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Genética molecular

Organización, regulación y manipulación genética

Dra. Mildred Jiménez

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Objetivos

Comprender las bases moleculares de las mutaciones que conllevan a las enfermedades genéticas

Usar tal información para mejorar diagnósticos y tratamientos

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I- Análisis de secuencias individuales de ADN y ARN

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Limitantes iniciales Obtener cantidad suficiente de la secuencia de ADN o ARN de interés a ser analizada.

Purificar la secuencia de interés dentro de todos los demás segmentos de ADN o ARNm presentes en la célula.

clonaje molecular y PCR

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Clonaje Molecular

Involucra la transferencia de una secuencia de ADN de interés a una célula o microorganismo.

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Cultivo del microorganismo Cultivo del microorganismo

Reproducción de la secuencia de ADN Reproducción de la secuencia de ADN introducida + ADN propiointroducida + ADN propio

Aislamiento de las secuencias de Aislamiento de las secuencias de interés en grandes cantidadesinterés en grandes cantidades

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Enzimas de Restricción 1970’s endonucleasa de restricción bacterianas (enzimas de restricción)

Reconocen secuencias específicas de la doble banda del ADN y lo cortan cerca o en el sitio de reconocimiento.

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Enzimas de restricción Secuencias de 4 - 6 pb

Secuencias palindrómicas

5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’

Extremos pegagosos o romos

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EcoRI Reconoce la secuencia específica de 6 pb

Corta en cada hebra entre las bases G y A

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Enzima Origen Bacteriano

Sitio de Reconocimiento

Resultado del Corte

EcoRI Escherichia coli

5'GAATTC 3'CTTAAG

5'---G**AATTC---3' 3'---CTTAA**G---5'

BamHIBacillus amyloliquefaciens

5'GGATCC 3'CCTAGG

5'---G**GATCC---3' 3'---CCTAG**G---5'

HindIII

Haemophilus influenzae

5'AAGCTT 3'TTCGAA

5'---A**AGCTT---3' 3'---TTCGA**A---5'

Sau3A Staphylococcus aureus

5'GATC 3'CTAG

5'---**GATC---3' 3'---CTAG**---3'

PovII* Proteus vulgaris

5'CAGCTG 3'GTCGAC

5'---CAG**CTG---3' 3'---GTC**GAC---5'

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La digestión de una molécula de ADN con una enzima de restricción determinada

colección reproducible y

característica de fragmentos de ADN

refleja la frecuencia y localización de

sitios específicos de restricción

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Implicaciones

1- Un solo cambio de una sola base puede abolir el reconocimiento de la enzima por el sitio y por lo tanto su capacidad de corte en ese determinado lugar

2- Toda las moléculas de ADN digeridas con EcoRI, tienen los mismos extremos pegagosos.

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Vectores

“Molécula de ADN que se puede replicar de forma autónoma en un huesped (célula bacteriana o levadura) del cual puede ser aislado de una forma pura para su subsecuente análisis.”

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Los vectores pueden alcanzar un alto número de copias por célula.

Las bacterias y levaduras se pueden hacer crecer indefinidamente en un laboratorio

grandes cantidades del ADN de interés

El clonaje de fragmentos humanos de ADN en un vector por medio de enzimas de restricción y AND ligasa, permite la propagación del fragmentos de ADN clonado junto con la molécula del vector.

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ADN recombinante

“Nueva combinación de ADN creada in vitro entre secuencias de interés de ADN humano (u otro) y moléculas vectoras bacterianas (u otras) capaces de duplicarse indefinidamente dentro

de una cepa de laboratorio”

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Vectores Plásmidos

Bacteriófago Lambda

Cósmidos

BACs y YACs

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Plásmidos ADN circular doble banda Se replica extracromosomalmente En bacterias o levaduras Resistencia a antibióticos Segmentos cortos de ADN (hasta 15 kb) Selección

pocos kb marcadores (resistencia a antibióticos) sitios de restricción

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Bacteriófago Lambda Virus bacterial ADN db relativamente largo (45kb) 1/3 de su genoma es no esencial Infecta las bacterias y se replica en la bacteria produciendo cantidades enormes de virus (hasta 1 millón)

Puede crear lisis bacteriana Segmentos de ADN de hasta 20 kb

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Cósmidos Plásmidos que utilizan la habilidad de las partículas infecciosas del bacteriófago lambda para empaquetar eficientemente piezas lineares de ADN y luego adherirse a la superficie de las bacterias e inyectar el contenido de ADN.

Permite segmentos insertos de hasta 45 kb Secuencias Cos

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BACs

Bacterial Artificial Chromosomes Plásmidos enormes 1990’s Pueden contener insertos de hasta 300 kb

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YACs

Yeast Artificial Chromosomes Vector con mayor capacidad (hasta 2000 kb)

Se transfiere a Saccharomyces cerevisiae

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Librerías Genómicas 1- Digestión parcial del ADN genómico con una enzima de restricción.

2- Digestión del vector (misma ER)

3- Ligación del vector (ADN ligasa)

4- Introducción en célula huesped

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Librerías de ADN complementario

Ventajas: Representación directa de las secuencias codificantes (no intrones)

Tejidos con expresión selectiva

ADNc: copias de la población de ARNm presente en un determinado tejido.

