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TESIS DOCTORAL
ANOMALÍAS
EN EL PERFIL DE METILACIÓN COMO
BIO-MARCADOR EN EL CÁNCER DE MAMA
JOAQUINA MARTÍNEZ GALÁN
Oncología Médica y Radioterápica
UNIVERSIDAD DE GRANADA
DEPARTAMENTO DE RADIOLOGÍA
Y
MEDICINA FÍSICA
Editor: Editorial de la Universidad de GranadaAutor: Joaquina Martínez GalánD.L.: GR 2002-2011ISBN: 978-84-694-0204-7
Joaquina Martínez-Galán Índice
ii
ÍNDICE
1. INTRODUCCIÓN ………………………………………………………………………………… 1
1.1. EPIDEMIOLOGÍA ………………………………………………………………………… 2
1.2. ETIOLOGÍA …………………………………………………………………………………. 7
1.2.1. Historia familiar ……………………………………………………………….. 9
1.2.2. Edad ………………………………………………………………………………….. 11
1.2.3. Historia menstrual y reproductiva …………………………………… 11
1.2.4. Terapia hormonal …………………………………………………………….. 13
1.2.5. Exposición a radiación ionizante………………………………………. 15
1.2.6. Historia de lesiones benignas …………………………………………… 16
1.2.7. Otros Factores de Riesgo …………………………………………………... 18
a) Dieta …………………………………………………………………………….. 18
b) Ingesta de alcohol ………………………………………………………… 18
c) Obesidad ……………………………………………………………………… 19
1.3. FACTORES PRONÓSTICOS Y PREDICTIVOS DE RESPUESTA EN EL
CÁNCER DE MAMA ……………………………………………………………………….
20
1.3.1. Factores dependientes del paciente. Edad ….……………………. 23
1.3.2. Factores dependientes de las características histológicas
del tumor …………………………………………………………………………. tumor
23
a) Estadio ganglionar “N” …………………………………………………. 23
b) Tamaño tumoral “T” ……………………………………………………. 25
c) Grado histológico “G” …………………………………………………… 26
d) Invasión linfovascular …………………………………………………. 27
e) Tipo histológico …………………………………………………………… 28
1.3.3. Factores dependientes de las características moleculares
del tumor ………………………………………………………………………….
29
a) Expresión de receptores hormonales ………………………….. 30
b) Expresión de Her-2/neu (erb-2) ………………………………….. 30
c) Proteína p53………………………………………………………………… 31
d) Ki-67 (mi 1) …………………………………………………………………. 32
e) Otros factores moleculares pendientes de validar.
Perfil génico …………………………………………………………………
33
Joaquina Martínez-Galán Índice
iii
1.4. PRUEBAS DIAGNÓSTICAS EMPLEADAS EN EL DIAGNÓSTICO DEL
CÁNCER DE MAMA. LIMITACIONES ACTUALES EN EL
DIAGNÓSTICO PRECOZ ………………………………………………………………..
35
1.4.1. Autoexploración ……………………………………………………………….. 36
1.4.2. Exploración mamaria por un clínico experto ………………….. 37
1.4.3. Ecografía mamaria ……………………………………………………………. 38
1.4.4. Mamografía ………………………………………………………………………. 38
1.4.5. Resonancia Nuclear Magnética ……………………………………….. 40
1.5. ALTERACIONES EPIGENÉTICAS EN EL CÁNCER …………………………… 42
1.5.1.Biología de las regiones CpG, metilación del ADN y
acetilación/desacetilación de las histonas ……………………… acetilación/desacetilación de las histonas
46
1.5.2. Aplicación del estudio del perfil de metilación aberrante
del ADN en el cáncer de mama ………………………………………….
52
1.5.3. Muestras y fluídos en los que se puede estudiar el perfil de
metilación ………………………………………………………………………...
56
a) Detección de ADN libre extraído de suero o plasma ….. 56
b) Detección del ADN tumoral a partir del lavado de los
conductos galactóforos …………………………………………………
57
1.5.4. Posibles campos de aplicación del estudio del ADN
metilado de forma patológica …………………………………………..
58
a) ADN metilado como marcador de riesgo en cáncer ……. 58
b) ADN metilado como marcador pronóstico en cáncer .… 60
c) ADN metilado como factor predictivo de respuesta
clínica en cáncer …………………………………………………………..
61
d) Aplicación del ADN metilado a la terapéutica del cáncer 63
1.6. GENES UTILIZADOS EN ESTE TRABAJO DE INVESTIGACIÓN. RUTAS METABÓLICAS EN LAS QUE INTERVIENE …………………………
65
1.6.1. Metilación en genes supresores de tumores ………………….. 65
1.6.2. Metilación en genes relacionados con los mecanismos de
control celular ………………………………………………………………….
