UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE ODONTOLOGÍA
CARRERA DE ODONTOLOGÍA
"ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA DEL EXTRACTO ACUOSO DE LA PLANTA
HIERBA MORA (SOLANUM NIGRUM) SOBRE CEPAS DE CÁNDIDA
ALBICANS ATCC®10231™”ESTUDIO IN VITRO
PROYECTO PREVIO A LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE
ODONTÓLOGA
AUTOR: MISHELLE CAROLINA CUASÉS TETAMUEZ
TUTOR: Dra. MARINA ANTONIA DONA VIDALE
QUITO, Mayo 2018
ii
© DERECHOS DE AUTOR
Yo, Mishelle Carolina Cuasés Tetamuez, en calidad de autora de la tesis realizada
sobre “ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA DEL EXTRACTO ACUOSO DE LA
PLANTA HIERBA MORA (SOLANUM NIGRUM) SOBRE CEPAS DE
CÁNDIDA ALBICANS ATCC®10231™”ESTUDIO IN VITRO, autorizo a la
Universidad Central del Ecuador a hacer uso del contenido total o parcial que me
pertenecen, con fines estrictamente académicos o de investigación.
Los derechos que como autora me corresponden, con excepción de la presente
autorización serán vigentes a mi favor, de conformidad con lo establecido en los
artículos 5, 6, 8, 19 y demás pertinentes de la Ley de Propiedad Intelectual y su
Reglamento.
También autorizo a la Universidad Central del Ecuador realizar la digitalización y
publicación de éste trabajo de investigación en el repositorio virtual, de conformidad
a lo dispuesto en el artículo 144 de la Ley Orgánica de Educación Superior.
----------------------------
Mishelle Cuasés
0401829486
iii
APROBACIÓN DEL TUTOR DEL TRABAJO DE TITULACIÓN
Yo, Dra. Marina Antonia Dona Vidale, en mi calidad de tutora del trabajo de
titulación, modalidad trabajo de investigación, elaborado por Mishelle Carolina
Cuasés Tetamuez; cuyo título es "ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA DEL
EXTRACTO ACUOSO DE LA PLANTA HIERBA MORA (SOLANUM
NIGRUM) SOBRE CEPAS DE CÁNDIDA ALBICANS
ATCC®10231™”ESTUDIO IN VITRO previo a la obtención del Grado de
Odontóloga; considero que el mismo reúne los requisitos y méritos necesarios en el
campo metodológico y epistemológico, para ser sometido a la evaluación por parte
del tribunal examinador que se designe, por lo que APRUEBO, a fin de que el
trabajo sea habilitado para continuar con el proceso de titulación determinado por la
Universidad Central del Ecuador.
En la ciudad de Quito, a los 3 días del mes de Abril de 2018.
……………………………………
Dra. Marina Antonia Dona Vidale
DOCENTE-TUTORA
CI. 170888442-2
iv
APROBACIÓN DE LA PRESENTACIÓN ORAL/TRIBUNAL
El tribunal constituido por: El Dr. Juan Pablo Jaramillo y la Dra. Silvana Terán.
Luego de receptar la presentación oral del trabajo de titulación previo a la obtención
del título (o grado académico) de Odontóloga presentado por la Srta. Mishelle
Carolina Cuasés Tetamuez.
Con el título:
"ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA DEL EXTRACTO ACUOSO DE LA
PLANTA HIERBA MORA (SOLANUM NIGRUM) SOBRE CEPAS DE
CÁNDIDA ALBICANS ATCC®10231™”ESTUDIO IN VITRO
Emite el siguiente veredicto: APROBADO
Fecha: 06 de mayo de 2018.
Para constancia de lo actuado firman:
Nombre y Apellido Calificación Firma
Presidente: Dr. Juan Pablo Jaramillo. ---------------- ---------------------
Vocal 1: Dra. Silvana Terán. ---------------- ---------------------
v
DEDICATORIA
A Dios por darme la oportunidad de vivir guiar mi vida e iluminar mi camino.
A mi Padre Abraham Cuasés por toda lucha constante, su amor infinito y apoyo incondicional
quien con su carácter me ayudo a ser fuerte y la dulzura como siempre es conmigo.
A mi madre Carmita Tetamuez por todo su amor, dedicación, su entrega desde que nací y sus
consejos hasta sus últimos suspiros de vida.
A mis hermanos Esteban, Alicia, Tania, José Luis, Carlos Alberto por quererme y ayudarme
cada momento y estar presentes siempre.
A mis Ti@s Alicia, Clara, Arnaldo, Maorí, Mariela, Ximena, Silvia y Consuelo por su apoyo
moral sentimental y económico.
A mí querido Alexis por acompañarme en todo momento.
Mishelle C.
vi
AGRADECIMIENTO
A Dios ya que con su suplo de vida pude culminar mis objetivos.
A mis amados padres por su entrega total para yo poder terminar mis estudios, amor
incondicional, paciencia, apoyo económico y por saber reprenderme cuando lo necesitaba
por ello logre ser ahora todo lo que soy las agradezco con mi corazón y a usted mamita linda
gracias por dar más de lo normal por cada uno de sus hijos y aunque la vida está muy difícil
sin usted, le prometo que seguiré adelante.
A mis queridos herman@s porque todos han estado pendientes de mí.
A mis queridas tías Alicia y Clara que se han convertido como unas madres para mí y mis
hermanos.
A mi familia por su granito de arena para yo poder culminar mis estudios.
A la Universidad Central del Ecuador por permitirme ser parte de la gloriosa Universidad.
A la Facultad de Odontología y sus docentes que impartieron sus conocimientos y anécdotas
que ayudaron a mi formación profesional.
A mi querida Tutora Marina Dona por su paciencia, comprensión y predisposición para
ayudarme a realizar mi trabajo.
Mishelle C.
vii
ÍNDICE DE CONTENIDOS
LISTA DE TABLAS. ................................................................................................. xi
LISTA DE FIGURAS. ............................................................................................... xii
LISTA DE ANEXOS. ............................................................................................... xiii
RESUMEN ............................................................................................................... xiv
ABSTRACT ............................................................................................................... xv
CAPITULO I ............................................................................................................... 1
1.1.- INTRODUCCION. .......................................................................................... 1
1.2.- PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ........................................................ 3
1.3 OBJETIVOS: ..................................................................................... 5
1.3.1.- OBJETIVO GENERAL ........................................................................... 5
1.3.2.- OBJETIVOS ESPECÍFICOS. .................................................................. 5
1.4.- JUSTIFICACIÓN ........................................................................................... 6
1.5.- HIPÓTESIS ..................................................................................................... 8
1.5.1.- Hipótesis de investigación ........................................................................ 8
1.5.2.-Hipótesis nula ............................................................................................ 8
CAPITULO II .............................................................................................................. 9
2.1.- MARCO TEORICO ....................................................................................... 9
2.1.1.- MEDICINA NATURAL. ............................................................................. 9
2.1.1.1.- Extractos acuosos. ............................................................................. 9
2.1.1.2.- Métodos de obtención de los extractos. ........................................... 10
2.1.1.2.1.- EFS, fluidos supercríticos. ........................................................ 10
2.1.1.2.2.- Extracción por centrifugación. ................................................. 10
2.1.1.2.3.- Extracción en fase sólida. ......................................................... 10
2.1.1.2.4- Extracción por infusión.- ........................................................... 11
2.2.- HIERBA MORA ........................................................................................... 11
viii
2.2.1.- Familia. ................................................................................................... 11
2.2.2.- Descripción y origen de la planta. .......................................................... 11
2.2.3.- Principios activos y composición química. ............................................ 12
2.2.4.- Propiedades. ............................................................................................ 14
2.2.5.- Indicaciones. ........................................................................................... 15
2.2.6.- Efectos adversos. .................................................................................... 15
2.2.7.- Extracto acuoso de las hojas secas de Hierba Mora. .............................. 16
2.2.7.1.- Método de obtención. ...................................................................... 16
2.3.- Micosis Oportunistas. .................................................................................... 16
2.3.2- Factores de Oportunismo. ........................................................................ 18
2.3.2.1- Condiciones de los hongos ............................................................... 18
2.3.2.2.- Factores que dependen del huésped. ............................................... 18
2.3.2.3.- Factores específicos que afectan la distribución de Cándida en la
cavidad bucal. ................................................................................................ 18
2.3.2.4.- Factores sistémicos. ........................................................................ 19
2.3.3.- Patogenia ................................................................................................ 19
2.3.4.- Manifestaciones Clínicas. ...................................................................... 20
2.3.5.- Tratamiento farmacológico. ................................................................... 21
2.4.- Cándida Álbicans. .......................................................................................... 22
2.4.1.- Descripción de la Cepa. .......................................................................... 22
2.4.2.- Taxonomía. ............................................................................................. 23
2.4.3.- Reproducción. ......................................................................................... 23
2.4.4.- Sensibilidad a la Nistatina. ..................................................................... 24
CAPITULO III ......................................................................................................... 25
3.- METODOLOGÍA ............................................................................................... 25
3.1- DISEÑO DE INVESTIGACIÓN. .................................................................. 25
3.2.- SUJETO Y TAMAÑO DE MUESTRA ........................................................ 25
ix
3.3.- CRITERIOS DE INCLUSIÓN. ..................................................................... 26
3.4.- CRITERIOS DE EXCLUSIÓN. ................................................................... 26
3.5.- SELECCIÓN DE LA MUESTRA. ............................................................... 26
3.7.- ORGANIZACIÓN Y PLANIFICACION DE LA INVESTIGACION. ....... 29
3.7.1.- Infraestructura. ........................................................................................ 29
3.7.2.- Recursos humanos. ................................................................................. 29
3.7.3.- Recursos Utilitarios. ............................................................................... 29
3.7.4.- Diseño de la Investigación. ..................................................................... 31
3.7.4.1.- Preparación de las hojas de la Hierba Mora (Solanum Nigrum). .... 31
3.7.4.2.- Proceso de obtención del extracto de la Hierba Mora (Solanum
Nigrum) .......................................................................................................... 32
3.7.4.3.- Dilución del extracto. ...................................................................... 34
3.7.5.- Medio de Cultivo. ................................................................................... 35
3.7.6.- Activación de la cepa Cándida Álbicans ATCC® 10231™ .................. 36
3.7.7.- Inoculación bacteriana para le experimentación. ................................... 38
3.7.7.1- Aplicación de los extractos sobre los discos y en los cultivos. ........ 39
3.7.7.2.- Incubación de los medios de cultivo. ............................................ 40
3.7.7.3.- Medición de los halos de inhibición. ............................................ 40
3.7.3.4.- Manejo de Bioseguridad y Control. ................................................. 41
3.7.3.5.- Eliminación de Desechos. ............................................................... 42
3.8.- ASPECTOS BIOETICOS. ............................................................................ 43
3.9.1.- Riesgos potenciales del estudio. ............................................................. 44
3.9.2.- Beneficios potenciales del estudio. ......................................................... 44
3.9.3.- Idoneidad ética y experticia técnica del investigador principal. ............. 45
3.9.4.- Idoneidad ética y experticia técnica del tutor. ........................................ 45
3.9.5.- Declaración de conflicto de intereses del investigador principal. .......... 45
3.9.6.- Declaración de conflicto de intereses del turor. ..................................... 45
x
3.10.- RESULTADOS ESPERADOS. .................................................................. 45
CAPITULO IV ......................................................................................................... 47
4. 1.- ANÁLISIS DE RESULTADOS. .................................................................. 47
4.2.- RESULTADOS. ............................................................................................ 48
CAPITULO V .......................................................................................................... 57
5.1 DISCUSIÓN. ................................................................................................... 57
6.-CONCLUSIONES. .............................................................................................. 60
7.-RECOMENDACIONES. .................................................................................... 61
8.- BIBLIOGRAFIA. ............................................................................................... 62
xi
LISTA DE TABLAS.
