante para la actividad inhibitoria MAO-B.
Observando que la sustitución en la posición 3 del anillo cumarínico, parece tener
importancia para su actividad como i-MAO (en la bibliografía aparece además descrita
la sustitución en dicha posición con grupos fenilo, metilo, ácido carboxílico, ester o
cloruro de ácido 2b), pensamos en estudiar el efecto de la introducción de diferentes
anillos heterocíclicos sobre la actividad MAO. Adicionalmente se exploró la
importancia del número y posición de los sustituyentes sobre el anillo de benzopirano
3.-Discusión de Resultados
19
sobre dicha actividad, por ello se sintetizaron una nueva serie de 3-heteroarilcumarinas
(Esquema 4).
+O
H
OHR4
OHO
O O
R4R2
R1
R3
R2
R1
R3
13 R1 = R2 = R3 = H14 R1 =OCH3; R2 = R3 = H15 R2 = OCH3; R1 = R3 = H16 R1 = R3 = OCH3; R2 = H
a R4 =
b R4 =
c R4 =
S
S
NH
13a R1 = R2 = R3 = H; R4 =
13b R1 = R2 = R3 = H; R4 =
13c R1 = R2 = R3 = H; R4 =
S
S
NH
14a R1 =OCH3; R2 = R3 = H; R4 =
14b R1 =OCH3; R2 = R3 = H; R4 =
14c R1 =OCH3; R2 = R3 = H; R4 =
S
NH
15a R2 = OCH3; R1 = R3 = H; R4 =
15b R2 = OCH3; R1 = R3 = H; R4 =
15c R2 = OCH3; R1 = R3 = H; R4 =
S
S
NH
16a R1 = R3 = OCH3; R2 = H; R4 =
16b R1 = R3 = OCH3; R2 = H; R4 =
16c R1 = R3 = OCH3; R2 = H; R4 =
S
S
NH
S
DCC/DMSO
110ºC/24-48h
Esquema 4
Los ensayos enzimáticos demuestran que estos compuestos son en general
inhibidores selectivos de MAO-B ( Tabla 4).
De los resultados obtenidos se deduce que el número y la posición de los grupos
metoxilo sobre la estructura de benzopirano es más importante para la actividad que la
naturaleza del sustituyente heterocíclico en la posición 3.
La sustitución en posición 6 ó 7 del anillo de benzopirano conduce en general a un
incremento de la actividad i-MAO, mientras que la sustitución en posición 5 conduce a
una pérdida de la misma.
3.-Discusión de Resultados
20
Table 4. Valores de IC50 e índice de selectividad MAO-B [IC50 (MAO-A)]/[IC50 (MAO-B)] de los nuevos compuestos y los inhibidores de referencia.
Cada valor de IC50 es la media ± S.E.M. de cinco experimentos (n = 5). Nivel de significación estadística: aP <0,01 en comparación con el IC50 correspondientes a valores obtenidos frente a la MAO-B, fueron determinados por ANOVA / Dunnett s. bLos valores obtenidos bajo el supuesto de que el CI50 correspondiente en contra de la MAO-A es la concentración más alta ensayada (100 µM ó 1 mM) ** Inactivos a 100 mM (la concentración más alta ensayada). A mayores concentraciones los compuestos precipitan. SI: El índice de selectividad hMAO-B = IC50 (hMAO-A) / IC50 (hMAO-B).
3.2 Síntesis y evaluación farmacológica de híbridos benzofurano-resveratrol
La preparación de los 2-arilbenzofuranos intentó llevarse a cabo inicialmente a partir
de 3-fenilcumarinas, utilizando DIBAL-H a -78 °C y a continuación añadiendo H2SO4
2N y calentando la reacción a reflujo durante 3 h (Esquema 5).
Compuestos MAO-A (CI50) MAO-B (CI50) Indice Selectividad
13a ** 6.37 ± 0.43 µM > 15b
13b ** 13.3 ± 0.89 µM > 7.5b
13c ** 1.92 ± 0.13 µM > 52b
14a ** 262.95 ± 17.61 nM >380b
14b 4.16 ± 0.28 µMa 55.63 ± 3.73 nM > 75
14c 9.67 ± 0.65 µMa 45.95 ± 3.08 nM > 210
15a ** 633.55 ± 42.43 nM > 158b
15b ** 233.73 ± 15.65 nM > 428b
15c ** ** ---
16a ** ** ---
16b ** ** ---
16c ** ** ---
R-(-)-deprenilo 67.25 ± 1.02 µMa 19.60 ± 0.86 nM 3431
Iproniazida 6.56 ± 0.76 µM 7.54 ± 0.36 µM 0.87
3.-Discusión de Resultados
21
OO O
a) DIBAL -78°b) H2SO4 2N, refl.
MeO MeO
18
Esquema 5
Los rendimientos de la reacción son bajos (aprox. 10%), debido a las drásticas
condiciones utilizadas, pues el producto principal de la cumarina comercial 3-fenil-7-
metoxicumarina, resulta ser el 3-fenil-7-metoxi-2H-cromeno 19 (aprox. 90%
rendimiento), que se forma por la reducción del grupo carbonílico de la cumarina a
grupo CH2 (Figura 1).
OMeO O OMeO
19 Figura 1
Los datos 1H-RMN han confirmado la formación del cromeno presentando la señal
de un singlete a 5 ppm correspondiente a los 2 protones metilénicos del C-2.
Los métodos más comunes para la obtención de los 2-arilbenzofuranos recurren a la
reacción de Sonogashira Pd/catalizada entre o-yodo-fenoles y fenilacetilenos variamente
substituidos3, a la ciclodehidrogenación de 2-hidroxiestilbenos4, y a la reacción entre
una sal de fosfonio o-hidroxi substituida y ácidos benzoicos comerciales o los
correspondientes cloruros de los ácidos5. Este último método nos ha parecido el más
sencillo y por lo tanto fue el que elegimos.
El método implica primero la preparación de la sal de fosfonio a partir de un o-
hidroxisalicilaldehido oportunamente sustituido. Se reduce el grupo aldehídico a grupo
bencilico con NaBH4 y luego se trata el producto de reducción con PPH3 HBr
(Esquema 6).
3 i) Kundu, N.; Pal, M.; Mahanty, J.S.; De, M. J. Chem. Soc. Perkin Trans 1, , 1997, 2815 ii) Arcadi, A.; Cacchi, C.; Fabrizi, G.; Marinelli, F.; Moro, L. Synlett, 1999, 9, 1432. 4 Imafuku, K.; Fujita, R. Chemistry Express, 1991, 6, 323 5 a) McAllister, G. D.; Hartley, R.C.; Dawson, M.J.; Knaggs, A.R. J. Chem. Soc. Perkin Trans 1, , 1998, 3453. b) Ono, M.; Kawashima, H.; Nonaka, A.; Kaway, T.; Haratake, M.; Mori, H.; Kung, M.P.; Kung, H.F.; Saji, H.; Nakayama, M. J. Med. Chem. 2006, 49, 2725-2730
3.-Discusión de Resultados
22
H
O
OHNaBH4
OHPPh3 HBr PPh3
+ Br-
OH
OH
R RR
Esquema 6
La reacción entre la sal de fosfonio y el cloruro del ácido benzoico en tolueno
utilizando Et3N como catalizador lleva a la formación de los 2-arilbenzofuranos. La
reacción va a reflujo en 2 h y los rendimientos son muy satisfactorios (Esquema 7).
.
PPh3+ Br-
OH
O Cl
O+
Et3NtoluenoR
RR
R
Esquema 7
La reducción del doble enlace en posición 2-3 del benzofurano 23, realizada por
hidrogenación catalítica con Pd/C en EtOH en 24 h llevó a la formación del 2-fenil-
dihidrobenzofurano 26 con un 80 % de rendimiento (Esquema 8).
O
H2/Pd
EtOHOMe OMe
OMe
OMe
OOMe OMe
OMe
OMe
23 26
Esquema 8
Los datos 1H-RMN confirman la formación del producto de reducción con la
aparición de dos doble dobletes a 3.28 y 3.59 ppm relativos a los dos protones del C-3 y
el triplete de C-2 a 5.71 ppm.
En la Tabla 5 se observan lo benzofuranos y también el dihidrobenzofurano 26, que
han sido preparados y que serán sometidos a ensayos biológicos como potenciales
inhibidores de MAO.
3.-Discusión de Resultados
23
Tabla 5
OMeO18
OMe
OMe
OMeO
OMe23
OMe
OMeO
OMe 24 25
OOMe
OMe
OOMe
OMe
OMe
OMe26
O
OMe
OMe
OMe28
O
OMe
OMe29
OOMe
30
33
OOMe
O
OMe
OMe34 35
O
OMe
OMe
OMe
O
BrOMe
OMe
OMe
38
39O
BrOMe
OMe
O
BrOMe
40
O
OMe
OMe
OMe
O43
O
OMe
OMeO44
OOMe
O45
4.-Conclusiones
4.-Conclusiones
27
Se obtuvo una nueva serie de derivados híbridos que incorporan en una sola
estructura el núcleo de la cumarina y del resveratrol, con diversos sustituyentes y
con rendimientos aceptables, utilizando como reacción central la reacción de
Perkin (compuestos 1-12).
Se obtuvo una nueva serie de 3-heteroarilcumarinas, isósteros de los híbridos
anteriores, con diversos sustituyentes y buenos rendimientos, utilizando como
reacción clave la reacción de Perkin (compuestos 13-16).
Se obtuvo una nueva serie de derivados híbridos que incorporan en una sola
estructura el núcleo del benzofurano y del resveratrol, con diversos sustituyentes
y con rendimientos aceptables, utilizando como paso clave la reacción de Wittig
(17 compuestos entre el 18 y el 45, véase “III Relación de Compuestos Finales
Obtenidos”).
Se obtuvo un 2-fenildihidrobenzofurano análogo simplificado de la viniferina
(compuesto 26), por reducción de su precursor benzofuránico con un
rendimiento del 80%. La puesta a punto de esta reacción permitirá la síntesis de
una serie seleccionada.
Se caracterizaron todos los derivados obtenidos con punto de fusión, espectros
de masas, 1H-RMN y 13C-RMN.
Ensayos farmacológicos, todavía preliminares, fueron ya realizados para algunos
de los compuestos sintetizados, ofreciendo interesantes perfiles como
vasodilatadores, antigregantes plaquetarios e inhibidores MAO-B. Se continuará
este proceso para todas las series preparadas.
5.-Parte experimental
5.-Parte Experimental
31
Aspectos generales
Las reacciones se llevaron a cabo en atmósfera de argón desoxigenado y seco. Los
disolventes utilizados en las reacciones se secaron por destilación sobre un agente
desecante adecuado, en atmósfera de argón, inmediatamente antes de su uso. Los
agentes desecantes utilizados fueron: Na/benzofenona para THF, CaH2 para CH2Cl2,
CHCl3 y Et3N. El DMSO se destiló al vacío y se guardó sobre tamices moleculares 4Å
bajo argón 1.
El material de vidrio utilizado en las reacciones que exigieron condiciones anhidras
se secó por calentamiento a 140 oC durante 12 horas y posterior enfriamiento en
corriente de argón seco.
Las adiciones de disoluciones y disolvente se llevaron a cabo vía jeringa o cánula.
El secado de las disoluciones obtenidas tras la elaboración de cada reacción se llevó
a cabo mediante Na2SO4 ó MgSO4 anhidros.
Los espectros de RMN se registraron en espectrómetros Bruker WM-250 (250.13
MHz para 1H y 62.89 MHz para 13C). Para los espectros de RMN se emplearon CDCl3
y DMSO-d6 como disolventes. Los desplazamientos químicos están expresados en
unidades δ (ppm), las constantes de acoplamiento J en Hz y tomando como referencia la
señal del TMS (0 ppm) en todos los casos.
Los puntos de fusión se determinaron en un aparato Reichter Kofler y no están
corregidos.
Los espectros de masas de baja redisolución se realizaron en un sistema Hewlett-
Packard 59970-GC/MS operando a 70 eV.
Los análisis elementales se realizaron en analizadores elementales Perkin-Elmer
240B y Carlo-Erba EA1108.
Para cromatografía en capa fina se empleó gel de sílice GF-254 (Merck) y las
manchas se visualizaron bajo luz UV (254 y 366 nm) para los compuestos que absorben
a dicha longitud de onda, y también por el revelado al calor de los cromatofolios de
capa fina previamente tratados con el revelador adecuado2 (ácido fosfomolíbdico, yodo,
según corresponda).
Para cromatografía en columna se empleó gel de sílice 35-70 μm. Para las reacciones
a baja temperatura se utilizaron baños de hielo seco con acetona.
1Perrin, D. y Armarego, W.L.F. Purification of Laboratory Chemicals. 1988,, Pergamon Press. 2 Kirchner, J.G.; Thin-Layer Chromatography. 1978, John Wiley & Sons.
5.-Parte Experimental
32
5.-Parte Experimental
33
3-Fenil-6-metilcumarina (1)
DCC/DMSO
H
O
OHCOOH
O O
1
Una disolución de ácido fenilacético (2.50 g, 18.53 mmol), 2-hidroxi-5-
metilbenzaldehido (2.00 g, 14.60 mmol) y DCC (4.72 g, 23.00 mmol) en DMSO (30
mL) fue calentada en un baño de aceite a 110° C por 24 h. Finalizada la reacción se
adicionó agua fria (100 mL) y ácido acético (10 mL). A continuación se dejó con
agitación y a temperatura ambiente durante 4 h, tras lo cual se extrajo con etér etílico (4
x 100 mL). La diciclohexilurea que precipita fue separada de la interfase por filtración y
la fase etérea se extrajo con una disolución al 5 % de NaHCO3 (100 mL). La fase
orgánica fue separada, lavada con agua, secada con Na2SO4 anhidro y el disolvente
evaporado al vacío, obteniéndose un residuo que fue purificado por cromatografía en
columna utilizando como eluyente Hexano/AcOEt 9:1. Se obtuvieron 2.37 g (Rto: 68
%) de 1 como un sólido blanco puro.
P. f.: 148–149 °C 1H-RMN (CDCl3) δ (ppm): 2.42 (s, 3H, CH3), 7.27 (m, 1H, H-7), 7.34 (m, 2H, H-4’ H-8), 7.43 (m, 3H, H-2’ + H-4’ + H-5), 7.70 (dd, 2H, H-1’ + H-5’, J = 7.7 y 1.8), 7.77 (s, 1H, H-4). 13C-RMN (CDCl3) δ (ppm): 21.29, 116.67, 119.57, 128.17, 128.70, 128.95, 129.02, 129.26, 132.95, 134.65, 135.35, 140.39, 152.16, 161.31. MS m/z (%): 236 (M+, 100), 208 (50), 178 (8), 165 (8). Anal. Elem.: Calculado para C16H12O2 C, 81.34; H, 5.12. Experimental C, 81.44; H, 4.84.
5.-Parte Experimental
34
5.-Parte Experimental
35
6-Metil-3-(4’-metoxifenil)cumarina (2)
DCC/DMSO
H
O
OHCOOH
O O
OMe
MeO
2
Analogamente a la preparación de 1, la reacción del ácido 4-metoxifenilacético
(2.29 g, 13.80 mmol) con el 2-hidroxi-5-metilbenzaldehido (1.50 g, 11.00 mmol) y
DCC (3.55 g, 17.10 mmol) en DMSO (30 mL), condujo a un residuo que fue purificado
por cromatografía en columna eluyendo con Hexano/AcOEt 9:1. Se obtuvieron 1.78 g
(Rto: 61 %) de 2 como un sólido blanco puro.
P. f.: 144–145 °C 1H-RMN (CDCl3) δ (ppm): 2.40 (s, 3H, CH3), 3.84 (s, 3H, OCH3), 6.96 (dd, 2H, H-3’ + H-5’, J = 6.8 y 2.1), 7.26 (m, 3H, H-4 + H-7 + H-8), 7.66 (m, 3H, H-3 + H-2’ + H-6’). 13C-RMN (CDCl3) δ (ppm): 20.75, 55.32, 113.85, 116.04, 119.54, 127.19, 127.46, 127.66, 129.77, 132.02, 134.03, 138.47, 151.41, 160.05, 160.96. MS m/z (%): M+ 266 (100), 223 (60), 195 (24), 165 (16). Anal. Elem.: Calculado para C17H14O3: C, 76.68; H, 5.30. Experimental: C, 76.88; H, 5.32.
5.-Parte Experimental
36
5.-Parte Experimental
37
3-(3’,5’-Dimetoxifenil)-6-metilcumarina (3)
DCC/DMSO
H
O
OHCOOH
O O
MeO
OMe
OMe
OMe
3
Analogamente a la preparación de 1, la reacción del ácido 3,5-
dimetoxifenilacético (1.81 g, 9.20 mmol) con el 2-hidroxi-5-metilbenzaldehido (1.00 g,
7.30 mmol) y DCC (2.35 g, 11.30 mmol) en DMSO (20 mL), condujo a un residuo que
fue purificado por cromatografía en columna eluyendo con Hexano/AcOEt 9:1. Se
obtuvieron 1.29 g (Rto: 60 %) de 3 como un sólido blanco puro.
P. f.: 110–111 °C. 1H-RMN (CDCl3) δ (ppm): 2.40 (s, 3H, CH3), 3.82(s, 6H, OCH3), 6.50 (t, 1H, H-4’, J = 2.1), 6.83 (d, 2H, H-2’ + H-6’, J = 2.1), 7.22–7.33 (m, 3H, H-5 + H-7 + H-8), 7.74 (s, 1H, H-4). 13C-RMN (CDCl3) δ (ppm): 20.72, 55.41, 100.89, 106.72, 116.06, 119.22, 127.69, 127.93, 132.49, 134.10, 136.68, 140.02, 151.60, 160.48, 160.61. MS m/z (%): M+ 296 (100), 295 (17), 267 (16), 210 (8). Anal. Elem.: Calculado para C18H16O4: C, 72.96; H, 5.44. Experimental: C, 73.23; H, 4.90.
5.-Parte Experimental
38
5.-Parte Experimental
39
6-Metil-3-(3’,4’,5’-trimetoxifenil)cumarina (4)
DCC/DMSO
H
O
OHCOOH
O O
MeO
OMe
OMe
OMe
MeO
OMe
4
Analogamente a la preparación de 1, la reacción del ácido 3,4,5-
trimetoxifenilacético (2.08 g, 9.20 mmol) con el 2-hidroxi-5-metilbenzaldehido (1.00 g,
7.30 mmol) y DCC (2.35 g, 11.30 mmol) en DMSO (30 mL), condujo a un residuo que
fue purificado por cromatografía en columna con Hexano/AcOEt 9:1. Se obtuvieron
1.66 g (Rto: 70 %) de 4 como un sólido blanco puro.
P. f.: 165–166 °C. 1H-RMN (CDCl3) δ (ppm): 2.43 (s, 3H, CH3), 3.90 (s, 3H, OCH3), 3,92 (s, 6H, (OCH3)2), 6.93 (d, 2H, H-2’ + H-6’, J = 2.1), 7.24–7.35 (m, 3H, H-5 + H-7 + H-8), 7.76 (s, 1H, H-4). 13C-RMN (CDCl3) δ (ppm): 20.70, 56.19, 60.72, 105.94, 116.03, 119.24, 127.48, 127.58, 130.04, 130.44, 132.38, 134.12, 139.48, 151.45, 153.02, 160.66. MS m/z (%): M+ 326 (100), 311 (89), 283 (43), 253 (12). Anal. Elem.: Calculado para C19H18O5: C, 69.93; H, 5.56. Experimental: C, 70.14; H, 5.58.
5.-Parte Experimental
40
5.-Parte Experimental
41
6-Metil-3-(2’-metoxifenil)cumarina (5)
DCC/DMSO
H
O
OHCOOH
O O
OMe MeO
5
Analogamente a la preparación de 1, la reacción del ácido 2-metoxifenilacético
(1.52 g, 9.15 mmol) con el 2-hidroxi-5-metilbenzaldehido (1.00 g, 7.34 mmol) y DCC
(2.36 g, 11.44 mmol) en DMSO (20 mL), condujo a un residuo que fue purificado por
cromatografía eluyendo con Hexano/AcOEt 9:1. Se obtuvieron 1.15 g (Rto: 59 %) de 5
como un sólido amarillo puro.
P. f.: 177–178 °C. 1H-RMN (CDCl3) δ (ppm): 2.42 (s, 3H, CH3), 3.84 (s, 3H, OCH3), 7.02 (m, 2H, H-7 + H-8), 7.27-7.38 (m, 5H), 7.70 (s, 1H, H-4). 13C-RMN (CDCl3) δ (ppm): 20.80, 55.81, 111.31, 116.21, 119.24, 120.57, 124.20, 126.36, 127.58, 130.14, 130.80, 132.21, 133.89, 141.84, 151.82, 157.22, 160.55. MS m/z (%): M+ 266 (100), 249 (20), 237 (13), 173 (17). Anal. Elem.: Calculado para C17H14O3: C, 76.68; H, 5.30.
Experimental: C, 76.80; H, 5.45.
5.-Parte Experimental
42
5.-Parte Experimental
43
6-Metil-3-(3’-metoxifenil)cumarina (6)
6
DCC/DMSO
H
O
OHCOOH
O O
MeOOMe
Analogamente a la preparación de 1, la reacción del ácido 3-metoxifenilacético
(1.52 g, 9.15 mmol) con el 2-hidroxi-5-metilbenzaldehido (1.00 g, 7.34 mmol) y DCC
(2.36 g, 11.44 mmol) en DMSO (20 mL), condujo a un residuo que fue purificado por
cromatografía en columna con Hexano/AcOEt 9:1. Se obtuvieron 1.04 g (Rto: 53 %) de
6 como un sólido amarillo puro.
P. f.: 84–85 °C. 1H-RMN (CDCl3) δ (ppm): 2.36 (s, 3H, CH3), 3.79 (s, 1H, OCH3), 6.98 (dd, 2H, H-7 + H-8), 7.2-7-4 (m, 5H), 7.7 (s, 1H, H-4). 13C-RMN (CDCl3) δ (ppm): 20.77, 55.37, 114.15, 114.38, 116.10, 119.28, 120.86, 127.70, 129.43, 132.48, 134.12, 136.12, 139.91, 140.10, 151.60, 159.45, 160.66. MS m/z (%): M+ 266 (100), 251 (1), 238 (38), 223 (2). Anal. Elem.: Calculado para C17H14O3: C, 76.68; H, 5.30.
Experimental: C, 76.85; H, 5.60.
5.-Parte Experimental
44
5.-Parte Experimental
45
6-Cloro-3-(2’-metoxifenil)cumarina (7)
7
DCC/DMSO
H
O
OHCOOH
O O
Cl
ClOMe MeO
Analogamente a la preparación de 1, la reacción del ácido 2-metoxifenilacético
(0.53 g, 3.20 mmol) con el 5-cloro-2-hidroxibenzaldehido (0.40 g, 2.55 mmol) y DCC
(0.82 g, 4.00 mmol) en DMSO (20 mL), condujo a un residuo que fue purificado por
cromatografía eluyendo con Hexano/AcOEt (9:1). Se obtuvieron 0.34 g (Rto: 46 %) de
7 como un sólido amarillo puro
P. f.: 177-179 °C 1H-RMN (CDCl3) δ (ppm): (CDCl3) δ (ppm): 3.83 (s, 3H, OCH3), 7.00 (d, J = 8.2, 1H), 7.05 (d, J = 7.5, 1H), 7.22 (d, J = 8.2, 1H), 7.41 (m, 3H), 7.60 (m, 1H), 7.66 (s, 1H). 13C-RMN (CDCl3) δ (ppm): 55.7, 111.3, 116.7, 118.2, 120.6, 121.0, 126.9, 130.0, 130.4, 130.7, 131.0, 133.8, 140.2, 152.2, 156.9, 157.1. MS m/z (%): [M+2]+ 288 (33), M+ 286 (100), 269 (16), 251 (8). Anal. Elem.: Calculado para C16H11O3Cl: C, 67.03; H, 3.87.
Experimental: C, 67.25; H, 3.99.
5.-Parte Experimental
46
5.-Parte Experimental
47
6-Cloro-3-(4’-metoxifenil)cumarina (8)
8
DCC/DMSO
H
O
OHCOOH
O O
Cl
Cl
MeO
OMe
Analogamente a la preparación de 1, la reacción del ácido 4-metoxifenilacético
(2.65 g, 15.96 mmol) con el 5-cloro-2-hidroxibenzaldehido (2.00 g, 12.77 mmol) y
DCC (4.11 g, 19.92 mmol) en DMSO (30 mL), condujo a un residuo que fue purificado
por cromatografía eluyendo con Hexano/AcOEt (9:1). Se obtuvieron 1.0 g (Rto: 27 %)
de 8 como un sólido amarillo puro.
P. f.: 194-196 °C 1H-RMN (CDCl3) δ (ppm): 3.85 (s, 3H, OCH3), 6.99 (d, J = 8.9, 2H), 7.29 (d, J = 8.0, 1H), 7.48 (m, 2H), 7.66 (d, J = 8.9, 2H), 7.71 (s, 1H). 13C-RMN (CDCl3) δ (ppm): 55.4, 113.9 (2C), 117.7, 118.3, 120.3, 121.1, 126.8, 129.8 (2C), 130.8, 136.9, 141.1, 151.9, 156.3, 158.2. MS m/z (%): [M+2]+ 288 (33), M+ 286 (100), 258 (13). Anal. Elem.: Calculado para C16H11O3Cl: C, 67.03; H, 3.87.
Experimental: C, 67.10; H, 3.99.
