Tipificacin VPH PCRtrResultados en medio privado

Dr. Jos de J. Curiel ValdsAnatomopatlogo

Patlogo ClnicoColposcopista

Academia Mexicana de Ciruga

Evolucin en la deteccin del Cncer de Crvix

ThinPrep SurePath

1996 19991949

LBC: Citologa lquida

2003

Revisin de las pautas de screening

1990s LBC 2000sTest de Papanicolau

VHP 99,7% Cnceres de Crvix1

1Walboomers et al., Journal of Pathology 189:12-19,1999 ( Modificado )

PCR

1980

P16 CINTecCervatec p16 ELISA

L1Ag CytoactivONCOTEC mRNA E6/E7Screening 1 basado en

DNA HPV

HC-2 / H VentanaAmplicor* RocheDNA Invader* WD

2008PREVENCION PRIMARIA

ESCENARIO POSTVACUNAL

Prevencin SecundariaProg. Base PoblacionalFinlandia 1963-2008

Meisels and Fortin 1976Purola and Savia 1977Coilocito / Efecto citopatico HPV

Drst et al. 1983

1.- Estudio de Papanicolaou citologa cervical.

2.- Colposcopa

3.- Biopsia Estndar de

4.- Pruebas moleculares

Cmo se si lo tengo?Cmo se diagnostica?

FORMA TRADICIONAL

FORMA MODERNAMAS SEGURA

BASE LIQUIDA

Es el mtodo de deteccin recomendado Se considera en NIC 1 poco sensible y especfica. Solo es positiva por definicin si existe una fase

productiva. NIC 2 y 3 es mas sensible y especfica. En base lquida sube la sensibilidad y especificidad. Es estndar para medir esta sensibilidad y

especificidad ha sido la biopsia.

Citologa

Indicada cuando existe una citologa anormal

Usada de rutina y en personas de 20 a 30 aos es causa de sobre diagnstico

Imgenes en mosaico de diversos tipos, relieves, patrn de vasos etc.

Algunos muy caractersticos.

Siempre requiere de biopsia que lo corrobore.

Colposcopa

2.- Colposcopa

3.- Biopsia Estndar de Oro (?)

4.- Pruebas moleculares

Cmo se si lo tengo?Cmo se diagnostica?

NORMAL

VIRUS

ALGUNAS IMGENES COLPOSCPICAS Y SU CORRELACIN HISTOLGICA

FinoMetaplasia Madura

Metaplasia InmaduraRara vez NIC

DensoNIC Alto Grado

Liso

FinoMetaplasia Maduracon paraqueratosis

GruesoNIC Alto Grado

a Carcinoma Invasor

Mosaico

FinoNIC I

GruesoNIC II y III

Punteado

Metaplasia queratinizante

Siempre ver quehay por debajo

Leucoplasia

Aceto Blanco

1.- Estudio de

2.- Colposcopa

3.- Biopsia Estndar de Oro (?)

4.- Pruebas mol

Cmo se si lo tengo?Cmo se diagnostica?

NORMAL

VIRUS

TODAS LESIONES ACETOBLANCAS

NINFLAMATORIO/REACTIVO

O SUGESTIVO DE VPH NIC 1 NIC2 NIC 3 CARCINOMA

H.E 460 R /S 128 296 28 5 3

NEGATIVO 46.3 %POSITIVO

53.7 % DE + A +++ NUCLEAR O CITOPLASM

P16 460 213 212 20 12 3

P16 VS HISTOLOGA

Curiel-Valds Rev Mex de enf del Tr Gen inf 2008

Valor Predictivo positivo: VP(+) = 0.5650

Valor Predictivo Negativo: VP(-) = 0.5986

Sensibilidad: Se = 0.7540

Especificidad: Es = 0.3872

ESTADSTICA ENTRE H.E. Y P16

Curiel-Valds Rev Mex de enf del Tr Gen inf 2008

CONCORDANCIA INTEROBSERVADOR EXPERTOS

CONCORDANCIA INTEROBSERVADORCON H.E Y P16

NORMAL L. No Dx NIC 1 NIC 2 NIC 3 CARCINOMA TOTAL CONCORDANCIA

NORMAL 71% 3% 52% 35% 72% 94% 3800 71%

P 16 94% * 91% 100% 99% 100% 96%

KLAES AM. J. SURG PATH. NOV 2002

NIC DE 40 A 97 %

FRAG 1 NIC 1

FRAG 2 NIC 2

100 % OBJETIVO

PATOLOGOSMEXICANOS

POSITIVO FOCAL

POSITIVO DIFUSOCuriel-Valds Rev Mex de G y obstet 2008

No todo lo que parece es!!!