Tabla 1.- Resultados de Inhibición por grupo. .......................................................... 48
Tabla 2.- Estadísticos descriptivos de la distribución de halos de inhibición por
grupo. ......................................................................................................................... 49
Tabla 3.- Prueba de Normalidad mediante estadístico de Kolmogorov Smirnov. .... 51
Tabla 4.- Media y desviación estándar del halo de inhibición por grupo. ................ 51
Tabla 5.- Resultados de la prueba de Kruskal Wallis. .............................................. 53
Tabla 6.- Resultados de la prueba de U Mann Whitney. .......................................... 54
Tabla 7.- Nivel de sensibilidad del grupo frente a Cándida Álbicans. ..................... 55
xii
LISTA DE FIGURAS.
Figura 1.- Hierba Mora en su estado Natural. .......................................................... 12
Figura 2.- Recolección y desinfección de la Hierba Mora. ...................................... 31
Figura 3.- Trituración de las hojas de Hierba Mora. ................................................. 32
Figura 4.- Hojas colocadas en el papel filtro y luego en el equipo de Soxhlet ......... 33
Figura 5.- Almacenamiento en envase de vidrio. ..................................................... 33
Figura 6.- Extractos al 50%, 75% y 100% ................................................................ 35
Figura 7.- Colocación del medio de cultivo Agar Dextrosa Sabouraud 4% Merck
sobre discos Petri. ...................................................................................................... 36
Figura 8.- Activación de la cepa Cándida albicans ATCC® 10231™ ..................... 37
Figura 9.- Caldo con inóculos de fúngicos en relación con escala estándar
McFarland. ................................................................................................................. 38
Figura 10.- Siembra en el medio de cultivo. ............................................................. 39
Figura 11.- Discos blancos embebidos con el extracto y colocados en las cajas Petri.
................................................................................................................................... 39
Figura 12.- Colocación en la incubadora por un periodo de 24horas. ...................... 40
Figura 13.- Contador de colonias tipo Quebec® y medicion de halos. .................... 41
Figura 14. Cámara de flujo laminar tipo II. .............................................................. 42
Figura 15.- Autoclave derecha esteriliza material contaminado antes de su proceso
final de eliminación. Autoclave izquierda esteriliza material previo a su uso. ......... 43
Figura 16.- Diagrama de caja y bigotes para la distribución de halos de inhibición
por grupo. ................................................................................................................... 50
Figura 17.- Media del halo de inhibición por grupo. ................................................ 52
Figura 18.- Nivel de sensibilidad del grupo frente a Cándida Álbicans. .................. 56
xiii
LISTA DE ANEXOS.
Anexo 1.- Certificado de Aprobación por el SEISH-UCE. ....................................... 65
Anexo 2.- Aprobación para el uso y asesoramientos de los Laboratorios de la F.C.Q.
................................................................................................................................... 66
Anexo 3.- Factura de compra de Cándida Álbicans ATCC®10231™. .................... 67
Anexo 4.- Certificado de calidad de la cepa Cándida Álbicans ATCC®10231™. .. 68
Anexo 5.- Instrucciones de uso y activación de la cepa Cándida Albicans® 10231™.
................................................................................................................................... 69
Anexo 6.- Certificado de esterilización de los materiales. ........................................ 70
Anexo 7.- Protocolo de Manejo de Desechos. ........................................................... 71
Anexo 8.- Autorización para el uso de las instalaciones del Depósito de Desechos
Infecciosos. ................................................................................................................ 72
Anexo 9.- Certificado de haber realizado el experimento. ........................................ 73
Anexo 10.- Certificado de idoneidad del autor. ......................................................... 74
Anexo 11.- Certificado de idoneidad del tutor. ......................................................... 75
Anexo 12.- Declaración de conflicto de interés del autor. ........................................ 76
Anexo 13.- Declaración de conflicto de interés del tutor. ......................................... 77
Anexo 14.- Certificado de análisis de resultados. ..................................................... 78
Anexo 15.- Renuncia al trabajo estadístico. .............................................................. 79
Anexo 16.- Certificado de Urkund Analysis Result .................................................. 80
xiv
TEMA.- "ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA DEL EXTRACTO ACUOSO DE LA
PLANTA HIERBA MORA (SOLANUM NIGRUM) SOBRE CEPAS DE
CÁNDIDA ALBICANS ATCC®10231™”ESTUDIO IN VITRO.
Autor: Mishelle Carolina Cuasés Tetamuez.
Tutor: Dra. Marina Dona
RESUMEN
Científicamente se conoce que la Cándida Àlbicans es el hongo que encontramos
con mayor frecuencia en cavidad oral; se caracteriza por ser un patógeno oportunista
de importancia, por tal motivo en este estudio se demostrará una alternativa para el
tratamiento de las patologías causadas por este fúngico, que son de fácil acceso y
bajo costo, nos referimos a las plantas medicinales. Así nos planteamos identificar la
actividad antifúngica de extracto acuoso de las hojas secas de la Hierba Mora en una
concentración de 50%, 75% y 100 % sobre cepas de Cándida Álbicans
ATCC®10231™. Una vez obtenido el extracto de las hojas secas de la Hierba Mora,
mediante la disecación y trituración de la hojas, donde se añadió alcohol potable al
70% se prepararon 15 unidades experimentales en cajas Petri con el fúngico donde
colocamos discos embebidos con el extracto de la planta a concentraciones de 50%,
75% y 100%, se midieron los halos inhibitorios formados alrededor de los discos de
papel, como control negativo agua destilada y como control positivo nistatina, luego
se colocaron en la incubadora por un tiempo de 24 horas a 35 grados. Como
resultado se determinó que la concentración al 100% demostró un pequeño halo de
inhibición mientras que las contracciones de 50% y 75% no demostraron actividad
antifúngica a diferencia de la nistatina.
PALABRAS CLAVES: CÁNDIDA ALBICANS, HIERBA MORA, EXTRACTO
ACUOSO
xv
THEME. - "ANTIFUNGAL ACTIVITY OF THE AQUEOUS ABSTRACT OF
THE GRASS MORA PLANT (SOLANUM NIGRUM) ON CEDIDA CEPAS
ALBICANS ATCC®10231 ™" IN VITRO STUDY
Author: Cuasés Tetamuez Mishelle Carolina
Tutor: Dra. Dona Vidale Marina Antonia
ABSTRACT
It is scientifically known that Candida Àlbicans is the fungus that we find most
frequently in the oral cavity; It is characterized as an opportunistic pathogen of
importance, for this reason in this study will be demonstrated an alternative for the
treatment of the pathologies caused by this fungal, which are easily accessible and
low cost, we refer to medicinal plants. Thus we set out to identify the antifungal
activity of aqueous extract of the dried leaves of the Black Herb at a concentration of
50%, 75% and 100% on strains of Candida Álbicans ATCC®10231 ™. Once
obtained the extract of the dried leaves of the Black Herb, by means of the dissection
and crushing of the leaves, where 70% drinking alcohol was added, 15 experimental
units were prepared in Petri dishes with the fungal one where we placed disks
embedded with the extract of the plant at concentrations of 50%, 75% and 100%, the
inhibitory haloes formed around the paper discs were measured, as negative control
distilled water and as positive control nystatin, then placed in the incubator for a time
of 24 hours at 35 degrees. As a result, it was determined that the 100% concentration
showed a small halo of inhibition, while the 50% and 75% contractions showed no
antifungal activity, unlike nystatin.
KEYWORDS: CANDIDA ALBICANS, MORA GRASS, AQUEOUS EXTRACT.
1
CAPITULO I
1.1.- INTRODUCCIÓN.
.
Abdul (1) mencionó que no de los principales fúngicos oportunistas de mayor
importancia en humanos es la Cándida Álbicans, existen diversos tipos de Cándidas
pero más agresivo desde el punto de vista médico y odontológico es el tipo
Álbicans, el cual por sus factores de progresión para causar una enfermedad genera
la Candidiasis. Aguirre (2) aseguró que es un hongo habitual en cavidad oral pero
llega a producir enfermedad cuando existe desequilibrio de sistema inmunitario entre
otros factores predisponentes. (2)
Existen varias terapias farmacológicas para el tratamiento de esta enfermedad para
lograr controlar este fúngico, pero que muchos de estos fármacos además de su costo
elevado causan efectos secundarios no deseados, por eso se ha buscado alternativas
para el control de este fúngico por medio de la medicina natural aprovechando la
biodiversidad que existe en nuestro país. (3)
La Hierba Mora es una planta muy común que existe en casi todos los países del
mundo, perteneciente al familia de las Solanaceae, muy conocidas por poseer
sustancias químicas tipo venenoso, que son glucoalcaliodes como la solanina en
mayor cantidad y alfa-chaconina, solasonina en menor proporción, en este estudio se
pretende obtener mediante un proceso de laboratorio, el extracto acuoso de las hojas
secas de la hierba mora. (4)
2
Martínez (5) mencionó que la solanina tenía una actividad inhibitoria frente a
Cándida Álbicans ATCC ® 10231™, ya que la ser un veneno invade y envenena al
hongo impidiendo su proliferación debido que impide el potencial de membrana
evitando la colonización en el huésped.
El objetivo de la investigación es determinar la actividad antifúngica mediante un
estudio in vitro del extracto acuoso de las hojas secas de Hierba Mora (Solanum
Nigrum), aplicado sobre cepas de Cándida Álbicans ATCC ® 10231™. A partir de
lo cual se determinará la concentración mínima inhibitoria y concentración mínima
Antifúngica por que se aplica a diferentes de 50%, 75% y 100%.
El tipo de investigación es experimental in vitro trasversal, operamos con cepas de
Cándida Álbicans ATCC® 10231™ identificadas anteriormente por laboratorios
Microbiológicos e importadas por Medibac – Inc S.A Trabajaremos con 200 gramos
de hojas de Solanum Nigrum, para obtener el extracto acuoso.
TIPO DE MUESTRA. Muestreo por conveniencia que sea dirigido por personal de
la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Central del Ecuador. El análisis
de la actividad antifúngica se dará utilizando 3 concentraciones de extracto acuoso de
las hojas secas de Hierba Mora al 50%, 75% y 100%, tres repeticiones de cada una,
utilizando el método de difusión en disco, como control cero se hará con agua
destilada y el control positivo con nistatina.