5.-Parte Experimental
48
5.-Parte Experimental
49
6-Cloro-3-(3’-metoxifenil)cumarina (9)
9
DCC/DMSO
H
O
OHCOOH
O O
Cl
ClMeO
OMe
Analogamente a la preparación de 1, la reacción del ácido 3-metoxifenilacético
(0.47 g, 2.83 mmol) con el 5-cloro-2-hidroxibenzaldehido (0.35 g, 2.23 mmol) y DCC
(0.72 g, 3.49 mmol) en DMSO (15 mL), condujo a un residuo que fue purificado por
cromatografía con Hexano/AcOEt (9:1). Se obtuvieron 0.25 g (Rto: 40 %) de 9 como un
sólido blanco puro.
P. f.: 144-146 °C 1H-RMN (CDCl3) δ (ppm): 3.85 (s, 3H, OCH3), 6.96 (dd, J = 2.5 y 8.2, 1H), 7.25 (m, 2H), 7.35 (m, 2H), 7.48 (m, 2H), 7.72 (s, 1H). 13C-RMN (CDCl3) δ (ppm): 55.32, 114.2, 114.8, 117.8, 120.6, 120.8, 127.0, 129.2, 129.5, 129.7, 131.3, 135.5, 138.5, 151.8, 159.5, 159.8. MS m/z (%): [M+2]+ 288 (29), M+ 286 (100), 258 (30). Anal. Elem.: Calculado para C16H11O3Cl: C, 67.03; H, 3.87.
Experimental: C, 67.20; H, 3.95.
5.-Parte Experimental
50
5.-Parte Experimental
51
6-Bromo-3-(2’-metoxifenil)cumarina (10)
10
DCC/DMSO
H
O
OHCOOH
O O
Br
BrOMe MeO
Analogamente a la preparación de 1, la reacción del ácido 2-metoxifenilacético
(1.03 g, 6.20 mmol) con el 2-hidroxi-5-bromobenzaldehido (1.00 g, 4.90 mmol) y DCC
(1.59 g, 7.70 mmol) en DMSO (20 mL), condujo a un residuo que fue purificado por
cromatografía en columna con Hexano/AcOEt (9:1). Se obtuvieron 0.46 g (Rto: 29 %)
de 10 como un sólido amarillo puro.
P. f.: 183-185 °C 1H- RMN (CDCl3) δ (ppm): 3.82 (s, 3H, OCH3), 6.99 (d, J = 7.5, 1H), 7.03 (d, J = 7.4, 1H), 7.24 (d, J = 8.4, 1H), 7.36 (m, 2H), 7.60 (m, 2H), 7.66 (s, 1H). 13C-RMN (CDCl3) δ (ppm): 55.7, 111.3, 116.7, 118.2, 120.6, 121.0, 123.5, 127.6, 130.0, 130.5, 130.7, 133.8, 140.2, 152.5, 157.1, 159.6. MS m/z (%): [M+2]+ 332 (100), M+ 330 (97), 315 (23), 237 (32). Anal. Elem.: Calculado para C16H11O3Br: C, 58.03; H, 3.35.
Experimental: C, 58.25; H, 3.49.
5.-Parte Experimental
52
5.-Parte Experimental
53
6-Bromo-3-(4’-metoxifenil)cumarina (11)
11
DCC/DMSO
H
O
OHCOOH
O O
Br
Br
MeO
OMe
Analogamente a la preparación de 1, la reacción del ácido 4-metoxifenilacético
(1.03 g, 6.20 mmol) con el 5-bromo-2-hidroxibenzaldehido (1.00 g, 4.90 mmol) y DCC
(1.59 g, 7.70 mmol) en DMSO (20 mL), condujo a un residuo que fue purificado por
cromatografía con Hexano/AcOEt (9:1). Se obtuvieron 0.56 g (Rto: 33 %) de 11 como
un sólido blanco puro.
P. f.: 205-206 °C 1H-RMN (CDCl3) δ (ppm): 3.85 (s, 3H, OCH3), 6.97 (d, J = 8.8, 2H), 7.23 (m, 1H), 7.57 (dd, J = 2.2 y 8.7, 1H), 7.63 (m, 3H), 7.67 (s, 1H). 13C-RMN (CDCl3) δ (ppm): 55.3, 113.9 (2C), 114.1, 116.9, 118.1, 121.4, 126.5, 128.9, 129.8 (2C), 129.9, 133.6, 136.8, 152.0, 160.4. MS m/z (%): [M+2]+ 332 (100), M+ 330 (13), 302 (12), 288 (40). Anal. Elem.: Calculado para C16H11O3Br: C, 58.03; H, 3.35.
Experimental: C, 58.15; H, 3.42.
5.-Parte Experimental
54
5.-Parte Experimental
55
6-Bromo-3-(3’-metoxifenil)cumarina (12)
12
DCC/DMSO
H
O
OHCOOH
O O
Br
BrMeO
OMe
Analogamente a la preparación de 1, la reacción del ácido 4-metoxifenilacetico
(1.03 g, 6.20 mmol) con el 2-hidroxi-5-bromobenzaldehido (1.00 g, 4.90 mmol) y DCC
(1.59 g, 7.70 mmol) en DMSO (20 mL), condujo a un residuo que fue purificado por
cromatografía eluyendo con Hexano/AcOEt 9:1. Se obtuvieron 0.53 g (Rto: 31 %) de 12
como un sólido blanco puro.
P. f.: 148-150 °C 1H-RMN (CDCl3) δ (ppm): 3.85 (s, 3H, OCH3), 6.96 (dd, J = 2.3 y 8.2, 1H), 7.20 (m, 2H), 7.36 (m, 2H), 7.60 (d, J = 8.3, 1H), 7.75 (s, 1H), 7.85 (s, 1H). 13C-RMN (CDCl3) δ (ppm): 55.2, 114.1, 114.6, 116.9, 118.0, 120.7, 121.0, 129.0, 129.4, 130.0, 133.9, 135.3, 138.3, 152.1, 159.3, 159.6. MS m/z (%): [M+2]+ 332 (100), M+ 330 (28), 302 (34). Anal. Elem.: Calculado para C16H11O3Cl: C, 58.03; H, 3.35.
Experimental: C, 58.15; H, 3.50.
5.-Parte Experimental
56
5.-Parte Experimental
57
6-Cloro-3-(2’-hidroxifenil)cumarina (7a)
7a
O O
Cl
O O
Cl HI
Ac2O/AcOH
MeO HO
7
Sobre una didisolución de 7 (0.15 g, 0.52 mmol) en AcOH/Ac2O (1:1, 3 mL), se
adicionó gota a gota HI 57 % (6 mL) a O °C. Finalizada la adición se llevó a
temperatura ambiente y a continuación se mantuvo a reflujo durante 3 h. Finalizada la
reacción, el disolvente se elimina al vacio, obteniendose un residuo sólido que fue
purificado por cromatografía en columna con Hexano/AcOEt 8:2. Se obtuvieron 0.04 g
(Rto: 28 %) del compuesto 7a como un sólido amarillo puro.
P. f.: 225-227 ºC 1H-RMN (DMSO-d6) δ (ppm): 6.86 (m, 2H), 7.23 (m, 2H), 7.39 (d, J = 8.8, 1H), 7.78 (dd, J = 2.3 y 8.8, 1H), 7.97 (s, 1H), 8.00 (s, 1H), 9.64 (sa, 1H, OH). 13C-RMN (DMSO-d6) δ (ppm): 115.7, 116.0, 118.2, 118.7, 121.2, 121.8, 127.1, 129.9, 130.3, 130.7, 133.8, 140.6, 140.7, 152.1, 155.1. MS m/z (%): [M+2]+ 274 (23), M+ 272 (100), 244 (35). Anal. Elem.: Calculado para C15H9O3Cl: C, 66.07; H, 3.33.
Experimental: C, 66.25; H, 3.49.
5.-Parte Experimental
58
5.-Parte Experimental
59
6-Cloro-3-(4’-hidroxifenil)cumarina (8a)
8a
O O
Cl
O O
Cl HI
Ac2O/AcOH
8
OMe OH
Analogamente a la preparación de 7a a partir de 7, la reacción de 8 (0.15 g, 0.52
mmol) y HI (6 mL) en AcOH/Ac2O (1:1, 3 mL), condujo a un residuo que fue
purificado por cromatografía en columna (Hexano/AcOEt 8:2). Se obtuvieron 0.09 g
(Rto: 60 %) de 8a como un sólido amarillo intenso puro.
P. f.: 241-243 ºC 1H-RMN (DMSO-d6) δ (ppm): 6.84 (d, J = 8.6, 2H), 7.44 (d, J = 8.8, 1H), 7.58 (m, 3H), 7.84 (d, J = 2.5, 1H), 8.09 (s, 1H), 9.81 (sa, 1H, OH). 13C-RMN (DMSO-d6) δ (ppm): 115.1 (2C), 117.7, 121.1, 124.8, 127.2, 127.8, 128.1, 129.9 (2C), 130.6, 137.1, 151.2, 158.2, 159.5. MS m/z (%): [M+2]+, 274 (20), M+ 272 (100), 244 (74). Anal. Elem.: Calculado para C15H9O3Cl: C, 66.07; H, 3.33.
Experimental: C, 66.22; H, 3.47.
5.-Parte Experimental
60
5.-Parte Experimental
61
6-Cloro-3-(3’-hidroxifenil)cumarina (9a)
9a
O O
Cl
O O
Cl HI
Ac2O/AcOH
9
OMe OH
Analogamente a la preparación de 7a a partir de 7, la reacción de 9 (0.15 g, 0.52
mmol) y HI (6 mL) en AcOH/Ac2O (1:1, 3 mL), condujo a un residuo que fue
purificado por cromatografia (Hexano/AcOEt 8:2). Se obtuvieron 0.10 g (Rto: 70 %) de
9a como un sólido amarillo intenso puro.
P. f.: 221-223 ºC 1H-RMN (DMSO-d6) δ (ppm): 6.82 (dd, J = 2.2 y 8.0, 1H), 7.10 (m, 2H), 7.25 (m, 1H), 7.44 (d, J = 8.8, 1H), 7.61 (dd, J = 2.5 y 8.8, 1H), 7.86 (d, J = 2.5, 1H), 8.14 (s, 1H), 9.60 (sa, 1H, OH); 13C-RMN (DMSO-d6) δ (ppm): 115.5, 115.9, 117.8, 119.2, 120.9, 127.6, 128.0, 128.2, 129.3, 131.1, 135.5, 139.1, 151.5, 157.1, 159.2. MS m/z (%): [M+2]+ 274 (21), M+ 272 (100), 244 (48). Anal. Elem.: Calculado para C15H9O3Cl: C, 66.07; H, 3.33.
Experimental: C, 66.30; H, 3.45.
5.-Parte Experimental
62
5.-Parte Experimental
63
6-Bromo-3-(2’-hidroxifenil)cumarina (10a)
10a
O O
Br
O O
Br HI
Ac2O/AcOH
MeO HO
10
Analogamente a la preparación de 7a a partir de 7, la reacción de 10 (0.10 g,
0.30 mmol) y HI (4 mL) en AcOH/Ac2O (1:1, 2 mL), condujo a un residuo que fue
purificado por cromatografía en columna (Hexano/AcOEt 8:2). Se obtuvieron 0.07g
(Rto: 73 %) de 10a como un sólido amarillo intenso puro.
P. f.: 230-232 ºC. 1H-RMN (DMSO-d6) δ (ppm): 6.87 (m, 2H), 7.23 (m, 2H), 7.40 (d, J = 8.8, 1H), 7.74 (dd, J = 2.3 y 8.8, 1H), 7.99 (s, 1H), 8.02 (s, 1H), 9.64 (sa, 1H, OH). 13C-RMN (DMSO-d6) δ (ppm): 115.7, 116.0, 118.2, 118.7, 121.2, 121.8, 127.1, 129.9, 130.3, 130.7, 133.8, 140.6, 152.1, 155.1, 158.8. MS m/z (%): [M+2]+ 318 (47), M+ 316 (71), 300 (8), 288 (40). Anal. Elem.: Calculado para C15H9O3Br: C, 56.81; H, 2.86.
Experimental: C, 56.95; H, 3.00.
5.-Parte Experimental
64
5.-Parte Experimental
65
6-Bromo-3-(4’-hidroxifenil)cumarina (11a)
11a
O O
Br
O O
Br HI
Ac2O/AcOH
11
OMe OH
Analogamente a la preparación de 7a a partir de 7, la reacción de 10 (0.10 g,
0.30 mmol) y HI (4 mL) en AcOH/Ac2O (1/1, 2 mL), condujo a un residuo que fue
purificado por cromatografía en columna (Hexano/AcOEt 8:2). Se obtuvieron 0.05 g
(Rto: 57%) de 11a como un sólido amarillo intenso puro.
P. f.: 226-228 ºC. 1H-RMN (DMSO-d6) δ (ppm): 6.84 (d, J = 8.8, 2H), 7.34 (d, J = 9.1, 1H), 7.54 (d, J = 8.8, 2H), 7.66 (m, 1H), 7.99 (s, 1H), 8.09 (s, 1H), 9.81 (sa, 1H, OH). 13C-RMN (DMSO-d6) δ (ppm): 115.1 (2C), 116.0, 118.0, 121.6, 124.8, 127.7, 129.9 (2C), 130.2, 133.3, 137.0, 151.6, 158.2, 159.4. MS m/z (%): [M+2]+ 318 (31), [M+1]+ 317 (100), M+ 316 (40). Anal. Elem.: Calculado para C15H9O3Cl: C, 56.81; H, 2.86.
Experimental: C, 56.87; H, 3.00.
5.-Parte Experimental
66
5.-Parte Experimental
67
6-Bromo-3-(3’-hidroxifenil)cumarina (12a)
12a
O O
Br
O O
Br HI
Ac2O/AcOH
12
OMe OH
Analogamente a la preparación de 7a a partir de 7, la reacción de 12 (0.10 g, 0.3
mmol) y HI (4 mL) en AcOH/Ac2O (1:1, 2 mL), condujo a un residuo que fue
purificado por cromatografía en columna (Hexano/AcOEt 8:2). Se obtuvieron 0.09 g
(Rto: 94 %) de 12a como un sólido amarillo intenso puro.
P. f.: 219-221 ºC 1H-RMN (DMSO-d6) δ (ppm): 6.82 (dd, J = 2.0 y 7.7, 1H), 7.10 (m, 2H), 7.25 (m, 1H), 7.38 (d, J = 8.8, 1H), 7.73 (dd, J = 2.3 y 8.8, 1H), 8.00 (d, J = 2.3, 1H), 8.14 (s, 1H), 9.59 (sa, 1H, OH). 13C-RMN (DMSO-d6) δ (ppm): 115.5, 115.9, 116.1, 118.1, 119.2, 121.4, 128.0, 129.3, 130.6, 133.9, 135.5, 139.0, 151.9, 157.1, 159.1. MS m/z (%): [M+2]+ 318 (46), M+ 316 (79), 288 (46). Anal. Elem.: Calculado para C15H9O3Cl: C, 56.81; H, 2.86.
Experimental: C, 56.98; H, 3.01.
5.-Parte Experimental
68
5.-Parte Experimental
69
3-(2-Tienil)cumarina (13a)
O
H
OH
DCC/DMSO
13a
S OHO
O
S
O
Analogamente a la preparación de 1, la reacción del ácido 2-tiofenilacético (1.40
g, 9.82 mmol) con el 2-hidroxibenzaldehido (1.00 g, 8.18 mmol) y DCC (2.53g, 12.27
mmol) en DMSO (10 mL), condujo a un residuo que fue purificado por cromatografía
en columna eluyendo con Hexano/AcOEt 9:1. Se obtuvieron 0.64 g (Rto: 34 %) de 13a
como un sólido blanco puro.
P. f.: 166-167 oC. 1H-RMN (CDCl3) δ (ppm): 7.12 (m, 1H), 7.28 (d, J = 9.4, 1H), 7.35 (d, J = 9.4, 1H), 7.42 (d, J = 5.1, 1H), 7.52 (m, 2H), 7.80 (d, J = 3.8, 1H), 7.99 (s, 1H). 13C-RMN (CDCl3) δ (ppm): 116.4, 119.3, 121.7, 124.6, 127.0, 127.5, 127.7, 129.6, 131.1, 135.5, 135.9, 152.6, 160.1. MS m/z (%): [M + 1]+, 229 (22), M+,228 (30). Anal. Elem.: Calculado para C13H8O2S: C, 68.40; H, 3.53.
Experimental: C, 68.52; H, 3.59.
5.-Parte Experimental
70
5.-Parte Experimental
71
3-(3-Tienil)cumarina (13b)
O
H
OH
DCC/DMSO
13b
S OHO
O
S
O
Analogamente a la preparación de 1, la reacción del ácido 3-tiofenilacético (1.40
g, 9.82 mmol) con el 2-hidroxibenzaldehido (1.00 g, 8.18 mmol) y DCC (2.50 g, 12.27
mmol) en DMSO (10 mL), condujo a un residuo que fue purificado por cromatografía
en columna con Hexano/AcOEt 9:1. Se obtuvieron 0.69 g (Rto: 37 %) de 13b como un
sólido blanco puro
P. f.: 175-176 oC. 1H-RMN (CDCl3) δ (ppm): 7.30 (d, J = 7.5, 1H), 7.35 (m, 2H), 7.53 (m, 3H), 7.93 (s, 1H), 8.18 (d, J = 3.0, 1H). 13C-RMN (CDCl3) δ (ppm): 116.3, 119.4, 122.6, 124.5, 125.6, 126.0, 126.2, 127.7, 131.1, 134.3, 137.2, 152.8, 160.0. MS m/z (%): [M + 1]+, 229 (18), M+, 228 (33). Anal. Elem.: Calculado para C13H8O2S: C, 68.40; H, 3.53.
Experimental: C, 68.50; H, 3.60
5.-Parte Experimental
72
5.-Parte Experimental
73
3-(3-Indolil)cumarina (13c)
O
H
OH
DCC/DMSO
13c
O
NH
ONH
OH
O
Analogamente a la preparación de 1, la reacción del ácido 3-indolilacético (1.70
g, 9.82 mmol) con el 2-hidroxibenzaldehido (1.00 g, 8.18 mmol) y DCC (2.53g, 12.27
mmol) en DMSO (10 mL), condujo a un residuo que fue purificado por cromatografía
en columna (Hexano/AcOEt 9:1). Se obtuvieron 0.72 g (Rto: 33 %) de 13c como un
sólido blanco puro.
P. f.: 190-191 oC. 1H-RMN (CDCl3) δ (ppm): 7.32 (m, 3H), 7.48 (m, 2H), 7.58 (dd, J = 7.6; 1.3, 1H), 7.98 (m, 1H); 8.16 (s, 1H), 8.20 (d, J = 2.6, 1H), 8.65 (sa, 1H, NH). 13C-RMN (CDCl3) δ (ppm): 111.9, 116.3, 119.5, 120.2, 120.9, 122.7, 122.9, 124.4, 125.5, 127.2, 127.6, 130.1, 134.9, 136.2, 143.5, 152.2, 160.8. MS m/z (%): [M + 1]+, 262 (15), M+, 261 (40). Anal. Elem.: Calculado para C17H11NO2: C, 78.15; H, 4.24.
Experimental: C, 78.20; H, 3.30
5.-Parte Experimental
74
5.-Parte Experimental
75
7-Metoxi-3-(2-tienil)cumarina (14a)
O
H
OH
DCC/DMSO
14aO
S
O
S OHO MeO
MeO
Analogamente a la preparación de 1, la reacción del ácido 2-tiofenilacético (1.12
g, 7.88 mmol) con el 2-hidroxi-4-metoxibenzaldehido (1.00 g, 6.57 mmol) y DCC (2.11
g, 10.25 mmol) en DMSO (10 mL), condujo a un residuo que fue purificado por
cromatografía en columna eluyendo con Hexano/AcOEt 9:1. Se obtuvieron 0.46 g (Rto:
27 %) de 14a como un sólido blanco puro.
P. f.: 155-156 oC. 1H-RMN (CDCl3) δ (ppm): 3.89 (s, 3H), 6.85 (s, 1H), 6.88 (d, J = 8.4, 1H), 7.11 (m, 1H), 7.38 (dd, J = 4.0 y 1.0, 1H), 7.45 (d, J = 8.4, 1H), 7.74 (dd, J = 4.0 y 1.0, 1H), 7.96 (s, 1H). 13C-RMN (CDCl3) δ (ppm): 55.8, 100.4, 112.9, 113.1, 126.1, 126.5, 126.8, 127.4, 128.7, 136.0, 136.4, 154.5, 161.0, 162.5. MS m/z (%): [M + 1]+, 259 (33), M+, 258 (44). Anal. Elem.: Calculado para C14H10O3S: C, 65.10; H, 3.90.
Experimental: C, 65.17; H, 3.97
5.-Parte Experimental
76
5.-Parte Experimental
77
7-Metoxi-3-(3-tienil)cumarina (14b)
O
H
OH
DCC/DMSO
14b
S OHO
O
S
O
MeO
MeO
Analogamente a la preparación de 1, la reacción del ácido 3-tiofenilacético (1.12
g, 7.88 mmol) con el 2-hidroxi-4-metoxibenzaldehido (1.00 g, 6.57 mmol) y DCC (2.11
g, 10.25 mmol) en DMSO (10 mL), condujo a un residuo que fue purificado por
cromatografía en columna (Hexano/AcOEt 9:1). Se obtuvieron 0.42 g (Rto: 25 %) de
14b como un sólido blanco puro.
P. f.: 168-169 oC. 1H-RMN (CDCl3) δ (ppm): 3.87 (s, 3H), 6.85 (m, 2H), 7.36 (dd, J = 5.0 y 3.0, 1H), 7.42 (d, J = 8.4, 1H), 7.50 (dd, J = 5.0 y 1.2, 1H), 7.87 (s, 1H), 8.11(dd, J = 3.0 y 1.2, 1H). 13C-RMN (CDCl3) δ (ppm): 55.7, 100.3, 112.8, 113.0, 119.3, 125.0, 125.5, 126.0, 128.6, 134.6, 137.5, 154.6, 160.8, 162.4. MS m/z (%): [M + 1]+, 259 (25), M+, 258 (47). Anal. Elem.: Calculado para C14H10O3S: C, 65.10; H, 3.90.
Experimental: C, 65.18; H, 3.97
5.-Parte Experimental
78
5.-Parte Experimental
79
3-(3-Indolil)-7-metoxicumarina (14c)
O
H
OH
DCC/DMSO
14c
S OHO
O
NH
O
MeO
MeO
Analogamente a la preparación de 1, la reacción del ácido 3-indolilacético (1.38
g, 7.88 mmol) con el 2-hidroxi-4-metoxibenzaldehido (1.00 g, 6.57 mmol) y DCC (2.11
g, 10.25 mmol) en DMSO (10 mL); condujo a un residuo que fue purificado por
cromatografía en columna con Hexano/AcOEt 9:1. Se obtuvieron 0.55 g (Rto: 29 %) de
14c como un sólido blanco puro.
P. f.: 185-186 oC. 1H-RMN (CDCl3) δ (ppm): 3.95 (s, 3H), 6.89 (m, 2H), 7.28 (m, 2H), 7.47 (m, 2H), 7.95 (m, 1H), 8.10 (s, 1H), 8.13 (d, J = 3.0, 1H), 8.57 (sa, 1H, NH). 13C-RMN (CDCl3) δ (ppm): 55.7, 100.3, 100.0, 111.7, 112.6, 113.6, 119.4, 119.5, 120.6, 122.5, 126.0, 126.8, 128.1, 135.5, 136.2, 153.8, 161.1, 161.6. MS m/z (%): [M + 1]+, 292 (17), M+, 291 (49). Anal. Elem.: Calculado para C18H13NO3: C, 74.22; H, 4.50.
Experimental: C, 74.29; H, 4.56
5.-Parte Experimental
80
5.-Parte Experimental
81
6-Metoxi-3-(2-tienil)cumarina (15a)
O
H
OH
DCC/DMSO
15a
S OHO
O
S
O
MeO
MeO
Analogamente a la preparación de 1, la reacción del ácido 2-tiofenilacético (1.12
g, 7.88 mmol) con el 2-hidroxi-5-metoxibenzaldehido (1.00 g, 6.57 mmol) y DCC (2.11
g, 10.25 mmol) en DMSO (10 mL), condujo a un residuo que fue purificado por
cromatografía en columna con Hexano/AcOEt 9:1. Se obtuvieron 0.80 g (Rto: 47 %) de
15a como un sólido blanco puro.
P. f.: 150-151 oC. 1H-RMN (CDCl3) δ (ppm): 3.85 (s, 3H), 6.96 (d, J = 2.8, 1H), 7.09 (m, 2H), 7.27 (d, J = 9.0, 1H), 7.42 (dd, J = 5.1 y 1.0, 1H), 7.79 (dd, J = 3.7 y 1.0, 1H), 7.94 (s, 1H). 13C-RMN (CDCl3) δ (ppm): 55.7, 109.4, 117.3, 119.0, 119.6, 121.9, 127.0, 127.5, 127.7, 135.2, 135.9, 147.1, 156.2, 161.1. MS m/z (%): [M + 1]+, 259 (22), M+, 258 (50). Anal. Elem.: Calculado para C14H10O3S: C, 65.10; H, 3.90.
Experimental: C, 65.15; H, 3.94
5.-Parte Experimental
82
5.-Parte Experimental
83
6-Metoxi-3-(3-tienil)cumarina (15b)
O
H
OH
DCC/DMSO
15b
S OHO
O
S
O
MeO
MeO
Analogamente a la preparación de 1, la reacción del ácido 3-tiofenilacético (1.12
g, 7.88 mmol) con el 2-hidroxi-5-metoxibenzaldehido (1.00 g, 6.57 mmol) y DCC (2.11
g, 10.25 mmol) en DMSO (10 mL), condujo a un residuo que fue purificado por
cromatografía en columna con Hexano/AcOEt 9:1. Se obtuvieron 0.73 g (Rto: 43 %) de
15b como un sólido blanco puro.