UNIVERSO POSIBLE A ESTUDIAR

80-90% < 25 aos~20 % > 30 aos

40-50% < 25 aos~20 % 30 aos

30 aos

A quienes seleccionar

UNIVERSO CON ENFERMEDAD GRAVENUESTRO OBJETIVO A ENCONTRAR

P16

PCR Y CH II

A quienes seleccionar

J.J.C.V.

PORTADOR

Debemos situar de manera segura a nuestra paciente en este esquema

antes de cualquier tratamiento

METAPLASIAS

HS

Espectros molecular y visiblepara diagnstico de VPH

DETECTAR LAS INFECCIONES PERSISTENTES PREDOMINATEMENTE POR VIRUS DE ALTO RIESGO

DEFINICIN DE ALTO RIESGO POR BIOLOGA MOLECULAR Y DATOS

EPIDEMIOLGICOS. CASOS CON Dx HISTOLGICO DE CNCER Y NIC

META

PCR CH2 OTROS

Inmunohistoqumica: P16 L 1 DE Cpsula otros

METODOS MOLECULARES

PRODUCTIVA: L1 Y L2 TRANSFORMANTE: E6 (P53) Y E7 (gRb) (ONCOGNICA)

AMBAS EN TRES ETAPAS CLNICAS PORTADOR SANO INFECCIN SUBCLNICA INFECCIN CLNICA

INFECCION POR VPHDOS MODALIDADES

TRES ETAPAS

Deteccin

Como riesgo

Enfermedad

Diagnstico yCapacidad de progresin

Estudio citolgico

Sensibilidad medianaEspecificidad alta

Colposcopa

Sensibilidad altaEspecificidad baja

Biopsia

Sensibilidad alta Especificidad mediana a alta

Clnico GineclogoColposcopista

Colposcopa y Toma de muestras

AnatomopatlogoCitopatlogo

Interpretacin y diagnstico

Patlogo

Deteccin a confirmacin

Donde est el Patlogo en el diagnstico del VPH

EPIDEMIOLOGIADETECCION: Presencia de VPH como mtodo primario de tamizaje antes de citologa

CONFIRMACION DE DX ?

SEGUIMIENTO DESPUS DE TRATAMIENTO

CURIOSIDAD (POSITIVO EN LA PAREJA) USO EN HOMBRES (?) EN TEJIDOS FRESCO Y PARAFINA

Involucrados: Bilogos molecularesAnatomopatlogos Patlogos Clnicos, Qumicos

Para que se usan las pruebas moleculares

EVOLUCIN DE VIRUS PRESENTE A VIRUS TRANSFORMANTE

HPV Prevalence and Cervical Cancer Incidence by Age

15-19

20-24

25-29

30-34

35-39

40-44

45-49

50-54

55-59

60-65

Age (Years)

HPV

Pre

vale

nce

(%) HPV (HC2)

Cancer

1. Sellors JW, et al. CMAJ, 2000;163:503. Ries, et al. 2000 SEER Cancer Stats NCI, 1973-1997. Sellors JW, et al. CMAJ, 2002;167:871.

0

5

10

15

20

25

30

0

5

10

15

20

25

30

Canc

er in

cide

nce

per 1

00,0

00

Porque? Involucionan o evolucionan

Ciclo viral productivo y transformante

Replicacin, y electroforesis con comparacin de un codigo de barras contra controles ya establecidos.

No es absoluta la comparacin, similitud de un % decreciente 95 % virus de alto riesgo 89 % virus de bajo riesgo 70 Virus de alto riesgo.