3
1.2.- PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Lindhe (6) mencionó que en el gran conjunto de las enfermedades gingivales
de origen micótico la de mayor importancia, fueron originada por Cándida
donde el género Álbicans siendo el más común. Sapp (7) agregó que la
Cándida Álbicans, es un hongo común de la cavidad bucal, que suele
desarrollarse por deterioro de la inmunidad del huésped, causando así
alteraciones que no se manifiestan solo en cavidad bucal sino se extienden e
involucran a la faringe, laringe y el esófago.
De tal manera también Carranza (8) afirmó que las alteraciones de la mucosa
bucal originadas por hongos serían escasas en pacientes inmunocompetentes,
pero muy frecuentes en inmunodeprimidos, o en personas que hayan sido
sometidas a un tiempo prolongado de antibioticoterapia.
Sapp (7) sugirió que existen factores predisponente para la proliferación de
este hongo los cuales menciona la edad, estado inmunológico del huésped etc.
ya que esos factores van a favorecer a la colonización de este
microorganismo, que posteriormente este hongo invadirá tejidos blandos de la
cavidad bucal, provocando Candidiasis oral. (2)
En estudios previos Martínez et al (5) mencionaron la eficacia del extracto
acuoso de las hojas de Hierba Mora sobre Cándida Álbicans, pero no hay
evidencia científica que lo demuestre que el extracto puede perder o no
características químicas fungicidas contra C. Álbicans.
Fuentes (9) aseguró que en la cocción de las hojas se potencializa su efecto
contra Cándida Álbicans, pero solo se han obtenido pruebas en laboratorio
4
cultivando Cándida Álbicans y sometiendo al extracto acuoso de las hojas de
hierba mora, obteniendo resultados favorables. Así también Sánchez (4)
argumentó que hace falta realizar más estudios con plantas medicinales para
tratar patologías bucales.
Por lo mencionado anteriormente, esta investigación se realizará con el fin de
determinar la efectividad antifúngica del extracto acuoso de las hojas de
Hierba Mora a diferentes concentraciones de 50%, 75% y 100% de
concentración sobre Cándida Álbicans; ya que se han destacado estudios
donde muestran que inhibe su crecimiento, pero no existe evidencia
científica, de acuerdo al volumen o cantidad exacta de extracto para ser usado
con este fin. Así como también no existe evidencia científica de cómo
utilizarlo, en productos para uso odontológico, para la eliminación de
Cándida Álbicans.
Es así que para definir el problema de esta investigación formulamos la
siguiente pregunta: ¿El extracto acuoso de las hojas de la Hierba Mora tiene
actividad antifúngica sobre Cándida Álbicans inoculada en cultivos?
Por este motivo surge la necesidad de obtener y emplear productos naturales a
base de plantas, que han sido utilizado por personas de muchos países ya que
esta planta crece en casi todos los países; para la prevención y tratamiento de
patologías bucales, de esta manera tendríamos un alternativa de tratamiento
que es natural, fácil de hacer, no es costosa y que si es efectiva, tratando de
evitar los fármacos que comúnmente se utiliza para tratar esta patología.
5
1.3 OBJETIVOS:
1.3.1.- OBJETIVO GENERAL
Determinar si existe una actividad antifúngica del extracto acuoso de las
hojas de Hierba Mora (Solanum Nigrum) frente a cepas de Cándida
Álbicans ATCC®10231™ mediante un diseño experimental in vitro.
1.3.2.- OBJETIVOS ESPECÍFICOS.
Obtener el extracto acuoso al de las hojas secas de la Hierba Mora
Identificar la actividad antifúngica del extracto acuoso de las hojas de Hierba
Mora a concentraciones de 50%, 75% y al 100% mediante el método de
difusión del disco sobre cepas de Cándida Álbicans ATCC®10231™
inoculados en cultivos estériles.
Comparar el grado de inhibición de los discos impregnados con el extracto de
Hierba mora en sus concentraciones de 50%, 75% y 100% en los cultivos
inoculados con Cándida Álbicans ATCC®10231™
Diferenciar los halos inhibitorios de los discos con extracto acuoso de hierba
mora con los discos de nistatina sobre cepas de Cándida Álbicans
ATCC®10231™.
6
1.4.- JUSTIFICACIÓN
Calixto (10) destacó la importancia del uso de plantas dentro de la medicina
tradicional, dicho conocimiento de ciertas especies ha sido escasamente desarrollado,
creando la necesidad de fomentar la investigación acerca de los beneficios de los
recursos naturales, en beneficio de la salud. Así Ansaloni et al. (3) indicaron lo
importante que resultó el uso de plantas medicinales, dentro del campo de la
medicina, para favorecer la ꞌsaludꞌ y el ꞌbienestarꞌ
Martínez (5) sugirió la importancia de desarrollar investigaciones con extractos de
ciertas plantas; dentro de su estudio destacó que el extracto acuoso de las hojas secas
de hierba mora, posee sustancias químicas que ayudan a detener el crecimiento y
desarrollo de microorganismos como hongos y bacterias. Indicó Sánchez (4) que el
compuesto más importante que actúa como antibacterianos y antifúngicos contra
microorganismos como el hongo Cándida Álbicans es la solanina que resultó ser
como un potente veneno para el fúngico.
Por lo que Martínez (5) mencionó la importancia del estudio de dichas sustancias
naturales en el beneficio de la salud bucal, logrando un uso adecuado de las mismas,
bajo un sustento científico.
Se desarrollará la conceptualización de medicina natural, por ende hablaremos de
plantas medicinales y la fitoterapia, para concentrarnos específicamente de la planta
Hierba Mora, especies, descripción botánica, propiedades y usos terapéuticos. Se
profundizará el conocimiento de la planta Hierba Mora, ya que existen datos
antropológicos y etnobotánica por parte de la medicina ancestral, pero propician de
un sustento científico. Así mismo se encontró estudios de su composición y
7
características químicas, que nos llamó la atención y nos dedicamos investigarla
para lograr comprobar su efectividad. (11)
Consiguiente describiremos la composición química, propiedades, mecanismo de
acción y actividad biológica con el objetivo de determinar efectividad antimicótica
del extracto acuoso de las hojas secas de la planta hierba mora en una concentración
de 50%, 75% y 100% sobre cepas de Cándida Álbicans de cultivos estériles, donde
se observará los halos inhibitorios de este microorganismo, para sugerir que dicha
planta sea utilizada, como control de patologías que afectan a la mucosa oral, que el
mencionado hongo sea el causante.
Con esta investigación esperamos resultados positivos para inhibir C. Álbicans, y
así podemos contribuir a un posible tratamiento natural, de bajo costo, accesible a
personas de bajos recursos económicos que no tienen acceso a la salud oral integral,
mejorando su calidad de vida. Esto servirá entonces como un precedente para
siguientes estudios y la posibilidad de emplear en productos antimicóticos contra
alteraciones buco dentales, que afectan a la población.
8
1.5.- HIPÓTESIS
1.5.1.- Hipótesis de investigación
H1. El extracto acuoso de las hojas de la planta Hierba Mora tiene acción
antifúngica sobre las cepas de Cándida Álbicans ATCC®10231™.
1.5.2.-Hipótesis nula
H0. El extracto acuoso de las hojas de la planta Hierba Mora no tiene
acción antifúngica sobre las cepas de Cándida Álbicans
ATCC®10231™.
9
CAPITULO II
2.1.- MARCO TEÓRICO
2.1.1.- MEDICINA NATURAL.
Jiménez (12) mencionó que el uso de medicina natural, está relacionado
con la evolución del hombre y su raciocinio, por estar en íntimo contacto
con la naturaleza y mediante la observación de costumbres de otros
animales, ha logrado tener conocimientos empíricos así como también
experiencia con respecto al uso de plantas medicinales, dando origen a la
medicina natural.
Es así que Castro et al. (13) aclararon que los productos a base de
plantas medicinales podrían ser seguros y efectivos, aunque no están
sustentados con suficientes bases científicas. Sánchez (4) confirmó que la
fitoterapia es una alternativa para tratamientos de varias enfermedades
así es que Torres (14)sugirió que se debe hacer constantemente
múltiples investigaciones con plantas para obtener bases científicas y
poder difundir esta clase de medicina.
2.1.1.1.- Extractos acuosos.
Bruneton (15) explicó que las plantas luego de ser sometidas a varios
procesos se puede obtener los extractos, que consisten en la fracción
no volátil de los principios activos, es decir, que al no ser
volatilizables o ser inestables con la temperatura, no se pueden
obtener mediante destilación.
10
2.1.1.2.- Métodos de obtención de los extractos.
2.1.1.2.1.- EFS, fluidos supercríticos.
Bruneton (15) determinó que un fluido supercrítico es una
sustancia, que mediante operaciones mecánicas, cumpliendo
condiciones operativas de presión y temperatura, se sitúa por
encima de su punto crítico, pero por debajo de la presión que hace
falta para condensarlo en un sólido.
Saiz (16) también argumentó que se utiliza gases como el CO2 a
elevada presión, en estado líquido o supercrítico, en lugar de
disolventes clorados, que producen residuos tóxicos, la extracción
suele durar unas 24 horas que se lo puede acelerar manualmente.
2.1.1.2.2.- Extracción por centrifugación.
Bruneton (15)explicó que los extractos obtenidos por este proceso
poseen características aromáticas superiores a las conseguidas por
extracción por arrastre de vapor, no es un proceso térmico, por
ello sus propiedades son más estables, por los antioxidantes
naturales presentes. A pesar de ello, la fricción interna de la
materia prima produce una elevación de temperatura no
controlable que puede implicar una degradación térmica y un
oscurecimiento del extracto. (15)
2.1.1.2.3.- Extracción en fase sólida.
Bruneton (15) menciona que se emplean columnas o cartuchos
capaces de retener el analito, que se extrae posteriormente con un
pequeño volumen de disolvente.
11
2.1.1.2.4- Extracción por infusión.-
Saiz (16) aconsejó que se debe disecar el vegetal del cual se
requiere el extracto para lego ser molidos o triturados y ser
vaciados en agua a punto de ebullición y dejar reposar para
posteriormente ser guardados en frascos rotulados.
2.2.- HIERBA MORA
2.2.1.- Familia.
Ugaz (17) sugirió que la Hierba Mora proviene de:
Nombre vulgar: “Hierba Mora
REYNO: PLANTAE
DIVISION: MAGNOLIOPHYTA
CLASE: MAGNLIOPSIDA
SUB CLASE: ASTERIDAE
ORDEN: SOLANALES
FAMILIA: SOLANACEAE
GENERO: Solanum.
ESPECIE: Solanum Nigrum
2.2.2.- Descripción y origen de la planta.
Suags (18) la describe como una planta morfológicamente muy variable,
tallos cortamente pubescentes o glabros, peciolos de 12 a 50 mm de largo, sus
hojas a menudo en pares, aovadas, enteras o sinuado-dentadas, de 5 a 10 cm
de largo y 1 a 5 cm de ancho, fruto carnoso, globoso y negro al madurar,
llegan a mediar hasta 60cm.
12
Figura 1.- Hierba Mora en su estado Natural.