P. f.: 164-165 oC. 1H-RMN (CDCl3) δ (ppm): 3.84 (s, 3H), 6.95 (d, J = 3.0, 1H), 7.06 (dd, J = 9.0 y 3.0, 1H), 7.25 (d, J = 9.0, 1H), 7.37 (dd, J = 5.1 y 3.0, 1H), 7.50 (dd, J = 5.1 y 1.3, 1H), 7.86 (s, 1H), 8.18 (dd, J = 3.0 y 1.3, 1H). 13C-RMN (CDCl3) δ (ppm): 55.7, 109.6, 117.2, 118.9, 119.7, 122.8, 125.6, 126.0, 126.1, 134.3, 136.9, 147.2, 156.0, 160.1. MS m/z (%): [M + 1]+, 259 (27), M+, 258 (52). Anal. Elem.: Calculado para C14H10O3S: C, 65.10; H, 3.90.
Experimental: C, 65.20; H, 3.99
5.-Parte Experimental
84
5.-Parte Experimental
85
3-(3-Indolil)-6-metoxicumarina (15c)
O
H
OH
DCC/DMSO
15cO
NH
ONH
OH
O
MeO
MeO
Analogamente a la preparación de 1, la reacción del ácido 3-indolilacético (1.38
g, 7.88 mmol) con el 2-hidroxi-5-metoxibenzaldehido (1.00 g, 6.57 mmol) y DCC (2.11
g, 10.25 mmol) en DMSO (10 mL), condujo a un residuo que fue purificado por
cromatografía en columna (Hexano/AcOEt 9:1). Se obtuvieron 0.73 g (Rto: 38 %) de
15c como un sólido blanco puro.
P. f.: 188-189 oC. 1H-RMN (CDCl3) δ (ppm): 3.84 (s, 3H), 5.87 (d, J = 7.7, 1H), 6.93 (d, J = 2.8, 1H), 7.04 (dd, J = 9.0 y 2.8, 1H), 7.30 (m, 3H), 7.79 (d, J = 7.7, 1H), 8.01 (s, 1H), 8.27 (s, 1H), 8.30 (sa, 1H, NH). 13C-RMN (CDCl3) δ (ppm): 55.7, 109.3, 112.6, 115.4, 117.2, 118.7, 119.3, 119.8, 122.7, 124.6, 125.7, 127.3, 135.9, 137.0, 146.7, 150.8, 156.1, 160.5. MS m/z (%): [M + 1]+, 292 (35), M+, 291 (57). Anal. Elem.: Calculado para C18H13NO3: C, 74.22; H, 4.50.
Experimental: C, 74.30; H, 4.53
5.-Parte Experimental
86
5.-Parte Experimental
87
5,7-Dimetoxi-3-(2-tienil)cumarina (16a)
O
H
OH
DCC/DMSO
16a
S OHO
O
S
O
OMe
MeO
OMe
MeO
Analogamente a la preparación de 1, la reacción del ácido 2-tiofenilacético (0.94
g, 6.58 mmol) con el 4,6-dimetoxi-2-hidroxibenzaldehido (1.00 g, 5.49 mmol) y DCC
(1.76 g, 8.56 mmol) en DMSO (10 mL), condujo a un residuo que fue purificado por
cromatografía en columna con Hexano/AcOEt 9:1. Se obtuvieron 0.71 g (Rto: 45 %) de
16a como un sólido blanco puro.
P. f.: 177-178 oC. 1H-RMN (CDCl3) δ (ppm): 3.86 (s, 3H), 3.93 (s, 3H), 6.31 (d, J = 2.1, 1H), 6.46 (d, J = 2.1, 1H), 7.10 (dd, J = 5.0 y 3.6, 1H), 7.36 (d, J = 5.0, 1H), 7.72 (d, J = 3.6, 1H), 8.29 (s, 1H). 13C-RMN (CDCl3) δ (ppm): 55.6, 56.0, 92.4, 95.1, 126.5, 127.1, 127.3, 127.5, 131.5, 136.9, 153.2, 155.3, 156.9, 160.0, 163.4. MS m/z (%): [M + 1]+, 289 (24), M+, 288 (51). Anal. Elem.: Calculado para C15H12O4S: C, 62.49; H, 4.20.
Experimental: C, 62.55; H, 4.27
5.-Parte Experimental
88
5.-Parte Experimental
89
5,7-Dimetoxi-3-(3-tienil)cumarina (16b)
O
H
OH
DCC/DMSO
16b
S OHO
O
S
O
OMe
MeOOMe
MeO
Analogamente a la preparación de 1, la reacción del ácido 3-tiofenilacético (0.94
g, 6.58 mmol) con el 4,6-dimetoxi-2-hidroxibenzaldehido (1.00 g, 5.49 mmol) y DCC
(1.76 g, 8.56 mmol) en DMSO (10 mL), condujo a un residuo que fue purificado por
cromatografía en columna con Hexano/AcOEt 9:1. Se obtuvieron 0.55 g (Rto: 35 %) de
16b como un sólido blanco puro.
P. f.: 158-159 oC. 1H-RMN (CDCl3) δ (ppm): 3.85 (s, 3H), 3.90 (s, 3H), 6.28 (d, J = 1.8, 1H), 6.42 (d, J = 1.8, 1H), 7.35 (dd, J = 4.8 y 2.5, 1H), 7.52 (d, J = 4.8, 1H), 8.10 (d, J = 2.5, 1H), 8.20 (s, 1H). 13C-RMN (CDCl3) δ (ppm): 55.6, 55.8, 92.2, 94.8, 104.3, 117.3, 124.4, 125.2, 126.1, 132.7, 135.0, 155.3, 156.8, 160.4, 163.2. MS m/z (%): [M + 1]+, 289 (17), M+, 288 (60). Anal. Elem.: Calculado para C15H12O4S: C, 62.49; H, 4.20.
Experimental: C, 62.53; H, 4.24
5.-Parte Experimental
90
5.-Parte Experimental
91
5,7-Dimetoxi-3-(3-indolil)cumarina (16c)
O
H
OH
DCC/DMSO
16c
O
NH
ONH
OH
O
OMe
MeO
OMe
MeO
Analogamente a la preparación de 1, la reacción del ácido 3-indolilacético (1.15
g, 7.88 mmol) con el 4,6-dimetoxi-2-hidroxibenzaldehido (1.00 g, 6.57 mmol) y DCC
(2.11 g, 10.25 mmol) en DMSO (10 mL); condujo a un residuo que fue purificado por
cromatografía en columna eluyendo con Hexano/AcOEt 9:1. Se obtuvieron 0.76 g (Rto:
43%) de 16c como un sólido blanco puro.
P. f.: 179-180 oC. 1H-RMN (CDCl3) δ (ppm): 3.88 (s, 3H), 3.95 (s, 3H), 5.68 (d, J = 7.2, 1H), 6.33 (d, J = 2.0, 1H), 6.48 (d, J = 2.0, 1H), 7.33 (m, 2H), 7.89 (dd, J = 7.2 y 1.2, 1H), 8.17 (s, 1H), 8.33 (dd, J = 7.0 y 1.2, 1H), 8.48 (sa, 1H, NH). 13C-RMN (CDCl3) δ (ppm): 55.8, 56.0, 92.3, 95.0, 104.6, 113.6, 115.3, 115.8, 119.6, 122.6, 124.5, 127.6, 133.3, 136.0, 151.0, 155.0, 156.8, 161.1, 163.2. MS m/z (%): [M + 1]+, 322 (28), M+, 321 (57). Anal. Elem.: Calculado para C19H15NO4: C, 71.02; H, 4.71.
Experimental: C, 71.10; H, 4.77.
5.-Parte Experimental
92
5.-Parte Experimental
93
2-Fenil-6-metoxibenzofurano (18) y 3-Fenil-7-metoxi-2H-cromeno (19)
OMeOO OMeO¡) DiBAL, -780C
¡¡) H2SO4 2N,reflujo
17 18
OMeO+
19
Sobre una didisolución de 17 (0.10 g, 0.40 mmol) en CH2Cl2 anhidro en
atmósfera de argón se añadió gota a gota a -78 ˚C DiBAL-H (0.59 mL, 0.59 mmol) y se
agitó durante 1 h. A continuación se añadieron gota a gota 1.5 equivalentes de DiBAL-
H (0.59 mL, 0.59 mmol) y se mantuvo en agitación 2 h mas a -78 ˚C. Se llevó a -50 ˚C
y se adicionó H2SO4 2N (10 mL). Se dejó subir lentamente la temperatura y a
continuación se calentó a reflujo 3 h. Finalizada la reacción se extrajo con CH2Cl2 (3 x
15 mL). Le fase orgánica fue secada con Na2SO4, filtrada y llevada a sequedad. Se
obtuvo un residuo sólido marrón que fue purificado mediante cromatografía en columna
eluyendo con Hexano/Tolueno 6:4 (2v). Se obtuvieron 35 mg de 18 (Rto: 10%) y 0.34 g
de 19 (Rto: 90%) como sólidos blancos.
Compuesto 18: P. f.: 156-157 ºC 1H-RMN (CDCl3) δ (ppm): 3.80 (s, 3H, OCH3); 6.80 (dd, J = 8.6 y 2.3, 1H); 6.88 (d, J = 1.0, 1H), 7.00 (d, J = 2.0, 1H), 7.24 (m, 1H), 7.37 (m, 3H), 7.74 (m, 2H). 13C-RMN (CDCl3) δ (ppm): 56.4 (OCH3), 96.5, 101.8, 112.65, 121.7, 123.2, 125.1, 128.7, 129.4, 131.4, 140.0, 156.6, 158.7. MS m/z (%): [M+1]+ 224 (14), M+ 223 (80), 208 (100), 151 (32). Anal. Elem.: Calculado para C15H12O2: C, 80.34; H, 5.39.
Experimental C, 80.36; H, 5.44.
Compuesto 19:
P. f.: 189-190 ºC 1H-RMN (CDCl3) δ (ppm): 3.64(s, 3H, OCH3), 5.0 (s, 2H, H-2), 6.32 (s, 1H), 6.36 (d, J = 2.5, 1H), 6.64 (s, 1H), 6.86 (d, J = 7.8, 1H), 7.22 (m, 5H).
5.-Parte Experimental
94
13C-RMN (CDCl3) δ (ppm): 55.99 (OCH3), 67.88 (OCH2), 102.05, 108.04, 116.83, 120.48, 125.13, 128.23, 128.37, 129.21, 129.32, 137.56, 135.18, 161.31. MS m/z (%): [M+1]+ 239 (15), M+ 238 (91), 237 (100), 194 (13). Anal. Elem.: Calculado para C16H14O2: C, 80.65; H, 5.92.
Experimental C, 80.15; H, 6.27.
Compuesto 18
Compuesto 19
5.-Parte Experimental
95
2-Acetoniloxi-3-metoxibenzaldehido (20)
H
O
OHOMe
Ac2OH
O
OCOCH3OMe
20
Sobre una didisolución de 2-hidroxi-3-metoxibenzaldehido (5.01 g, 32.95 mmol)
y K2CO3 (5.92 g, 42.84 mmol) en etér etílico anhidro (100 mL) se adicionó anhídrido
acético. La reacción se mantuvo en agitación a temperatura ambiente durante 2 h. Luego
se filtró lavando con etér varias veces. La disolución fue llevada a sequedad para dar un
aceite. Se adicionó H2O y se extrajo con CH2Cl2. La fase orgánica fue secada con
Na2SO4, filtrada y llevada a sequedad. El residuo sólido obtenido fue purificado por
cromatografía en columna con Hexano/AcOEt (85:15). Se obtuvieron 5.45 g (Rto: 84
%) del compuesto 20 como sólido blanco.
P. f.: 115-116 ºC 1H-RMN (CDCl3) δ (ppm): 2.19 (s, 3H, CH3CO), 3.66 (s, 3H, OCH3), 7.01 (d, 1H, J = 8.1, H-4), 7.11 (t, J = 8.1, H-3), 7.24 (d, J = 8.1, H-2), 9.92 (s, 1H, CHO). 13C-RMN (CDCl3) δ (ppm): 20.7 (CH3CO), 56.6 (OCH3), 118.2, 121.5, 127.39, 129.5, 141.8, 152.1. 169.0 (CO), 189.1 (CHO). Anal. Elem.: Calculado para C15H12O2: C, 61.85; H, 5.19.
Experimental C, 60.77; H, 5.85.
5.-Parte Experimental
96
5.-Parte Experimental
97
Acetato de 2-hidroxi-3-metoxibencilo (21)
H
O
OCOCH3OMe
NaBH3CN OCOCH3
OHOMe2120
Sobre una didisolución de 20 (5.45 g, 28.09 mmol) en THF/H2O (100 mL) se
adicionó el cianoborohidruro de sodio, y a continuación se acidificó a pH 3 con
AcOH/THF/HCl (10:8:1). Se mantuvo en agitación a temperatura ambiente durante 1 h.
Se adicionó H2O y se extrajo con CH2Cl2 (3 x 25 mL). La fase orgánica fue lavada con
NaHCO3 (3 x 25 mL) y NaCl saturado (25 mL); secada con Na2SO4, filtrada y llevada a
sequedad. El sólido obtenido fue purificado por cromatografía en columna eluyendo con
Hexano/AcOEt 9:1. Se obtuvieron 2.78 g (Rto: 50 %) del compuesto 21 como un aceite
amarillo.
1H-RMN (CDCl3) δ (ppm): 2.08 (s, 3H, CH3CO), 3.84 (s, 3H, OCH3), 5.19 (s, 2H, CH2), 6.28 (sa, 1H, OH), 6.87 (3H, m). 13C-RMN (CDCl3) δ (ppm): 20.8 (CH3CO), 55.9 (OCH3), 61.4 (CH2), 110.9, 119.5, 121.6, 122.2, 144.2, 146.6, 171.3. Anal. Elem.: Calculado para C10H12O4: C, 61.22; H, 6.16.
Experimental C, 61.10; H, 6.23.
5.-Parte Experimental
98
5.-Parte Experimental
99
Bromuro de 2-hidroxi-3-metoxibenciltrifenilfosfonio (22)
21
OCOCH3
OHOMe
PPh3HBr PPh3+ Br-
OHOMe
22
Sobre una suspensión de hidrobromuro de trifenilfosfina (4.40 g, 12.82 mmol)
en acetonitrilo anhidro se adicionó una disolución de 21 (2.51 g, 12.82 mmol) en el
mismo disolvente. Se calentó a reflujo durante 2 h. A continuación la reacción se llevó a
sequedad, el residuo obtenido fue solubilizado en CH2Cl2 y precipitado en etér etílico, el
sólido precipitado fue filtrado y secado. Se obtuvieron 5.71 g (Rto: 92 %) del
compuesto 22 como sólido blanco.
P. f.: 203-204 ºC. 1H-RMN (CDCl3) δ (ppm): 3.7 (s, 3H, OCH3), 4.8 (d, J = 14.1, 2H, CH2), 6.52 (m, 1H), 6.65 (m, 1H), 6.89 (d, J = 1.5, 1H), 7.74 (m, 15, H). 13C-RMN (CDCl3) δ (ppm): 24.0 (CH2), 55.0 (OCH3), 112.0, 120.0, 123.4, 123.5, 125.1, 128.0, 129.4, 134.7, 145.0, 155.2.
5.-Parte Experimental
100
5.-Parte Experimental
101
7-Metoxi-2-(3’,4’,5’-trimetoxifenil)benzofurano (23)
22
PPh3+ Br-
OHOMe
OMe
OMe
OMeO
OMe
DMAP/DCC
+OHMeO
MeOOMe
O
23
Sobre una didisolución de 22 (1.50 g, 3.13 mmol), ácido 3,4,5-trimetoxibenzoico
(0.67 g, 3.16 mmol) y DMAP (0.06 g, 0.50 mmol), en CH2Cl2 anhidro, se adicionó la
DCC (0.81 g, 3.94 mmol) en CH2Cl2 anhidro. Se mantuvo en agitación a temperatura
ambiente en atmosfera de argón durante una noche. El día siguiente se llevó a sequedad
la reacción y el residuo obtenido fue solubilizado con dioxano anhidro, se adicionó Et3N
(2.45 mL, 17.71 mmol) y se calentó a reflujo 12 h. Finalizada la reacción se llevó a
temperatura ambiente, el precipitado se filtró y la disolución se llevó a sequedad. El
residuo obtenido fue purificado por cromatografía en columna con Hexano/AcOEt
95:15. Se obtuvieron 0.62 g (Rto: 62 %) del compuesto 23 como sólido blanco.
P. f.: 217-218ºC 1H-RMN (CDCl3) δ (ppm): 3.81 (s, 3H, OCH3-C4’), 3.86 (s, 6H, OCH3-C3’ + CH3O-C5’), 3.95 (s, 3H, OCH3-C7), 6.71 (dd, J = 7.2 y 1.7, 1H, H-6), 6.86 (s, 1H, H-3), 7.00 (s, 2H, H-2’ + H-6’), 7.07 (m, 2H, H-4 + H-5). 13C-RMN (CDCl3) δ (ppm): 56.0 (OCH3-C7), 56.3 (OCH3-C3’ + OCH3-C5’), 61.0 (OCH3-C4’), 101.5 (C3), 102.4 (C2’ + C6’), 106.5 (C6), 113.2 (C4), 123.7 (C5), 125.9 (C1’), 131.0 (C3a), 138.7 (C4’), 144.0 (C7a), 145.2 (C7), 153.5 (C3 + C5’), 155.9 (C2). MS m/z (%): [M+1]+ 315 (13), M+ 314 (100), 240 (19), 210 (14). Anal. Elem.: Calculado para C18H18O5: C, 68.78; H, 5.77.
Experimental C, 68.71; H, 5.82.
5.-Parte Experimental
102
5.-Parte Experimental
103
2-(3’,5’-Dimetoxifenil)-7-metoxibenzofurano (24)
PPh3+ Br-
OHOMe
OMe
OMeO
OMe
DMAP/DCC+ OHMeO
OMe
O
22 24
Analogamente a la preparación de 23, la reacción de 22 (1.50 g, 3.13 mmol),
ácido 3,4,5-trimetoxibenzoico (0.58 g, 3.16 mmol), DMAP (0.06 g, 0.50 mmol), DCC
(0.81 g, 3.94 mmol) en CH2Cl2 anhidro y Et3N (2.45 mL, 17.71 mmol) en dioxano
anhidro condujo a un residuo que fue purificado por cromatografía en columna con
Hexano/AcOEt (95:15). Se obtuvieron 0.47 g (Rto: 53 %) del compuesto 24 como
sólido blanco.
P. f.: 209-211 ºC 1H-RMN (CDCl3) δ (ppm): 3.75 (s, 6H, OCH3-C3’ + OCH3-C5’), 3.93 (s, 3H, OCH3-C7), 6.37 (t, J = 1.9, 1H, H-4’), 6.70 (d, J = 7.5, 1H, H-6), 6.89 (s, 1H, H-3), 6.94 (d, J = 1.9, 2H, H-2’ + H-6’), 7.05 (m, 2H, H-4 + H-5). 13C-RMN (CDCl3) δ (ppm): 55.5 (OCH3-C3’ + OCH3-C5’), 56.1 (OCH3-C7), 101.1 (C4’), 102.2 (C3), 103.1 (C2’ + C6’), 106.8 (C6), 113.4 (C4),123.6 (C5), 130.8 (C3a), 132.1 (C1’), 144.1 (C7a), 145.3(C7), 155.9 (C2), 161.1 (C3 + C5’). MS m/z (%): [M+1]+ 285 (26), M+ 284 (100), 240 (33), 211 (14). An. Elem. Calculado para C17H16O4: C, 71.82; H, 5.67.
Experimental C, 71.78; H, 5.71.
5.-Parte Experimental
104
5.-Parte Experimental
105
7-Metoxi-2-(4’-metoxifenil)benzofurano (25)
22 25
PPh3+ Br-
OHOMe
OOMe
OMe DMAP/DCC
+OH
O
MeO
Analogamente a la preparación de 23, la reacción de 22 (1.50 g, 3.13 mmol),
ácido 4-metoxibenzoico (0.48 g, 3.16 mmol), DMAP (0.06 g, 0.50 mmol), DCC (0.81 g,
3.94 mmol) en CH2Cl2 anhidro y Et3N (2.45 mL, 17.71 mmol) en dioxano anhidro
condujo a un residuo que fue purificado por cromatografía en columna con
Hexano/AcOEt (95:15). Se obtuvieron 0.40 g (Rto: 49 %) del compuesto 25 como
sólido blanco.
P. f.: 225-226 ºC 1H-RMN (CDCl3) δ (ppm): 3.57 (s, 3H, OCH3-C4’), 3.81 (s, 3H, OCH3-C7), 6.57 (dd, J = 6.6 y 2.4, 1H, H-6), 6.63 (s, 1H, H-3), 6.73 (d, J = 8.8, 2H, H-3’ + H-5’), 6.94 (m, 2H, H-4 + H-5), 7.60 (d, J = 8.9, 2H, H-2’ + H-6’). 13C-RMN (CDCl3) δ (ppm): 55.2 (OCH3-C4’), 56.1 (OCH3-C7), 100.1 (C3), 106.4 (C6), 113.2 (C4), 114.2 (C3’ + C5’), 123.2 (C1’), 123.6 (C5), 26.5 (C2’ + C6’), 131.3 (C3a), 143.9 (C7a), 145.3 (C7), 156.2 (C2), 160.1 (C4’). MS m/z (%): [M+1]+, 255 (22), M+, 254 (100), 239 (53), 211 (19). Anal. Elem.: Calculado para C16H14O3: C, 75.57; H, 5.55.
Experimental C, 75.46; H, 5.60.
5.-Parte Experimental
106
5.-Parte Experimental
107
7-Metoxi-2-(3’,4’,5’-trimetoxifenil)dihidrobenzofurano (26)
OOMe
OMe
OMe
OMeO
OMe
OMe
OMe
OMe
H2/Pd
23 26
Una disolución de 23 (0.10 g, 0.32 mmol) en etanol absoluto fue hidrogenada
sobre Pd/C (0.30 g) a 4 atm de presión durante 24 h. Una vez finalizada la reacción se
filtró el catalizador, lavando varias veces con etanol absoluto. La fase orgánica fue
llevada a sequedad para dar un sólido que fue purificado por cromatografía en columna
con Hexano/AcOEt 9:1 .Se obtuvieron 0.08 g (Rto: 80 %) del compuesto 26 como un
sólido blanco.
P. f.: 135-136 ºC 1H-RMN (CDCl3) δ (ppm): 3.28 (dd, J = 9.2, 1H, H-3), 3.59 (dd, J = 9.2, 1H, H-3), 3.83 (s, 3H, OCH3-C4’), 3.84 (s, 6H, OCH3-C3’ + OCH3-C5’), 3.89 (s, 3H, OCH3-C7), 5.71 (t, J = 9.2, 1H, H-2), 6.65 (s, 2H, H-2’ + H-6’), 6.79 (d, J = 7.9, 1H, H-6), 6.82 (d, J = 7.6, 1H, H-4), 6.85 (dd, J = 7.9 y 7.6, H-5). 13C-RMN (CDCl3) δ (ppm): 39.5 (C3), 56.6 (OCH3-C7), 56.8 (OCH3-C3’ + OCH3-C5’),61.5 (OCH3-C4’), 85.9 (C2), 103.9 (C2’ + C6’), 112.1 (C6), 117.7 (C4), 122.0 (C5), 128.4 (C3a), 137.6 (C1’), 138.4 (C4’), 145.2 (C7), 148.5 (C7a), 154.0 (C3 + C5’). Anal. Elem.: Calculado para C16H14O3: C, 75.57; H, 5.55.
Experimental C, 75.60; H, 5.75.
5.-Parte Experimental
108
5.-Parte Experimental
109
Bromuro de 2-hidroxibenciltrifenilfosfonio (27)
OH
OH
PPh3HBr PPh3+ Br-
OH27
Sobre una suspensión de hidrobromuro de trifenilfosfina (13.60 g, 40.00 mmol) en
acetonitrilo anhidro se adicionó una didisolución de alcohol 2-hidroxibencílico (5.00 g, 40.00
mmol) en el mismo disolvente. Se calentó a reflujo 2 h, a continuación se llevo a sequedad la
reacción, el residuo obtenido fue solubilizado en CH2Cl2 y precipitado en etér etílico, el sólido
precipitado fue filtrado y secado. Se obtuvieron 17.00 g (Rto: 94 %) del compuesto 27 como sólido
blanco puro que se utilizó pora la reacción siguiente.
P. f.: 210-211 ºC 1H-RMN (CDCl3) δ (ppm): 4.8 (d, J = 14.1, 2H, CH2), 6.35 (s, 1H), 6.52 (d, J = 2.3, 1H), 6.89 (d, J = 1.5, 1H), 7.74 (m, 2H). 13C-RMN (CDCl3) δ (ppm): 24.9 (CH2), 114.7, 118.0, 122.0, 123.6, 125.1, 127.9, 128.0, 130.5, 134.7, 158.0.
5.-Parte Experimental
110
5.-Parte Experimental
111
2-(3’,4’,5’-Trimetoxifenil)benzofurano (28)
PPh3+ Br-
OH
Cl
OMeO
MeOOMe
O
OMe
OMe
OMe
Et3N+
27 28
Una didisolución de 27 (0.50 g, 1.10 mmol) y cloruro de 3,4,5-trimetoxibenzoilo (0.25 g,
1.11 mmol) en tolueno (20 mL) y trietilamina (0.5 mL) fue calentada a reflujo durante 2 h.
Finalizada la reacción se filtró el sólido y la didisolución fue llevada a sequedad. El residuo
obtenido fue purificado por cromatografía en columna con Hexano/AcOEt 95:5, para obtener 28
como sólido blanco puro (0.19 g, Rto: 60 %).