67
1.6.3. Metilación de genes implicados en la reparación del ADN 69
1.6.4. Metilación de genes implicados en la adhesión celular … 69
1.6.5. Metilación en genes implicados en la prolferación celular 71
Joaquina Martínez-Galán Índice
iv
2. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS …………………………………………………………………… 73
2.1. HIPÓTESIS ………………………………………………………………………………… 75
2.2. OBJETIVOS ………………………………………………………………………………… 77
3. MATERIAL Y MÉTODOS …………………………………………………………………….. 79
3.1. DISEÑO ………………………………………………………………………………………. 81
3.2. PERIODO DE ESTUDIO ……………………………………………………………….. pág. 81
3.3. MATERIAL …………………………………………………………………………………. 82
3.3.1. Fuentes del material de estudio ……………………………………… 82
a) Fuentes de los datos biográficos, clínicos y anatomo-
patológicos …………………………………………………………………...
82
b) Fuente de datos analíticos ………………………………………….. 84
3.3.2. Instrumentación ………………………………………………………………. 85
a) Centrífugas …………………………………………………………………. 85
b) Baño termostatizado …………………………………………………… 86
c) Congeladores ……………………………………………………………….. 86
d) pH-Metro ……………………………………………………………………… 87
e) Balanza de precisión ……………………………………………………. 87
f) Termociclador ……………………………………………………………... 87
g) Sistema de electroforesis …………………………………………….. 87
h) Transiluminador …………………………………………………………. 87
i) Sistema de reproducción fotográfica y video …………….. 88
j) Análisis de imagen ………………………………………………………. 88
k) Otros ……………………………………………………………………………. 88
3.3.3. REACTIVOS QUÍMICOS ………………………………………………………. 88
a) Etanol 99%, Pellets de NaOH, β-mercaptoetanol y
Buffer TE ………………………………………………………………………
88
b) Agarosa ………………………………………………………………………... 88
c) Tampón de carga …………………………………………………………. 88
d) Bromuro de etidio ……………………………………………………….. 89
e) Otros reactivos químicos …………………………………………….. 89
f) Solución de ClONa al 10% …………………………………………… 89
3.3.4. REACTIVOS BIOLÓGICOS PARA PCR ………………………………… 89
a) DNA estándar CpGenomeTM ………………………………………… 89
b) Extracción del ADN ……………………………………………………… 89
c) Modificación del ADN metilado ………………………………….. 90
d) Amplificación ………………………………………………………………. 91
92
Joaquina Martínez-Galán Índice
v
3.3.5. MATERIAL FUNGIBLE ………………………………………………………..
a) Material plástico para el aislamiento del ADN, modificación bisulfítica del ADN metilado y amplificación por PCR- RT ……………………………………………
92
3.4. MÉTODO …………………………………………………………………………………….. 93
3.4.1. Obtención de las muestras sanguíneas incluidas en el
estudio ……………………………………………………………………………
93
3.4.2. Extracción del ADN de la muestra de suero de los sujetos 95
3.4.3. Modificación Bisulfítica …………………………………………………… 97
3.4.4. Procedimiento experimental …………………………………………… 99
3.4.5. PCR en tiempo Real QMS-PCR utilizando SYBR Green………. 101
3.5.6. Análisis estadístico ………………………………………………………….. 106
4. RESULTADOS ……………………………………………………………………………………. 107
4.1. CARACTERÍSTICAS DEL GRUPO CASOS Y CONTROLES INCLUIDOS EN ESTE ESTUDIO ……………………………………………………………………….
107
4.1.1. Análisis descriptivo univariante del grupo control ………...... 107
a) Datos Epidemiológicos-biográficos ……………………………… 107
b) Datos histopatológicos en grupo control con patología benigna ………………………………………………………………………...