Elaboración.- Cantón Espejo, provincia del Carchi. Fecha.- 10/01/2018
Fuente.- Mishelle Carolina Cuasés Tetamuez
Ansaloni (3) argumenta que es una planta silvestre y anual, que se propaga
por semillas y no requiere de cuidados especiales para su desarrollo, se
originan en regiones templadas y tropicales de todo el mundo, para esta la
investigación la hierba mora la tomaremos de la región sierra (Provincia del
Carchi).
2.2.3.- Principios activos y composición química.
Gao (19) mencionó que esta planta está compuesta de esta manera.
Glucoalcaloides: Solanina, alfa-solanina, solasonina, solanigrina, alfa-
chaconina.
Gao (19) afirmó que los glucoalcaloides del género Solanum son
alquilaminas esteroidales con el esqueleto C27 del colestano que se
encuentran en la planta en forma de glicósidos, son derivados de esteroides,
biogenéticamente muy relacionados a los triterpeniodes tetracíclicos, del
ciclopentanoperhidrofenantreno.
13
Ugaz (17) agregó que se los conoce como metabolitos de estrés ya que son
importantes en el control de algunas enfermedades por hongos y por
nematodos e insectos.
Solanina.- Produce disminución de la actividad motora, aceleración de la
velocidad respiratoria, efectos inotrópicos positivos similares al glicósido
cardiotónico K-estrofantósido y efecto hemolítico (20). Así también Gao
(19)incluye también que el mecanismo tóxico de la solanina se da por la
interacción química con las membranas mitocondriales.
La exposición a la solanina abre los canales de potasio de la mitocondria, así
se disminuye el potencial de la membrana, haciendo que el ión Ca2+ pase de
la mitocondria al citoplasma, creando un incremento de la concentración del
mismo lo que provocaría los daños celulares y apoptosis. (19)
solamargina y solasonina.- alteran el potencial de membrana y canales
iónicos (20).
Alfa-chaconina y alfa-solanina alteran el potencial de membrana y el
transporte activo de sodio estas moléculas al igual que la alfa-tomatina,
favorecen la pérdida de componentes celulares (iones, Ca2+ y proteínas), por
desestabilización de la membrana celular y actividad cardiotónica. (22)
Taninos: Son compuestos polifenólicas soluble en agua, alcohol, y acetona
no nitrogenadas de origen vegetal, se encuentra en las raíces, la corteza, y
escasamente en las hojas son de sabor astringente y son muy utilizados por
14
sus propiedades antibacteriana, antioxidantes, antisépticas, vasoconstrictoras,
astringentes, cicatrizantes, antidiarreicas. (39)
Saponina: Son un grupo de glucósidos naturales solubles en agua y poseen
propiedades diuréticas, digestivas, antiinflamatorias, expectorantes,
antimicrobianas, anticancerígenas y antiespasmódicas. (9)
Flavonoides: Quercitina
Quercitina.- Muñoz (23)afirmó que proporciona el color a flores, frutas,
hortalizas con propiedades antioxidantes, antiinflamatorias, antihistamínicas,
ofrece una variedad de posibles usos terapéuticos, principalmente en la
prevención y tratamiento de las siguientes condiciones:
Tratamiento para alergias.
Asma.
la urticaria.
inhibe la liberación de histamina de los basófilos y los mastocitos
Aftas.
Diabetes mellitus, cataratas, trastornos de la retina, enfermedades
nerviosas, y otras complicaciones de la diabetes.
2.2.4.- Propiedades.
Se le atribuye ciertas propiedades que aún no están científicamente
comprobadas pero que han dado un gran resultado, Vernal (19)mencionó que
la planta actúa como cicatrizante, calmante, narcótica, anti herpética,
antihemorroidal, analgésica, antifúngica, antiséptica, pediculicida. Lizarazo
(25) aseguró que es de buena utilidad en la agricultura por ser un planta
venenosa en altas cantidades s la prepara para ser empleada como insecticida.
15
2.2.5.- Indicaciones.
Vernal (20)mencionó que esta planta era muy utilizada por nuestros ancestros
muy efectiva para lavados vaginales, en el tratamiento de las afecciones de la
piel y los ojos. Suags (18) recomendó para tratamientos de aftas bucales.
Torres (14) agregó que se puede utilizar en curación de heridas superficiales
para resfriados tratamientos gastrointestinales urticarias. Martínez (5) afirmó
que fue una gran alternativa para el tratamiento de las afecciones
oportunistas de la Cándida Álbicans dando un buen resultado para su
eliminación.
2.2.6.- Efectos adversos.
Sánchez. (21) relacionó los efectos adversos de acuerdo a la cantidad de
ingesta de la planta; si se excede más de 30mg resulta ser tóxico, actúa como
un veneno, en casos más graves afecto el sistema nervioso. Sacha (26) replicó
que la toxicidad por solanina que se da por el consumo de frutos y hojas,
puede llevar a la muerte.
Gao (19) destacó que el envenenamiento por solanina se manifiesta con
problemas gastrointestinales y neurológicos, con síntomas como nausea,
diarrea, vómito, calambres estomacales, ardor en la garganta, arritmia
cardiaca, dolor de cabeza y mareo.
Kuklinki (21) aseveró que los casos más severos incluyen alucinaciones,
entumecimiento, parálisis, ictericia, fiebre, dilatación de las pupilas e
16
hipotermia, en altas dosis, el envenenamiento por solanina puede causar la
muerte. Luego de estudios realizados Gao (19)confirmó que dosis de 2 a 5
miligramos por kilo de peso corporal pueden causar síntomas tóxicos, y dosis
de 3 a 6 miligramos por kilo pueden llegar a ser fatales
2.2.7.- Extracto acuoso de las hojas secas de Hierba Mora.
Calixto (10)afirmó, que el extracto se lo puedo obtener de todas las especies
de Solanum ya que presentan el mismo principio activo y con similares usos
terapéuticos. Lizarazo (25) resaltó que es utilizado en muchos países por sus
efectos insecticidas utilizados en la agricultura. Martínez (5) destacó que el
extracto tiene actividad antifúngica. La solanina es el componente primordial
del extracto acuoso de la Hierba Mora.
2.2.7.1.- Método de obtención.
Se empleará el método extracción por infusión de la planta
previamente disecada y triturada añadiendo alcohol potable al
70%.
2.3.- Micosis Oportunistas.
Aguirre (2) explicó que las infecciones provocadas por hongos han
incrementado su frecuencia y su importancia clínica, en épocas anteriores las
micosis bucales estaban asociadas con condiciones tales que tienen relación
con un sistema inmunológico deteriorado. Ceccoti (26) enunció que en las
personas con cánceres destructivos, quemaduras, diabetes, mal nutrición,
17
tratamientos prolongados con corticoides, entre otros; favorece la colonización
de esta levadura.
Por otra parte el Instituto Nacional de Seguridad e Higiene (27) mencionó que;
la ‘candidiasis oral’ en la población normal estuvo presente entre un ‘40%’ y
‘60%’considerándose más frecuente en el paciente geriátrico debido a factores
generales y locales.
Rodríguez (29) definió como una enfermedad micótica causada por cualquiera
de las especies del género Cándida, determinándose como una enfermedad
oportunista, muy frecuente en nuestros días, en la que siempre debemos
investigar la presencia de factores favorecedores del crecimiento y
transformación patógena del germen.
Rodríguez el at.(29) aclararon que Candidiasis Oral es una enfermedad
cosmopolita muy frecuente siendo una de las micosis más importantes, con
mayor frecuencia en la cavidad bucal; afecta a ambos sexos, a cualquier edad,
aunque son más frecuentes en los extremos de la vida.
Granados (30) agregó que estos hongos son habitantes habituales en boca,
sistema gastrointestinal, piel y vagina, por lo que se consideran agentes
infecciosos endógenos específicos, que logran proliferar cuando el huésped no
se encuentra inmunocompetente.
Cecoti (27) sugirió que son poco virulentos, no son transmisibles y solo
producen infección de la mucosa en presencia de una predisposición local o
general manifiesta o ambas.
18
2.3.2- Factores de Oportunismo.
2.3.2.1- Condiciones de los hongos
.Aguirre (2) mencionó que estas son los factores de oportunismo:
Soportar temperaturas de 37°C. (2)
Producir un cambio bioquímico, debido a que le huésped es ricos en enzimas
y el hongo las aprovecha. (2)
Cambian de forma, el hongo reduce su tamaño. (2)
Poseer los factores de virulencia. (2)
Relación con el huésped. (2)
2.3.2.2.- Factores que dependen del huésped.
Por utilizar esteroides inhalados
Dieta altas en carbohidratos
Xerostomía
Por uso de prótesis
Granados (30)
2.3.2.3.- Factores específicos que afectan la distribución de Cándida
en la cavidad bucal.
Granados (30)manifestó que la C. Álbicans absorbe mucinas salivales, lo que
le facilita la adhesión a las superficies inorgánicas como las prótesis
La C. Álbicans prolifera en un medio bucal con pH ácido. (30)
Existe cambio en la capa externa de la pared celular de la C. Álbicans debido
a la variación de proteínas que las hace hidrofóbicas que se unen sin
dificultad a los tejidos y la parte hidrofílicas se cree q se une por medio de
fuerzas denominada London-Van der Walls, que son fuerzas electrostáticas.
(2).
19
2.3.2.4.- Factores sistémicos.
Inmunosupresión. (8)
De acuerdo con la edad muy joven o de avanzada edad. (8)
Deficiencias nutricionales. (8)
Uso de antibióticos de amplio espectro por largo tiempo. (8)
Trastornos endocrinos como diabetes. (8)
Enfermedades como hepatitis, tuberculosis. (8)
2.3.3.- Patogenia
Liébana (31)aclaró que los Hongos tipo Cándida tienen numerosas
moléculas en su superficie directamente responsable de la adherencia a los
tejidos del huésped, entre las que se encuentran:
a. Un receptor homólogo de la integrina humana CR 3, que se une con los
grupos argininaglicina-ácido aspártico (RGD) de C3bi, fibrinógeno,
fibronectina y laminina. (31)
b. Una lectina que se une con los azúcares de las células epiteliales. (31)
c. Proteínas con manosa que se unen con las moléculas similares a lectina de
las células epiteliales. (31)
Rodríguez (29) mencionó otros factores de virulencia, como la
aspartilproteinasa, que ayuda en la invasión tisular destruyendo las proteínas
de la matriz extracelular y una adenosina secretada que bloquea la
producción de radicales de O2 en los neutrófilos y su degranulación.
Finalmente, la transición de formas levaduriformes a hifas es importante
para la virulencia del hongo, ya que parece que las hifas brotan fuera de las
células, que las absorben.
20
2.3.4.- Manifestaciones Clínicas.
Depende del sitio afectado lo recalcó Palacios (32)
a.- A nivel Cutáneo.- Palacios (32) destacó que es más frecuente en
diabéticos por el alto contenido de glucógeno en piel y acidez elevada, se
manifiesta como erosiones que no sangran y en el fondo se observa rojo
brillante, sensación de ardor o quemazón que se presenta en axilar,
interglúteo, inguinal, submamario, suprapúbico y en uñas degenerando el
tejido.
b.- A nivel Muco-cutánea. Ryan (33)observó lesiones eritematosas con
material blanquecino o lechoso, por la formación de una película o
pseudomembrana, que cubre la lengua, carrillos y paladar, muy frecuente en
recién nacidos inmunodeprimidos y desnutridos, también se presenta en
pacientes diabéticos por medicación constante, otra manifestación es la
queilitis angular.