PCR secuencial o de punto final

Los tipos pueden variar dentro de los grupos ya que se parecen molecularmente

Como un mtodo de Dx epidemiolgico.

Detecta desde portadores y enfermedad transitoria hasta enfermos

No distingue fase productiva o transformante

Selecciona a quienes vigilar de los 30 aos en adelante.

PCR de punto finalIndicaciones de uso

Hibridacin ADN/ARN. Cctel de sondas:

- Alto riesgo: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y 68.

- Bajo riesgo: 6, 11, 42, 43 y 44. Sensibilidad adecuada a procesos de

tamizaje de VPH (1 pg/mL). Aprobado por la FDA. Posibilidad de semicuantificar. Estandarizada y automatizable.

(Poljak et al. J Clin Virol 2002; 25: S89-97.)

Deteccin del VPH mediante amplificacin de la seal. Tecnologa de captura de hbridos (HC2)

Al ser menos sensible a travs de estudio se ha comprobado que detecta a los mas capaces de inducir neoplasia.

Factor pronstico de progresin.

Aprobado por FDA

Posteriormente su fuerza especificidad de no LAG o CaCu

CAPTURA DE HIBRIDOS TRADUCCION CLINICA

Una prueba negativa de CH2 no significa que no se tenga virus

El mtodo ha sido estandarizado de manera que las unidades relativas de luz detectadas se compararon con la evolucin a Ca Cu

Se requiere un nmero relativamente elevado de copias para que sea oncognico

Por ello es que se requiere realizar la prueba cada 3 aos

CAPTURA DE HIBRIDOS TRADUCCION CLINICA

El mismo mtodo para subir la temperatura y desdoblar la cadena de DNA

Ciclos con temperatura controlada con sustratos que emiten luz

Medida a diferentes temperatura y diferentes colores para los tipos especficos de virus

El proceso dura unas horas y se realiza en una termociclador programado que lee EN TIEMPO INMEDIATO (REAL) la progresin de la replicacin viral.

PRC en tiempo real

Deteccin segura del tipo viral: la lectura de la electroforesis es dependiente de la calidad de la electroforesis, en PCR TR esta dada por la temperatura de unin y el color en cada ciclo

Deteccin de enfermedades mixtas (varios tipos virales) PCR de punto final el tipo que predomina inhibe a los otros y no se detectan.

Tiempo de proceso: el mismo da (se requieren cuando menos 16 muestras por corrida) PCR tradicional mnimo 10 das

Costo: es semejante

PRC en tiempo realVentajas sobre PCR de punto final

Mtodo de tamizaje Es mas senisble que el estudio citolgico (pero es mas caro) Si se realiza de manera simultnea obliga a revisar la

citologa de manera mas minuciosa, evita falsos negativos sobre todo el LAG

Detecta mas mujeres en riesgo sin enfermedad (CCV detecta solo las que tienen enfermedad)

CH2 y PCR tiempo real FUTURO

Es preferible hacer colposcopa y tomar biopsia. La Positividad de PCR, CH2 no indica necesariamente

NIC, puede ser metaplasia atpica o inmadura con virus en reposo.

En EU la colposcopa y la biopsia son mucho mas caras que una prueba de PCR o CH2.

Si sale positiva en EU ya se manda a Colposcopa y biopsia.

En ASC US o H en Mxico

PCR tr REPORTE

Detalles de informe

Controles detalles

PCRtr permite la cuantificacin de los virus y ello permitehacer una homologa con CH2 ya que esta no significa queen realidad no se tenga VPH

Reporte grfica

Ejemplos de infeccin mixta

Ejemplos de infeccin mixta

Ejemplos de infeccin mixta

Se realizaron 1234 estudios de PCRtr para determinar la presencia y en su caso, el genotipo de VPH

3 aos (2013-2015) en pacientes atendidos en nuestra clnica de patologa.

En el 98% de las determinaciones se realizaron en mujeres (cervicales), el resto en hombres (no cervicales).

El promedio de la edad global fue de 33.74+9.39 aos, con un rango de los 11 a los 83 aos de edad. La edad en relacin al sexo no fue diferente (p>0.05), sin embargo, la edad de los hombres fue 3 aos mayor a la edad de las mujeres (36.9+11.91 vs 33.5+9.0).