110
4.1.2. Análisis descriptivos univariante del grupo casos ……………. 110
a) Datos Epidemiológicos-biográficos ……………………………… 110
b) Datos referentes a las características clínicas del tumor 113
c) Datos referentes al tipo de cirugía ………………………………. 114
d) Datos referentes al resultado anatomo-patológico ……… 115
e) Datos referentes al tratamiento Adyuvante ……………….... 120
f) Datos del seguimiento …………………………………………………. 122
4.2. METILACIÓN DE LOS PROMOTORES DE LOS GENES ESTUDIADOS EN ESTE TRABAJO ……………………………………………………………………..
126
4.2.1. Determinación del estado de metilación en el grupo control ……………………………………………………………………………...
126
4.2.2. Determinación del estado de metilación en el grupo de pacientes con cáncer de mama …………………………………………
127
4.2.3. Análisis inicial de los resultados ……………………………………….
127
4.2.4. Determinación del estado metilación en el grupo de mujeres afectas de cáncer de mama …………………………………
130
4.2.5. Estadística descriptiva general por grupo ………………….......... 132
Joaquina Martínez-Galán Índice
vi
4.3. ESTUDIO DE LA RELACIÓN ENTRE LAS VARIABLES EPIGENÉTICAS ………………………………………………………………………….
134
4.3.1. Contraste de la hipótesis …………………………………………………. 136
4.3.2. Análisis multivariante …………………………………………………….. 138
4.3.3. Validación de la capacidad discriminatoria del test ………… 140
4.3.4. Sensibilidad y especificidad del test diagnóstico ……………… 143
4.4. CORRELACIÓN PERFIL METILACIÓN DE RE METILADO (+) EN SUERO CON EL SILENCIAMIENTO DE EXPRESIÓN RE EN TUMOR
147
4.5. VARIACIÓN PERFIL DE METILACIÓN PRE Y POST-TRATAMIENTO 150
4.6. ESTUDIO CORRELACIÓN VARIABLES CLÍNICO-PATOLÓGICAS CON EL PERFIL DE METILACIÓN DE LOS GENES RE, 14-3-3 SIGMA, E-CADHERINA, APC Y RAR- BETA…………………………………………………….
153
4.7. ANÁLISIS DE SUPERVIVENCIA ……………………………………………………. 155
4.7.1. Análisis univariante de los factores pronósticos clínico- patológicos relacionados con la supervivencia libre de enfermedad ………………………………………………………………………
155
4.7.2. Análisis univariante de los niveles de metilación de los genes RE y 14-3-3-sigma en relación con la supervivencia libre de enfermedad …………………………………………………………
161
4.7.3. Análisis univariante de los factores pronósticos clínico- patológicos relacionados con la supervivencia global del cáncer de mama ………………………………………………………………..
162
4.7.4. Análisis univariante de los niveles de metilación de los genes RE y 14-3-3-sigma en relación con la supervivencia global del cáncer de mama……………………………………………….. cáncer de mama
170
4.7.5. Modelo de regresión multivariante de Cox ………………………. 170
5. DISCUSIÓN ………………………………………………………………………………………… 175
5.1. DIAGNÓTICO PRECOZ EN EL CÁNCER DE MAMA. JUSTIFICACIÓN 175
5.1.1. Despistaje del cáncer de mama mediante las técnicas actuales. Sus ventajas, limitaciones, costes y riesgos ………..
175
5.1.2. Papel de los Marcadores Tumorales empleados actualmente en la clínica, sus ventajas y limitaciones ………
179
5.2. NECESIDAD DE BUSCAR NUEVOS BIOMARCADORES EN EL CÁNCER DE MAMA …………………………………………………………………….
182
Joaquina Martínez-Galán Índice
vii
5.3. JUSTIFICACIÓN DEL ADN METILADO COMO BIOMARCADOR EN EL CÁNCER DE MAMA ………………………………………………………………….
186
5.3.1. Discriminación entre casos - controles y entre controles sanos/controles con patología benigna ……………………………
192
5.3.2. Monitorización y respuesta biológica de los biomarcadores en sangre periférica tras tratamiento ……..
200
5.3.3. Correlación de los Biomarcadores hipermetilados y las variables clínico patológicas ………………………………………… variables clínico patológicas
202
5.4. CORRELACIÓN DE FENOTIPOS LUMINALES EN CÁNCER DE MAMA Y METILACIÓN …………………………………………………………………………….
208
6. CONCLUSIONES ………………………………………………………………………………… 211
7. PUBLICACIONES Y COMUNICACIONES EN CONGRESOS ……………………… 215
8. ABREVIATURAS ………………………………………………………………………………... 226
9. BIBLIOGRAFÍA ………………………………………………………………………………… 229
INTRODUCCIÓN
Joaquina Martínez-Galán Introducción
- 1 -
1. INTRODUCCIÓN
Hace veinte años el cáncer era considerado una enfermedad maligna de etiología
desconocida y de carácter invariablemente mortal. Esta concepción fatalista se ha
modificado en las últimas décadas gracias al avance producido especialmente en el
campo de la biología molecular, que han permitido encontrar nuevas dianas
moleculares sobre las que desarrollar nuevos fármacos, lo que ha a su vez ha
permitido una mejor aproximación al pronóstico de la enfermedad y un mejor
manejo en el tratamiento de los pacientes diagnosticados de cáncer.
La palabra cáncer, es un término genérico que se emplea para designar un grupo
de entidades que difieren de forma variable en su histogénesis, morfología,
evolución clínica, pronóstico y tratamiento, presentando particularidades
morfológicas y biológicas que permiten clasificar e identificar por separado
diferentes tipos de tumores.
Hoy día y como consecuencia del desarrollo de la proteómica, genómica y la
incorporación de técnicas de biología molecular a la práctica clínica y asistencial, se
ha podido encontrar una explicación genética y molecular para muchas de las
alteraciones celulares que acontecen en esta patología, con la consiguiente
repercusión en los aspectos clínicos que afectan al diagnóstico, pronóstico y el
tratamiento de los pacientes con cáncer.