- Palacios(32) afirmó que se manifiesta en mucosa vaginal por consumo de
ATB, embarazadas o anticonceptivos orales, se presenta con secreciones
grumosas blanquecinas con un aspecto de leche cortada, prurito intenso, en
hombres se presenta zonas eritematosas o pseudomembranosas en la parte del
glande o en el surco balano-prepucial.
- Candidiasis mucocutánea crónica.- Palacios(32)mencionó que es un
síndrome infeccioso raro y heterogéneo que afecta a niños con defectos
genéticos (inmunodeficiencias), se desarrolla en los primeros años de vida a
manera de un eritema en piel que evoluciona a lesión hiperqueratósica y en la
mucosa bucal por lo tanto se observa glositis, queilitis, onixis, perionixis,
infección del grande y pequeños pliegues producidos por Cándida.
21
- Palacios (32) agregó que puedo involucrar mucosa digestiva; esófago,
estómago e intestino. La afección esofágica puede ser parte del afta que se
inicia en la boca, odinofagia, disfagia, dolor retroesternal, hemorragia,
náuseas, vómitos, aunque el cuadro puede ser asintomático.
c.- Candidiasis Profunda o Invasiva. Palacios (32)mencionó que las
principales rutas de invasión de las levaduras son vía catéteres endovenosos
(a nivel hospitalario) y por penetración a través de la mucosa intestinal
(involucra a las especies que colonizan previamente el tracto gastrointestinal).
d.- Enfermedad alérgica: Ciancio (34) argumentó que algunos pacientes
presentan cuadros alérgicos por sensibilización a los antígenos de Cándida,
por lo que se observa; eczemas, gastritis, enteritis u otras manifestaciones
clínicas. Pueden verse lesiones vesiculosas en piel que se localizan en
espacios interdigitales de manos y pies u otras localizaciones que por lo
general son estériles.
2.3.5.- Tratamiento farmacológico.
El Instituto Nacional e Higiene (28) sugirió que para el tratamiento de
candidiasis mucosas y cutáneas, se emplean antifúngicos del grupo
azoles, los cuales encontramos en lociones, pomadas, cremas tópicas y
supositorios. Solo en infecciones profundas recurriremos a tratamientos
sistémicos, utilizando fármacos como fluconazol y la nistatina.
Rodríguez (29) aconsejó que lo mejor es evitar la interferencia con el
equilibrio de la flora microbiana y las defensas del huésped ya que se
puede alterar y favorecer la colonización del fúngico; como medidas de
precaución, se debe suprimir los irritantes, tales como los alimentos
22
demasiado calientes, ácidos y picantes, el tabaco y alcohol.
Se dispone en general de las siguientes alternativas terapéuticas: (29)
a.-Control de factores predisponentes. (29)
b.-Colutorios. (29)
c.-Antimicóticos específicos tópicos y/o sistémicos en uso tópico (29)
- Derivados poliénicos: Nistatina, Anfotericina B.
- Derivados imidazólicos: Miconazol, Ketoconazol, Clotrimazol,
Econazol.
- Derivados triazólicos: Fluconazol, Itraconazol.
d.-Tratamiento sistémico: se utilizan los derivados imidazólicos y
triazólicos, así como en casos muy excepcionales la Anfotericina
B.7(29)
2.4.- Cándida Álbicans.
Negroni (35)enunció que los hongos del género Cándida son levaduras, es decir que
son unicelulares.
2.4.1.- Descripción de la Cepa.
Sapp et al. (7) mencionaron que estos microorganismos se muestran como
levaduras en gemación o también como seudohifas; se las observó en
cadenas de células alargadas enlazadas entre ellas. Sin embargo Liébana
(31) explicó que la Cándida se puede presentar como una célula redonda u
ovalada.
INH (28) afirmó que son de 3-8 x 2-7 micras de tamaño, agrupadas en
pequeños grupos, mientras que, en forma de hongo filamentoso, las células
se alargan y se diversifican tomando la apariencia de filamentos, pseudo-
23
hifas o pseudo-micelio. Liébana (31) mencionó que presentaron un
metabolismo aerobio siendo así gram positivas.
2.4.2.- Taxonomía.
Hooper (36) determinó de esta manera:
Reino: Fungi
Clase: Saccharomycetes
Orden: Saccharomycetales
Familia: Saccharomycetaceae
Género: Cándida
Especie: C. Álbicans
2.4.3.- Reproducción.
Ryan(33) manifestó que la Cándida Álbicans se reproduce por medio de
gemación mediante la formación de blastoconidias, puede formar hifas,
estimulada por temperatura, pH y nutrientes, las hifas en las etapas
iniciales, tienen el aspecto de retoños, denominados tubos germinales,
las seudohifas, son formas elongadas con restricciones a intervalos,
carecen de paredes paralelas y de la tabicación que se observa en las
hifas verdaderas. (37)
24
2.4.4.- Sensibilidad a la Nistatina.
Este medicamento es empleado en infecciones por hongos de tipo oral,
vaginal, intestinal, cutáneo y esofágico.
Barata (38) señaló que la nistatina es un medicamento de tipo poliénico,
con poca absorción intestinal a dosis bajas, que se aísla en cultivos de
streptomyces noursei, es un medicamento capaz de impedir el
crecimiento fúngico.
Barata (38) concluye que la nistatina a más de erradicar el origen de las
molestias como medicamento antifúngico tópico cada ocho horas
ayuda a desaparecer la presencia del hongo en la cavidad bucal.
Se elimina por vía renal, se emplea en infecciones fúngicas de piel y
mucosas, tales como la candidiasis o la estomatitis.
25
CAPITULO III
3.- METODOLOGÍA
Con la aprobación del Subcomité de Ética de Investigación en Seres Humanos de la
Universidad Central del Ecuador SEISH-UCE podemos realizar la investigación.
(VER ANEXO 1)
3.1- DISEÑO DE INVESTIGACIÓN.
Experimental.- Porque identificó actividad antifúngica del extracto
acuoso de las hojas secas de hierba mora sobre cepas de Cándida
Álbicans ACCT®10231TM .Se llevó a cabo con la aprobación de la Dra.
Isabel Fierro Decana en la Facultad de Ciencias Químicas de la
Universidad Central del Ecuador. (VER ANEXO 2)
In Vitro.- El experimento se realizó en un ambiente cerrado fuera del
organismo.
Comparativo.- Se determinó que a la máxima concentración de extracto
se logró un halo de inhibición pequeño y se observó la mayor actividad
de la nistatina.
3.2.- SUJETO Y TAMAÑO DE MUESTRA
-Trabajamos con cepas de Cándida Álbicans ATCC® 10231™ importadas
anteriormente por Medibac – Inc S.A.
-Se requirió 2 kilogramos de hojas secas de hierba mora traídas de la Provincia
del Carchi, con lo que se preparó el extracto acuoso.
26
-Para el método de difusión en disco, utilizamos 15 cajas Petri con medios de
cultivo Sabouraud-Dextrosa con agar inoculados con Cándida Álbicans ATCC
®10231™, con concentraciones obtenida del extracto acuoso de la hierba
mora al 50%, 75% y 100%, nistatina, la cual fue control positivo y para el
control negativo con agua destilada.
3.3.- CRITERIOS DE INCLUSIÓN.
Multiplicación de cepas de Cándida Álbicans ATCC ® 10231™
Cepas de Cándida Álbicans ATCC ® 10231™ que no hayan tenido contacto
con ningún tipo de reactivo.
Extracto acuoso de la Hierba Mora que sea del tipo (Solanum Nigrum)
3.4.- CRITERIOS DE EXCLUSIÓN.
Cultivos de Cándida Álbicans ATCC ® 10231™ que se hayan contaminado
con otros microorganismos.
Hongos tipo Cándida Álbicans ATCC que no han sido cultivadas bajo las
condiciones adecuadas para su crecimiento.
3.5.- SELECCIÓN DE LA MUESTRA.
Cepa liofilizada de Cándida Álbicans ATCC ® 10231™ importadas por
Laboratorios Medibac – Inc S.A, en condiciones y temperatura apropiada.
(VER ANEXO 3)
Hojas secas de la planta Hierba Mora un aproximado de 150mg traída de la
Provincia del Carchi
27
3.6.- DEFINICIÓN OPERACIONAL DE LAS VARIABLES
VARIABLE DEFINICIÓN OPERACIONAL TIPO CLASIFICACION INDICADOR CATEGÓRICO ESTANDARIZACIÓ
N
Actividad
antifúngica
Característica química del extracto acuoso
de las hojas secas de la hierba mora;
capacidad de alcanzar el efecto deseado,
tras un procedimiento alcanza la acción.
Dependiente Cualitativa
Nominal
Halo de inhibición Dirigido por la Dra.
Rachide Acosta
responsable del área
de Laboratorio
Químico y
Bacteriológico de la
Facultad de Ciencias
Químicas. Extracto acuoso al 50%,
75 y 100% de las hojas
secas de hierba mora
Sustancia química proveniente de la
desecación de las hojas de la hierba mora
para luego someterse a infusión.
Independiente Cuantitativa
Intervalo
Halo de actividad anti
fúngica
Elaborado por el
Biólogo Darwin
Roldan.
Cándida Álbicans ATCC
® 10231™ CEPA Es un hongo diploide asexual (forma de
levadura) y saprófito, de la familia de los
Sacaromicetos.
Dependiente Cuantitativo Grado de crecimiento Dirigido por la Dra.
Rachide Acosta
responsable del área
de Laboratorio
Químico y
Bacteriológico de la
Facultad de Ciencias
Químicas.
28
Nistatina
Antifúngico potente muy utilizado en cantidad
de 100.000 U
Independiente Cuantitativa
Mínima concentración
antifúngica
Dirigido por la Dra.
Rachide Acosta
responsable del área
de Laboratorio
Químico y
Bacteriológico de la
Facultad de Ciencias
Químicas.
29
3.7.- ORGANIZACIÓN Y PLANIFICACION DE LA INVESTIGACION.
3.7.1.- Infraestructura.
- Instalaciones de los Laboratorios de Análisis Clínico y Bacetariológico del
departamento de Ofertas Servicios y Productos de la Facultad de Ciencias
Químicas de la Universidad Central del Ecuador.
- Uso del Laboratorio de Análisis Clínico y Bacteriológico de la Facultad de Ciencias
Químicas de la Universidad Central del Ecuador.
- Unidad de Titulación de la Facultad de Odontología de la Universidad Central del
Ecuador.
3.7.2.- Recursos humanos.