Transcriptasa reversa

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Transcriptasa Reversa ADN polimerasa dependiente de ARN

Derivada de retrovirus

Requiere de primer para iniciar síntesis de ADN (oligo -dT). Oligo dT se une a la cola de poli A de los ARNm

Niveles de ARNm transcripto

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Sondas de Acido Nucleico

identificación del clon que lleva la secuencia de interés

screening de una librería

hibridización del ácido nucleico

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Marcadores (probes) A una secuencia X de ácidos nucleicos se prueba su complementaridad con un fragmento de ADN o ARN conocido y marcado (que se puede detectar).

Marcaje: Trazadores radioactivos (Fósforo 32) Compuestos histoquímicos Colorante fluorescente

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acgacttgag

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Hibridación

Hebra simple desnaturalización

Formación de dobles hebras hibridización a fragmentos de ADN marcados con secuencia nucleótidica equivalente

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II- Reacción en Cadena de la Polimerasa

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PCR Alternativa al clonaje Generar cantidades ilimitadas de una secuencia de interés

Es una amplificación enzimática de un fragmento de ADN (blanco o molde) situado entre dos oligonucleótidos “primers”

PCR ADN Primers: le dan la especificidad

ADN polimerasa Cofactores enzimáticos A,G,T,C

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Amplificación exponencial

2n n= # ciclos

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PCR reverso Amplificación a partir de ARN

ARNm ADNc amplificación

transcriptasa polimerasa

reversa primers…

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Porciones particulares del gen (usualmente exones) se pueden amplificar utilizando primers específicos para el gen normal o el gen mutado.

diagnóstico por amplificación

diagnóstico por ASO en SB

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III- Métodos para el análisis de ácidos nucleicos

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Southern Blotting Mediados de los 70’s Método estándar para analizar la estructura del ADN digerido por enzimas de restricción

1- Aislamiento del ADN 10 ml de sangre => 108 leucocitos => 100µg de ADN

2- Digestión => ≈ 1 millón de fragmentos 3- Separación de los fragmentos según su tamaño ==> electroforesis en geles de agarosa

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4- Blotting: A) desnaturalización (base fuerte) B) transferencia a un filtro de nitrocelulosa (blotting), por corriente eléctrica

5- Unión con una sonda marcada ==> hidridación

6- Lavados 7- Revelado (exposición al revelador, placa de rayos X…)

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Electroforesis en geles de agarosa

Separa las moléculas por tamaño

Fragmentos pequeños migran más rapidamente que los grandes

Tinción con bromuro de etidio ==> Fluoresce con luz UV

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NEGATIVO POSITIVO

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Análisis con sondas alelo específicas Sonda sintética de oligonucleótidos = ASO (Allele Specific Oligonucleotide)

Corta longitud aprox. 20 pb ===> sensible a diferencias en un par de bases

ASOs para el alelo normal o para el alelo mutado

Permite diferenciar homocigotas y heterocigotas

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Porciones particulares del gen (usualmente exones) se pueden amplificar utilizando primers específicos para el gen normal o el gen mutado.

diagnóstico por amplificación

diagnóstico por ASO en SB

79Thompson & Thompson Genetics in Medicine

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IV- Métodos para análisis de proteínas

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Western Blotting

1- Aislamiento de las proteínas de la muestra

2- Separación por electroforesis en geles de poliacrilamida

3- Transferencia a membrana 4- Incubación de la membrana con Ac anti -proteína en cuestión

5- Adición de un segundo Ac marcado 6- Revelado

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V- Análisis de la secuencia de ADN

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Secuenciación de Sanger

Análogos de nucleótidos que inhiben la polimerasa

“Materiales”: ADN molde a secuenciar Primers ADN polimerasa dNTPs ddNTPs análogos marcados (fluorescencia o radiación)

Electroforesis en gel de agarosa

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VI- Hibridación in situ de cromosomas

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FISH (hibridación fluorescente in situ )

Cromosomas en metafase se fijan en portaobjetos

Se desnaturalizan in situ ==> se exponen las dos hebras del ADN

Se hibridizan con sondas marcadas con un colorante fluorescente

Se visualizan al microscopio de fluorescencia con una longitud de onda que y un filtro para observar el fluorocromo

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“Chromosome painting” Parte de un brazo cromosómico Todo un brazo El cromosoma entero

Spectral karyotiping (SKY)

Análisis de telómeros / microdeleciones

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Mapeo por FISH Permite visualización directa de la posición del gen Regiones de 1-2 millones de pb (cromatina condensada)

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Un caso interesante de transferencia de genes se ilustra en este experimento en el que aisló el gen para la enzima luciferasa de las luciérnagas y se incorporó en esta planta.

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Literatura:

Nelson D, Cox M. Lehninger Principles in Biochemistry.

Strachan T, Read A. Human Molecular Genetics

Nussbaum R, McInnes R, Willard H. Thompson & Thompson Genetics in Medicine.

Bases de datos:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/http://www.ensembl.org/