Uno de los avances más relevantes en el estudio de la carcinogénesis ha sido
poder conocer y explorar las diferentes rutas de señalización y transducción de
señales que tiene lugar en la célula en respuesta a un estímulo inicial y como esta
puede ocasionar en determinadas circunstancias la pérdida de equilibrio entre
genes encargados de velar por el correcto funcionamiento del ciclo celular y
aquellos otros de cuya transcripción se deriva la activación desorganizada y
patológica de cascadas moleculares que pueden favorecer el desarrollo de un
proceso tumoral. Por tanto, identificar las vías y rutas de señalización específicas
que las células tumorales utilizan para promover procesos relacionados con
proliferación, supervivencia y capacidad metastásica junto con la identificación de
Joaquina Martínez-Galán Introducción
- 2 -
nuevos marcadores moleculares en suero u otros fluídos corporales que puedan ser
de utilidad en el diagnóstico precoz y en la predicción de respuesta tumoral al
tratamiento oncológico establecido, supondría un importante objetivo que podría
ayudar a alcanzar un diagnóstico más temprano con el consiguiente mejor
pronóstico de los pacientes así como aplicar tratamientos más personalizados y por
tanto menos tóxicos a los pacientes diagnosticados de cáncer.
En la práctica habitual se dispone de la posibilidad de poder realizar en algunos
tipos de tumores, determinaciones de sustancias que, conocidas como marcadores
tumorales, son producidas o inducidas por las células neoplásicas, o por células del
huésped, y cuya presencia anómala puede ser detectada en el suero o en otros
fluídos corporales. Su concentración en el suero o su detección en el tejido
pretenderían reflejar el crecimiento o la actividad del tumor y así ser de utilidad
para establecer el pronóstico, realizar el seguimiento o comprobar la eficacia del
tratamiento realizado. Sin embargo la mayoría de estas sustancias no son
específicas de un tumor, por lo que se sabe que su utilidad en el diagnóstico es
relativa aunque en algunos casos se ha demostrado su valía en la detección
temprana de recidiva y en el control evolutivo de la enfermedad.
Por tanto, dada la alta prevalencia de cáncer a nivel mundial y la importancia de
realizar un diagnóstico precoz, se hace necesaria la búsqueda de nuevos
marcadores moleculares que ayuden a discernir pacientes afectados de cáncer,
conocer mejor el grado de extensión de su enfermedad, y diferenciarlos de los
sujetos sanos o de aquellos afectos de procesos tumorales benignos.
1.1. EPIDEMIOLOGIA
El cáncer sigue siendo un problema de salud de primer orden en Europa donde,
aunque las tasas de incidencia específicas por edad se mantienen estables, el
número total de casos aumenta lentamente debido a las mejores técnicas
diagnósticas y sobre todo al envejecimiento de la población. En 2008, se
diagnosticaron aproximadamente 3.2 millones de nuevos casos de cáncer en
Joaquina Martínez-Galán Introducción
- 3 -
Europa; esto supone un aumento del número anual de nuevos casos de cáncer del
orden de 300.000 casos desde el 2004 (10.5%) [1].
Considerando la incidencia global de cáncer tanto en hombres como en mujeres,
el cáncer más frecuentemente diagnosticado en Europa en el año 2008 fue el cáncer
colo-rectal con una incidencia aproximada de 436.000 nuevos casos (13.6% del
total), seguido del cáncer de mama con 421.000 casos (13.1%), el cáncer de pulmón
con 391.000 casos (12.2%) y finalmente el cáncer de próstata con un total de casos
de 382.000 (11.9%). Gráfica 1.
2
5
24
25
21
39
6
25
60
42
42
54
22
20
38
39
42
95
51
117
89
342
129
212
18
16
33
37
40
45
50
55
60
62
67
78
83
84
88
88
92
96
140
149
382
391
421
436
0 100 200 300 400 500
Testicular
L.H.
Vesícula
Mieloma Múltiple
Laringe
Esófago
Tiroides
Cérvix
Hígado
SNC
Ovario
Leucemia
Endometrio
Melanoma
LNH
Riñón
C. oral y Faringe
Páncreas
Vejiga
Estómago
Próstata
Pulmón
Mama
Colo-rectal
Casos
Muertes
Gráfica 1. Número estimado de casos y muertes por cáncer en Europa en 2008.
Joaquina Martínez-Galán Introducción
- 4 -
No obstante si analizamos solamente la incidencia ocurrida en el sexo femenino,
el cáncer más frecuentemente diagnosticado fue el cáncer de mama con una
incidencia aproximada del 28.2% en toda Europa y del 23% en España [1, 2].
Gráfica 2.
