TRABAJO PRACTICO Nº 3
ENZIMOINMUNOANALISIS
“ELISA”
Docentes encargados:Bioq. Natalia GuiñazúBioq. Maria Sol RennaBiol. Virginia AndreaniBioq. Mauricio FigueredoBioq. Vanina GarridoBioq. Laura Dulgerian
Interacción Antígeno-Anticuerpo
Naturaleza de la interacciónNo covalente
Reversible
Específica
Podemos diferenciar 3 etapasPrimaria
Secundaria
Terciaria
Primaria: Primer reconocimiento Ag-Ac
No visible
Rápida
Poco influenciada por Tº, electrolitos
Etapas de la interacción Ag-Ac
Ac
T. cruzi
Secundaria:Interacción de los complejos Ag-Ac
Visibles
Influenciados por Tº, electrolitos,viscosidad
Terciaria: Sólo ocurren in vivo
Fenómenos biológicos (Reacción de Arthus, efectos vasógenos)
AGLUTINACIÓN Y PRECIPITACIÓN
Trabajos prácticos Nº 1-2
Primaria: Primer reconocimiento Ag-Ac
No visible
Rápida
Poco influenciada por Tº, electrolitos
Etapas de la interacción Ag-Ac
Ac
T. cruziELISA
Trabajo práctico Nº 3
Inmunofluorescencia
Trabajo Práctico Nº4
Objetivo Trabajo Práctico Nº3
Evaluar la presencia de IgG específica para Bordetella pertussis y virus Rubeola
Determinar la concentración de IgG purificada
Determinar la composición de la IgG purificada por Western blot. Detección de cadena pesada γy µ.
¿Qué estrategias permiten detectar la reacción primaria Ag-Ac in vitro?
Como en el medio reaccionan antígenos y anticuerpos entonces puedo detectar la reacción marcando el antígeno o
el anticuerpo?????
Yuhu!!!!!!!!
El Ag o el Ac se marcan covalentementecon distintas sustancias
Radioactivas Radioinmunoanálisis
Enzimas Enzimoinmunoanálisis
Fluorocromos Inmunofluorescencia
Medición de radioactividad
Medición de color
Medición de fluorescencia
ELISA
Fundamento: Un anticuerpo conjugado con una enzima reacciona con un sustra-to sin color produciendo un producto coloreado
Permite la detección de Ag o Ac
Cualitativo, semicuantitativo y cuantitativo
Sensible y específico
Diferentes ELISA
Detección de anticuerpos específicos:
ELISA indirectoELISA doble sandwich
Detección de antígenos:
ELISA directo competitivoELISA sandwich
IgG especifica para el virus Rubeola
IgG totalcitoquinas
ELISA
Tres etapas comunes:
Sensibilización de la placa de ELISA
Incubación con la muestra problema
Revelado de la reacción Ag-Ac, mediante reacciones enzimáticas
Objetivo Trabajo Práctico Nº3
Evaluar la presencia de IgG específica para Bordetella pertussis y virus Rubeola
ELISA indirectoELISA indirecto
Determinar la concentración de IgG purificada
ELISA ELISA sandwichsandwich
ELISA indirectoELISA indirectoCómo determinamos la presencia de Acs
específicos?
Antígeno: Bordetella pertussis:
Homogeneizado del microorganismoProteínas purificadasProteínas recombinantes
1º paso inmovilización del antígeno a la fase sólida
Fase sólida:
Placas de ELISA (poliestireno o cloruro de polivinilo-PVC)
Alta capacidad de uniónBaja desorciónAlta transparencia
Tipos de unión:Covalente, tratamiento previo de la placa
No covalente interacción carga del antígeno
LAVADOS
Siempre entre paso y paso, debemos lavar la placa de ELISA para eliminar las moléculas que no interaccionan lo suficientemente fuerte.
Soluciones salinas tamponadas, como PBS mas detergente como Tween 20, se utilizan para lavar.
2º paso bloquear los sitios libres de unión
En la placa pueden quedar sitios libres que son ocupados por las proteínas presentes en la solución de bloqueo.
Solución de bloqueo, bufffer salino con proteínas que no reaccionan o interfieren en el sistema Ag-Ac.
Proteínas: Leche en polvoAlbúmina
3º paso incubación con la muestra problema y controles
Se diluyen las muestras en el líquido de bloqueo y se permite la interacción por un tiempo determinado.
OCURRE LA INTERACCIÓN PRIMARIA Ag-Ac
4º paso incubación con el conjugado enzimático
Ha ocurrido la interacción específica Ag-Ac que queremos detectar, pero no es visible.
Agrego un anticuerpo marcado con una enzima para detectar al anticuerpo (muestra problema) que está reaccionando.
5º paso revelado de la reacción
Revelamos la presencia de la reacción Ag-Ac mediante el empleo del sustrato de la enzima y un cromógeno que permita visualizar la reacción.
Paso 3, incubación con la muestra
IgG purificada por columna de afinidad
Alguno de estos anticuerpos reconoce específicamente a la Bordetella?
Paso 5, agregado del cromógeno y el sustrato
Determino la reacción por la medición de la densidad óptica
ELISA cuantitativos
ELISA sandwichELISA competitivo
¿Cómo logramos medir concentración?
Utilizando testigos de concentración conocida
En el práctico como determinamos la concentración de IgG......el testigo es una muestra con IgG de concentración conocida
.......si quisiera determinar concentración de TNFα ¿podría usar el mismo testigo que para IgG?
Práctico Nº3 Objetivo: “Medición de la concentración de
IgG purificada”
ELISA Sandwich
1º Sensibilización de la placa con anticuerpo anti-IgG y lavado
2º Bloqueo y lavado3º Incubación con la muestra problema y lavado4º Incubación con anti-IgG marcada con una enzima y
lavado5º Revelado
Paso 3, incubación con la muestra
IgG purificada por columna de afinidad
Que concentración de IgG obtuve??
Paso 5, agregado del cromógeno y el sustrato
Determino la reacción por la medición de la densidad óptica
¿Que controles se incluyen en el ELISA?
Controles NEGATIVOS de matriz similar a la matriz muestra problema que no reaccionan en el sistema
Controles POSITIVOS que contienen Ag o Ac a detectar
Blancos de reacción
SIEMPRE DA REACCIÓN SIEMPRE DA REACCIÓN NEGATIVANEGATIVA
SIEMPRE DA REACCIÓN SIEMPRE DA REACCIÓN POSITIVAPOSITIVA
Curva del testigo o standard
Solución de concentración conocida de IgG
Se realizan diluciones seriadas de conc. conocida
Se obtiene una curva de calibración dosis respuesta
Densidad Optica
Concentración de IgG
Por extrapolación de la DO obtenida en el problema se determina la concentración
DO MPDO MP
500 mg %
Cuales son las características de un testigo?
De concentración conocida
Estable en el tiempo
Reaccione específicamente en el sistema
Matriz similar a la muestra problema
Sistemas de detección más utilizadosEnzimas
PeroxidasaFosfatasa alcalina
Sitemas avidina-biotina/estreptavidina-peroxidasa
AglutinaciónAglutinación Precipitación Precipitación ELISAELISA RIARIA
Límite de Límite de detección (detección (ugug//mlml)) 0,3 10-50 0,01-0,0001 0,006-0,0006
CostoCosto + + +++ +++++
Complejidad del Complejidad del laboratoriolaboratorio - - ++ +++++
Descrita porDescrita por 1950Coombs
(hemagluti-nacion)
1897 R.Kraus1946 Oudin1947 Oucht.1965 Mancini
1960S.A. Berson
R. Yalow(Premio Nobel)
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