Con los permisos requeridos se obtuvo la colaboración de la Dra. Rachide
Acosta quien se fue la encargada de la supervisión del proceso experimental,
al Bioquímico Darwin Roldan que colaboró en la elaboración del extracto,
realizando las respectivas diluciones, al Ing. Juan Carlos Túquerres, quien
ayudó con la recepción de los datos para elaborar los respectivos cuadros y
tablas estadísticas para comparar resultados y el personal designado de la
Facultad de Odontología encargados de evaluar los avances y trabajos finales
del presente estudio para que los resultados puedan ser confiables.
3.7.3.- Recursos Utilitarios.
MATERIALES.
Guantes.
Hisopos.
30
Discos de papel filtro de 6mm de diámetro.
Mascarilla.
Mandil.
Gafas.
EQUIPOS.
Autoclave.
Incubadora.
Cabina de flujo laminar II.
Refrigeradora.
Equipo tipo Quebec.
Estufa.
INSTRUMENTOS.
Cajas Petri.
Tubos de ensayo.
Pipetas.
Puntas para pipetas.
Asas bacteriológicas.
Gradilla.
MATERIAL BIOLÓGICO.
Extracto de las hojas secas de Hierba Mora
Nistatina 30mg/ml
Agua destilada.
Agar Sabouraud dextrosa.
Solución MacFarland 0.5
Cepas liofilizada de Cándida Álbicans ATCC®10231™
31
3.7.4.- Diseño de la Investigación.
3.7.4.1.- Preparación de las hojas de la Hierba Mora (Solanum Nigrum).
Recolección.
Se recolectaron las hojas de la Hierba Mora (Solanum nigrum) en la provincia del
Carchi cantón Espejo. Los cuales fueron desinfectados con Lysol, desechando las
partes marchitas. Luego se disecaron a temperatura ambiente durante tres días en un
ambiente donde no hay luz natural ni artificial colocados en recipientes limpios y
secos, posteriormente se empaquetó 2 kilogramos de lo recolectado en un recipiente
hermético y seco, se transportó las hojas hasta la ciudad de Quito, a los Laboratorios
de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Central del Ecuador.
Figura 2.- Recolección y desinfección de la Hierba Mora.
Elaboración.- Cantón Espejo, provincia del Carchi. Fecha.- 9/03/2018
Fuente.- Cuasés Tetamuez Mishelle Carolina.
32
Siguiente a esto la muestra fue triturada en un mortero y se depositaron en un
recipiente limpio y seco forrada con papel Kraft listas para su utilización.
Figura 3.- Trituración de las hojas de Hierba Mora.
Elaboración.- Laboratorio de la F.C.Q. Fecha.- 12/03/2018
Fuente.- Mishelle Carolina Cuasés Tetamuez
3.7.4.2.- Proceso de obtención del extracto de la Hierba Mora (Solanum
Nigrum)
El procedimiento para obtener las sustancias se basó en la extracción
sólido-líquido, donde se procedió a pesar las hojas de dicha planta, se
obtuvo 100g y se colocó en un cartucho de material poroso que se lo puso
en el equipo Soxhlet, añadiendo con el alcohol potable al 70% que actuó
como solvente para obtener el extracto de las hojas y filtrando de esta
forma el extracto en un recipiente estéril.
33
Figura 4.-Hojas colocadas en el papel filtro y luego en el equipo de Soxhlet
Elaboración.- Laboratorios de la F.C.Q. Fecha.- 19/03/2018
Fuente.- B.F. Darwin Roldan.
El extracto obtenido se almacenó en un recipiente de vidrio que no permita
el paso de la luz solar, cerrados herméticamente y colocados a refrigeración
y con la debida rotulación.
Figura 5.-Almacenamiento en envase de vidrio.
Elaboración.-Laboratorios de la F.C.Q. Fecha.- 20/03/2018
Fuente.- Mishelle Carolina Cuases Tetamuez.
34
3.7.4.3.- Dilución del extracto.
Luego de esperar la evaporación del alcohol durante una semana se precedió a
realizar las diluciones del extracto que de acuerdo a nuestro experimento se
realizaron 2 diluciones al 50% 75% con agua destilada, la concentración del 100%
no requiere dilución es el extracto puro, para realizar las diluciones se aplicó la
siguiente fórmula.
VICI= V2C2
Dónde:
V1 = Volumen de extracto concentrado.
C1= Concentración del extracto.
V2 = Volumen de extracto diluido a preparar.
C2 = Concentración del extracto diluido.
De esta manera se preparó 30 ml de solución del extracto de Hierba Mora al 50% a
partir de la solución al 100%.
V1 = C2V2 = (50%) (30ml)
C1 (100%)
V1 = 15ml del extracto de hierba mora.
VH2O = 15ml de agua destilada.
V1 + VH2O = 15ml + 15ml
VT = 30ml de extracto de hierba mora al 50%
35
De esta manera se preparó 30 ml de solución del extracto de Hierba Mora al 75% a
partir de la solución al 100%.
V1 = C2V2 = (75%) (30ml)
C1 (100%)
V1 = 22.5ml del extracto de hierba mora.
VH2O = 7.5 ml de agua destilada.
V1 + VH2O = 22.5ml + 7.5ml
VT = 30ml de extracto de hierba mora al 75%
.Figura 6.- Extractos al 50%, 75% y 100%
Elaboración.-Laboratorios de la F.C.Q. Fecha.- 21/03/2018
Fuente.- Mishelle Carolina Cuasés Tetamuez.
3.7.5.- Medio de Cultivo.
Se utilizó el medio de cultivo Agar Dextrosa Sabouraud 4% Merck, ya que es el
adecuado para el crecimiento de levaduras y hongos, en éste caso de Cándida
Álbicans. Es el medio selectivo recomendado por el Laboratorio de Análisis
Clínico y Bacteriológico de la Facultad de Química de la Universidad Central del
Ecuador.
36
Figura 7.- Colocación del medio de cultivo Agar Dextrosa Sabouraud 4% Merck sobre
discos Petri.
Elaboración: Laboratorio de Análisis Clínico y Bacteriológico de la Facultad de
Química de la Universidad Central del Ecuador.
Fecha: 19/03/2018 Fuente: Mishelle Carolina Cuasés Tetamuez
3.7.6.- Activación de la cepa Cándida Álbicans ATCC® 10231™
La cepa de Cándida Álbicans ATCC® 10231™ fue importada en rigurosas
condiciones de temperatura, en estado de liofilización en su envase KWIK-
STIK™. (VER ANEXO 4)
Para activación la cepa se la retiró de refrigeración y dejó a que se equilibre a
temperatura ambiente por 20 minutos, luego se siguió las recomendaciones de
apertura y uso con aproximadamente 10 pasos propuestas por el fabricante. (VER
ANEXO 5)
37
Fueron incubadas a temperatura 35°c por 24 horas en el Laboratorio de Análisis
Clínico y Bacteriológico de la Facultad de Química de la Universidad Central del
Ecuador.
Figura 8.- Activación de la cepa Cándida albicans ATCC® 10231™
Elaboración: Laboratorio de Análisis Clínico y Bacteriológico de la Facultad de
Química de la Universidad Central del Ecuador.
Fecha: 20/03/2018 Fuente: Mishelle Carolina Cuases Tetamuez.
Como referencia de turbidez se utilizó la estandarización de turbidez de 0,5
McFarland y se comparó visualmente con el caldo del inóculo previamente
elaborado con la cepa Cándida Álbicans ATCC® 10231™ para determinar que la
cantidad de bacterias por mililitro esté dentro de los índices preestablecidos. Se
obtuvo una escala de 1.5 x 109 u.f.c/ml de Cándida Álbicans ATCC® 1023™
38
Figura 9.- Caldo con inóculos de fúngicos en relación con escala estándar McFarland.
Elaboración: Laboratorio de Análisis Clínico y Bacteriológico de la Facultad de
Química de la Universidad Central del Ecuador.
Fecha: 26/03/2018 Fuente: Mishelle Carolina Cuases Tetamuez.
3.7.7.- Inoculación bacteriana para le experimentación.
Se sembró el fúngico sobre el medio de cultivo Sabouraud Dextrosa 4% Merck
localizado en las cajas Petri, previamente realizado la estandarización McFarland,
mediante un hisopo estéril el cuál fue presionado sobre las paredes del mismo para
reducir excesos. La siembra se realizó en diferentes direcciones con la finalidad de
esparcir sobre toda la superficie de la placa la levadura.
39
Figura 10.- Siembra en el medio de cultivo.
Elaboración: Laboratorio de Análisis Clínico y Bacteriológico de la Facultad de
Química de la Universidad Central del Ecuador.
Fecha: 26/03/2017 Fuente: Mishelle Carolina Cuasés Tetamuez.
3.7.7.1- Aplicación de los extractos sobre los discos y en los cultivos.
Se colocaron 20 micro litros de la diluciones (50%,75% y 100%) sobre cada disco
de papel con la ayuda de una pipeta. En cada caja Petri se colocó un disco de
control positivo Nistatina 30 mg/ml y un disco para control negativo con agua
destilada.
Figura 11.-Discos blancos embebidos con el extracto y colocados en las cajas Petri.
Elaboración: Laboratorio de Análisis Clínico y Bacteriológico de la Facultad de
Química de la Universidad Central del Ecuador.
Fecha: 26/03/2018Fuente: Mishelle Carolina Cuasés Tetamuez
40
3.7.7.2.- Incubación de los medios de cultivo.
Se incubó por 24 horas a temperatura de 35 grados.
Figura 12.- Colocación en la incubadora por un periodo de 24horas.
Elaboración: Laboratorio de Análisis Clínico y Bacteriológico de la Facultad de
Química de la Universidad Central del Ecuador.
Fecha: 26/03/2018 Fuente: Mishelle Carolina Cuasés Tetamuez.
3.7.7.3.- Medición de los halos de inhibición.
Se midieron los halos de inhibición a las 24 horas luego de su incubación,
utilizando una regla milimetrada Merck Sharp & Dohme y un contador de
colonias tipo Quebec. Se detallan los resultados en el capítulo IV.
41
Figura 13.- Contador de colonias tipo Quebec® y medicion de halos.
Elaboración: Laboratorio de Análisis Clínico y Bacteriológico de la Facultad de
Química de la Universidad Central del Ecuador.
Fecha: 27/03/2018 Fuente: Mishelle Carolina Cuasés Tetamuez.
3.7.3.4.- Manejo de Bioseguridad y Control.
Este proceso experimental se ejecutó dentro de la cámara de flujo laminar, que es un
equipo cuya función es filtrar el aire contaminado y emitir aire limpio en cada
momento mientras dura el proceso de experimentación. Se trabajó dentro de ésta
cabina para evitar contaminarnos
al respirar partículas de bacterias que afecten la salud, el medio ambiente y evitar a
toda escala que las muestras elaboradas se contaminen.
42
Figura 14. Cámara de flujo laminar tipo II.
Elaboración: Laboratorio de Análisis Clínico y Bacteriológico de la Facultad
de Química de la Universidad Central del Ecuador.
Fecha: 26/03/2018 Fuente: Mishelle Carolina Cuases Tetamuez.
3.7.3.5.- Eliminación de Desechos.