420.845; 28%
204.233; 14%
99.590; 7%82.527; 5%66.734; 4%
59.753; 4%
54.753; 4%
47.246; 3%
44.839; 3%
413.534; 28%
Casos de Cáncer en mujeresMama
Colo-rectal
Pulmón
Endometrio
Ovario
Estómago
Cérvix
Páncreas
Melanoma
Otros
En cuanto a las tasas de mortalidad por cáncer en global en Europa, el tipo de
cáncer con mayor mortalidad fue el cáncer de pulmón con 342.000 muertes lo que
representa el 19.9 % del total, seguido del cáncer colo-rectal con 212.000 casos de
muerte por cáncer (12.3 %), el cáncer de mama con 129.000 casos (7.5 %) y por
último el cáncer de estómago con 117.000 (6.8 %), gráfica 1. Sin embargo cuando
analizamos lo que sucede en el género femenino, el cáncer de mama se sitúa como
la principal causa de muerte por cáncer siendo su porcentaje del 17 % en Europa y
del 18.4 % en España [2]. Gráfica 3.
Gráfica 2. Distribución de los casos de cáncer más frecuentes esperados en el año 2008 en Europa.
Joaquina Martínez-Galán Introducción
- 5 -
129.309; 17%
101.604; 13%
86.846; 12%
21.670; 3%41.929; 6%47.495; 6%
25.025; 3%
46.918; 6%
9.964; 1%
249.555; 33%
Muerte por Cáncer en mujeres
Mama
Colo-rectal
Pulmón
Endometrio
Ovario
Estómago
Cérvix
Páncreas
Melanoma
Otros
La epidemiología por tanto del cáncer de mama adquiere una gran relevancia
por tratarse de la neoplasia maligna más frecuente entre las mujeres y tener una
morbi-mortalidad que si bien no es de las más elevadas sí constituye un importante
problema de salud pública. El cáncer de mama representa la primera causa de
muerte por cáncer en la mujer en los países industrializados siendo en los países
latinoamericanos y africanos la segunda causa de muerte por cáncer tras el cáncer
de cérvix uterino. También en los países del continente asiático el cáncer de mama
es el segundo tipo de cáncer más frecuentemente diagnosticado, seguido del cáncer
gástrico [3].
Concretamente en España, el cáncer de mama representa la neoplasia maligna
más frecuente entre las mujeres exceptuando el cáncer de piel no melanoma,
estando la probabilidad de que una mujer española desarrolle esta enfermedad
antes de los 75 años de edad comprendida entre un 5% y un 8%, lo que significa
que aproximadamente 1 de cada 10- 12 mujeres desarrollarán la enfermedad [4].
En los países industrializados, en las últimas décadas, se ha producido un
incremento estable e importante en la incidencia de esta enfermedad. Quizás este
incremento en la incidencia esté en relación con la mejora de la atención sanitaria y
Gráfica 3. Distribución de los tipos de cáncer más frecuentes esperados en el año 2008 en Europa por mortalidad.
Joaquina Martínez-Galán Introducción
- 6 -
con una mejor estrategia diagnóstica que permite una detección de la enfermedad
más eficaz.
Los datos recopilados entre 1988 y 1990 indican que el riesgo de desarrollar
cáncer de mama a lo largo de la vida de las mujeres es del 12.2% [5]. El número de
casos nuevos estimados a nivel mundial viene a ser de 720.000 por año, cifra que
representa un 20% de todos los casos de cáncer, concretamente en 2006, se
diagnosticaron unos 319.900 de nuevos casos de cáncer de mama.
En términos de mortalidad, el cáncer de mama representa el tumor que más
mortalidad causa en el sexo femenino. En el año 2006, un total de 85300 mujeres
diagnosticadas de cáncer de mama fallecieron por esta causa, lo que equivale a un
16.7% de todas las causas por cáncer.
Es la primera causa de muerte por neoplasia en las mujeres de 35 a 65 años,
siendo también en mujeres norteamericanas la neoplasia diagnosticada con más
frecuencia y la segunda causa más frecuente de muerte por cáncer. El riesgo de
muerte por cáncer de mama a lo largo de la vida es del 3.6%, o lo que es lo mismo
una de cada 282 mujeres. Esta relativa constancia en la mortalidad a pesar del
incremento en la incidencia puede deberse a los mejores programas de detección
precoz y a los avances en el tratamiento [4, 6].
Datos recopilados en EEUU en cuanto a mortalidad han puesto de manifiesto
una disminución anual del 2% en el índice de mortalidad lo que ha supuesto una
reducción total del 25% de muertes de cáncer en 2007 comparadas con 1990 [7].