P. f.: 101-102 °C 1H-RMN (CDCl3) δ (ppm): 3.90 (s, 3H, OCH3-C4’), 3.96 (s, 6H, OCH3-C3’ + OCH3-C5’), 6.85 (s, 1H, H-3), 7.09 (s, 2H, H-2’ + H-6’), 7.2-7.6 (m, 6H, Ar-H). 13C-RMN (CDCl3) δ (ppm): 56.2, 56.5, 102.8, 104.6, 111.6, 121.0, 123.3, 123.9, 124.5, 124.8, 139.1, 151.4, 155.5, 156.7. MS m/z (%): M+ 284 (100), 269 (90), 241 (15), 211 (19), 168 (22). Anal. Elem.: Calculado para C17H16O4: C, 71.82; H, 5.67.
Experimental C, 71.86; H, 5.58.
5.-Parte Experimental
112
5.-Parte Experimental
113
2-(3’,5’-Dimetoxifenil)benzofurano (29)
27 29
PPh3+ Br-
OH
Cl
OMeO
OMeO
OMe
OMe
Et3N+
Una didisolución de 27 (0.50 g, 1.10 mmol) y cloruro de 3,5-dimetoxibenzoilo (0.22 g, 1.11
mmol) en tolueno (20 mL) y trietilamina (0.5 mL) fue calentada a reflujo durante 2 h. Finalizada la
reacción se filtró el sólido y la disolucion fue llevada a sequedad. El residuo obtenido fue purificado
por cromatografía en columna con Hexano/AcOEt 95:5, para obtener 29 como sólido blanco (0.16
g, Rto: 58 %).
P. f.: 110-111 °C 1H-RMN (CDCl3) δ (ppm): 3.87 (s, 6H, OCH3-C3’ + OCH3-C5’), 6.5 (s, 1H, H-3), 7.01 (s, 1H, H-4’), 7.03 (d, 2H, H-2’ + H-6’), 7.2-7.6 (m, 4H, Ar-H). 13C-RMN (CDCl3) δ (ppm): 56.0, 100.6, 102.6, 103.8, 111.5, 121.2, 123.5, 123.9, 124.8, 132.5, 155.4, 156.6, 162.4. MS m/z (%): M+ 254 (100), 225 (12), 197 (20), 168 (15), 139 (10). Anal. Elem.: Calculado para C16H14O3: C, 75.57; H, 5.55.
Experimental C, 75.63; H, 5.58.
5.-Parte Experimental
114
5.-Parte Experimental
115
2-(4’-Metoxifenil)benzofurano (30)
27 30
PPh3+ Br-
OHCl
O
MeOO
OMeEt3N
Una didisolución de 27 (0.50 g, 1.10 mmol) y cloruro de 4-metoxi-benzoilo (0.19 g, 1.11
mmol) en tolueno (20 mL) y trietilamina (0.5 mL) fue calentada a reflujo durante 2 h. Finalizada la
reacción se filtró el sólido y la disolución fue llevada a sequedad. El residuo obtenido fue purificado
por cromatografía en columna con Hexano/AcOEt 95:5, obteniendose 30 como sólido blanco (0.17
g, Rto: 69 %).
P. f.: 102-103 °C 1H-RMN (CDCl3) δ (ppm): 3.87 (s, 3H, OCH3-C4’), 6.9 (s, 1H, H3), 6.99 (d, 2H, H-3’ + H-5’), 7.2-7.6 (m, 4H, Ar-H), 7.81 (d, 2H, H-2’ + H-6’). 13C-RMN (CDCl3) δ (ppm): 55.9, 102.6, 111.7, 114.6, 121.2, 122.5, 123.5, 123.6, 124.5, 128.7, 155.6, 156.7, 160.6. MS m/z (%): M+ 254 (100), 225 (12), 197 (20), 168 (15). Anal. Elem.: Calculado para C16H14O3: C, 75.57; H, 5.55.
Experimental C, 75.63; H, 5.58.
5.-Parte Experimental
116
5.-Parte Experimental
117
Alcohol 2-hidroxi-5-metilbencilico (31)
H
OH
O
OH
OH
NaBH4
31
Sobre una didisolución de 2-hidroxi-5-metilbenzaldehido (0.50 g, 3.60 mmol) en etanol (10
mL) a 0 °C se adicionó borohidruro de sodio (0.13 g, 3.60 mmol) y la reacción se mantuvo en
agitación a temperatura ambiente durante 2 h. Finalizada la reacción la didisolución se llevó a
sequedad, al residuo sólido obtenido se le adicionó HCl 1N (10 mL) y se extrajo con etér etílico (10
mL x 3). La fase orgánica fue secada con Na2SO4, filtrada y evaporada al vacío para dar el
compuesto 31 como un aceite (0.40 g, Rto: 81 %).
1H-RMN (CDCl3) δ (ppm): 2.35 (s, 3H, CH3), 4.85 (s, 2H, CH2), 5.0 (1H, CH2-OH), 6.7 (dd, 2H, H-5 + H-6), 7.0 (s, 1H, H-3), 7.05 (sa, 1H, Ar-OH). 13C-RMN (CDCl3) δ (ppm): 24.8, 58.3, 116.4, 129.6, 128.9, 130.7, 131.5, 151.6.
5.-Parte Experimental
118
5.-Parte Experimental
119
Bromuro de 2-hidroxi-5-metilbenciltrifenilfosfonio (32)
PPh3+ Br-
OH
OH
OH31 32
PPh3 HBr
Sobre una suspensión de hidrobromuro de trifenilfosfina (0.90 g, 2.60 mmol) en acetonitrilo
anhidro (25 mL) se adicionó una disolución de 31 (0.40 g, 2.60 mmol) en el mismo disolvente. Se
calentó a reflujo 2 h. A continuación la reacción se llevó a sequedad y el residuo obtenido fue
disuelto en CH2Cl2 (50 mL) y precipitado en etér etílico, el precipitado fue filtrado y secado.
Obteniendose el compuesto 32 como sólido blanco (0.95 g, Rto: 79 %) que se utilizó en la siguiente
reacción.
P. f.: 217-218 ºC 1H-RMN (CDCl3) δ (ppm): 3.77 (s, 3H, OCH3), 4.8 (d, J = 14.1, 2H, CH2), 6.35 (s, 1H), 6.52 (d, J = 1.5, 1H), 6.89 (d, J = 1.5, 1H), 7.74 (sa, 1H, OH). 13C-RMN (CDCl3) δ (ppm): 23.0, 24.9 (CH2), 114.7, 118.4, 123.0, 126.6, 127.1, 128.0, 129.9, 134.0, 135.5, 157.2.
5.-Parte Experimental
120
5.-Parte Experimental
121
5-Metil-2-(4’-metoxifenil)benzofurano (33)
32 33
PPh3+ Br-
OHCl
O
MeOO
OMeEt3N
Una didisolución de 32 (0.25 g, 0.50 mmol) y cloruro de 4-metoxibenzoilo (0.09 g, 0.50
mmol) en tolueno (10 mL) y trietilamina (0.25 mL) fue calentada a reflujo durante 2 h. Finalizada la
reacción se filtró el sólido y la disolución fue llevada a sequedad. El residuo obtenido fue purificado
por cromatografía en columna eluyendo con Hexano/AcOEt 95:5, obteniendose 33 como sólido
blanco (0.10 g, Rto: 78 %).
P. f.: 157-158 °C 1H-RMN (CDCl3) δ (ppm): 2.16 (s, 3H, CH3-C5), 3.85 (s, 3H, OCH3-C4’), 6.8 (s, 1H, H-3), 6.97 (d, 2H, H-3’ + H-5’), 7.26 (s, 1H, H-5), 7.35 (m, 2H, H-6 + H-7), 7.77 (d, 2H, H-2’ + H-6’). 13C-RMN (CDCl3) δ (ppm): 24.6, 55.8, 102.6, 111.7, 114.6, 120.5, 122.5, 123.8, 125.3, 128.4, 131.7, 152.6, 156.7, 160.5. MS m/z (%): M+ 238 (100), 223 (75), 195 (25), 165 (10). Anal. Elem.: Calculado para C16H14O2: C, 80.65; H, 5.92.
Experimental C, 80.69; H, 5.96.
5.-Parte Experimental
122
5.-Parte Experimental
123
2-(3’,5’-Dimetoxifenil)-5-metilbenzofurano (34)
PPh3+ Br-
OH
Cl
O
O
Et3NOMe
OMe
+MeO
OMe32 34
Una didisolución de 32 (1.00 g, 2.00 mmol) y cloruro de 3,5-dimetoxibenzoilo (0.40 g, 2.00
mmol) en tolueno (40 mL) y trietilamina (1 mL) fue calentada a reflujo durante 2 h. Finalizada la
reacción se filtró el sólido y la disolución fue llevada a sequedad. El residuo obtenido fue purificado
por cromatografía en columna con Hexano/AcOEt 95:5, obteniendose 34 como sólido blanco puro
(0.40 g, Rto: 75 %).
P. f.: 142-143 °C 1H-RMN (CDCl3) δ (ppm): 2.45 (s, 3H, CH3-C5), 3.87 (s, 6H, OCH3-C3’+ OCH3-C5’), 6.45 (s, 1H, H-3), 6.92 (s, 1H, H-4’), 7.0 (t, 2H, H-2’ + H-6’), 7.10-7.35 (m, 3H, Ar-H). 13C-RMN (CDCl3) δ (ppm): 24.5, 55.7, 100.6, 102.7, 103.5, 111.8, 120.5, 123.6, 125.3, 131.8, 132.5, 152.2, 156.7, 162.4. MS m/z (%): M+ 268 (100), 237 (20), 225 (15), 181 (25), 134 (10). Anal. Elem.: Calculado para C17H16O3: C, 76.10; H, 6.01.
Experimental C, 76.25; H, 6.10.
5.-Parte Experimental
124
5.-Parte Experimental
125
5-Metil-2-(3’,4’,5’-trimetoxifenil)benzofurano (35)
32 35
PPh3+ Br-
OHCl
O
MeOO
Et3NOMe
OMe
OMe+ MeO
OMe
Una didisolución de 32 (1.00 g, 2.00 mmol) y cloruro de 3,4,5-trimetoxibenzoilo (0.46 g,
2.00 mmol) en tolueno (40 mL) y trietilamina (1 mL) fue calentada a reflujo durante 2 h. Finalizada
la reacción se filtró el sólido y la disolución fue llevada a sequedad. El residuo obtenido fue
purificado por cromatografía en columna eluyendo con Hexano/AcOEt 95:5, obteniendose 35 como
sólido blanco puro (0.33 g, Rto: 56 %).
P. f.: 119-120 °C 1H-RMN (CDCl3) δ (ppm): 2.44 (s, 3H, CH3-C5), 3.89 (s, 3H, OCH3-C4’), 3.96 (s, 6H, OCH3-C3’ + OCH3-C5’), 6.88 (s, 1H, H-3), 7.07 (s, 2H, H-2’ + H-6’), 7.25 (s, 1H, H-4), 7.35-7.4 (m, 2H; H-6 + H-7). 13C-RMN (CDCl3) δ (ppm): 24.6, 56.3, 56.7, 102.6, 104.7, 111.6, 120.5, 123.9, 124.8, 125.6, 131.4, 139.0, 151.4, 152.6, 156.9. MS m/z (%): M+ 298 (100), 283 (80), 255 (15), 169 (20). Anal. Elem.: Calculado para C18H18O4: C, 72.47; H, 6.08.
Experimental C, 72.50; H, 6.15.
5.-Parte Experimental
126
5.-Parte Experimental
127
Alcohol 5-bromo-2-hidroxibencilico (36)
H
OH
BrO
OH
OH
BrNaBH4
36
Sobre una didisolución de 5-bromo-2-hidroxibenzaldehido (1.00 g, 5.00 mmol) en etanol
(20 mL) a 0 °C se adicionó borohidruro de sodio (0.19 g, 5.00 mmol) y la reacción se mantuvo en
agitación a temperatura ambiente durante 2 h. Finalizada la reacción la disolución se llevó a
sequedad, al residuo sólido obtenido se le adicionó HCl 1N (20 mL) y se extrajo con eter etílico (10
mL x 3). La fase orgánica fue secada con Na2SO4, filtrada y llevada a sequedad para dar el
compuesto 36 como un sólido blanco (0.79 g, Rto: 78 %).
P. f.: 88-89 °C 1H-RMN (CDCl3) δ (ppm): 2.65 (1H, CH2-OH), 4.90 (s, 2H, CH2), 6.74 (d, 1H), 7.15 (s, 1H), 7.26 (m, 1H), 7.4 (1H, OH). 13C-RMN (CDCl3) δ (ppm): 57.3, 115.8, 118.5, 131.1, 132.2, 133.1, 153.4.
5.-Parte Experimental
128
5.-Parte Experimental
129
Bromuro de 5-bromo-2-hidroxibenciltrifenilfosfonio (37)
36
PPh3+ Br-
OH
BrOH
OH
Br PPh3 HBr
37
Sobre una suspensión de hidrobromuro de trifenilfosfina (1.17 g, 3.00 mmol) en acetonitrilo
anhidro se adicionó una disolución de 36 (0.79 g, 3.00 mmol) en el mismo disolvente. Se calentó a
reflujo durante 2 h. A continuación la reacción se llevó a sequedad, el residuo obtenido fue
solubilizado en CH2Cl2 y precipitado en etér etílico, el sólido precipitado fue filtrado y secado. Se
obtuvo el compuesto 37 como sólido blanco (1.70 g, Rto: 95 %) que se utilizó en la siguiente
reacción.
P. f.: 219-221 ºC 1H-RMN (CDCl3) δ (ppm): 4.8 (d, J = 14.1, 2H, CH2), 6.35 (s, 1H), 6.52 (d, J = 1.5, 1H), 6.89 (d, J = 1.5, 1H), 7.74 (sa, 1H, OH). 13C-RMN (CDCl3) δ (ppm): 23.4 (CH2), 115.7, 118.4, 118.9, 126.9, 127.9, 128.6, 129.9, 134.0, 135.0, 155.2.
5.-Parte Experimental
130
5.-Parte Experimental
131
5-Bromo-2-(3’,4’,5’-trimetoxifenil)benzofurano (38)
Cl
O
MeO
MeO
OMe
PPh3+ Br-
OH O
Et3NBr BrOMe
OMe
OMe+
37 38
Una didisolución de 37 (0.50 g, 0.94 mmol) y cloruro de 3,4,5-trimetoxi-benzoilo (0.21 g,
0.94 mmol) en tolueno (20 mL) y trietilamina (0.5 mL) fue calentada a reflujo durante 2 h.
Finalizada la reacción se filtró el sólido y la disolución fue llevada a sequedad. El residuo obtenido
fue purificado por cromatografía en columna con Hexano/AcOEt 95:5, obteniendose 38 como
sólido blanco (0.26 g, Rto: 75 %).
P. f.: 169-170 °C 1H-RMN (CDCl3) δ (ppm): 3.90 (s, 3H, OCH3-C4’), 3.96 (s, 6H, OCH3-C3’ + OCH3-C5’), 6.89 (s, 1H, H3), 7.06 (s, 2H, H-2’ + H-6’), 7.25 (m, 1H), 7.37 (m, 1H), 7.68 (m, 1H). 13C-RMN (CDCl3) δ (ppm): 56.3, 56.6, 102.9, 104.7, 113.8, 116.6, 124.3, 124.8, 126.2, 129.0, 139.3, 151.4. 154.3, 156.8. MS m/z (%): [M+2]+ 364 (15), M+ 362 (83), 347 (100), 289 (50). Anal. Elem.: Calculado para C17H15BrO4: C, 56.22; H, 4.16.
Experimental C, 56.40; H, 4.85.
5.-Parte Experimental
132
5.-Parte Experimental
133
5-Bromo-2-(3’,5’-dimetoxifenil)benzofurano (39)
37 39
Cl
OMeO
OMe
PPh3+ Br-
OH O
Et3NBr BrOMe
OMe
+
Una didisolución de 37 (0.50 g, 0.94 mmol) y cloruro de 3,5-dimetoxibenzoilo (0.19 g, 0.94
mmol) en tolueno (20 mL) y trietilamina (0.5 mL) fue calentada a reflujo durante 2 h. Finalizada la
reacción se filtró el sólido y la disolución fue llevada a sequedad. El residuo obtenido fue purificado
por cromatografía en columna con Hexano/AcOEt 95:5, obteniéndose 39 como sólido blanco puro
(0.11 g, Rto: 35 %).
P. f. 95-96 °C 1H-RMN (CDCl3) δ (ppm): 3.86 (s, 6H, 2CH3), 6.49 (t, 1H, H-4’), 6.93 (s, 1H, H-3), 6.99 (d, 2H, H-2’ + H-6’), 7.25 (s, 1H), 7.37 (s, 1H), 7.69 (s, 1H). 13C-RMN (CDCl3) δ (ppm): 55.8, 100.3, 102.7, 103.4, 113.9, 116.4, 124.2, 126.2, 129.1, 132.5, 154.4, 156.8, 162.3. MS m/z (%): [M+2]+ 336 (18), 334 M+, 334 (100), 224 (32), 139 (15). Anal. Elem.: Calculado para C16H13BrO3: C, 57.68; H, 3.93.
Experimental C, 57.78; H, 3.98.
5.-Parte Experimental
134
5.-Parte Experimental
135
5-Bromo-2-(4’-metoxifenil)benzofurano (40)
37 40
PPh3+ Br-
OHCl
O
MeOO
Et3NBr Br+ OMe
Una didisolución de 37 (0.50 g, 0.94 mmol) y cloruro de 4-metoxibenzoilo (0.16 g, 0.95
mmol) en tolueno (20 mL) y trietilamina (0.5 mL) fue calentada a reflujo durante 2 h. Finalizada la
reacción se filtró el sólido y la disolución fue llevada a sequedad. El residuo obtenido fue purificado
por cromatografía en columna con Hexano/AcOEt 95:5, obteniendose 40 como sólido blanco puro
(0.13 g, Rto: 50 %).
P. f.: 166-167 °C 1H-RMN (CDCl3) δ (ppm): 3.86 (s, 3H, OCH3-C4’), 6.81 (s, 1H, H-3), 6.99 (d, 2H, H-3’ + H-5’), 7.25 (s, 1H, H-4), 7.35 (m, 2H, H-6 + H-7), 7.79 (d, 2H, H-2’ + H-6’). 13C-RMN (CDCl3) δ (ppm): 55.9, 102.9, 113.6, 114.7, 116.4, 122.8, 124.4, 126.0, 128.8, 129.1, 154.5, 156.8, 160.6. MS m/z (%): [M+2]+ 304 (18), M+ 302 (100), 287 (75), 261 (50). Anal. Elem.: Calculado para C15H11BrO2: C, 59.43; H, 3.66.
Experimental C, 59.50; H, 3.71.
5.-Parte Experimental
136
5.-Parte Experimental
137
Alcohol 3-etoxi-2-hidroxibencilico (41)
H
OH
O
OH
OH
NaBH4
O O41
Sobre una didisolución de 3-etoxi-2-hidroxibenzilalcohol (2.00 g, 12.00 mmol) en etanol (20
mL) a 0 °C se adicionó borohidruro de sodio (0.45 g, 12.00 mmol) y la reacción se mantuvo en
agitación a temperatura ambiente durante 2 h. Finalizada la reacción se llevó a sequedad la
disolución, se adicionó HCl 1N (40 mL) al residuo sólido obtenido y se extrajo con etér etílico (20
mL x 3). La fase organica fue secada con Na2SO4, filtrada y llevada a sequedad para dar el
compuesto 41 como sólido blanco (1.81 g, Rto: 90 %).
P. f.: 166-167 °C 1H-RMN (CDCl3) δ (ppm): 1.40 (t, 3H, CH3), 3.2 (1H, CH2OH), 4.07 (q, 2H, CH2-CH3), 4.8 (s, 2H, CH2-OH), 6.5 (1H, OH), 6.78 (m, 3H). 13C-RMN (CDCl3) δ (ppm): 14.7, 58.1, 65.1, 114.8, 120.4, 122.3, 129.6, 143.5, 148.6.
5.-Parte Experimental
138
5.-Parte Experimental
139
Bromuro de 3-etoxi-2-hidroxibenciltrifenilfosfonio (42)
41
PPh3+ Br-
OH
PPh3 HBrOH
OHO O
42
Sobre una suspensión de hidrobromuro de trifenilfosfina (3.41 g, 10.00 mmol) en
acetonitrilo anidro (40 mL) se adicionó una disolución de alcohol 3-etoxi-2-hidroxibencílico (1.69
g, 10.00 mmol) en el mismo disolvente. Se calentó a reflujo 2 h. A continuación se llevó a sequedad
la reacción, el residuo obtenido fue disuelto en CH2Cl2 y precipitado con eter etílico, el sólido
precipitado fue filtrado y secado. Se obtuvo el compusto 42 como un sólido blanco puro (3.90 g,
Rto: 79 %) que se utilizó en la reacción siguiente.
P. f.: 156-157 °C 1H-RMN (CDCl3) δ (ppm): 1.40 (t, 3H, CH3), 3.2 (1H, CH2OH), 4.07 (q, 2H, CH2-CH3), 4.8 (s, 2H, CH2-OH), 6.5 (1H, OH), 6.78 (m, 3H). 13C-RMN (CDCl3) δ (ppm): 14.7, 58.1, 65.1, 114.8, 120.4, 122.3, 129.6, 143.5, 148.6
5.-Parte Experimental
140
5.-Parte Experimental
141
7-Etoxi-2-(3’,4’,5’-trimetoxifenil)benzofurano (43)
42
PPh3+ Br-
OHO
Cl
O
MeO O
Et3NOMe
OMe
OMe+
O
MeO
OMe43
Una didisolución de 42 (1.00 g, 2.00 mmol) y cloruro de 3,4,5-trimetoxibenzoilo (0.46 g,
2.00 mmol) en tolueno (40 mL) y trietilamina (1 mL) fue calentada a reflujo durante 2 h. Finalizada
la reacción se filtró el sólido y la disolución fue llevada a sequedad. El residuo obtenido fue
purificado por cromatografía en columna con Hexano/AcOEt 95:5, obteniendose 43 como sólido
blanco puro (0.36 g, Rto: 55 %).
P. f.: 143-144°C 1H-RMN (CDCl3) δ (ppm): 1.55 (t, 3H, CH3), 3.87 (s, 3H, OCH3-C4’), 3.97 (s, 6H, 2CH3), 4.35 (q, 2H, CH2), 6.77 (d, 1H, H-6), 6.95 (s, 1H, H-3), 7.10 (s, 2H, H-2’ + H-6’), 7.12-7.16 (m, 2H, H-4 + H-5). 13C-RMN (CDCl3) δ (ppm): 14.7, 56.2, 56.4, 65.0, 102.8, 104.6, 112.6, 112.8, 123.9, 124.4, 132.4, 139.2, 141.8, 145.2, 151.3, 156.8. MS m/z (%): M+ 328 (100), 313 (75), 285 (15), 150 (10). Anal. Elem.: Calculado para C19H20O5: C, 69.50; H, 6.14.
Experimental C, 69.78; H, 6.24.
5.-Parte Experimental
142
5.-Parte Experimental
143
2-(3’,5’-Dimetoxifenil)-7-etoxibenzofurano (44)
42 44
PPh3+ Br-
OHO
Cl
O
O
Et3NOMe
OMe
+
O
MeO
OMe
Una didisolución de 42 (1.00 g, 2.00 mmol) y cloruro de 3,5-dimetoxibenzoilo (0.40 g, 2.00
mmol) en tolueno (40 mL) y trietilamina (1 mL) fue calentada a reflujo durante 2 h. Finalizada la
reacción se filtró y la disolución fue llevada a sequedad. El residuo obtenido fue purificado por
cromatografía en columna con Hexano/AcOEt 95:5, obteniendose 44 como sólido blanco puro (0.40
g, Rto: 78 %).
P. f.: 63-64 °C
1H-RMN (CDCl3) δ (ppm): 1.52 (t, 3H, CH3), 3.87 (s, 6H, 2CH3), 4.32 (q, 2H, CH2), 6.47 (t, 1H, H-4’), 6.80 (dd, 1H, H-6), 6.98, (s, 1H, H-3), 7.02 (d, 1H, H-2’ + H-6’), 7.10-7.20 (m, 2H, H-4 + H-5). 13C-RMN (CDCl3) δ (ppm): 14.7, 55.8, 65.2, 100.5, 102.9, 103.5, 110.8, 112.6, 123.8, 126.2, ,132.3, 141.5, 145.3, 156.6, 162.4. Anal. Elem.: Calculado para C18H18O4: C, 72,47; H, 6.08.
Experimental C, 72.85; H, 6.15.
5.-Parte Experimental
144
5.-Parte Experimental
145
7-Etoxi-2-(4’-metoxifenil)benzofurano (45)
42 45
PPh3+ Br-
OHO
Cl
O
OEt3N
+OMeO
OMe
Una didisolución de 42 (1.00 g, 2.00 mmol) y cloruro de 4-metoxi-benzoilo (0.34 g, 2.00
mmol) en tolueno (40 mL) y trietilamina (1 mL) fue calentada a reflujo durante 2 h. Finalizada la
reacción se filtró el sólido y la disolución fue llevada a sequedad. El residuo obtenido fue purificado
por cromatografía en columna con Hexano/AcOEt 95:5, obteniendose 45 como un sólido blanco
(0.29 g, Rto: 54 %).