Los materiales e instrumentos como caja Petri, tubos de ensayo e hisopos que
fueron utilizados durante el proceso de experimentación fueron llevados a un
autoclave específico obviamente clasificados por alrededor de 30 minutos a
134°C, 1,1 atmósferas de presión, el paso final después del enfriamiento por
alrededor de 30min se coloca en fundas rojas rotuladas, pesar, fechar y enviar al
Depósito final de Desechos de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad
Central. (VER ANEXO 6)
43
La empresa que retira los desechos infecciosos de la Universidad es la empresa
“EMGIRS-EP”. Toda información adicional en base al manejo de material
infeccioso fue proporcionada por el laboratorio de análisis clínico y bacteriológico
(VER ANEXO 7)
Figura 15.- Autoclave derecha esteriliza material contaminado antes de su proceso final de
eliminación. Autoclave izquierda esteriliza material previo a su uso.
Elaboración: Laboratorio de Análisis Clínico y Bacteriológico de la Facultad de Química
de la Universidad Central del Ecuador.
Fecha: 28/03/2018 Fuente: Mishelle Carolina Cuasés Tetamuez
3.8.- ASPECTOS BIOÉTICOS.
Este estudio fue experimental, in vitro, se realizó con la aprobación de la Dra.
Isabel Fierro, Decana de la Facultad de Ciencias Químicas quien concedió el
uso de las instalaciones de los Laboratorios de Química del departamento de
Ofertas, servicios y Productos de la Facultad de Ciencias Químicas de la
Universidad Central del Ecuador y del Laboratorio de Análisis Clínico y
44
Bacteriológico a cargo de la Dra. Rachide Acosta, quien certifica que se ha
realizado la investigación en sus instalaciones. (VER ANEXO 9)
Por completo esta investigación se llevó a cabo en condiciones controladas, sin
experimentos en seres vivos, solamente con cepas liofilizadas fúngicas que
crecen en aereobiosis, por ello no se requiere un consentimiento informado ni
una declaración de confidencialidad. El análisis de los fundamentos bioéticos,
jurídicos y metodológicos de esta investigación fueron avalados por el Comité
de Ética de la Universidad Central.
3.9.1.- Riesgos potenciales del estudio.
Se cumplió todas las normativas establecidas por los Laboratorios de Facultad
de Ciencias Químicas, se siguió las normas de bioseguridad propuestas por el
laboratorio de análisis clínico y bacteriológico de la Facultad de Química de la
Universidad Central. Por ser un estudio in vitro no se estuvo expuesto a
fluidos.
3.9.2.- Beneficios potenciales del estudio.
Con este trabajo de investigación, se espera que el beneficio sea de la
Universidad Central del Ecuador, la Facultad de Odontología ya que puede
promover a los estudiantes con futuras investigaciones relacionadas a este
tema.
45
Con los resultados obtenidos, el beneficio será para las personas que llegue a
leer sobre este estudio, ya que con el avance científico en un futuro se
pretende motivar a seguir investigando y se opte por el consumo de productos
naturales para tratar patologías producidas por el fúngico en mención, Es una
alternativa de tratamiento que a mas ser eficaz es de fácil acceso elaboración y
bajo costo.
3.9.3.- Idoneidad ética y experticia técnica del investigador principal.
(VER ANEXO 9)
3.9.4.- Idoneidad ética y experticia técnica del tutor.
(VER ANEXO 10)
3.9.5.- Declaración de conflicto de intereses del investigador principal.
(VER ANEXO 11)
3.9.6.- Declaración de conflicto de intereses del turor.
(VER ANEXOS 12)
3.10.- RESULTADOS ESPERADOS.
Se espera obtener un muestreo lo suficientemente amplio para poder determinar
datos en este tipo de estudio; donde se pueda establecer la acción inhibitoria del
extracto acuoso de las hojas secas de Hierba Mora frente a la cepa C. Álbicans.
Datos que servirán para visualizar el beneficio que se tiene hoy en día, al utilizar
tratamientos a base de medicina natural como tratamientos antifúngicos.
Con esto se espera obtener información valiosa que ayude a que en un futuro se
puedan utilizar colutorios a base de extractos naturales en el tratamiento de
micosis oportunistas que afectan a las mucosas bucales, e ir creando nuevas
46
alternativas que sean de fácil acceso para aquellos sectores de bajos recursos
económicos, con lo cual se espera que tengan también acceso a un sistema de
salud bucal a base de medicina natural el cual lo puedan obtener sin ningún
costo.
47
CAPITULO IV
4. 1.- ANÁLISIS DE RESULTADOS.
El objetivo de la investigación fue analizar la actividad antifúngica que podría
producir el extracto acuoso de la planta Hierba Mora sobre cepas de Cándida
Álbicans, para ello se llevó a cabo un proceso experimental en el que se midió
en milímetros los halos de inhibición capaces de ser creados por el extracto en
mención sobre el fúngico, la técnica utilizada fue de difusión en agar, y los
resultados fueron avalados por profesionales especialistas.(VER ANEXO 13)
Análisis de la información.
A partir del informe suministrado por el Laboratorio de Ciencias Químicas de
la Universidad Central, se procedió a estimar el valor promedio del halo de
inhibición de cada cepa, mediante el uso de una hoja de cálculo en Microsoft
Excel 2010. Con dicho valor medio se diseñó una base de datos en el programa
SPSS 23 a fin de realizar el procesamiento estadísticos descriptivos e
inferencial.
Se aplicó la prueba de normalidad según Kolmogoron Smirnov, determinándose
que las distribuciones no podrían considerarse como normales por lo cual para la
comparación de la eficacia de las soluciones inhibidoras de Cándica albicans se
debieron emplear las pruebas no paramétricas; en este caso Kruskal Wallis (para
los grupos), U Mann Whitney (para pares) y Chi cuadrado (para nivel de
sensibilidad de las soluciones).
48
4.2.- RESULTADOS.
Tabla 1.- Resultados de Inhibición por grupo.
HIERBA MORA (SOLANUM NIGRUM) NISTATINA
AGUA DESTILADA
50% 75% 100%
REPETICIÓN HALOS DE INHIBICIÓN (mm) HALOS DE INHIBICIÓN (mm)
1 6 6 9 20 6
2 6 6 8 23 6
3 6 7 9 25 6
4 6 7 9 24 6
5 6 6 8 23 6
6 6 6 9 25 6
7 6 7 9 24 6
8 6 7 9 25 6
9 6 7 8 23 6
10 6 6 9 25 6
11 6 7 9 24 6
12 6 7 8 24 6
13 6 7 8 25 6
14 6 6 9 23 6
15 6 7 9 24 6
Se observó que en la solución acuosa con Hierba mora al 50%, no se formó halo
de inhibición, al igual que con el control negativo, por ello el valor reportado es
de 6mm que equivale al diámetro del disco de difusión empleado en la
experiencia. Además es evidente que al aumentar la concentración de Hierba
mora, aumentó el diámetro del halo de inhibición, aun cuando estos valores
estuvieron muy por debajo del hallado para el control positivo.
49
A partir de estos resultados se procedió a estimar los estadísticos descriptivos
como se indican en las siguientes tablas y gráficas.
Tabla 2.- Estadísticos descriptivos de la distribución de halos de inhibición por grupo.
Se realizó el análisis estadístico descriptivo de cada uno de los grupos en estudio
(cepas), caracterizado por el agente INHIBITORIO. En base a los resultados se
observa que dentro de cada grupo existió homogeneidad del diámetro, y a medida que
se aumentó la concentración de hierba mora, también aumentó el halo formado.
El grupo con solución acuosa al 50% de Hierba mora, al igual que el control negativo
presentaron un valor constante (diámetro del disco 6mm), lo que indicó ausencia de
formación de halo, por ello no se han estimado sus estadísticos descriptivos.
Estadístico Hierba mora
75% Hierba mora
100%
Control positivo (Nistatina)
Media 6,60 8,67 23,80
95% de intervalo de confianza para la media
Límite inferior 6,32 8,40 23,07
Límite superior 6,88 8,94 24,53
Mediana 7,00 9,00 24,00
Varianza 0,26 0,24 1,74
Desviación estándar 0,51 0,49 1,32
Error estándar 0,13 0,13 0,34
Mínimo 6,00 8,00 20,00
Máximo 7,00 9,00 25,00
50
Figura 16.- Diagrama de caja y bigotes para la distribución de halos de inhibición por
grupo.
En la gráfica se observa la tendencia de los cinco grupos; el grupo 1 (50%) y el
grupo 5 (control negativo), se muestran constantes a valor de 6mm, y el valor de la
mediana para los grupos experimentales aumentó con la concentración, siendo de
7mm para la solución al 75% y de 9 mm para la concentración al 100%, valores
que se encuentran muy por debajo del control positivo que presentó una mediana
de 24mm.
Dado que se muestrearon 15 discos por grupo y en atención a los resultados
descriptivos, se procedió a desarrollar la prueba de Kolmogorov-Smirnov, con
corrección de Lilliefors y la de Shapiro Wilks para contrastar la hipótesis de
distribución normal.
51
Tabla 3.- Prueba de Normalidad mediante estadístico de Kolmogorov Smirnov.
GRUPO
Kolmogorov-Smirnovb Shapiro-Wilk
Estadístico gl Sig. Estadístico Gl Sig.
HALO Hierba
mora 75% ,38 15,00 ,00 ,63 15,00 ,00
Hierba
mora
100%
,42 15,00 ,00 ,60 15,00 ,00
Control
positivo
(Nistatina)
,23 15,00 ,04 ,79 15,00 ,00
Las dos pruebas determinaron que los tres grupos con datos (no constantes)
referidos al halo de inhibición, no cumplieron con el criterio de normalidad
(p<0,05), por lo que para el procesamiento inferencial, fue necesario considerar la
pruebas no paramétricas.
Tabla 4.- Media y desviación estándar del halo de inhibición por grupo.
GRUPO MEDIA (DS)
Hierba mora
50% 6,0 (0,00)
Hierba mora
75% 6,6 (0,51)
Hierba mora
100% 8,7 (0,49)
Control positivo
(Nistatina) 23,8 (1,32)
Control negativo
(Agua destilada)
6,0 (0,00)
52
A juzgar por los valores de la media, la hierba mora al 75% apenas sobrepasa el valor de 6
mm y al 100% se presentó un valor de 8,7mm, en tanto que para las Nistatina el valor
medio fue sumamente alto en este caso 23,8 mm.
Al realizar la prueba de Kruskal Wallis (H- test), la significancia fue p <0,01, con lo que se
pudo inferir que existían diferencias significativas en el valor medio del halo, y por lo tanto
en la efectividad.
Figura 17.- Media del halo de inhibición por grupo.
Se realizó la prueba de Kruskal Wallis para los tres grupos (con distribución no
uniforme), con el fin de establecer si existía diferencia significativa en la capacidad
inhibitoria determinada por el diámetro del halo de inhibición.
6,0 6,6
8,7
23,8
6,0
Hierba mora50%
Hierba mora75%
Hierba mora100%
Control positivo(Nistatina)
Controlnegativo (Agua
destilada)
53
Tabla 5.- Resultados de la prueba de Kruskal Wallis.