Por tanto y a pesar de existir una tendencia gradual de aumento en la incidencia
del cáncer de mama, datos derivados de la vigilancia personal, programas de
“screening” y avances en el diagnóstico, así como en el correcto seguimiento de la
enfermedad y los avances terapéuticos han dado como resultado una disminución
en la mortalidad por cáncer de mama del 2% por año [8]. Por tanto parece claro
que el diagnóstico más temprano de la enfermedad nos conduciría a una
disminución de la mortalidad por cáncer de mama y por ello es necesario insistir
en la importancia de obtener mejores programas de “screening”, con mayor
Joaquina Martínez-Galán Introducción
- 7 -
capacidad para detectar potenciales casos de cáncer de mama y de esta forma
poder anticiparnos a su abordaje terapéutico probablemente de forma menos
agresiva y con mayores porcentajes de curación.
1.2. ETIOLOGÍA
El cáncer se considera una patología compleja resultado de múltiples
alteraciones debidas al acúmulo de distintos acontecimientos genéticos dentro de
una célula. La célula en su proceso de crecimiento y proliferación carente de
regulación hacia el desarrollo tumoral adquiere nuevas características tanto
funcionales como morfológicas distintas a las que caracterizan a la célula de la que
derivaba, dando lugar a un clon celular con capacidad de crecer de forma
desorganizada, carente de control y progresivamente con mayor grado de displasia
celular hasta que finalmente, puede desencadenar el desarrollo del proceso
canceroso [9].
Estudios en el campo de la carcinogénesis apoyan la hipótesis que propone que
estos cambios neoplásicos se desarrollan durante un largo periodo de tiempo en el
cual se van acumulando mutaciones somáticas en la célula, resultando de todo ello
un paso progresivo desde un fenotipo celular normal a un fenotipo hiperplásico,
posteriormente displásico y finalmente neoplásico [10]. Este daño genético que se
va acumulando en la célula, ocasiona cambios transcripcionales a favor de genes
que inducen proliferación y supervivencia celular incontrolada conocidos como
oncogenes, suprimiendo la expresión de otro grupo de genes llamados genes
supresores de tumores que por el contrario actuarían regulando el ciclo celular,
inhibiendo el crecimiento e induciendo fenómenos apoptóticos [11].
Sin embargo la genética por sí sola no puede explicar la diversidad de fenotipos
que se encuentran dentro de una misma población así como tampoco puede
explicar cómo seres homocigotos o clonados a pesar de tener secuencias de ADN
idénticas, pueden tener fenotipos y susceptibilidades diferentes a una enfermedad.
Hoy día sabemos que el cáncer también puede ser resultado de acontecimientos
epigenéticos que conducirían al desarrollo de un tumor por producir cambios
Joaquina Martínez-Galán Introducción
- 8 -
hereditarios de la expresión génica de la célula sin que con ello se deriven cambios
en la secuencia del ADN [12]. Molecularmente este hecho se relaciona con un
patrón de metilación aberrante que ocurre en la región promotora del gen, que está
fuertemente vinculada con la represión transcripcional de la cromatina y,
consecuentemente, con la pérdida de función de este gen sin producirse por ello
cambios en la secuencia de nucleótidos [13].
Este evento conocido como “epigenético” que fue acuñado por primera vez en
1939 por C.H. Waddington y fue definido como “Interacciones ocasionales entre los
genes y sus productos que determinan el fenotipo celular” , no fue hasta años más
tarde cuando se entendió que este tipo de alteraciones hereditarias de la expresión
génica no son debidos a cambio alguno en la secuencia del ADN [14].
De todos los eventos epigenéticos el más conocido es el de la metilación del ADN
cuyo descubrimiento, unido a su relación con la falta de actividad de genes tumor
supresor permitió la identificación de distintos genes supresores de tumores cuyos
promotores se encontraban metilados en el tumor y no metilados en los tejidos
peritumorales sanos, así como más recientemente su relación con la inactivación
génica mediante microARN (miARN) por metilación de su material genético [15].
No obstante, además de las alteraciones genéticas y epigenéticas que explican la
cascada de eventos que median en el desarrollo de un proceso neoplásico, se han
descrito otros factores conocidos como “factores de riesgo” que por estar en
relación con la exposición a carcinógenos ambientales, o ligados a cierta
predisposición genética, se les considera como factores que aumentan la
probabilidad de que la persona expuesta o predispuesta desarrolle el cáncer. En
este sentido son varios los factores de riesgo descritos como parcialmente
responsables del desarrollo del cáncer de mama, aunque ninguno de ellos ha sido
identificado como causa fundamental de la misma.
Entre los factores que, etiológicamente han sido relacionados con el cáncer de
mama se describen los siguientes:
Joaquina Martínez-Galán Introducción
- 9 -
1.2.1. Historia familiar
La mayoría de los cánceres de mama, se desarrollan en mujeres sin
antecedentes familiares considerándose por ello esporádicos. Sin embargo el
presentar antecedentes familiares de primer grado (madre o hermana), y a una
edad de presentación inferior a 40 años, o la existencia de varios casos en la
familia, se asocia con un mayor riesgo para desarrollar esta enfermedad [16]. De
hecho entre un 15% a un 20% de los casos de cáncer de mama se presentan en
pacientes con antecedentes familiares de esta enfermedad, aunque desconocemos
en qué medida esta agregación familiar es fruto del azar, de una susceptibilidad
genética, de determinados factores ambientales o de alguna combinación de todos
estos factores. En estos casos hablamos de cáncer de mama familiar [17, 18].