P. f.: 55-56 °C 1H-RMN (CDCl3) δ (ppm): 1.53 (t, 3H, CH3), 3.87 (s, 3H, OCH3-C4’), 4.33 (q, 2H, CH2), 6.60 (dd, 1H, H-6), 6.75 (s, 1H, H-3), 6.98 (d, 2H, H-3’ + H-5’), 7.20 (m, 2H, H-4 + H-5), 7.75 (d, 2H, H-2’+ H-6’). 13C-RMN (CDCl3) δ (ppm): 14.9, 55.8, 65.1, 102.7, 112.8, 112.6, 114.9, 122.7, 123.8, 124.3, 128.4, 141.7, 145.3, 156.6, 160.8. MS m/z (%): M+ 268 (30), 240 (20), 225 (25). Anal. Elem.: Calculado para C17H16O3: C, 76.10; H 6.01.
Experimental C, 76.25; H 6.10.
5.-Parte Experimental
146
6.-Anexo
Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 19 (2009) 3268–3270
Contents lists available at ScienceDirect
Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters
journal homepage: www.elsevier .com/ locate/bmcl
A new series of 3-phenylcoumarins as potent and selective MAO-B inhibitors
Maria Joao Matos a,b,*, Dolores Viña a,c, Elias Quezada a,b, Carmen Picciau b, Giovanna Delogu b,Francisco Orallo c, Lourdes Santana a, Eugenio Uriarte a
a Departamento de Química Orgánica, Facultad de Farmacia, 15782 Santiago de Compostela, Spainb Dipartimento Farmaco Chimico Tecnologico, Facoltà di Farmacia, 09124 Cagliari, Italyc Departamento de Farmacología, Facultad de Farmacia, 15782 Santiago de Compostela, Spain
a r t i c l e i n f o
Article history:Received 24 March 2009
a b s t r a c t
6-Methyl-3-phenylcoumarins 3–6 were designed, synthesized and evaluated as monoamine oxidase A
es) are a large family of compounds, inhibitors (iMAO). These modifications were studied to find out
Revised 17 April 2009Accepted 20 April 2009Available online 24 April 2009
Keywords:CoumarinResveratrolMonoamino oxidase inhibitorsPerkin reaction3-Phenylcoumarins
Coumarins (or benzopyron
and B (MAO-A and MAO-B) inhibitors. The synthesis of these new compounds (resveratrol–coumarinhybrids) was carried out with good yield by a Perkin reaction, from the 5-methylsalicylaldehyde andthe corresponding phenylacetic acid. They show high selectivity to the MAO-B isoenzyme, with IC50 val-ues in the nanomolar range. Compound 5 is the most active compound and is several times more potentand selective than the reference compound, R-(�)-deprenyl.
� 2009 Elsevier Ltd. All rights reserved.
of natural and synthetic origin, that show numerous biologicalactivities.1 Recent studies pay special attention to their antioxida-
2–6
how these changes can contribute to the biological activity of thesemolecules, helping to understand a structure–activity relationship
tive, anticarcinogenic and enzymatic inhibition properties. In re-gard to the monoamine oxidase (MAO) inhibition, the recentfindings revealed that MAO-A and MAO-B affinity and selectivitycan be efficiently modulated by appropriate substitutions in thecoumarin ring, in particular in the 3:4 and 6:7 positions.7–11
The resveratrol (3,40,5-trihydroxystilbene) is a phytoalexin ofnatural origin present in spermatophytes species such as vines,in response to damage. Resveratrol was already studied as antiox-idant, anti-inflammatory, cardioprotective (vasodilatory and plate-let antiaggregatory activities), anticancer, enzymatic inhibitor,proving to be very efficient in a large group of in vitro, ex vivoand/or in vivo experiments.12–15 The resveratrol’s cis and trans iso-mers are inhibitors of the MAO activity. cis-Resveratrol is less effec-tive than trans-resveratrol as inhibitor of MAO-A and MAO-Bactivities.16
Due to these coincident properties, it seems to be interesting todesign and synthesize hybrids that incorporate the skeleton ofthose two kinds of molecules.17,18 In the present compounds theresveratrol nucleus is blocked by the coumarin ring and can onlyassume the trans isomeric form. A series of these molecules, withdifferent number and position of methoxy groups in the 3-phenylring (compounds 3–6), was synthesized and evaluated as MAO
0960-894X/$ - see front matter � 2009 Elsevier Ltd. All rights reserved.doi:10.1016/j.bmcl.2009.04.085
* Corresponding author. Tel.: +34 981 563100.E-mail address: [email protected] (M.J. Matos).
(SAR).MAO is a FAD-containing enzyme with two known isoforms
(MAO-A and MAO-B) and is present in the mitochondrial outermembrane of glial, neuronal and other cells.19 MAO enzymes inter-vene in the monoamines degradation and carry out an importantphysiologic function in the adrenaline, noradrenaline and seroto-nin deamination (preferentially MAO-A) and in the b-phenylethyl-amine and benzylamine deamination (preferentially MAO-B).20
This enzymatic function increases the synaptic concentration ofthese neurotransmitters and conditions to a great extent the neu-rone’s excitement of those possessing receptors for thesemediators.21
The iMAO are a class of compounds that act by blocking theMAO enzymatic action, being used by several years in the treat-ment of the depression and anxiety diseases (iMAO-A) or in Parkin-son’s disease (iMAO-B).22 Nowadays is being studied also in theAlzheimer’s disease.23
The active sites of these two isoenzymes (MAO-A and MAO-B)are not completely known and for this reason there is a lack ofinformation in respect of how the inhibitors act selectively inone of the two of them.10 Recent X-ray crystal structures ofMAO-B24,25 and MAO-A,21,26 completed with irreversible andreversible inhibitors, can be used in the future as a tool to thestructural basis to help understanding the selective enzyme–ligandrecognition and drug development of iMAOs.21
Chem
With the aim of finding out new structural features for the MAOinhibitory activity and selectivity, we decided in this work to ex-plore the importance of the number and position of different meth-oxy groups under the benzenic ring in 3-position (compounds427,28–6), to establish a relation between them and with the nonsubstituted analogue (compound 327–29).
The preparation of these 6-methyl-3-phenylcoumarins was per-formed via the classical Perkin reaction.29 This reaction was carriedout by condensation of the 5-methylsalicylaldehyde 1 and the con-veniently substituted phenylacetic acids 2, with N,N0-dicyclohexyl-carbodiimide (DCC) as dehydrating agent, under DMSO reflux,during 24 h (Scheme 1). The reaction to obtain 3–6 is very cleanand the yields are between 60% and 70%.30–33 The obtained prod-ucts are easy to purify by flash chromatography, using a mixtureof hexane/ethyl acetate in a proportion 9:1 as eluent.
The inhibitory MAO activity of compounds 3–6 was evaluatedin vitro by the measurement of the enzymatic activity of human re-combinant MAO isoforms in BTI insect cells infected with baculo-virus.8,34 Then, the IC50 values and MAO-B selectivity ratios [IC50
(MAO-A)]/[IC50 (MAO-B)] for inhibitory effects of both, new com-pounds and reference inhibitors, were calculated (Table 1).35
The prepared series of compounds proved to be selective asinhibitor of the MAO-B isoenzyme. Compound 3, none substitutedin the phenyl ring, is by itself very active and selective againstMAO-B isoenzyme. Compound 4 (with a p-methoxy group) has aMAO-B IC50 similar to the R-(�)-deprenyl (reference MAO-B inhib-itor) and is more selective than this one. The most potent moleculeof this family is compound 5, bearing two methoxy groups in 30-and 50-positions (IC50 = 8.98 ± 1.42 nM). This one is two times moreactive and several times more iMAO-B selective than the R-(�)-deprenyl. Compound 6, with 3 methoxy groups, is more active than3 (none substituted) but it loses activity in respect to the mono anddimethoxy derivatives (compounds 4 and 5, respectively). None ofthe described compounds showed a MAO-A inhibitory activity forthe highest concentration tested (100 lM). This iMAO-B selectivity
OHOR1
R2
M. J. Matos et al. / Bioorg. Med.
OOOH
CHOMe Me
1 2 3-6
a R3R1
R2
R3
3: R1 = R2 = R3 = H4: R1 = R3 = H , R2 = OMe5: R1 = R3 = OMe , R2 = H6: R1 = R2 = R3 = OMe
Scheme 1. Reagents and conditions: (a) DCC, DMSO, 110 �C, 24 h.
Table 1MAO-A and MAO-B inhibitory activity results for compounds 3–6 and referencecompounds
Compd MAO-A IC50 MAO-B IC50 Ratio
3 * 283.75 ± 0.98 nM >352b
4 * 13.05 ± 0.90 nM >7663b
5 * 8.98 ± 1.42 nM >11,136b
6 * 160.64 ± 1.01 nM >623b
R-(�)-Deprenyl 67.25 ± 1.02 lMa 19.60 ± 0.86 nM 3431Iproniazide 6.56 ± 0.76 lM 7.54 ± 0.36 lM 0.87
* Inactive at 100 lM (highest concentration tested). At higher concentrationscompounds precipitate.
a P <0.01 versus the corresponding IC50 values obtained against MAO-B, asdetermined by ANOVA/Dunnett’s.
b Values obtained under the assumption that the corresponding IC50 againstMAO-A is the highest concentration tested (100 lM).
is an important factor to discriminate the potential therapeuticapplication of this kind of molecules.
Comparing the iMAO-B activities of 3 and 4, the introduction ofa p-methoxy group increases the inhibitory activity. Substitutionwith two methoxy groups in the 30- and 50-positions on the phenylring, compound 5, improves the iMAO-B activity. Increasing thenumber of methoxy substituent to three, compound 6, decreasesthe enzymatic inhibitory activity. However, compound 6 is evenbetter than none substituted coumarin 3. The presence of methoxysubstituent in the 3-phenyl ring seems to be important to modu-late and improve the inhibitory enzymatic activity of the 6-methyl-3-phenylcoumarins.
These hybrid compounds with resveratrol–coumarin skeletonshow high selectivity against MAO-B isoenzyme, being active inthe nanomolar range. Introduction of methoxy groups in the phe-nyl ring improves the activity, giving more active and selectivecompounds than the reference ones. These modifications, whichwe studying more deeply, can improve the pharmacologic profileof the synthesized coumarins in the Parkinson’s disease.
. Lett. 19 (2009) 3268–3270 3269
Acknowledgements
Thanks the Spanish Ministerio de Sanidad y Consumo(PI061457 and PI061537) and to Xunta da Galicia (PXIB20304PR,INCITE08PXIB203022PR and 08CSA019203PR) and FondazioneBanco Sardegna (Italy) for financial support. M.J.M. also thanks toMIUR the Ph.D. Grant.
References and notes
1. Borges, F.; Roleira, F.; Milhazes, N.; Santana, L.; Uriarte, E. Curr. Med. Chem.2005, 12, 887.
2. Hoult, J. R. S.; Payá, M. Gen. Pharmacol. 1996, 27, 713.3. Kontogiorgis, C.; Hadjipavlou-Litina, D. J. Enzyme Inhib. Med. Chem. 2003, 18, 63.4. Kabeya, L.; Marchi, A.; Kanashiro, A.; Lopes, N.; Silva, C.; Pupo, M.; Lucisano-
Valim, Y. Bioorg. Med. Chem. 2007, 15, 1516.5. Carotti, A.; Altomare, C.; Catto, M.; Gnerre, C.; Summo, L.; De Marco, A.; Rose, S.;
Jenner, P.; Testa, B. Chem. Biod. 2006, 3, 134.6. Chilin, A.; Battistutta, R.; Bortolato, A.; Cozza, G.; Zanatta, S.; Poletto, G.;
Mazzorana, M.; Zagotto, G.; Uriarte, E.; Guiotto, A.; Pinna, L.; Meggio, F.; Moro,S. J. Med. Chem. 2008, 51, 752.
7. Santana, L.; Uriarte, E.; González-Díaz, H.; Zagotto, G.; Soto-Otero, R.; Méndez-Álvarez, E. J. Med. Chem. 2006, 49, 1118.
8. Santana, L.; González-díaz, H.; Quezada, E.; Uriarte, E.; Yáñez, M.; Viña, D.;Orallo, F. J. Med. Chem. 2008, 51, 6740.
9. Catto, M.; Nicolotti, O.; Leonetti, F.; Carotti, A.; Favia, A.; Soto-Otero, R.;Méndez-Álvarez, E.; Carotti, A. J. Med. Chem. 2006, 49, 4912.
10. Gnerre, C.; Catto, M.; Leonetti, F.; Weber, P.; Carrupt, P.; Altomare, C.; Carotti,A.; Testa, B. J. Med. Chem. 2000, 43, 4747.
11. Chimenti, F.; Secci, D.; Bolasco, A.; Chimenti, P.; Granese, A.; Befani, O.; Turini,P.; Alacaro, S.; Ortuso, F. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2004, 14, 3697.
12. Frémont, L. Life Sci. 2000, 66, 663.13. Orallo, F. In Resveratrol in Health and Disease; Aggarwal, B. B., Shishodia, S., Eds.;
CRC Press: USA, 2005; p 577.14. Leiro, J.; Álvarez, E.; Arranz, J.; Laguna, R.; Uriarte, E.; Orallo, F. J. Leukocyte Biol.
2004, 75, 1156.15. Orallo, F. Curr. Med. Chem. 2008, 15, 1887.16. Yánez, M.; Fraiz, N.; Cano, E.; Orallo, F. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2006,
344, 688.17. Vilar, S.; Quezada, E.; Santana, L.; Uriarte, E.; Yánez, M.; Fraiz, N.; Alcaide, C.;
Cano, E.; Orallo, F. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2006, 16, 257.18. Vilar, S.; Quezada, E.; Alcaide, C.; Orallo, F.; Santana, L.; Uriarte, E. Qsar Comb.
Sci. 2007, 26, 317.19. De Colibus, L.; Li, M.; Binda, C.; Lustig, A.; Edmondson, D. E.; Mattevi, A. Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2005, 102, 12684.20. Grimsby, J.; Lan, N. C.; Neve, R.; Chen, K.; Shih, J. C. J. Neurochem. 1990, 55,
1166.21. Edmondson, D. E.; Mattevi, A.; Binda, C.; Li, M.; Hubalek, F. Curr. Med. Chem.
2004, 11, 1983.22. Harfenist, H.; Heuseur, D. J.; Joyner, C. T.; Batchelor, J. F.; White, H. L. J. Med.
Chem. 1996, 39, 1857.23. Wouters, J. Curr. Med. Chem. 1998, 5, 137.24. Binda, C.; Newton-Vinson, P.; Hubalek, F.; Edmondson, D. E.; Mattevi, A. Nat.
Struct. Biol. 2002, 9, 22.25. Binda, C.; Li, M.; Hubalek, F.; Restelli, N.; Edmondson, D. E.; Mattevi, A. Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2003, 100, 9750.
. Che
26. Ma, J.; Yoshimura, M.; Yamashita, E.; Nakagawa, A.; Ito, A.; Tsukihara, T. J. Mol.Biol. 2004, 338, 103.
27. Hans, N.; Singhi, M.; Sharma, V.; Grover, S. K. Indian J. Chem., Sect. B 1996, 35,1159.
28. Mohanty, S.; Makrandi, J. K.; Grover, S. K. Indian J. Chem., Sect. B 1989, 28, 766.29. Kamat, S. P.; D́Souza, A. M.; Paknikar, S. K.; Beaucahmp, P. S. J. Chem. Res. (S)
2002, 242.30. 6-Methyl-3-phenylcumarin (3). It was obtained with a yield of 68%. Mp 148–
149 �C (biblio. 145–147 �C, 149–150 �C). 1H NMR (CDCl3) d (ppm), J (Hz): 2.42(s, 3H, –CH3), 7.27 (m, 1H, H-7), 7.34 (m, 2H, H-40 and H-8), 7.43 (m, 3H, H-20 ,H-40 and H-5), 7.70 (dd, 2H, H-10 and H-50 , J = 7.7 and 1.8), 7.77 (s, 1H, H-4).13C NMR (CDCl3) d (ppm): 21.29, 116.67, 119.57, 128.17, 128.70, 128.95,129.02, 129.26, 132.95, 134.65, 135.35, 140.39, 152.16, 161.31. DEPT (CDCl3) d(ppm): 21.29, 100.60, 116.67, 128.17, 128.95, 129.02, 129.26, 132.95, 140.39.MS m/z (%): 236 (M+, 100), 208 (50), 178 (8), 165 (8) 76 (6), 51 (69). Anal. Calcdfor C16H12O2: C, 81.34; H, 5.12; O, 13.54. Found: C, 81.44; H, 4.84.
31. 3-(40-Methoxy)phenyl-6-methylcumarin (4). It was obtained with a yield of61%. Mp 144–145oC (biblio. 143 �C). 1H NMR (CDCl3) d (ppm), J (Hz): 2.40 (s,3H, –CH3), 3.84 (s, 3H, –OCH3), 6.96 (dd, 2H, H-30 and H-50 , J = 6.8 and 2.1), 7.26(m, 3H, H-4, H-7 and H-8), 7.66 (m, 3H, H-3, H-20 and H-60). 13C NMR (CDCl3) d(ppm): 20.75, 55.32, 113.85, 116.04, 119.54, 127.19, 127.46, 127.66, 129.77,132.02, 134.03, 138.47, 151.41, 160.05, 160.96. DEPT (CDCl3) d (ppm): 20.76,55.32, 113.85, 116.04, 127.46, 129.78, 132.01, 138.48. MS m/z (%): 266 (M+,100), 223 (60), 195 (24), 165 (16), 152 (13), 115 (5), 89 (5), 63 (7), 50 (6). Anal.Calcd for C17H14O3: C, 76.68; H, 5.30; O, 18.02. Found: C, 76.88; H, 5.32.
32. 3-(30 ,50-Dimethoxy)phenyl-6-methylcumarin (5). It was obtained with a yieldof 60%. Mp 110–111oC. 1H NMR (CDCl3) d (ppm), J (Hz): 2.40 (s, 3H, –CH3), 3.82(s, 6H, –(OCH3)2), 6.50 (t, 1H, H-40 , J = 2.1), 6.83 (d, 2H, H-20 and H-60 , J = 2.1),7.22–7,33 (m, 3H, H-5, H-7 and H-8), 7.74 (s, 1H, H-4). 13C NMR (CDCl3) d(ppm): 20.72, 55.41, 100.89, 106.72, 116.06, 119.22, 127.69, 127.93, 132.49,134.10, 136.68, 140.02, 151.60, 160.48, 160.61. DEPT (CDCl3) d (ppm): 20.72,55.40, 100.89, 106,71, 116.06, 127.69, 132.49, 140.02. MS m/z (%): 296 (M+,100), 295 (17), 267 (16), 210 (8), 181 (22), 152 (13), 139 (6), 105 (8), 76 (9).Anal. Calcd for C18H16O4: C, 72.96; H, 5.44; O, 21.60. Found: C, 73.23; H, 4.90.
33. 6-Methyl-3-(30 ,40 ,50-trimethoxy)phenylcumarin (6). It was obtained with ayield of 70%. Mp 165–166 oC. 1H NMR (CDCl3) d (ppm), J (Hz): 2.43 (s, 3H, –CH3), 3.90 (s, 3H, –OCH3), 3,92 (s, 6H, –(OCH3)2), 6.93 (d, 2H, H-20and H-60 ,J = 2.1), 7.24–7.35 (m, 3H, H-5, H-7 and H-8), 7.76 (s, 1H, H-4). 13C NMR (CDCl3)d (ppm): 20.70, 56.19, 60.72, 105.94, 116.03, 119.24, 127.48, 127.58, 130.04,
3270 M. J. Matos et al. / Bioorg. Med
130.44, 132.38, 134.12, 139.48, 151.45, 153.02, 160.66. DEPT (CDCl3) d (ppm):20.76, 56.23, 60.77, 105.97, 116.08, 127.63, 132.43, 139.54. MS m/z (%): 326(M+, 100), 311 (89), 283 (43), 253 (12), 225 (30), 197 (10), 169 (10), 148 (5),115 (8). Anal. Calcd for C19H18O5: C, 69.93; H, 5.56; O, 24.51. Found: C, 70.14;H, 5.58.
34. Determination of human monoamine oxidase (hMAO) isoform activity: The effectsof the test compounds on hMAO isoform enzymatic activity were evaluated bya fluorimetric method following the experimental protocol previouslydescribed by us. Briefly, 0.1 mL of sodium phosphate buffer (0.05 M, pH 7.4)containing the test drugs in various concentrations and adequate amounts ofrecombinant hMAO-A or hMAO-B required and adjusted to obtain in ourexperimental conditions the same reaction velocity [165 pmol of p-tyramine/min (hMAO-A: 1.1 lg protein; specific activity: 150 nmol of p-tyramineoxidized to p-hydroxyphenylacetaldehyde/min/mg protein; hMAO-B: 7.5 lgprotein; specific activity: 22 nmol of p-tyramine transformed/min/mgprotein)] were placed in the dark fluorimeter chamber and incubated for15 min at 37 �C. The reaction was started by adding (final concentrations)200 lM Amplex� Red reagent, 1 U/mL horseradish peroxidase and 1 mM p-tyramine. The production of H2O2 and, consequently, of resorufin wasquantified at 37 �C in a multidetection microplate fluorescence reader(FLX800TM, Bio-Tek� Instruments, Inc., Winooski, VT, USA) based on thefluorescence generated (excitation, 545 nm, emission, 590 nm) over a 15 minperiod, in which the fluorescence increased linearly.Control experiments werecarried out simultaneously by replacing the test drugs with appropriatedilutions of the vehicles. In addition, the possible capacity of the above testdrugs to modify the fluorescence generated in the reaction mixture due to non-enzymatic inhibition (e.g., for directly reacting with Amplex� Red reagent) wasdetermined by adding these drugs to solutions containing only the Amplex�
Red reagent in a sodium phosphate buffer.The specific fluorescence emission(used to obtain the final results) was calculated after subtraction of thebackground activity, which was determined from vials containing allcomponents except the hMAO isoforms, which were replaced by a sodiumphosphate buffer solution.On the other hand, in our experiments and under our experimental conditions,the control activity of hMAO-A and hMAO-B (using p-tyramine as a commonsubstrate for both isoforms) was 165 ± 2 pmol of p-tyramine oxidized to p-hydroxyphenylacetaldehyde/min (n = 20).
35. All IC50 values shown in the table are expressed as means ± SEM from fiveexperiments.
m. Lett. 19 (2009) 3268–3270
Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 19 (2009) 5053–5055
Contents lists available at ScienceDirect
Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters
journal homepage: www.elsevier .com/ locate/bmcl
Synthesis and evaluation of 6-methyl-3-phenylcoumarins as potentand selective MAO-B inhibitors
Maria Joao Matos a,b,*, Dolores Viña a,c, Carmen Picciau a,b, Francisco Orallo c,Lourdes Santana a, Eugenio Uriarte a
a Departamento de Química Orgánica, Facultad de Farmacia, Universidad de Santiago de Compostela, 15782 Santiago de Compostela, Spainb Dipartimento Farmaco Chimico Tecnologico, Facoltà di Farmacia, Università di Cagliari, 09124 Cagliari, Italyc Departamento de Farmacología, Facultad de Farmacia, Universidad de Santiago de Compostela, 15782 Santiago de Compostela, Spain
a r t i c l e i n f o
Article history:Received 12 June 2009
a b s t r a c t
A series of 6-methyl-3-phenylcoumarins 3-6 were synthesized and evaluated as monoamine oxidase Aand B (MAO-A and MAO-B) inhibitors. A comparative study between the three possible mono methoxy
emarkable amounts in the nature. species, produced in response to an exterior or interior damage.18
Revised 4 July 2009Accepted 7 July 2009Available online 10 July 2009
Keywords:PhenylcoumarinsMAOIsMonoamino oxidasePerkin reactionCoumarin–resveratrol hybrids
Coumarins are present in r
3-phenyl derivatives and the p-hydroxy analogue is reported. The synthesis of these new resveratrol-cou-marin hybrids was carried out by a Perkin reaction between the 5-methylsalicylaldehyde and the corre-sponding phenylacetic acids. The p-methoxy substituted compound 3 was hydrolyzed to 6 by atraditional reaction with hydriodic acid. The prepared compounds show high selectivity to the MAO-Bisoenzyme, some of them with IC50 values in the low nanomolar range. Compound 4, with the methoxygroup in meta position, is the most active of this series, with an IC50 against MAO-B of 0.80 nM, and isseveral times more potent and MAO-B selective than the R-(�)-deprenyl (reference compound).
� 2009 Elsevier Ltd. All rights reserved.
They have attracted considerable interest due to their numerousbiological activities depending on their substitution pattern.1
Resveratrol shows a large number of pharmacological activities,including antiinflammatory, antioxidant, anticancer, and cardio-
19–23
These compounds have been shown to possess antioxidative andanticarcinogenic properties and to inhibit several enzymes.2–6Some coumarin derivatives of natural and synthetic origin havebeen characterized as monoamine oxidase inhibitors (MAOIs).7–12
Monoamine oxidase (MAO) is an FAD-containing enzymebound to the mitochondrial outer membrane of neuronal, glial,and other cells.10,13 This enzyme regulates levels of biogenicamines (including neurotransmitters) in the brain and the periph-eral tissues by catalyzing their deamination.11 MAO exists as twodistinct enzymatic isoforms, MAO-A and MAO-B, based on theirsubstrate and inhibitor specificities.14,15
MAO-A preferentially deaminates serotonin, adrenaline andnoradrenaline. That isoenzyme is irreversibly inhibited by low con-centrations of clorgyline. MAO-B preferentially deaminates b-phenylethylamine and benzylamine and is irreversibly inhibitedby R-(�)-deprenyl.16 The MAOIs have been used for several yearsin the treatment of depression and anxiety diseases (MAO-A inhib-itors) and in Parkinson’s disease (MAO-B inhibitors).17
Resveratrol, structurally 3,40,5-trihydroxystilbene, is a naturalphenolic component of Vitis vinifera L. and other spermatophyte
0960-894X/$ - see front matter � 2009 Elsevier Ltd. All rights reserved.doi:10.1016/j.bmcl.2009.07.039
* Corresponding author. Tel.: +34 1918523676.E-mail address: [email protected] (M.J. Matos).
protective properties and enzyme inhibition. cis and trans-res-veratrol proved to be MAO activity inhibitors, the trans isomerbeing more effective than the cis.24
Because of their similar characteristics, it was interesting to de-sign and synthesize hybrids that incorporate the nucleus of thecoumarins and resveratrol molecules.19,25 In previous work, our re-search group had reported a comparative study of the importanceto the MAOI activity of the different number of methoxy groups onthe phenyl ring in the 3 position of coumarin. This study contrib-uted to establish a relationship between them and with the non-substituted analogue.8 Based on this, and with the aim of helpingto better understand a structure/activity relationship for theMAO inhibitory activity and selectivity, in this paper we reportthe synthesis and evaluation of a new series. Maintaining the 6-methyl-3-phenylcoumarin structure, the three possible differentpositions of one methoxy group in 3-phenyl ring were explored.We also explored the importance of the hydrolysis of this methoxygroup.