GRUPO N
Rango
promedio
Chi-
cuadrado
Signifinacia
asintótica
(p)
HALO Hierba
mora 50% 15 8,00 40,162 ,000
Hierba
mora
100%
15 23,00
Control
positivo
(Nistatina)
15 38,00
Total 45
Al realizar el análisis de los valores medios de cada grupo, se determinó una
significancia inferior a la crítica (p<0,001), determinando que si existió diferencia en la
capacidad inhibitoria entre los grupos, por lo que se realizó además la prueba U Mann
Whitney para determinar si las diferencias encontradas en los valores medios del halo de
inhibición de pares correspondientes eran significativas, encontrándose lo siguiente:
54
Tabla 6.- Resultados de la prueba de U Mann Whitney.
(I) GRUPO
Diferencia de medias
(I-J) Significancia (p)
Hierba mora 50% Hierba mora 75% -,60 ,113
Hierba mora 100% -2,67 ,000
Control positivo
(Nistatina) -17,8 ,000
Control negativo
(Agua destilada) 0,00 1,000
Hierba mora 75% Hierba mora 100% -2,07 ,000
Control positivo
(Nistatina) -17,2 ,000
Control negativo
(Agua destilada)
,60
,113
Hierba mora 100% Control positivo
(Nistatina) -15,13 ,000
Control negativo
(Agua destilada) 2,67 ,000
Control positivo
(Nistatina)
Control negativo
(Agua destilada) 17,8 ,000
.
Se observa que prácticamente no hay diferencia en las soluciones de 50% y 75% respecto al
control negativo, es decir que a estas concentraciones serían ineficientes en el control de
Cándida Álbicans.
En tanto que al 100% ya presenta diferencia significativa respecto a las concentraciones
anteriores, pero a su vez es mucha más baja que el control positivo.
55
Adicionalmente se evaluó el nivel de sensibilidad de las soluciones frente a Cándida
Álbicans, empleando la siguiente escala: halo: <8mm : resistente; 8≤Halo≤14: sensibilidad
intermedia ( o al límite); Halo > 14mm: sumamente sensible.
Tabla 7.- Nivel de sensibilidad del grupo frente a Cándida Álbicans.
GRUPO
SENSIBILIDAD
Total Resistente
Sensibilidad al
límite
Sumamente
sensible
Hierba mora
50% 15 (100) 0 0 15
Hierba mora
75% 15 (100) 0 0 15
Hierba mora
100% 0 15 (100) 0 15
Control positivo
(Nistatina) 0 0 15 (100) 15
Control negativo
(Agua destilada) 15 (100) 0 0 15
Total 45 15 15 75
56
Figura 18.- Nivel de sensibilidad del grupo frente a Cándida Álbicans.
Se observó una total dependencia del nivel de sensibilidad en función al grupo, de acuerdo
a la prueba de chi cuadrado (p=0). El control positivo en un 100% se mostró como
sumamente sensibles, en el caso de Hierba Mora al 100% se llegó al nivel de
sensibilidad intermedia, para el resto de grupos se determinó un nivel de 100%
resistente.
100 100 100100 100
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Hierba mora50%
Hierba mora75%
Hierba mora100%
Controlpositivo
(Nistatina)
Controlnegativo (Agua
destilada)
Resistente Sensibilidad al límite Sumamente sensible
57
CAPITULO V
5.1 DISCUSIÓN.
Esta planta se ha investigada científicamente por dos ocasiones, aplicado al campo
de la salud, para la cual tomaremos referencia de estos artículos sobre la planta
Hierba Mora para posibles comparaciones de datos.
En esta investigación se buscó una alternativa como una posibilidad de que esta una
planta existente en el Ecuador, y de la que no se tiene evidencias científicas de su
utilización, puede demostrar actividad sobre un patógeno existente en cavidad oral
como es la Cándida Álbicans, para ello se vio la necesidad de hacer un estudio
experimental, con la técnica de difusión en disco, y el análisis de resultados indicó
que va a depender del grado de concentración aplicado tendrá una actividad
antifúngica.
La eficacia del extracto acuoso de la planta Hierba Mora sobre Cándida Álbicans,
fue comprobada por un estudio realizad por la revista Cubana de Plantas
medicinales Scielo, los cuales utilizaron métodos distintos para llegar a un mismo
fin, como la utilización de Dimetilsulfóxido (3) (DMSO) que es un disolvente
orgánico sobre la planta a comparación de que en otro estudio solo se empleó el
método de infusión de las hojas secas de la Hierba Mora al 20% de concentración
(5). En nuestra investigación se realizó con alcohol potable al 70% obteniendo como
resultado un efecto de inhibición leve.
58
Martinez (5)determinó en su estudio que al utilizar el extracto de la planta hierba
mora al 20% de concentración puede formar halos de inhibición sobre Cándida
Álbicans en la realización de su prueba experimental in vitro. Los resultados tienen
algo de concordancia a nuestra investigación, ya que el extracto si detuvo
levemente el crecimiento fúngico, dependiendo la concentración a la que fue
expuesta.
Martínez (5)mencionó que el extracto acuoso de la planta Hierba Mora inhibe
Cándida Álbicans manifestando halos mayores a los 15 mm, al igual que el otro
estudio según Ansaloni (3) describió que, se formó un halo de inhibición de 18mm
lo que discrepa de la investigación presente, ya que la concentración de 100% tuvo
la mayor zona de inhibición en 9 mm existiendo una diferencia de aproximadamente
6 mm- 9 mm, respectivamente.
En este experimento se realizaron tres concentraciones 50%,75% y 100% del
extracto acuoso obteniendo valores inhibitorios con promedio de 6mm, 7mm y
9mm respectivamente, mientras que en el estudio de Martínez (5) se realizó con una
única concentración de 20% obteniendo valores mayores o iguales a 15mm de
inhibición frente a Cándida Álbicans, en el estudio de Ansaloni (3) recalcó que
utilizando como solvente el Dimetilsulfóxido se obtuvo valores de 18mm de halos
de inhibición. En nuestro estudio únicamente se utilizó alcohol potable al 70% por
lo tanto, cabe mencionar la diferencia en el estudio.
59
Ansaloni (3)indicó que, las concentraciones de nistatina al 0,2mg/ml obtuvieron
inhibición de 37mm frente a Cándida siempre y cuando estén disueltas en
Dimetilsulfóxido. Así también Martínez (5)demostró en su investigación que con
una concentración al 20% de extracto acuoso de Hierba Mora se podía inhibir el
crecimiento de Cándida Álbicans, en nuestro estudio no se utilizó disolvente
orgánico Dimetilsulfóxido y realizamos varias concentraciones, en cuanto a la
nistatina únicamente utilizamos nistatina en concentración de 30mg/ml y el valor
promedio de inhibición fue de 24mm frente a Cándida Álbicans. Razón por la cual
el estudio varía.
En el estudio de Ansaloni (3) empleó Dimetilsulfóxido con una concentración de
extracto al 100% y en el estudio de Martínez (5)se empleó concentraciones de
extracto acuoso al 20% y en nuestro estudio concentraciones de 50%, 75% y 100%
teniendo actividad antifúngica leve solo a la concentración de 100%, entonces
determinamos que la variación de resultados se debe a las diferentes sustancias
empleadas y a los métodos de obtención del extracto de la planta Hierba Mora, por
lo que se sugiere ampliar el estudio de esta planta creando aceites, extractos o
esencias con diferentes métodos de obtención ya que es de fácil recolección
existente en el Ecuador.
60
6.-CONCLUSIONES.
- El extracto acuoso de las hojas de Hierba Mora a concentraciones del 100%
presentó actividad antifúngica en el estudio in vitro sobre Cándida Álbicans
con un promedio de halos de inhibición de 9mm.
- El extracto acuoso de las hojas de Hierba Mora a concentraciones a
concentraciones del 75% presentó actividad antimicrobiana in vitro sobre
Cándida Álbicans con un promedio de halos de inhibición de 7 mm.
- El extracto acuoso de las hojas de Hierba Mora a concentraciones a
concentraciones del 50% no presentó actividad antimicrobiana in vitro
sobre Cándida Álbicans.
- La nistatina presentó halos de inhibición in vitro por un promedio de 24 mm
frente a Cándida Álbicans.
- Cándida Álbicans demostró ser sensible al extracto acuoso de las hojas de
Hierba Mora a concentraciones del 75% y 100%, no obstante, presentó
mayor sensibilidad frente a la nistatina 30mg/ml.
61
7.-RECOMENDACIONES.
- Se recomienda realizar estudios dónde se utilice Dimetilsulfóxido como
disolvente a las mismas concentraciones de 50%, 75% y 100% para poder
determinar cuáles son las semejanzas o las diferencias al utilizarlo.
- Se sugiere realizar el extracto por otros métodos de obtención ya que
dependiendo de eso se puede llegar a tener mejores valores de actividad
antifúngica frente a Cándida Álbicans.
- Debido a su actividad inhibitoria, se sugiere investigaciones junto a
medicamentos naturales ya existentes en el mercado para poder potenciar su
acción antifúngica y se lo pueda emplear en el campo de la medicina.
- Se recomienda realizar una experimentación del extracto acuoso de la planta
fresca versus la planta seca, para saber si varía los resultados.
- Motivar a los estudiantes que realicen estudios posteriores a fin de descubrir
si la planta puede actuar con diferentes microorganismos que se localizan en
boca, a fin de encontrar soluciones a patologías orales.
62
8.- BIBLIOGRAFÍA.
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albicans. Yeast. 2000 Marzo; 16(4).
2. Aguirre J. Candidiasis orales. Iberoamericana de Micología. 2002; 19.
3. Ansaloni , Wilches , León , Orellana , Peñaherrera , Tobar , et al. Estudio Preliminar
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Azuay, Cañar y Loja, para Afecciones del Aparato Gastrointestinal. Tecnológica ESPO-
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Quinta ed. Buenos Aires: Panamericana; 2009.
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ANEXOS
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Anexo 1.- Certificado de Aprobación por el SEISH-UCE.
66
Anexo 2.- Aprobación para el uso y asesoramientos de los Laboratorios de la F.C.Q.
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Anexo 3.- Factura de compra de Cándida Álbicans ATCC®10231™.
68
Anexo 4.- Certificado de calidad de la cepa Cándida Álbicans ATCC®10231™.
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Anexo 5.- Instrucciones de uso y activación de la cepa Cándida Albicans® 10231™.
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Anexo 6.- Certificado de esterilización de los materiales.
71
Anexo 7.- Protocolo de Manejo de Desechos.
72
Anexo 8.- Autorización para el uso de las instalaciones del Depósito de Desechos
Infecciosos.
73
Anexo 9.- Certificado de haber realizado el experimento.
74
Anexo 10.- Certificado de idoneidad del autor.
75
Anexo 11.- Certificado de idoneidad del tutor.
76
Anexo 12.- Declaración de conflicto de interés del autor.
77
Anexo 13.- Declaración de conflicto de interés del tutor.
78
Anexo 14.- Certificado de análisis de resultados.
79
Anexo 15.- Renuncia al trabajo estadístico.
80
Anexo 16.- Certificado de Urkund Analysis Result
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