Dentro de este subgrupo de pacientes con cáncer de mama familiar, alrededor de
un 5-10% de los casos se atribuyen a mutaciones en células de la línea germinal
que se transmiten con carácter autosómico dominante y alta penetrancia [19].
Estas mutaciones producen la falta de expresión de genes tumor supresor y de
genes implicados en la reparación del ADN dañado, lo que ocasiona un acúmulo de
mutaciones en oncogenes y pérdida de control en sitios claves del ciclo celular lo
cual se asocia al desarrollo de un tumor. Entre los genes implicados en este
subgrupo de pacientes con mayor susceptibilidad al cáncer de mama se
encuentran el gen BRCA1 y BRCA2 [20]. Cuando tal anomalía genética se encuentra
hablamos de cáncer de mama hereditario. Generalmente, se trata de casos de
cáncer de mama que se caracterizan por presentarse a edades más tempranas y/o
estar asociados a antecedentes familiares muy importantes [21].
Por tanto en la historia del cáncer de mama distinguimos:
a) Cáncer esporádico: Pacientes sin historia familiar en dos o más
generaciones. Representa el 68% de todos los cánceres de mama.
b) Cáncer familiar: Cuando en una determinada familia aparece dicha
neoplasia en dos o más casos en parientes de primer grado (madre o
Joaquina Martínez-Galán Introducción
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hermana) o segundo grado (abuela, tía o prima) en ausencia de cáncer de
mama hereditario. Representa el 23%.
c) Cáncer de mama hereditario: Presentan varias características distintivas
cuando se compara con el cáncer de mama no hereditario o somático. Así, se
asocia con mutaciones en la línea germinal que se transmiten con un patrón
autosómico dominante y fuerte penetrancia [22, 23]. Representa un 5-10% [24]
de todos los casos de cáncer de mama y la edad de presentación es
considerablemente inferior a la que corresponde a los casos esporádicos. Otra
de las diferencias es que la prevalencia de cáncer de mama bilateral es más alta,
y suelen ser tumores preferentemente con pobre grado de diferenciación
celular, receptor de estrógenos negativos y tener con mayor frecuencia
afectación ganglionar [25].
En las familias de los individuos con este tipo de herencia se pueden presentar
otros tipos de tumores asociados, entre ellos: cáncer de mama y ovario
relacionados con la mutación en BRCA1 [26] y alteraciones en BRC2 asociadas al
síndrome del cáncer de mama en el varón. La suma de todos estos casos suponen
el 85% de todos los cánceres de mama hereditarios [27]. Otros síndromes
asociados a mutaciones genéticas son el síndrome Li-Fraumeni debido a
mutaciones del gen TP53 [22], y el síndrome de Cowden debido a mutaciones del
gen PTEN [28] entre otros.
De los estudios epidemiológicos también sabemos que alrededor de un 5-10 %
de las pacientes con cáncer de mama tienen un familiar de primer o segundo grado
diagnosticado también de cáncer de mama. Estas pacientes tienen un riesgo
relativo >50% de padecer cáncer de mama antes de los 70 años [29]. Este riesgo
varía en función de la edad en el momento del diagnóstico y número de familiares
afectos. Así para pacientes con edad al diagnóstico inferior a 40 años y familiares
de primer grado afectadas antes de los 50 años de edad este riesgo es mayor [30].
Dicho de otra manera en los países donde el cáncer de mama es frecuente, el riesgo
de desarrollarlo, aumenta el riesgo en un 5.5% para mujeres con un familiar de
Joaquina Martínez-Galán Introducción
- 11 -
primer grado afecto y en un 13% para mujeres con dos familiares afectos de cáncer
de mama [31].
1.2.2. Edad
El riesgo acumulado de desarrollar cáncer de mama aumenta con la edad. La
incidencia más alta de cáncer de mama ocurre después de los 35 años; en edades
posteriores la frecuencia aumenta progresivamente hasta alcanzar una meseta
entre los 45-55 años para finalmente aumentar de forma manifiesta. No obstante
en mujeres con mayor carga genética, el cáncer tiende a ocurrir en edades más
tempranas que en los casos esporádicos [16, 32] con el 83 % de los casos en
mujeres mayores de 50 años y sólo el 1.5 % en mujeres con menos de 30 años [33].