The synthesis of the 6-methyl-3-phenylcoumarins was carriedout via the classical Perkin reaction.26 This reaction is performedby condensation of the 5-methylsalicylaldehyde 1 and the appro-priately substituted phenylacetic acids 2, with N,N0-dicyclohexyl-carbodiimide (DCC) as dehydrating agent, in DMSO, at 110 �C, for
. Che
24 h (Scheme 1). Compounds 3,8 427 and 528 were obtained inyields of 61%, 53%, and 59%, respectively. The reaction mixturewas purified by flash chromatography, using hexane/ethyl acetate,in a proportion of 9:1, as eluent.
The p-methoxy derivative 3 was hydrolyzed with hydriodicacid, in the presence of acetic acid and acetic anhydride, at110 �C, for 5 h (Scheme 1). The residue was purified by crystalliza-tion of acetonitrile, and the phenol derivative 629 was obtainedwith a yield of 63%.
MAO inhibiting activity of compounds 3-6 was evaluatedin vitro by the measurement of the enzymatic activity of human re-combinant MAO isoforms in BTI insect cells infected with baculo-virus.8 Then, the IC50 values and MAO-B selectivity ratio [IC50
(MAO-A)]/[IC50 (MAO-B)] for inhibitory effects of both new com-pounds and reference inhibitors were calculated (Table 1).30
The resveratrol–coumarin hybrid compounds 3, 4, and 6showed high selectivity for the MAO-B isoenzyme and inhibitoryactivity in the nano to picomolar range. Compound 4 was the mostactive compound of this series, making the meta methoxy positionthe most interesting position at which to improve the MAO-B-inhibiting activity. Compound 5 has no MAOI activity up to thehighest tested concentration, proving that the methoxy group inthe ortho position is not favorable to the measured enzymatic inhi-bition. Changes on the methoxy substituent position on the phenylring in coumarin’s 3 position can modulate the pharmacologic po-tential of the synthesized coumarins.
Comparing compound 3 with its hydroxyl derivative 6, it wasshown that the hydrolysis of methoxy groups is not, in this case,a strategy to improve the MAOI activity. The IC50 of compound 6for inhibition of MAO-B activity is approximately 10 times biggerthan compound 3. However, this value is also in the nanomolarrange, and the molecule is also a potent MAOI, selective for theMAO-B isoenzyme.
In conclusion, the synthesized resveratrol–coumarin hybridcompounds show high selectivity for the MAO-B isoenzyme. Most
R
5054 M. J. Matos et al. / Bioorg. Med
OOOH
CHOMe MeOHO
1 2 3: R = p-OMe4: R = m-OMe5: R = o-OMe
6: R = p-OH
a
OMe
b
Scheme 1. Reagents and conditions: (a) DCC, DMSO, 110 �C, 24 h; (b) HI, AcOH,Ac2O, 110 �C, 5 h.
Table 1MAO-A and MAO-B inhibition by the prepared compounds 3–6 and for the referencecompounds
Compounds MAO-A IC50 MAO-B IC50 Ratio
3 * 13.05 ± 0.90 nM >7663b
4 * 802.60 ± 53.75 pM >124,595b
5 * *
6 * 155.59 ± 17.09 nM >643b
R-(�)-Deprenyl 67.25 ± 1.02 lMa 19.60 ± 0.86 nM 3431Iproniazid 6.56 ± 0.76 lM 7.54 ± 0.36 lM 0.87
* Inactive at 100 lM (highest concentration tested). At higher concentrations thecompounds precipitate.
a P <0.01 versus the corresponding IC50 values obtained against MAO-B, asdetermined by ANOVA/Dunnett’s.
b Values obtained under the assumption that the corresponding IC50 againstMAO-A is the highest concentration tested (100 lM).
of them present activity in the low nanomolar range. The introduc-tion of one meta methoxy group in the 3-phenyl ring improves sev-eral times the MAO-B inhibitory activity in respect to ortho andpara positions. Compound 4 is about 24 times more active thatR-(�)-deprenyl, and several times more selective than this drug.The hydrolysis of methoxy groups is not a strategy to get betterMAOI activity. These studied modifications can interestingly im-prove the pharmacologic potential of the 3-phenylcoumarins inthe treatment of Parkinson’s disease.
Acknowledgments
Thanks to the Spanish Ministerio de Sanidad y Consumo(PI061457 and PI061537) and to Xunta da Galicia (BTF20303PR,PXIB203022PR, and CSA019203PR) and Fondazione Banco Sarde-gna (Italy) for financial support. M.J.M. also thanks MIUR for aPhD grant.
References and notes
1. Borges, F.; Roleira, F.; Milhazes, N.; Santana, L.; Uriarte, E. Curr. Med. Chem.2005, 12, 887.
2. Hoult, J. R. S.; Payá, M. Gen. Pharmacol. 1996, 27, 713.3. Kontogiorgis, C.; Hadjipavlou-Litina, D. J. Enzyme Inhib. Med. Chem. 2003, 18, 63.4. Kabeya, L.; Marchi, A.; Kanashiro, A.; Lopes, N.; Silva, C.; Pupo, M.; Lucisano-
Valim, Y. Bioorg. Med. Chem. 2007, 15, 1516.5. Carotti, A.; Altomare, C.; Catto, M.; Gnerre, C.; Summo, L.; De Marco, A.; Rose, S.;
Jenner, P.; Testa, B. Chem. Biod. 2006, 3, 134.6. Chilin, A.; Battistutta, R.; Bortolato, A.; Cozza, G.; Zanatta, S.; Poletto, G.;
Mazzorana, M.; Zagotto, G.; Uriarte, E.; Guiotto, A.; Pinna, L.; Meggio, F.; Moro,S. J. Med. Chem. 2008, 51, 752.
7. Santana, L.; Uriarte, E.; González-Díaz, H.; Zagotto, G.; Soto-Otero, R.; Méndez-Álvarez, E. J. Med. Chem. 2006, 49, 1118.
8. Matos, M. J.; Viña, D.; Quezada, E.; Picciau, C.; Delogu, G.; Orallo, F.; Santana, L.;Uriarte, E. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2009, 19, 3268.
9. Santana, L.; González-Díaz, H.; Quezada, E.; Uriarte, E.; Yáñez, M.; Viña, D.;Orallo, F. J. Med. Chem. 2008, 51, 6740.
10. Gnerre, C.; Catto, M.; Leonetti, F.; Weber, P.; Carrupt, P.; Altomare, C.; Carotti,A.; Testa, B. J. Med. Chem. 2000, 43, 4747.
11. Catto, M.; Nicolotti, O.; Leonetti, F.; Carotti, A.; Favia, A.; Soto-Otero, R.;Méndez-Álvarez, E.; Carotti, A. J. Med. Chem. 2006, 49, 4912.
12. Chimenti, F.; Secci, D.; Bolasco, A.; Chimenti, P.; Bizzarri, B.; Granese, A.;Carradori, S.; Yanez, M.; Orallo, F.; Ortuso, F.; Alcaro, S. J. Med. Chem. 2009, 52,1935.
13. Chimenti, F.; Secci, D.; Bolasco, A.; Chimenti, P.; Granese, A.; Befani, O.; Turini,P.; Alacaro, S.; Ortuso, F. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2004, 14, 3697.
14. Geha, R. M.; Rebrin, I.; Chen, K.; Shih, J. C. J. Biol. Chem. 2001, 276, 9877.15. Johnston, J. P. Biochem. Pharmacol. 1968, 17, 1285.16. Grimsby, J.; Lan, N. C.; Neve, R.; Chen, K.; Shih, J. C. J. Neurochem. 1990, 55,
1166.17. Harfenist, H.; Heuseur, D. J.; Joyner, C. T.; Batchelor, J. F.; White, H. L. J. Med.
Chem. 1996, 39, 1857.18. Frémont, L. Life Sci. 2000, 66, 663.19. Vilar, S.; Quezada, E.; Santana, L.; Uriarte, E.; Yánez, M.; Fraiz, N.; Alcaide, C.;
Cano, E.; Orallo, F. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2006, 16, 257.20. Orallo, F. In Resveratrol in Health and Disease; Aggarwal, B. B., Shishodia, S., Eds.;
CRC Press: USA, 2005; p 577.21. Leiro, J.; Álvarez, E.; Arranz, J.; Laguna, R.; Uriarte, E.; Orallo, F. J. Leukocyte Biol.
2004, 75, 1156.22. Orallo, F. Curr. Med. Chem. 2008, 15, 1887.23. De Colibus, L.; Li, M.; Binda, C.; Lustig, A.; Edmondson, D. E.; Mattevi, A. Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2005, 102, 12684.24. Yánez, M.; Fraiz, N.; Cano, E.; Orallo, F. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2006,
344, 688.25. Vilar, S.; Quezada, E.; Alcaide, C.; Orallo, F.; Santana, L.; Uriarte, E. Qsar Comb.
Sci. 2007, 26, 317.26. Kamat, S. P.; D́Souza, A. M.; Paknikar, S. K.; Beaucahmp, P. S. J. Chem. Res. (S)
2002, 242.27. 3-(30-Methoxy)phenyl-6-methylcumarin (4): It was obtained with a yield of 53%.
Mp 84–85 �C. 1H NMR (CDCl3) d (ppm), J (Hz): 2.44 (s, 3H, –CH3), 3.88 (s, 1H, –OCH3), 6.97 (m, 1H, H-40), 7.26–7.42 (m, 6H, H-5, H-7, H-8, H-20 , H-50 and H-60)7.78 (s, 1H, H-4). 13C NMR (CDCl3) d (ppm): 20.77, 55.37, 114.15, 114.38,116.10, 119.28, 120.86, 127.70, 129.43, 132.48, 134.12, 136.12, 139.91, 140.10,151.60, 159.45 160.66. MS m/z (%): 267 (48), 266 (M+, 100), 239 (16), 238 (70),237 (20), 195 (48), 194 (16), 166 (10), 165 (29), 152 (23). Anal. Calcd forC17H14O3: C, 76.68; H, 5.30. Found: C, 76.76; H, 5.21.
28. 3-(20-Methoxy)phenyl-6-methylcumarin (5): It was obtained with a yield of 59%.Mp 177–178 �C. 1H NMR (CDCl3) d (ppm), J (Hz): 2.41 (s, 3H, –CH3), 3.82 (s, 1H,–OCH3), 7.02 (m, 2H, H-30 , H-40), 7.24–7.41 (m, 5H, H-5, H-7, H-8, H-50 and H-60) 7.69 (s, 1H, H-4). 13C NMR (CDCl3) d (ppm): 20.80, 55.81, 111.31, 116.21,
m. Lett. 19 (2009) 5053–5055
Chem
119.24, 120.57, 124.20, 126.36, 127.58, 130.14, 130.80, 132.21, 133.89, 141.84,151.82, 157.22 160.55. MS m/z (%): 267 (22), 266 (M+, 100), 265 (10), 249 (29),237 (22), 235 (14), 223 (22), 220 (12), 195 (29), 173 (26), 165 (25), 152 (17),145 (19), 118 (19). Anal. Calcd for C17H14O3: C, 76.68; H, 5.30. Found: C, 76.76;H, 5.22.
29. 3-(40-Hydroxy)phenyl-6-methylcumarin (6): It was obtained with a yield of 63%.
M. J. Matos et al. / Bioorg. Med.
Mp 217–218 �C. 1H NMR (CDCl3) d (ppm), J (Hz): 2.37 (s, 3H, –CH3), 6.84 (d, 2H,H-30 and H-50 , J = 8.8), 7.31 (d, 1H, H-8, J = 8.4), 7.40 (dd, 1H, H-7, J = 1.9 and
8.4), 7.56 (m, 3H, H-20 , H-60 and H-5), 8.06 (s, 1H, H-4). 13C NMR (CDCl3) d(ppm): 20.31, 115.04, 115.52, 119.45, 125.29, 126.66, 127.92, 129.83, 132.00,133.67, 138.46, 150.79, 157.95, 160.04. MS m/z (%): 253 (13), 252 (M+, 75), 224(58), 223 (26), 165 (12) 152 (15), 143 (23), 99 (37), 98 (25), 83 (12), 70 (20), 56(100), 55 (27). Anal. Calcd for C16H12O3: C, 76.18; H, 4.79. Found: C, 75.99; H,4.69.
30. All IC50 values shown in the table are expressed as means ± SEM from five
. Lett. 19 (2009) 5053–5055 5055
experiments.
Molecules 2010, 15, 270-279; doi:10.3390/molecules15010270
molecules ISSN 1420-3049
www.mdpi.com/journal/molecules Article
Synthesis and Vasorelaxant and Platelet Antiaggregatory Activities of a New Series of 6-Halo-3-phenylcoumarins †
Elías Quezada 1, Giovanna Delogu 2,*, Carmen Picciau 2, Lourdes Santana 3, Gianni Podda 2, Fernanda Borges 1, Verónica García-Morales 4, Dolores Viña 4 and Francisco Orallo 4
1 Chemistry Department, Faculty of Sciences, University Porto, 4169-007 Porto, Portugal; E-Mails: [email protected] (E.Q.); [email protected] (F.B.)
2 Dipartimento Farmaco Chimico Tecnologico, Universita degli Studi di Cagliari, Via Ospedale 72, 09124 Cagliari, Italy; E-Mails: [email protected] (C.P); [email protected] (G.P.)
3 Department of Organic Chemistry, Faculty of Pharmacy, University of Santiago de Compostela, 15782 Santiago de Compostela, Spain; E-Mail: [email protected] (L.S.)
4 Department of Pharmacology, Faculty of Pharmacy, University of Santiago de Compostela, 15782 Santiago de Compostela, Spain; E-Mails: [email protected] (D.V.); [email protected] (F.O.); [email protected] (V.G.M.)
† In memory of Prof. Francisco Orallo.
* Author to whom correspondence should be addressed; E-Mail: [email protected]; Tel.: +39-0706758566; Fax: +39-0706758553.
Received: 4 December 2009; in revised form: 21 December 2009 / Accepted: 23 December 2009 / Published: 12 January 2010
Abstract: A series of 6-halo-3-hydroxyphenylcoumarins (resveratrol-coumarins hybrid derivatives) was synthesized in good yields by a Perkin reaction followed by hydrolysis. The new compounds were evaluated for their vasorelaxant activity in intact rat aorta rings pre-contracted with phenylephrine (PE), as well as for their inhibitory effects on platelet aggregation induced by thrombin in washed human platelets. These compounds concentration-dependently relaxed vascular smooth muscle and some of them showed a platelet antiaggregatory activity that was up to thirty times higher than that shown by trans-resveratrol and some other previously synthesized derivatives.
Keywords: resveratrol; coumarin; vasorelaxant; platelet antiaggregatory activity
OPEN ACCESS
Molecules 2010, 15
271
1. Introduction
Coumarins (or benzopyrones) are a large family of compounds of natural and synthetic origin that show numerous biological activities, including cardiovascular properties [1]. For instance, Carbochromen (3-diethylaminoethyl-7-ethoxycarbonylmethoxy-4-methylcoumarin (Figure 1) is a potent specific coronary vasodilator that has been used for many years in the treatment of angina pectoris [2,3]. Futhermore, warfarin [3-(2-acetyl-1-phenylethyl)-4-hydroxycoumarin (Figure 1) is a coumarin with potent anticoagulant activity and a good pharmacokinetic profile [4].
Figure 1. Chemical structures of trans-resveratrol, carbochromen, and warfarin.
O O
NEt
Et
OO
OEt
Carbochromen
O O
OH O
Warfarin
HO
OH
OH
trans-Resveratrol
trans-Resveratrol (t-RESV; 3,4',5-trihydroxy-trans-stilbene; Figure 1) is a natural phenolic component of Vitis vinifera L. (Vitaceae). It is abundant in the skin of the grapes and it is present in higher concentrations in red than in white wines. trans-Resveratrol has shown a number of biological activities, including protection against coronary heart disease, as a result of different effects: significant antioxidant activity, modulation of lipoprotein metabolism, and vasodilatatory and platelet antiaggregatory properties [5–8].
Because of their similar characteristics, it was of interest to design and synthesize hybrids that incorporate the nucleus of the coumarins and resveratrol molecules. In previous work, our research group had reported the vasorelaxant and platelet antiaggregatory activities of a series of coumarin-resveratrol hybrids (3-arylcoumarins), bearing hydroxy or methoxy groups on the coumarin and/or on the 3-phenyl ring. 6-Hydroxy-3-(3’,5’-dihydroxyphenyl)coumarin showed vasorelaxant and platelet antiaggregatory activity higher than that of trans-resveratrol [9].
Based on this, and with the aim of improving the vasorelaxant and platelet antiaggregatory activities of resveratrol-coumarin hybrids and establishing a relationship between the structure and activity for this type of compounds we have studied the effects of substitution on the 3-arylcoumarin moiety with groups showing different steric and electronics effects. In this paper we report the synthesis and evaluation of a new series of 3-arylcoumarins in which the hydroxy group in the 6 position has been changed for a halogen group, and different positions of hydroxyl group in 3-phenyl ring were explored.
Molecules 2010, 15
272
2. Results and Discussion
The 3-phenylcoumarins 6-11 [10] were prepared from the conveniently substituted phenylacetic acids 1-3, the appropriate salicylaldehyde 4, 5 and dicyclohexylcarbodiimide (DCC) by a Perkin reaction [11–13] in dimethylsulfoxide (DMSO). These reactions gave 46%, 40%, 27%, 29%, 31% and 33% yield, respectively. Hydrolysis of the methoxy groups [14] by treatment with HI in acetic acid/acetic anhydride gave the hydroxy derivatives 12, 13, 14, 15, 16 and 17 [15–16], in 28%, 70%, 60%, 73%, 94% and 57% yield, respectively (Scheme 1).
Scheme 1. General synthetic route to obtain compounds 6-17.
OH
O
O OOH
HX
O
+
1 R1 = MeO; R2 = R3 = H2 R2 = MeO; R1 = R3 = H3 R3 = MeO; R1 = R2 = H
R2
R1
R3
4 X = Cl5 X = Br
X
R2
R1 R3
6 X = Cl; R1 = MeO; R2 = R3 = H7 X = Cl; R2 = MeO; R1 = R3 = H8 X = Cl; R3 = MeO; R1 = R2 = H9 X = Br; R1 = MeO; R2 = R3 = H10 X = Br; R2 = MeO; R1 = R3 = H11 X = Br; R3 = MeO; R1 = R2 = H
a
b
12 X = Cl; R1 = OH; R2 = R3 = H13 X = Cl; R2 = OH; R1 = R3 = H14 X = Cl; R3 = OH; R1 = R2 = H15 X = Br; R1 = OH; R2 = R3 = H16 X = Br; R2 = OH; R1 = R3 = H17 X = Br; R3 = OH; R1 = R2 = H
O O
X
R2
R1 R3
Reagents and conditions: (a) DCC, DMSO, 110 °C, 12h; (b) HI/AcOH/Ac2O, 0 °C to rt, 3 h.
The vasorelaxant effects of compounds 12-17 were studied on pre-contracted rat aortic rings with
endothelium [6]. The cumulative addition of t-RESV or the new compounds (1-100 μM) caused a concentration-dependent relaxation of the contractions induced by phenylephrine (PE, 1 μM) in intact rat aortic rings. The corresponding IC50 values are shown in Table 1.
Molecules 2010, 15
273
Table 1. Vasorelaxant activity (IC50 in μM) of tested compounds.
Compound PE (1 μM) 12 36.63 ± 2.46* 13 57.63 ± 3.87* 14 ** 15 48.79 ± 3.27* 16 46.67 ± 3.13* 17 **
t-RESV 3.12 ± 0.26 * P < 0.01 versus the corresponding IC50 values of t-RESV; ** Inactive at 100 μM (highest concentration tested). At higher concentrations compounds precipitate.
All evaluated compounds resulted less efficient than t-RESV in relaxing the contractions induced
by PE. Furthermore, substitution with a p-hydroxy group in the 3-phenyl ring (compounds 14 and 17) leads to inactive compounds. Platelet aggregation studies were also performed. Compounds 12, 13 and 17 inhibited platelet aggregation more effectively than t-RESV when thrombin (0.25 U/mL) was used as the stimulating agent (Table 2).
Table 2. Antiplatelet activity (IC50 in μM) for tested compounds.
Compound Thrombin (0.25 U/mL) 12 91.36 ± 6.13* 13 6.41 ± 2.15* 14 ** 15 ** 16 ** 17 20.1 ± 1.35*
t-RESV 195.50 ± 13.82 * P < 0.01 versus the corresponding IC50 values of t-RESV; ** Inactive at 100 μM (highest concentration tested). At higher concentrations compounds precipitate.
These results indicate that the variation of the position of the hydroxyl group on the 3-phenyl and the substitution with different halogen groups in the 6 position of the coumarin ring, in this type of molecules (resveratrol-coumarins hybrid), can give derivatives with a significantly higher pharmacological potency than t-RESV. This is the case for compound 13, which has a platelet antiaggregatory activity that is more than 32 times higher than that of t-RESV.
3. Experimental
3.1. General
Melting points were determined in a Reichert Kofler thermopan or in capillary tubes in a Buchi 510 apparatus, and are uncorrected. Infrared (IR) spectra were recorded in a Perkin-Elmer 1640FT spectrometer (KBr disks, ν in cm-1).13C and 1H spectra of samples approximately 10% solutions in chloroform-d, were recorder at room temperature in 5 mm o.d. tubes. TMS was used as internal
Molecules 2010, 15
274
standard, chemical shifts are expressed in ppm (δ), J in Hz. NMR spectra were recorded with a Bruker AMX 500 (1H-, 500 MHz; 13C-, 125 MHz) instrument. ). Mass spectra were obtained using a Hewlett-Packard 5988A spectrometer (70 eV). Silica gel (35-60 mesh) was used for flash chromatography (FC). Analytical TLC was performed on plates precoated with silica gel (Merck 60 F254, 0.25 mm). Elemental analyses were performed with a Perkin-Elmer 240B microanalyser. Phenylacetic acids 1-3, salicylaldehydes 4, 5, hydriodic acid (HI), acetic acid (AcOH), acetic anhydride (Ac2O), dicyclohexylcarbodiimide (DCC) and dimethylsulfoxide (DMSO) were commercially available (Aldrich). 3.2. Chemistry
The studied compounds are all known and were prepared by a traditional Perkin reaction carried out
in refluxing dimethylsulfoxide (DMSO) between conveniently substituted phenylacetic acids 1-3 and the corresponding salicylaldehyde 4, 5, using dicyclohexylcarbodiimide (DCC) as dehydrating agent (Scheme 1) [11–13]. Hydrolysis of methoxy groups [14], by treatment with HI in acetic acid/acetic anhydride gave the desired hydroxyl derivatives 12-17 [15–16]. 6-Chloro-3-(2’-methoxy)phenylcoumarin (6). Purified by chromatography using 9:1 hexane/ethyl acetate as eluent; Mp: 177–179 ºC; IR (KBr): 2920, 1705, 1610, 1302, 1125, 780 cm-1; 1H-NMR (CDCl3) δ (ppm): 3.83 (s, 3H, CH3O), 7.00 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.05 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.22 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.41 (m, 3H), 7.60 (m, 1H), 7.66 (s, 1H); 13C-NMR (CDCl3) δ (ppm): 55.7, 111.3, 116.7, 118.2, 120.6, 121.0, 126.9, 130.0, 130.4, 130.7, 131.0, 133.8, 140.2, 152.2, 156.9, 157.1; MS m/z (%): 288 ([M+2]+, 33), 286 (M+, 100), 269(16), 251 (8), 240 (5), 193 (21), 152 (16), 118 (14); Anal. Calcd for C16H11ClO3: C, 67.03; H, 3.87. Experimental: C, 67.25; H, 3.99.
6-Chloro-3-(3’-methoxy)phenylcoumarin (7). Purified by chromatography using 9:1 hexane/ethyl acetate as eluent; Mp: 144–146 ºC; IR (KBr): 2925, 1700, 1615, 1300, 1115, 775 cm-1; 1H-NMR (CDCl3) δ (ppm): 3.85 (s, 3H, CH3O), 6.96 (dd, J = 2.5; 8.2 Hz, 1H), 7.25 (m, 2H), 7.35 (m, 2H), 7.48 (m, 2H), 7.72 (s, 1H); 13C-NMR (CDCl3) δ (ppm): 55.32, 114.2, 114.8, 117.8, 120.6, 120.8, 127.0, 129.2, 129.5, 129.7, 131.3, 135.5, 138.5, 151.8, 159.5, 159.8; MS m/z (%): 288 ([M+2]+, 29), 286 (M+, 100), 258(30), 215 (20), 201 (5), 152 (7); Anal. Calcd for C16H11ClO3: C, 67.03; H, 3.87. Experimental: C, 67.20; H, 3.95.