El 36.2% de las muestras realizadas pertenecan a personas menores de 30 aos

Deteccin de tipo viral en medio privado D.F. 2.5 aos

Estudio estadstico

Se determin media y desviacin estndar, frecuencias y porcentajes.

Se aplicaron las pruebas de Kolmogorov-Smirnov, T de Student, ANOVA y Chi cuadrada.

Se calcularon los parmetros de prueba diagnstica con un intervalo de confianza del 95%.

El anlisis se realiz con el programa SPSSv19 y con el programa Epidat3.1.

Se tom como significancia estadstica un valor de p

Resultados

Tabla 1. Intervalos de la edad de las personas evaluadas con la tcnica de PCR

Frecuencia

Porcentaje vlido

Intervalos de edad (aos)

11-18

10

0,8

19-25

206

17,0

26-33

472

39,0

34-43

365

30,2

44-53

106

8,8

54-63

41

3,4

64-73

8

0,7

74-83

2

0,2

Total

1210

100,0

PCR en relacin al sexo

Tabla 2. Relacin del resultado de la PCR y el sexo.

P=0.17

pcr

Total

pos

neg

Sexo

mujeres

442

657

1099

40,2%

59,8%

100,0%

hombres

12

11

23

52,2%

47,8%

100,0%

Total

454

668

1122

40,5%

59,5%

100,0%

Tabla 3. Asociacin del resultado de la PCR de acuerdo a los intervalos de edad.

P=0.001

pcr

Total

pos

neg

edad cat1

11-18

4

6

10

0,9%

0,8%

0,8%

19-25

104

102

206

23,3%

13,4%

17,0%

26-33

175

297

472

39,1%

38,9%

39,0%

34-43

116

249

365

26,0%

32,6%

30,2%

44-53

30

76

106

6,7%

10,0%

8,8%

54-63

16

25

41

3,6%

3,3%

3,4%

64-73

2

6

8

,4%

,8%

,7%

74-83

0

2

2

,0%

,3%

,2%

Total

447

763

1210

100,0%

100,0%

100,0%

05

10152025303540

11 a 25aos

26 a 33 34 a 43 44 a 53 54 a 83

PositivosNegativosColumna1

PCR y citologa

*

* Otros virus no comprendidos en los 28 de la prueba

Tabla 4. Relacin entre el resultado de la PCR y del PAP.

P=0.0001

pcr

Total

pos

neg

papResul

Neg I y II

236

560

796

82,8%

99,5%

93,9%

ASCUS

16

0

16

5,6%

,0%

1,9%

NIC

33

3

36

11,6%

,5%

4,2%

Total

285

563

848

100,0%

100,0%

100,0%

PCR y Biopsia

* Otros virus no comprendidos en los 28 de la prueba

Tabla 5. Relacin del resultado de la PCR con los resultados de la Biopsia.

P=0.43

pcr

Total

positivo

negativo

BIOPSIA

Metaplasia

66

17

83

56,9%

68,0%

58,9%

NIC 1

38

4 *

42

32,8%

16,0%

29,8%

NIC2

3

0

3

1,7%

,0%

1.7%

NIC3

2

0

2

1,7%

,0%

1,4%

No cervical

8

3

11

6,9%

12,0%

7,8%

Total

116

25

141

100,0%

100,0%

100,0%

Sensibilidad y especificidad de PCRtr

Tabla 6. Resultados de la PCR como prueba diagnstica tomando en cuenta a la biopsia como estndar de oro

Sensibilidad

(IC 95%)

Especificidad

(IC 95%)

VPP

(IC 95%)

VPN

(IC95%)

ndice de Validez

IC95%)

Prevalencia (IC95%)

PCR (n=141)

85.71%

(75.66-95.77)

20%

(10.91-29.09)

41.38%

(31.99-50.77)

68%

(47.71-88.29)

46.1%

(37.5-54.6)

39%

(31.29-48.15)

Los genotipos de AR se asociaron a la Citologa positiva (P=0.0001)

