Ventajas de la
quimioluminiscencia en el
diagnóstico de las
enfermedades autoinmunes
Actualización en Autoinmunidad: nuevas tecnologías en
el laboratorio
10/25/2016
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Historia de los inmunoensayos
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1950 1960 1970 1980 1990 2000 2010
1977
Premio Nobel
R. Yalow &
S. Berson
1950s
RIA & Latex
Yalow & Berson
Singer & Plotz
Rosalyn Sussman Yalow
1971
ELISA
P. Perlmann &
E. Engvall
A. Schuurs &
B. van Weemen
Eva Engvall
1983
Quimio-
luminiscencia
A. Campbell
& Ashok Patel
Quimioluminiscencia en Química Clínica
A. Campbell & Ashok Patel
En autoinmunidad
2011
BIO-FLASH
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Tipos de inmunoensayo
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• Los tipos de inmunoensayo comerciales más comunes
• Factores diferenciales: - Revelado (colorimétrico, fluorescencia, quimioluminiscencia, …)
- Fase sólida (placa, micropartícula, …)
ELISA / FEIA Fluorescencia Quimioluminiscencia
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Tipos de inmunoensayo
• Selección del inmunoensayo en función del rango de
medida
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INMUNOFLUORESCENCIA
NEFELOMETRIA
TURBIDIMETRIA POTENCIADA POR LATEX
TURBIDIMETRIA
ELISA
QUIMIOLUMINESCENCIA (CMIA)
1 pg/mL 1 ng/mL 1 µg/mL 1 mg/mL
Concentración de analito
RIA
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¿Que es la quimioluminiscencia?
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Reacción quimioluminiscente
• Emisión de luz generada a partir de una reacción química,
generalmente dentro del espectro visible (380 - 780 nm)
• Dependiendo de la cinética de la emisión de luz: - Flash: emisión rápida llegando al pico en décimas de segundo y
decayendo en pocos segundos (Acridinio, Derivados del luminol…)
- Glow: emisión lenta, llegando al máximo en minutos y
manteniéndose estable por cerca de una hora (dioxetanos)
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500
1000
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2000
2500
3000
3500
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
Un
idad
es
Re
lati
vas
de
Lu
z (
RLU
s)
Tiempo (s)
Flash
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0 5 10 15 20 25 30 35
Un
idad
es
Re
lati
vas
de
Lu
z (
RLU
s)
Tiempo (min)
Glow
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Reacción quimioluminiscente
• Ejemplo de reacción: isoluminol
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Isoluminol
Tautomerización
Peróxido cíclico 3-aminoftalato
en estado excitado
Forma ceto Forma enol
Luz
H2O2 + NaOH
+ catalizador
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Ensayos CMIA: “Chemiluminescent
Microparticle Immunoassay”
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Esquema de ensayo CMIA
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Microparticulas 20 µL
Tampón Ensayo 80 µL
Muestra
Disp. & Mix
Incubación 10 min
Conjugado 150 µL
Disp. & Mix
Incubación 10 min
Aspirar
Dispensar 600 µl x 4
Aspirar x 4
MagWash
Aspirar
Dispensar 600 µl x 4
Aspirar x 4
MagWash
T1 (NaOH) 200 µl
T2 (H2O2) 200 µl
Disp. & Lectura
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Resultado
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• La luz (RLU) es directamente proporcional a la cantidad de
analito. Se interpolan las RLU en una curva de calibración de
concentración conocida
NaOH + catalizador
Peróxido
RL
U
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La fase sólida
• Partículas paramagnéticas de
entre 1 – 3 µm de gran
homogeneidad.
• Sólo en presencia de un campo
magnético son atraídas. No
presentan magnetismo
residual.
• Ofrecen gran versatilidad al
permitir ser funcionalizadas
con un gran número de
grupos químicos reactivos
• Unión antígeno-anticuerpo
en fase líquida. © B
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La fase sólida
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OH C
O
NH2
CH3
O
O
O S
CH2 CH CH2 O
O
Cobalt-based -
Streptavidin -
Protein A -
Protein C -
Anti-mouse IgG -
Grupos epoxi, carboxilo, tosilo
y amino son ejemplos de
funciones químicas para unir
covalentemente a las partículas
paramagnéticas el antígeno o
anticuerpo de interés. Su
orientación será al azar.
Ag o Ab con colas de histidina o biotiniladas
pueden inmovilizarse a partículas
magnéticas basadas en cobalto o
estrepavidina. Los Ab y mAb de ratón
pueden unirse a las partículas magnéticas
vía proteínas A/C o anti-IgG de ratón de una
manera más orientada.
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La fase sólida - Comparativa
Pocillos ELISA, ELFIA
Partículas paramagnéticas CMIA
Mayor superficie total
• Diámetro de partícula 1-3 µm
Lavado por separación magnética y aspiración
Gran versatilidad en unión covalente a múltiples grupos funcionales
Menor tiempo de incubación. Captura más rápida <10 minutos
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Menor superficie total
• ~2.5 cm2
Lavado por aspiración
Mayoritariamente unión por adsorción
Mayor tiempo de incubación
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El Conjugado
• Hay un abanico de compuestos quimioluminiscentes
usados para marcar los conjugados. Los productos
QUANTA Flash usan un derivado del isoluminol:
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Vía una unión amida (o pseudo-peptídica), el Ag o Ab (R) se une a la molécula
aminobutiletilisoluminol separado por un espaciador, lo que reduce el efecto pantalla
(quenching) de la proteína
N-(4-Aminobutil)-N-etilisoluminol
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Fotomultiplicador (PMT)
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• SPAD – Single Photon Avalanche Detector
• Gran rango dinámico (107)
• Capaz de detectar pocos fotones
• Mínimo ruido de fondo, mayor sensibilidad
• La luz es directamente proporcional a la cantidad de analito
NaOH + catalizador
Peróxido
RL
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Ventajas del CMIA
• Linealidad del ensayo significativamente superior (Rango
analítico).
• Mayor sensibilidad analítica (Límite de detección y Límite
de cuantificación).
• Mayor especificidad.
• Mejor precisión.
• Reacción significativamente más rápida.
• Mayor versatilidad en la unión de proteínas.
• Mayor automatización.
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Sumario
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