6-Chloro-3-(4’-methoxy)phenylcoumarin (8). Purified by chromatography using 9:1 hexane/ethyl acetate as eluent; Mp: 194–196 ºC; IR (KBr): 2918, 1710, 1614, 1300, 1117, 779 cm-1; 1H-NMR (CDCl3) δ (ppm): 3.85 (s, 3H, CH3O), 6.99 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 7.29 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.48 (m, 2H), 7.66 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 7.71 (s, 1H); 13C-NMR (CDCl3) δ (ppm): 55.4, 113.9 (2C), 117.7, 118.3, 120.3, 121.1, 126.8, 129.8 (2C), 130.8, 136.9, 141.1, 151.9, 156.3, 158.2; MS m/z (%): 288 ([M+2]+, 37), 286 (M+, 100), 258(13), 243 (16), 180 (3), 152 (5); Anal. Calcd for C16H11ClO3: C, 67.03; H, 3.87. Experimental: C, 67.10; H, 3.99.
Molecules 2010, 15
275
6-Bromo-3-(2’-methoxy)phenylcoumarin (9). Purified by chromatography using 9:1 hexane/ethyl acetate as eluent; Mp: 183–185 ºC; IR (KBr): 2909, 1709, 1615, 1305, 1120, 783 cm-1; 1H-NMR (CDCl3) δ (ppm): 3.82 (s, 3H, CH3O), 6.99 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.03 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 7.24 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.36 (m, 2H), 7.60 (m, 2H), 7.66 (s, 1H); 13C-NMR (CDCl3) δ (ppm): 55.7, 111.3, 116.7, 118.2, 120.6, 121.0, 123.5, 127.6, 130.0, 130.5, 130.7, 133.8, 140.2, 152.5, 157.1, 159.6; MS m/z (%): 332 ([M+2]+, 100), 330 (M+, 97), 315(23), 237 (32), 152 (15), 118 (16); Anal. Calcd for C16H11BrO3: C, 58.03; H, 3.35. Experimental: C, 58.25; H, 3.49.
6-Bromo-3-(3’-methoxy)phenylcoumarin (10). Purified by chromatography using 9:1 hexane/ethyl acetate as eluent; Mp: 148-150 ºC; IR (KBr): 2898, 1700, 1620, 1300, 1110, 789 cm-1; 1H-NMR (CDCl3) δ (ppm): 3.85 (s, 3H, CH3O), 6.96 (dd, J = 2.3; 8.2 Hz, 1H), 7.20 (m, 2H), 7.36 (m, 2H), 7.60 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.75 (s, 1H), 7.85 (s, 1H); 13C-NMR (CDCl3) δ (ppm): 55.2, 114.1, 114.6, 116.9, 118.0, 120.7, 121.0, 129.0, 129.4, 130.0, 133.9, 135.3, 138.3, 152.1, 159.3, 159.6; MS m/z (%): 332 ([M+2]+, 100), 330 (M+, 28), 302(34), 195 (10), 180 (10), 152 (17); Anal. Calcd for C16H11BrO3: C, 58.03; H, 3.35. Experimental: C, 58.15; H, 3.50.
6-Bromo-3-(4’-methoxy)phenylcoumarin (11). Purified by chromatography using 9:1 hexane/ethyl acetate as eluent; Mp: 205–206 ºC; IR (KBr): 2900, 1712, 1612, 1298, 1110, 781 cm-1; 1H-NMR (CDCl3) δ (ppm): 3.85 (s, 3H, CH3O), 6.97 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.23 (m, 1H), 7.57 (dd, J = 2.2, 8.7 Hz, 1H), 7.63 (m, 3H), 7.67 (s, 1H); 13C-NMR (CDCl3) δ (ppm): 55.3, 113.9 (2C), 114.1, 116.9, 118.1, 121.4, 126.5, 128.9, 129.8 (2C), 129.9, 133.6, 136.8, 152.0, 160.4; MS m/z (%): 332 ([M+2]+, 100), 330 (M+, 13), 302(12), 288 (40), 259 (18), 195 (10), 180 (17), 152 (14); Anal. Calcd for C16H11BrO3: C, 58.03; H, 3.35. Experimental: C, 58.15; H, 3.42.
6-Chloro-3-(2’-hydroxy)phenylcoumarin (12). Purified by chromatography using 8:2 hexane/ethyl acetate as eluent. Mp: 225–227 ºC. IR (KBr): 3500, 2920, 1705, 1613, 1300, 1120, 780 cm-1. 1H NMR (DMSO-d6) δ (ppm): 6.86 (m, 2H), 7.23 (m, 2H), 7.39 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.78 (dd, J = 2.3; 8.8 Hz, 1H), 7.97 (s, 1H), 8.00 (s, 1H), 9.64 (bs, 1H, 1OH). 13C NMR (DMSO-d6) δ (ppm): 115.7, 116.0, 118.2, 118.7, 121.2, 121.8, 127.1, 129.9, 130.3, 130.7, 133.8, 140.6, 140.7, 152.1, 155.1. MS m/z (%): 274 ([M+2]+, 23), 272 (M+, 100), 244(35), 180 (19), 152 (20), 118 (10). Anal. Calcd for C15H9ClO3: C, 66.07; H, 3.33. Experimental: C, 66.25; H, 3.49.
6-Chloro-3-(3’-hydroxy)phenylcoumarin (13). Purified by chromatography using 8:2 hexane/ethyl acetate as eluent; Mp: 221–223 ºC; IR (KBr): 3502, 2925, 1701, 1614, 1310, 1110, 785 cm-1; 1H-NMR (DMSO-d6) δ (ppm): 6.82 (dd, J = 2.2; 8.0 Hz, 1H), 7.10 (m, 2H), 7.25 (m, 1H), 7.44 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.61 (dd, J = 2.5; 8.8 Hz, 1H), 7.86 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 8.14 (s, 1H), 9.60 (bs, 1H, 1OH); 13C- NMR (DMSO-d6) δ (ppm): 115.5, 115.9, 117.8, 119.2, 120.9, 127.6, 128.0, 128.2, 129.3, 131.1, 135.5, 139.1, 151.5, 157.1, 159.2; MS m/z (%): 274 ([M+2]+, 21), 272 (M+, 100), 244(48), 180 (14), 152 (23), 118 (10); Anal. Calcd for C15H9ClO3: C, 66.07; H, 3.33. Experimental: C, 66.30; H, 3.45.
6-Chloro-3-(4’-hydroxy)phenylcoumarin (14). Purified by chromatography using 8:2 hexane/ethyl acetate as eluent; Mp: 241–243 ºC; IR (KBr): 3500, 2918, 1708, 1610, 1296, 1119, 783 cm-1; 1H-NMR
Molecules 2010, 15
276
(DMSO-d6) δ (ppm): 6.84 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.44 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.58 (m, 3H), 7.84 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 8.09 (s, 1H), 9.81 (bs, 1H, 1OH); 13C-NMR (DMSO-d6) δ (ppm): 115.1 (2C), 117.7, 121.1, 124.8, 127.2, 127.8, 128.1, 129.9 (2C), 130.6, 137.1, 151.2, 158.2, 159.5; MS m/z (%): 274 ([M+2]+, 20), 272 (M+, 100), 244(74), 180 (15), 152 (40), 118 (5); Anal. Calcd for C15H9ClO3: C, 66.07; H, 3.33. Experimental: C, 66.22; H, 3.47.
6-Bromo-3-(2’-hydroxy)phenylcoumarin (15). Purified by chromatography using 8:2 hexane/ethyl acetate as eluent; Mp: 230–232 ºC; IR (KBr): 3510, 2918, 1709, 1620, 1310, 1120, 780 cm-1; 1H-NMR (DMSO-d6) δ (ppm): 6.87 (m, 2H), 7.23 (m, 2H), 7.40 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.74 (dd, J = 2.3; 8.8 Hz, 1H), 7.99 (s, 1H), 8.02 (s, 1H), 9.64 (bs, 1H, 1OH); 13C-NMR (DMSO-d6) δ (ppm): 115.7, 116.0, 118.2, 118.7, 121.2, 121.8, 127.1, 129.9, 130.3, 130.7, 133.8, 140.6, 152.1, 155.1, 158.8; MS m/z (%): 318 ([M+2]+, 47), 316 (M+, 71), 300(8), 288 (40), 180 (54), 152 (100); Anal. Calcd for C15H9BrO3: C, 56.81; H, 2.86. Experimental: C, 56.95; H, 3.00.
6-Bromo-3-(3’-hydroxy)phenylcoumarin (16). Purified by chromatography using 8:2 hexane/ethyl acetate as eluent; Mp: 219–221 ºC; IR (KBr): 3505, 2919, 1709, 1622, 1312, 1123, 780 cm-1; 1H-NMR (DMSO-d6) δ (ppm): 6.82 (dd, J = 2.0; 7.7 Hz, 1H), 7.10 (m, 2H), 7.25 (m, 1H), 7.38 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.73 (dd, J = 2.3; 8.8 Hz, 1H), 8.00 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 8.14 (s, 1H), 9.59 (bs, 1H, 1OH); 13C- NMR (DMSO-d6) δ (ppm): 115.5, 115.9, 116.1, 118.1, 119.2, 121.4, 128.0, 129.3, 130.6, 133.9, 135.5, 139.0, 151.9, 157.1, 159.1; MS m/z (%): 318 ([M+2]+, 46), 316 (M+, 79), 288 (46), 180 (19), 152 (100); Anal. Calcd for C15H9BrO3: C, 56.81; H, 2.86. Experimental: C, 56.98; H, 3.01.
6-Bromo-3-(4’-hydroxy)phenylcoumarin (17). Purified by chromatography using 8:2 hexane/ethyl acetate as eluent; Mp: 226–228 ºC; IR (KBr): 3520, 2939, 1710, 1622, 1302, 1133, 784 cm-1; 1H-NMR (DMSO-d6) δ (ppm): 6.84 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.34 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 7.54 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.66 (m, 1H), 7.99 (s, 1H), 8.09 (s, 1H), 9.81 (bs, 1H, 1OH); 13C-NMR (DMSO-d6) δ (ppm): 115.1 (2C), 116.0, 118.0, 121.6, 124.8, 127.7, 129.9 (2C), 130.2, 133.3, 137.0, 151.6, 158.2, 159.4; MS m/z (%): 318 ([M+2]+, 31), 317 ([M+1]+, 100), 316 (M+, 40), 288 (39), 180 (14), 152 (46); Anal. Calcd for C15H9BrO3: C, 56.81; H, 2.86. Experimental: C, 56.87; H, 3.0.
3.3. Vasorelaxant activity
Vascular rings were prepared from aortae of male or female Wistar rats weighing 230–270 g. After
an equilibration period of at least 1 h, isometric contractions induced by PE (1 μM) were obtained. When contraction of the tissue in response to the corresponding vasoconstrictor agent had stabilized (after about 20 min), cumulatively increasing concentrations of the compounds were added to the bath at 15–20 min intervals (the time needed to obtain steady-state relaxation). Control tissues were subjected to the same procedure simultaneously, but in this case omitting the compounds and adding the vehicle [appropriate dilutions of dimethylsulfoxide (DMSO)]. Results shown in the tables are expressed as means ± SEM from five experiments. Means were compared by one-way analysis of variance (ANOVA) followed by Dunnett’s post hoc test. The inhibitory effects of the tested compounds in rat aorta and human platelet are expressed as IC50 (concentrations that produce a 50%
Molecules 2010, 15
277
inhibition) estimated by least-squares linear regression using the program Origin 5.0, with X = log molar concentration of the tested compounds and Y = % of pharmacological response.
3.4. Antiplatelet activity
Preparation of washed platelets. Washed human platelets were prepared from blood anticoagulated with citrate-phosphate-dextrose, which was obtained from Centro de Transfusion de Galicia (Santiago de Compostela, Spain). Bags containing buffy coat from individual donors were diluted with the same volume of washing buffer (NaCl, 120 mM; KCl, 5 mM; trisodium citrate, 12 mM; glucose, 10 mM; sucrose, 12.5 mM; pH 6) and centrifuged at 400 g for 9 min. The upper layer containing platelet (platelet-rich plasma) was removed and centrifuged at 400 g for 9 min. The resulting platelet pellet was recovered, resuspended with washing buffer, and centrifuged again at 1,000 g for 15 min. Finally, the platelet pellet from this step was resuspended in a modified Tyrode-HEPES buffer (HEPES, 10 mM; NaCl, 140 mM; KCl, 3 mM; MgCl2, 0.5 mM; NaHCO3, 5 mM; glucose, 10 mM; pH 7.4) to afford a cell density of 2.5–3.5 × 108 platelet/mL. The calcium concentration in the extracellular medium was 2 mM.
Platelet aggregation studies. Platelet aggregation was measured using a dual channel aggregometer (Chrono-log, Havertown, PA, USA). Each tested compound, dissolved in DMSO, was incubated with washed platelet at 37 °C for 5 min. Stimulus (thrombin) was then added to induce platelet aggregation and the light transmission was monitored over 5 min period. Platelet aggregation is measured as the maximum change in light transmission during this period. The 100% aggregation value was obtained when vehicle (DMSO) was added instead of the compounds. The final DMSO concentration was below 1% (v/v) in all cases.
4. Conclusions
In conclusion, some of the new synthesized molecules have been characterized as agents with remarkable human platelet antiaggregatory activity and significant vasorelaxant effects in intact rat aorta. Further experiments are in progress aimed at providing new data to clarify the precise mechanism by which coumarin-resveratrol hybrid derivatives produce their characteristic vasorelaxant and platelet antiaggregatory effects.
Acknowledgements
We thank Progetto di Ricerca Scientifica 2007-Università di Cagliari and Fondazione del Banco di Sardegna, Spanish Ministerio de Sanidad y Consumo (FISS PI061537, PI061457), Xunta de Galicia (Spain; INCITE08PXIB203022PR) and Spanish Ministerio de Ciencia e Innovación (FISS PS09/00618). D. Vina acknowledges sponsorships for a tenure-track research position at the University of Santiago de Compostela from the Isidro Parga Pondal Programme of the “Dirección Xeral de Investigación e Desenvolvemento, Xunta de Galicia”. E. Quezada thanks for a postdoctoral grant from FCT (Portugal). Verónica García-Morales thanks for a predoctoral grant (FPU, AP2008-
Molecules 2010, 15
278
02609, Spanish Ministerio de Ciencia e Innovación). C. Picciau thanks for a predoctoral grant Master & Back-Regione Sardegna.
References and Notes
1. Borges, F.; Roleira, F.; Milhazes, N.; Santana, L.; Uriarte, E. Simple coumarins and analogues in medicinal chemistry: Occurrence, synthesis and biological activity. Curr. Med. Chem. 2005, 12, 887–916.
2. Fiedler, V.B.; Scholtholt, J. Effects of carbocromene on myocardial oxygen consumption in isolated dog hearts. J. Pharmacol. Exp. Ther. 1981, 217, 306–313.
3. Opherk, D.; Schuler, G.; Waas, W.; Dietz, R.; Kubler, W. Intravenous carbochromen: A potent and effective drug for estimation of coronary dilatory capacity. Eur. Heart J. 1990, 11, 342–347.
4. Cao, Y.G.; Liu, X.Q.; Chen, Y.C.; Hao, K.; Wang, G.J. Warfarin maintenance dose adjustment with indirect pharmacodynamic model in rats. Eur. J. Pharm. Scien. 2007, 30, 175–180.
5. Bradamante, S.; Barenghi, L.; Villa, A. Cardiovascular protective effects of resveratrol. Cardiovasc. Drug Rev. 2004, 22, 169–188.
6. Orallo, F.; Alvarez, E.; Camina, M.; Leiro, J.M.; Gomez, E.; Fernandez, P. The possible implication of trans-Resveratrol in the cardioprotective effects of long-term moderate wine consumption. Mol. Pharmacol. 2002, 61, 294–302.
7. Wu, J.M.; Wang, Z.R.; Hsieh, T.C.; Bruder, J.L.; Zou, J.G.; Huang, Y.Z. Mechanism of cardioprotection by resveratrol, a phenolic antioxidant present in red wine. Int. J. Mol. Med. 2001, 8, 3–17.
8. Hao, H.D.; He, L.R. J. Mechanisms of cardiovascular protection by resveratrol. Med. Food 2004, 7, 290–298.
9. Vilar, S.; Quezada, E.; Santana, L.; Uriarte, E.; Yanez, M.; Fraiz, N.; Alcaide, C.; Cano, E.; Orallo, F. Design, synthesis, and vasorelaxant and platelet antiaggregatory activities of coumarin-resveratrol hybrids. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2006, 16, 257–261.
10. Oda, N.; Yoshida, Y.; Nagai, S.; Ueda, T.; Sakakibara, J. Synthesis of coumarins by Nucleophilic Denitrocyclization Reaction. Chem. Pharm. Bull. 1987, 35, 1796–1802.
11. Hans, N.; Singhi, M.; Sharma, V.; Grover, S.K. A novel one-step synthesis of 3-phenyl-, 4-methyl-3-phenyl- and 3-phenyl-4-styrylcoumarins using DCC-DMSO. Indian J. Chem. 1996, 35B, 1159–1162.
12. Perkin, W.H. On the artificial production of coumarin and formation of its homologues. J. Chem. Soc. 1868, 21, 53–63.
13. Perkin, W.H. On the formation of coumarin and of cinnamic and of other analogous acids from the aromatic aldehydes. 1877, 31, 388–427.
14. Begala, M.; Delogu, G.; Maccioni, E.; Podda, G.; Tocco, G.; Quezada, E.; Uriarte, E.; Fedrigo, M.A.; Favretto, D.; Traldi, P. Electrospray ionisation tandem mass spectrometry in the characterisation of isomeric benzofurocoumarin. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2001, 15, 1000–1010.
15. Walter, R.; Zimmer, H.; Purcell, T.C. Synthesis and cyclization reactions of 3-(2-hydroxybenzylidene)-2(3H)-coumaranones. J. Org. Chem. 1966, 31, 3854–3857.
Molecules 2010, 15
279
16. Mimai, M.; Suzuki, Y.; Hamma, N.; Murayama, E.; Aono, S. Coumarin derivatives. JP Pat. 49054371, 1974.
Sample Availability: Contact the authors.
© 2010 by the authors; licensee Molecular Diversity Preservation International, Basel, Switzerland. This article is an open-access article distributed under the terms and conditions of the Creative Commons Attribution license (http://creativecommons.org/licenses/by/3.0/).
Synthesis, molecular docking and inhibitory activity against human monoamine
oxidases of 3-heteroarylcoumarins.
Giovanna Delogu1, Carmen Picciau1, Giulio Ferino2, Elías Quezada3, Gianni Podda1,
Eugenio Uriarte2, Dolores Viña*4
1 Dipartimento Farmaco Chimico Tecnologico, Universita degli Studi di Cagliari, Via Ospedale 72,
09124 Cagliari, Italy 2 Departamento de Química Orgánica, Facultad de Farmacia, Universidad de Santiago de Compostela,
15782- Santiago de Compostela, Spain 3 Departamento de Química, Facudade de Ciências, 4169-007, Universidade de Porto, Porto, Portugal 4 Departamento de Farmacología, Facultad de Farmacia, Universidad de Santiago de Compostela, 15782-
Santiago de Compostela, Spain
Abstract. Monoamine oxidase (MAO) is an important drug target for the treatment of
neurological disorders. Series of 3-indolyl and 3-thiophenylcoumarins were synthesized
and evaluated as inhibitors of the two MAO isoforms, MAO-A and MAO-B. In general,
the derivatives were found to be selective MAO-B inhibitors with IC50 values in the
nanoMolar (nM) to microMolar (µM) range. Docking experiments were carried out in
order to compare the theoretical and experimental affinity of these compounds to the
human MAO-B protein. According with our results, docking experiments could be an
interesting methodology to try to predict the activity for this class of coumarins against
MAO-B receptor.
1. Introduction.
MAO is a FAD-containing enzyme with two known isoforms (MAO-A and MAO-B)
and it is present in the mitochondrial outer membrane of glial, neuronal and other cells
[1]. MAO enzymes intervene in the monoamines degradation carrying out an important
physiologic function in the adrenaline, noradrenaline and serotonin deamination
(preferentially MAO-A) and in the β-phenylethylamine and benzylamine deamination
(preferentially MAO-B) [2]. The MAO metabolic reaction involves the oxidation of the
amine function via oxidative cleavage of the α-CH bond of the substrate with the
ensuing generation of an imine intermediate. This pathway is accomplished by the
reduction of the flavin cofactor that is reoxidized by molecular oxygen, with
simultaneous hydrogen peroxide release. Subsequently, the imine intermediate is
hydrolyzed by a non-enzymatic pathway yielding ammonia and the corresponding
aldehyde [3]. This enzymatic function increases the synaptic concentration of the
neurotransmitters above mentioned and conditions to a great extent the neurone´s
excitement of those possessing receptors for these mediators [4]. These properties
determine the clinical importance of MAO inhibitors. In fact, interest in selective MAO-
B inhibitors has increased in the last years due to their therapeutic potential in aging
related neurodegenerative diseases such as Alzheimer´s disease (AD) and Parkinson´s
disease (PD) [5]. Selective MAO-A inhibitors have been used because of their
therapeutic potential in the treatment of neurological disorders such as depression [6].
The recent description of the crystal structure of the two isoforms of human MAO
provides to elucidate the mechanism underlying and allows investigation of the
selective interactions between these proteins and their ligands, to probe the catalytic
mechanism, and to gain a complete understanding of the pharmacophoric requirements
necessary for the rational design of new inhibitors [7,8].
Among the different existing inhibitors, those with a (1H)-benzopyran structure have
been deeply studied [9]. Substitution of the coumarin nucleus at position 3 has been
carried with phenyl, methyl, carboxylic acid, ethyl esther or acyl chloride groups [10].
In this work we synthesized and tested for MAO inhibitory activity some coumarin
derivatives substituted at position 3 with different heterocyclic rings. Additionally, we
explore the importance of the number and position of methoxy groups on (1H)-
benzopyran structure.
2. Results and discussion
2.1. Chemistry
The 3-heteroarylcoumarins derivatives were synthesized in moderate yield (25-47%) via
the classical Perkin reaction [11-14] by condensation of the ortho-
hydroxybenzaldehydes bearing the methoxy groups in the appropriate positions and the
conveniently substituted acetic acids, using N,N’-dicyclohexylcarbodiimide (DCC) as
dehydrating agent (Scheme 1). The structures of these compounds were confirmed by 1H NMR, 13C NMR, mass spectrometry and elemental analyses.
2.2. Enzyme inhibition studies
The potential effects of the new synthesized compounds on hMAO activity were
investigated by measuring their effects on the production of hydrogen peroxide (H2O2)
from p-tyramine, using the Amplex® Red MAO assay kit (Molecular Probes, Inc.,
Eugene, Oregon, USA) and MAO isoformas in microsomes prepared from insect cells
(BTI-TN-5B1-4) infected with recombinant baculovirus containing cDNA inserts for
hMAO-A or hMAO-B (Sigma-Aldrich Química S.A., Alcobendas, Spain). The
inhibition of hMAO activity was evaluated using the above method following the
general procedure described previously by us [15]. The tested drugs (new compounds
and reference inhibitors) themselves were unable to directly react with Amplex® Red
reagent. In addition, these test drugs had no effects on the resorufin standard
fluorescence curve which clearly indicates that these compounds do not react with
resorufin and do not quench the fluorescence generated by this product.
The control activity of hMAO-A and hMAO-B (using p-tyramine as common substrate
for both isoforms) was 165 ± 2 pmol of p-tyramine oxidized to p-
hydroxyphenylacetaldehyde/min (n = 20).
The results of the hMAO-A and hMAO-B inhibition studies with compounds 1a-c, 2a-
c, 3a-c and 4a-c are reported in Table 1 together with the selectivity index (SI =
hMAO-B selectivity ratios [IC50(hMAO-A)]/[IC50(hMAO-B)]). Enzymatic assays
revealed that most of tested compounds were moderate to potent hMAO inhibitors at
either low micromolar or nanomolar concentrations, showing a selective inhibitory
activity toward hMAO-B.
We can observe that the number and position of methoxy groups on (1H)-benzopyran
structure resulted more important for the activity than the nature of the heterocycle ring
in position 3. In fact, compounds 4a-c showing methoxy groups at 5 and 7 positions on
(1H)-benzopyran structure are inactive as MAO inhibitors. Introduction of a methoxy
group at either 6 or 7 position on (1H)-benzopyran structure, increases the MAO-B
activity between 10 and 100 fold (compare 1a vs 2a and 3a; 1b vs 2b; 1c vs 2c and 3c)
with the only exception of compounds 3b. Methoxy group at position 7 (compounds 2a-
c) let to improve the MAO-B inhibitory activity compared to the corresponding
compounds with the methoxy group at position 6, however compounds 2b and 2c
showed a weak MAO-A inhibitory activity leading to a small decrease in the B-
selectivity.
2.3. Molecular docking study
Docking experiments were carried out in order to compare the theoretical and
experimental affinity. The Protein Data Bank [16] (PDB) crystallographic structure of
human MAO-B (PDB code 2V60) [8] was considered as receptor for docking
simulations.
The scoring function estimates the affinity between ligands and receptor [17, 18]. With
the aim to verify the usefulness of the scoring function to recognize new molecules
potentially active as MAO-B inhibitors, different ligands were docked to the MAO-B
protein.
The experimental IC50 values were compared with those for the predicted activity
according to the scoring function (see Table 2). The square correlation coefficient (r2)
between the scoring function and the experimental MAO-B inhibitory activity pKi
resulted 0.44. This result is reasonable considering that scoring functions are not able to
provide a good correlation between the predicted and the experimental affinity [19-21].
In our case, a certain tendency of the model to rank the compounds basing on their
respective activity can be appreciated. In fact, when a cut-off value of IC50=1.0µM is
used in order to differentiate the compounds in two groups (high and low affinity), the
model is able to recognize clearly both groups. The most active compounds occupy the
first positions according to the scoring function. However, the compounds with IC50 >
1.0µM, are ranked in the last positions. The only exception is the inactive coumarin 4c
that is ranked in the first positions (see Table 2).