Los genotipos de bajo riesgo estn asociados tanto a Citologa como a la Biopsia positiva (P=0.0001)

En relacin a sexo, (mujer) (p=0.0001)

No hubo validez estadstica con la edad (p=0.035)

PCR de punto final dos etapas 1994 a 2004 2013

Positivos AR 76 43.6% 16 27 15.5 % 18 12 6.9% 31 7 4.0% 16 y 18 5 2.9%

Positivos BR 24 6 7 29% 11 5 20.8% 37 4 16.7%

PCR punto final o secuencia 2013174 casos Poblacin con E anormal

Pareja con PCRtr correlacin 80% Pareja con PCR tradicional 20%

En relacin a persistencia: Con PCR tradicional se opt por inicial tipificar y despus con

CH2. Haba cambios de tipo viral frecuente

Con PCRtr en infecciones mltiples se aprecia eliminacin de varios y se conservan algunos o es negativo en su totalidad.

Seguimiento y correlacin con la pareja

Mujer de 40 aos de edad con estudio citolgico anormal, LAG

Colposcopa normal, UEC en el orificio muy pequeo PCRtr positiva VPH 16 y 31 Cono diagnstico

Caso clnico 1

Cono diagnstico

PCR RT es una metodologa que se est usando en forma alterna y mas segura que CH2 y PCR de punto final

1.- Detecta infecciones mltiples 2.- El tipo viral detectados en el mas real 3.- Mismo costo 4.- Menos tiempo de proceso 5.- En ETS es mas segura y con un costo similar a los

dos cultivos.

Conclusin

Tipificacin VPH PCRtrResultados en medio privadoEvolucin en la deteccin del Cncer de CrvixCmo se si lo tengo?Cmo se diagnostica?CitologaColposcopaCmo se si lo tengo?Cmo se diagnostica?ALGUNAS IMGENES COLPOSCPICAS Y SU CORRELACIN HISTOLGICACmo se si lo tengo?Cmo se diagnostica?P16 VS HISTOLOGAESTADSTICA ENTRE H.E. Y P16CONCORDANCIA INTEROBSERVADOR EXPERTOSNmero de diapositiva 12No todo lo que parece es!!!Nmero de diapositiva 14A quienes seleccionarA quienes seleccionarNmero de diapositiva 17Espectros molecular y visiblepara diagnstico de VPHMETANmero de diapositiva 20METODOS MOLECULARESINFECCION POR VPHDOS MODALIDADESTRES ETAPASDonde est el Patlogo en el diagnstico del VPHPara que se usan las pruebas molecularesNmero de diapositiva 27Nmero de diapositiva 28Nmero de diapositiva 29Nmero de diapositiva 30Nmero de diapositiva 31HPV Prevalence and Cervical Cancer Incidence by AgeNmero de diapositiva 36Nmero de diapositiva 37Porque? Involucionan o evolucionanCiclo viral productivo y transformantePCR secuencial o de punto finalNmero de diapositiva 47Los tipos pueden variar dentro de los grupos ya que se parecen molecularmente PCR de punto finalIndicaciones de usoNmero de diapositiva 52CAPTURA DE HIBRIDOS TRADUCCION CLINICACAPTURA DE HIBRIDOS TRADUCCION CLINICAPRC en tiempo realPRC en tiempo realVentajas sobre PCR de punto finalCH2 y PCR tiempo real FUTURONmero de diapositiva 61En ASC US o H en MxicoPCR tr REPORTEDetalles de informeControles detallesReporte grficaEjemplos de infeccin mixtaEjemplos de infeccin mixtaEjemplos de infeccin mixtaDeteccin de tipo viral en medio privado D.F. 2.5 aosEstudio estadsticoResultadosPCR en relacin al sexoNmero de diapositiva 84Nmero de diapositiva 85PCR y citologaPCR y BiopsiaSensibilidad y especificidad de PCRtrNmero de diapositiva 89PCR de punto final dos etapas 1994 a 2004 2013PCR punto final o secuencia 2013174 casos Poblacin con E anormalSeguimiento y correlacin con la parejaCaso clnico 1Cono diagnsticoConclusin