A second study was made in order to asses that the model discriminates between ligands
and decoys. The synthesized coumarins were dispersed in a pool of 120 decoys
extracted from ZINC database [22]. After docking calculations, data were plotted with
the receiver operative characteristics (ROC) curve. This representation is particularly
suited to illustrating the tendency of a binary model to either correctly classify the
compounds or predict false positives [23-25] (see Figure 1). The area under the curve is
0.93, indicating high predictive power for model. Through docking calculations is
possible to differentiate between true ligands and decoys (see Figure 1).
3. Conclusions
In the current study three series of 3-heteroaryl coumarin derivatives were synthesized
and evaluated as inhibitors of MAO-A and –B. In general, the derivatives were found to
be selective for the MAO-B isoform with 7-methoxy-3-heteroarylcoumarins exhibiting
inhibition potencies in the low nanoMolar range. Docking experiments showed that the
affinity of the studied compounds by MAO-B is similar to that obtained experimentally.
According with our results, docking experiments could be an interesting methodology
to try to predict the activity for this class of coumarins in MAO-B receptor.
4. Experimental
4.1. General methods
Melting points (mp) are uncorrected and were determined with a Reichert Kofler
thermopan or in capillary tubes in a Buchi 510 apparatus. 1H NMR (300 MHz) and 13C
NMR (75.4 MHz) spectra were recorder with a Bruker AMX spectrometer. Chemical
shifts (δ) are expressed in parts per million (ppm) using TMS as internal standard. Spin
multiplicities are given as s (singlet), d (doublet), dd (doublet of doublets) and m
(multiplet). Mass spectrometry was carried out with a Kratos MS-50 or a Varian MAT-
711 spectrometer. Elemental analyses were performed by a Perkin-Elmer 240B
microanalyzer and were within ±0.4% of calculated values in all cases. Flash
Chromatography (FC) was performed on silica gel (Merck 60, 230-400 mesh);
analytical TLC was performed on precoated silica gel plates (Merck 60 F254).
4.2. Synthesis
4.2.1. General synthetic method for the Coumarin Skeleton
A solution of ortho-hydroxybenzaldehyde (1-4, 8.18 mmol), substituted acetic acid (a-c,
9.82 mmol) and DCC (12.27 mmol) in dimethylsulfoxide (DMSO, 10 mL), was heated
(oil bath) at 110 oC for 24-48 h. On completion of the reaction, cold water (100 mL) and
acetic acid (15 mL) were added. The reaction mixture was stirred at room temperature
for 4 h and extracted with diethyl ether (4 x 100 mL). The precipitated dicyclohexylurea
was filtered off. The filtrate was extracted with 5% aqueous NaHCO3 (200 mL). The
organic phase was stirred for 1 h with 5% aqueous sodium metabisulfite in order to
remove the unreacted hydroxybenzaldehyde. The organic phase was washed with water,
dried (Na2SO4) and the solvent removed under reduced pressure. The residue was
purified by column chromatography (Hexane/EtOAc, 9:1)
4.2.2. 3-(Thiophen-2-yl)coumarin (1a) [26]: Yield 34%; mp 166-167 oC. 1H
NMR(300MHz)(CDCl3): δ = 7.12 (m, 1H), 7.28 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 7.35 (d, J = 9.4 Hz,
1H), 7.42 (d, J = 5.1 Hz, 1H), 7.52 (m, 2H), 7.80 (d, J = 3.8 Hz, 1H), 7.99 (s, 1H). 13C
NMR(300MHz)(CDCl3): δ = 116.4, 119.3, 121.7, 124.6, 127.0, 127.5, 127.7, 129.6,
131.1, 135.5, 135.9, 152.6, 160.1. EI-MS (m/z): 229 [M + 1]+, 228[M+]. Anal. Calcd. for
C13H8O2S: C 68.40, H 3.53; Found: C68.52, H 3.59.
4.2.3. 3-(Thiophen-3-yl)coumarin (1b) [26]: Yield 37%; mp 175-176 oC. 1H
NMR(300MHz)(CDCl3): δ = 7.30 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.35 (m, 2H), 7.53 (m, 3H), 7.93
(s, 1H), 8.18 (d, J = 3.0 Hz, 1H). 13C NMR(300MHz)(CDCl3): δ = 116.3, 119.4, 122.6,
124.5, 125.6, 126.0, 126.2, 127.7, 131.1, 134.3, 137.2, 152.8, 160.0. EI-MS (m/z): 229
[M + 1]+, 228[M+]. Anal. Calcd. for C13H8O2S: C 68.40, H 3.53; Found: C68.50, H 3.6.
4.2.4. 3-(Indol-3-yl)coumarin (1c): Yield 33%; mp 190-191 oC. 1H
NMR(300MHz)(CDCl3): δ = 7.32 (m, 3H), 7.48 (m, 2H), 7.58 (dd, J = 7.6; 1.3 Hz, 1H),
7.98 (m, 1H); 8.16 (s, 1H), 8.20 (d, J = 2.6 Hz, 1H), 8.65 (br; 1H). 13C
NMR(300MHz)(CDCl3): δ = 111.9, 116.3, 119.5, 120.2, 120.9, 122.7, 122.9, 124.4,
125.5, 127.2, 127.6, 130.1, 134.9, 136.2, 143.5, 152.2, 160.8. EI-MS (m/z): 262 [M +
1]+, 261[M+]. Anal. Calcd. for C17H11NO2: C 78.15, H 4.24; Found: C78.20, H 4.30.
4.2.5. 7-Methoxy-3-(thiophen-2-yl)coumarin (2a) [27]: Yield 27%; mp 155-156 oC. 1H
NMR(300MHz)(CDCl3): δ = 3.89 (s, 3H), 6.85 (s, 1H), 6.88 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.11
(m, 1H), 7.38 (dd, J = 4.0; 1.0 Hz, 1H), 7.45 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.74 (dd, J = 4.0; 1.0
Hz, 1H), 7.96 (s, 1H). 13C NMR(300MHz)(CDCl3): δ = 55.8, 100.4, 112.9, 113.1,
126.1, 126.5, 126.8, 127.4, 128.7, 136.0, 136.4, 154.5, 161.0, 162.5. EI-MS (m/z): 259
[M + 1]+, 258[M+]. Anal. Calcd. for C14H10O3S: C 65.10, H 3.90; Found: C65.17, H
3.96.
4.2.6. 7-Methoxy-3-(thiophen-3-yl)coumarin (2b): Yield 25%; mp 168-169 oC. 1H
NMR(300MHz)(CDCl3): δ = 3.87 (s, 3H), 6.85 (m, 2H), 7.36 (dd, J = 5.0; 3.0 Hz, 1H),
7.42 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.50 (dd, J = 5.0; 1.2 Hz, 1H), 7.87 (s, 1H), 8.11(dd, J = 3.0;
1.2 Hz, 1H). 13C NMR(300MHz)(CDCl3): δ = 55.7, 100.3, 112.8, 113.0, 119.3, 125.0,
125.5, 126.0, 128.6, 134.6, 137.5, 154.6, 160.8, 162.4. EI-MS (m/z): 259 [M + 1]+,
258[M+]. Anal. Calcd. for C14H10O3S: C 65.10, H 3.90; Found: C65.15, H 3.97.
4.2.7. 3-(Indol-3-yl)-7-methoxycoumarin (2c): Yield 29%; mp 185-186 oC. 1H
NMR(300MHz)(CDCl3): δ = 3.95 (s, 3H), 6.89 (m, 2H), 7.28 (m, 2H), 7.47 (m, 2H),
7.95 (m, 1H), 8.10 (s, 1H), 8.13 (d, J = 3.0 Hz, 1H), 8.57 (br, 1H). 13C
NMR(300MHz)(CDCl3): δ = 55.7, 100.3, 100.0, 111.7, 112.6, 113.6, 119.4, 119.5,
120.6, 122.5, 126.0, 126.8, 128.1, 135.5, 136.2, 153.8, 161.1, 161.6. EI-MS (m/z): 292
[M + 1]+, 291[M+]. Anal. Calcd. for C18H13NO3: C 74.22, H 4.50; Found: C74.29, H
4.56.
4.2.8. 6-Methoxy-3-(thiophen-2-yl)coumarin (3a): Yield 47%; mp 150-151 oC. 1H
NMR(300MHz)(CDCl3): δ = 3.85 (s, 3H), 6.96 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 7.09 (m, 2H), 7.27
(d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.42 (dd, J = 5.1; 1.0 Hz, 1H), 7.79 (dd, J = 3.7; 1.0 Hz, 1H), 7.94
(s, 1H). 13C NMR(300MHz)(CDCl3): δ = 55.7, 109.4, 117.3, 119.0, 119.6, 121.9, 127.0,
127.5, 127.7, 135.2, 135.9, 147.1, 156.2, 161.1. EI-MS (m/z): 259 [M + 1]+, 258[M+].
Anal. Calcd. for C14H10O3S: C 65.10, H 3.90; Found: C65.15, H 3.94.
4.2.9. 6-Methoxy-3-(thiophen-3-yl)coumarin (3b): Yield 43%. mp 164-165 oC. 1H
NMR(300MHz)(CDCl3): δ = 3.84 (s, 3H), 6.95 (d, J = 3.0 Hz, 1H), 7.06 (dd, J = 9.0;
3.0 Hz, 1H), 7.25 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.37 (dd, J = 5.1; 3.0 Hz, 1H), 7.50 (dd, J = 5.1;
1.3 Hz, 1H), 7.86 (s, 1H), 8.18 (dd, J = 3.0; 1.3 Hz, 1H). 13C NMR(300MHz)(CDCl3): δ
= 55.7, 109.6, 117.2, 118.9, 119.7, 122.8, 125.6, 126.0, 126.1, 134.3, 136.9, 147.2,
156.0, 160.1. EI-MS (m/z): 259 [M + 1]+, 258[M+]. Anal. Calcd. for C14H10O3S: C
65.10, H 3.90; Found: C65.20, H 3.99.
4.2.10. 3-(Indol-3-yl)-6-methoxycoumarin (3c): Yield 38%; mp 188-189 oC. 1H
NMR(300MHz)(CDCl3): δ = 3.84 (s, 3H), 5.87 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 6.93 (d, J = 2.8 Hz,
1H), 7.04 (dd, J = 9.0; 2.8 Hz, 1H), 7.30 (m, 3H), 7.79 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 8.01 (s, 1H),
8.27 (s, 1H), 8.30 (br, 1H). 13C NMR(300MHz)(CDCl3): δ = 55.7, 109.3, 112.6, 115.4,
117.2, 118.7, 119.3, 119.8, 122.7, 124.6, 125.7, 127.3, 135.9, 137.0, 146.7, 150.8,
156.1, 160.5. EI-MS (m/z): 292 [M + 1]+, 291[M+]. Anal. Calcd. for C18H13NO3: C
74.22, H 4.50; Found: C74.30, H 4.52.
4.2.11. 5,7-Dimethoxy-3-(thiophen-2-yl)coumarin (4a): Yield 45%; mp 177-178 oC. 1H
NMR(300MHz)(CDCl3): δ = 3.86 (s, 3H), 3.93 (s, 3H), 6.31 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 6.46
(d, J = 2.1 Hz, 1H), 7.10 (dd, J = 5.0; 3.6 Hz, 1H), 7.36 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 7.72 (d, J =
3.6 Hz, 1H), 8.29 (s, 1H). 13C NMR(300MHz)(CDCl3): δ = 55.6, 56.0, 92.4, 95.1,
126.5, 127.1, 127.3, 127.5, 131.5, 136.9, 153.2, 155.3, 156.9, 160.0, 163.4. EI-MS
(m/z): 289 [M + 1]+, 288[M+]. Anal. Calcd. for C15H12O4S: C 62.49, H 4.20; Found:
C62.55, H 4.27.
4.2.12. 5,7-Dimethoxy-3-(thiophen-3-yl)coumarin (4b): Yield 35%; mp 158-159 oC. 1H
NMR(300MHz)(CDCl3): δ = 3.85 (s, 3H), 3.90 (s, 3H), 6.28 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 6.42
(d, J = 1.8 Hz, 1H), 7.35 (dd, J = 4.8; 2.5 Hz, 1H), 7.52 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 8.10 (d, J =
2.5 Hz, 1H), 8.20 (s, 1H). 13C NMR(300MHz)(CDCl3): δ = 55.6, 55.8, 92.2, 94.8,
104.3, 117.3, 124.4, 125.2, 126.1, 132.7, 135.0, 155.3, 156.8, 160.4, 163.2. EI-MS
(m/z): 289 [M + 1]+, 288[M+]. Anal. Calcd. for C15H12O4S: C 62.49, H 4.20; Found:
C62.53, H 4.24.
4.2.13. 5,7-Dimethoxy-3-(indol-3-yl)coumarin (4c): Yield 43%; mp 179-180 oC. 1H
NMR(300MHz)(CDCl3): δ = 3.88 (s, 3H), 3.95 (s, 3H), 5.68 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 6.33
(d, J = 2.0 Hz, 1H), 6.48 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.33 (m, 2H), 7.89 (dd, J = 7.2; 1.2 Hz,
1H), 8.17 (s, 1H), 8.33 (dd, J = 7.0; 1.2 Hz, 1H), 8.48 (br, 1H). 13C
NMR(300MHz)(CDCl3): δ = 55.8, 56.0, 92.3, 95.0, 104.6, 113.6, 115.3, 115.8, 119.6,
122.6, 124.5, 127.6, 133.3, 136.0, 151.0, 155.0, 156.8, 161.1, 163.2. EI-MS (m/z): 322
[M + 1]+, 321[M+]. Anal. Calcd. for C19H15NO4: C 71.02, H 4.71; Found: C 71.10, H
4.77.
4.3. Determination of MAO isoforms activity
The effects of the new synthesized compounds on hMAO isoform enzymatic activity
were evaluated by a fluorimetric method following the experimental protocol previously
described by us [15].
Briefly, 0.1 mL of sodium phosphate buffer (0.05 M, pH 7.4) containing the test drugs
(new compounds or reference inhibitors) in various concentrations and adequate
amounts of recombinant hMAO-A or hMAO-B required and adjusted to obtain in our
experimental conditions the same reaction velocity, (hMAO-A: 1.1 μg protein; specific
activity: 150 nmol of p-tyramine oxidized to p-hydroxyphenylacetaldehyde/min/mg
protein; hMAO-B: 7.5 μg protein; specific activity: 22 nmol of p-tyramine
transformed/min/mg protein) were incubated for 15 min at 37 ºC in a flat-black-bottom
96-well microtest™ plate, placed in the dark fluorimeter chamber. After this incubation
period, the reaction was started by adding (final concentrations) 200 μM Amplex® Red
reagent, 1 U/mL horseradish peroxidase and 1 mM p-tyramine. The production of H2O2
and, consequently, of resorufin was quantified at 37 °C in a multidetection microplate
fluorescence reader (FLX800TM, Bio-Tek® Instruments, Inc., Winooski, VT, USA)
based on the fluorescence generated (excitation, 545 nm, emission, 590 nm) over a 15
min period, in which the fluorescence increased linearly.
Control experiments were carried out simultaneously by replacing the test drugs (new
compounds and reference inhibitors) with appropriate dilutions of the vehicles. In
addition, the possible capacity of the above test drugs to modify the fluorescence
generated in the reaction mixture due to non-enzymatic inhibition (e.g., for directly
reacting with Amplex® Red reagent) was determined by adding these drugs to solutions
containing only the Amplex® Red reagent in a sodium phosphate buffer.
The specific fluorescence emission (used to obtain the final results) was calculated after
subtraction of the background activity, which was determined from vials containing all
components except the hMAO isoforms, which were replaced by a sodium phosphate
buffer solution.
4.4. Ligand docking
All docking calculations were performed with Maestro 9.0 package [28]. The crystal
structure of hMAO-B was prepared for docking with the Protein Preparation Wizard
workflow of Maestro that allows adding hydrogens which were subsequently minimized
with OPLS_2005 force field, and also optimize the protonation state of His residues and
the orientation of hydroxyl groups, Asn residues, and Gln residues. The docking was
performed by means of the Schrödinger program Glide [29], treating the ligands with a
fully flexible all-atom representation, and the receptor with a rigid grid depiction. The
grid was generated applying a van der Waals radii scaling factor of 1.00 with a partial
charge cut-off of less than 0.25e. The co-crystal ligand was used to center docking box
with a size capable of accommodating ligands with a length of ≤ 20Å. Before docking
calculations, all the compounds were subjected to ligand preparation with the LigPrep
tool of Maestro [28]. Different protonation states using a pH value of 7.0 ± 2.0 and
tautomers were generated. The docking calculations were performed with Glide extra
precision (XP) mode. A post-docking minimization was made on the output complexes
in order to reduce the initial 25 poses per ligand to 5.
Acknowledgments.
This work was supported by grants from Xunta de Galicia (Spain;
INCITE08PXIB203022PR), University of Cagliari (ex 60% 2009), Fondazione Banco
Sardegna 2007 and MIUR 2008.
E. Quezada thanks for a postdoctoral grant from FCT (Portugal). G. Ferino is grateful to
Regione Autonoma della Sardegna for a Master & Back scholarship and to S. Vilar for
helpul suggestions on the docking experiments. Technical support from Red Gallega de
Boinformatica and Centro de Supercomputacion de Galicia (CESGA) is gratefully
acknowledged.
References
[1] M. Reyes-Parada, A. Fierro, A.P. Iturriaga-Vasquez, B.K. Casseis, Curr. Enzyme
Inhib. 1 (2005) 85-95.
[2] J. Grimsby, N.C. Lan, R. Neve, K. Chen, J.C. Shih, J. Neurochem. 55 (1990) 1166-
1169.
[3] S.E. Rigby, J. Basran, J.P. Combe, A.W. Mohsen, H. Toogood, A. van Thiel, M.J.
Sutcliffe, D. Leys, A.W. Munro, N.S. Scrutton, Biochem. Soc. Trans. 33 (2005)
(part 4) 754-757.
[4] D.E. Edmondson, A. Mattevi, C. Binda, M. Li, F. Hubalek, Curr. Med. Chem. 11
(2004) 1983-1993.
[5] J.J. Chen, D.M. Swope, K. Dashtipour, Clin. Ther. 29 (2007) 1825-1849.
[6] P. Pacher, V. Kecskeméti, Curr. Med. Chem. 11 (2004) 925-943.
[7] C. Binda, P. Newton-Winson, F. Hubálek, D.E. Edmonson, A. Mattevi, Nat. Struct.
Biol. 9 (2002) 22-26 Data deposition. www.pdb.org (PDB ID code 1GOS).
[8] C. Binda, J. Wang, L. Pisani, C. Caccia, A. Carotti, P. Salvati, D.E. Edmondson, A.
Mattevi, J. Med.Chem. 50 (2007) 5848-5852.
[9] C. Gnerre, M. Catto, F. Leonetti, P. Weber, P.A. Carrupt, C. Altomare, A. Carotti,
B. Testa, J. Med. Chem. 43 (2000) 4747-4758.
[10] F. Chimenti, D. Secci, A. Bolasco, P. Chimenti, A. Granese, O. Befani, P. Turini,
S. Alcaro, F. Ortuso, Bioorg. Med. Chem. Lett. 14 (2004) 3697-3703.
[11] S. P. Kamat, S. K. Paknikar, P.S. Beaucahmp, J. Chem. Res. (S) (2002) 242-246.
[12] N. Hans, M. Singhi, V. Sharma, S. K. Grover, Indian J. Chem. 35B (1996) 1159–
1162.
[13] W. H. Perkin, J. Chem. Soc. 21 (1868) 53–63.
[14] W. H. Perkin, J. Chem. Soc. 31 (1877) 388–427.
[15] L. Santana, H. González-Díaz, E. Quezada, E. Uriarte, M. Yañez, D. Viña, F.
Orallo, J. Med. Chem. 51 (2008) 6740-6751.
[16] H.M. Berman, J. Westbrook, Z. Feng, G. Gilliland, T.N. Bhat, H. Weissig, I.N.
Shindyalov, P.E. Bourne, Nucleic Acids Res. 28 (2000) 235-242.
[17] D. Tarasov, D. Tovbin, J. Mol. Model. 15 (2009) 329-341.
[18] S. Vilar, G. Cozza, S. Moro, Curr. Top. Med. Chem. 8 (2008) 1555-1572.
[19] S. Vilar, J. Karpiak, S. Costanzi, J. Comput. Chem. 31 (2010) 707-720.
[20] G.L. Warren, C.W. Andrews, A.M. Capelli, B. Clarke, J. Lalonde, M.H. Lambert,
M. Lindvall, N. Nevins, S.F. Semus, S. Senger, G. Tedesco, I.D. Wall, J.M.
Woolven, C.E. Peishoff, M.S. Head, J. Med. Chem. 49 (2006) 5912-5931.
[21] S. Costanzi, I.G. Tikhonova, M. Ohno, E.J. Roh, B.V. Joshi, A.O. Colson, D.
Houston, S. Maddileti, T.K. Harden, K.A. Jacobson, J. Med. Chem. 50 (2007)
3229-3241.
[22] J.J. Irwin, B.K. Shoichet, ZINC - A free database of commercially available
compounds for virtual screening. J. Chem. Inf. Model. 45 (2005) 177-182.
[23] A.P. Bradley, Pattern Recognit. 30 (1997) 1145-1159.
[24] J.A. Hanley, B.J. Mcneil, Radiology 143 (1982) 29-36.
[25] B.J. Mcneil, J.A. Hanley, Med. Decis. Making 4 (1984) 137-150.
[26] Y. Ming, D. W. Boykin, Heterocycles 26 (1987) 3229-31.
[27] R. R. Roberts, J. G. Bentsen, Y. Li, U.S. Pat. Appl. Publ. (2004) US 2004062930.
[28] Maestro version 9.0; Schrödinger, LLC: New York, NY (2009).
[29] Glide version 5.5; Schrödinger, LLC: New York, NY (2009).
+O
H
OHR4
OHO
O O
R4R2
R1
R3
R2
R1
R3
1 R1 = R2 = R3 = H2 R1 =OCH3; R2 = R3 = H3 R2 = OCH3; R1 = R3 = H4 R1 = R3 = OCH3; R2 = H
a R4 =
b R4 =
c R4 =
S
S
NH
1a R1 = R2 = R3 = H; R4 =
1b R1 = R2 = R3 = H; R4 =
1c R1 = R2 = R3 = H; R4 =
S
S
NH
2a R1 =OCH3; R2 = R3 = H; R4 =
2b R1 =OCH3; R2 = R3 = H; R4 =
2c R1 =OCH3; R2 = R3 = H; R4 =
S
S
NH
3a R2 = OCH3; R1 = R3 = H; R4 =
3b R2 = OCH3; R1 = R3 = H; R4 =
3c R2 = OCH3; R1 = R3 = H; R4 =
S
S
NH
4a R1 = R3 = OCH3; R2 = H; R4 =
4b R1 = R3 = OCH3; R2 = H; R4 =
4c R1 = R3 = OCH3; R2 = H; R4 =
S
S
NH
a)
Scheme 1. Reagents and conditions: a) DCC/DMSO 110oC, 24-48 h.
Figure 1. ROC curve relative to synthesized coumarins and 120 ZINC decoys
Table 1. IC50 values and MAO-B selectivity ratios [IC50 (MAO-A)]/[IC50 (MAO-B)] for the inhibitory effects of test drugs (new compounds and reference inhibitors) on the enzymatic activity of human recombinant MAO isoforms expressed in baculovirus infected BTI insect cells.
Each IC50 value is the mean ± S.E.M. from five experiments (n = 5). Level of statistical significance: aP < 0.01 versus the corresponding IC50 values obtained against MAO-B, as determined by ANOVA/Dunnett´s. b Values obtained under the assumption that the corresponding IC50 against MAO-A is the highest concentration tested (100 µM or 1mM). ** Inactive at 100 µM (highest concentration tested). At higher concentrations the compounds precipitate. SI: hMAO-B selectivity index = IC50 (hMAO-A) /IC50 (hMAO-B).
DRUG MAO-A (IC50) MAO-B (IC50) SI
1a ** 6.37 ± 0.43 µM > 15b
1b ** 13.3 ± 0.89 µM > 7.5b
1c ** 1.92 ± 0.13 µM > 52b
2a ** 262.95 ± 17.61 nM >380b
2b 4.16 ± 0.28 µMa 55.63 ± 3.73 nM > 75
2c 9.67 ± 0.65 µMa 45.95 ± 3.08 nM > 210
3a ** 633.55 ± 42.43 nM > 158b
3b ** 233.73 ± 15.65 nM > 428b
3c ** ** ---
4a ** ** ---
4b ** ** ---
4c ** ** ---
R-(-)-deprenyl 67.25 ± 1.02 µMa 14.80 ± 0.99 nM 4,544
Iproniazide 6.56 ± 0.76 µM 7.54 ± 0.36 µM 0.87
Table 2. Comparison between experimental activity and predicted scoring function
against MAO-B
Docking Ranka Drug IC50 b Doking scorec
1 4c ** -8.4274 2 2a 0.2630 -8.1976 3 2c 0.0459 -7.9367 4 3a 0.6335 -7.9025 5 2b 0.0556 -7.8267 6 3b 0.2337 -7.5740 7 1c 1.9200 -7.5170 8 1b 13.3000 -7.4479 9 3c ** -7.2776 10 1a 6.3700 -6.4593 11 4b ** -5.3446 12 4a ** -5.1865
a Docking rank taking into account the study coumarins compounds; b expressed in µM; c expressed in kJ/mol. ** Inactive at 100 µM (highest concentration tested). At higher concentrations the compounds precipitate.