Es importante conocer que la edad, en el momento del diagnóstico, se
considerada como uno de los factores pronósticos más importantes en el cáncer de
mama. En efecto se ha observado que la presentación del cáncer en mujeres
menores de 40-45 años se asocia con factores pronósticos negativos, como son:
tumores que no expresan receptores hormonales y sobreexpresan HER-2/EGFR, y
sabemos que ambas circunstancias se asocian con mayores porcentajes de recaída
y con una menor supervivencia global [34]. Todo esto ha hecho pensar que el
cáncer en pacientes jóvenes sea una entidad biológica distinta con sus propias
rutas de señalización [35].
1.2.3. Historia menstrual y reproductiva
Muchos son los estudios epidemiológicos que han analizado el papel de la
historia menstrual y reproductiva de la mujer en la historia natural del desarrollo
del cáncer de mama. La mayoría de ellos, han proporcionado datos que apoyan que
factores reproductivos como son la edad de la menarquía temprana, edad de la
menopausia tardía, la edad del primer embarazo a término precoz, el número de
hijos y el haber dado o no lactancia materna son factores asociados con la
modulación del riesgo de desarrollar cáncer de mama [36, 37].
Joaquina Martínez-Galán Introducción
- 12 -
Esta asociación podría estar relacionada con el periodo de tiempo de exposición
de la mujer a niveles de estrógenos endógenos a lo largo de su vida y por ello, en
relación con el número de ciclos ovulatorios y por tanto con factores hormonales
que están firmemente relacionados con un mayor riesgo de desarrollar cáncer de
mama [38]. Los estrógenos actuarían estimulando la proliferación del epitelio
ductal así como la angiogénesis ocasionando una hiperplasia e hipertrofia de las
células ductales mamarias durante la primera fase del ciclo menstrual, pudiendo
así contribuir a la transformación neoplásica que puede derivar en el desarrollo
del cáncer de mama a lo largo de su vida [39].
La importancia que la influencia estrogénica tiene como inductor de
proliferación celular en la mama se observó al comprobar que aproximadamente
1/3 de las pacientes con cáncer de mama experimentaban una remisión del tumor
cuando se las sometían a tratamientos que implicaban el descenso en los niveles de
estrógenos circulantes en sangre periférica [40]. Así mismo, en células en cultivo se
ha observado que los estrógenos estimulan la secreción de factores de crecimiento
mitogénicos (TGF-α, IGF-1, EGF) e inhiben la secreción de factores represores de la
mitosis como el TGF-β mediando como factores paracrinos a nivel del estroma
mamario y favoreciendo la proliferación celular sobre la mama [41].
También se ha descrito que la exposición en etapas concretas de la vida de una
mujer a altos niveles estrogénicos “ventana estrogénica de Koreman”, como ocurre
al inicio de ciclos ovulatorios y durante los periodos anovulatorios que suceden a
lo largo de la vida menstrual o durante la perimenopáusia por insuficiencia
luteínica, podría ser otro factor favorecedor en la carcinogénesis del cáncer de
mama. En cambio otras variables como serían la edad temprana de paridad y la
lactancia materna, favorecen la diferenciación de los conductos terminales del
lobulillo que se produce durante el embarazo y la liberación de hormonas
autocrinas y paracrinas asociadas a cada embarazo a término, fenómenos que
pueden explicar los efectos beneficiosos que de la paridad temprana y la lactancia
tienen sobre el riesgo de padecer cáncer de mama [38]. Sin embargo estas ideas
siguen siendo controvertidas por existir estudios que no han encontrando relación
entre paridad y factor pronóstico del cáncer de mama [42, 43] mientras que otros
Joaquina Martínez-Galán Introducción
- 13 -
en cambio sí han encontrado asociación al describir que el desarrollo de un cáncer
de mama en una mujer nulípara se asocia con un factor pronóstico adverso al igual
que el tener un primer embarazo a una edad tardía [44]. Otros factores de riesgo
relacionados con la historia reproductiva son; la nuliparidad, el nacimiento del
primer hijo después de los 30 años y la ausencia de lactancia materna [45].
En resumen entre los factores que pueden aumentar la probabilidad de
desarrollar cáncer de mama están; edad temprana de presentación de la
menarquia (antes de los 12 años) y edad de presentación de la menopausia tardía
(después de los 55 años), ambos asociados a mayor exposición estrogénica. Por el
contrario, entre los factores reproductivos que se relacionan con una disminución
en la probabilidad de desarrollar cáncer de mama están la presentación de la
menarquia a una edad tardía (después de los 12-13 años) y la presentación precoz
de la menopausia (antes de los 45 años), ambos relacionados con una menor
exposición a niveles de estrógenos prolongados [46].
En recientes revisiones de la literatura, y a pesar que esta asociación sigue
estando confusa, es cada vez con más frecuente la publicación de nuevos datos que
demuestran un posible incremento del riesgo de desarrollar cáncer de mama en
relación con factores hormonales en función de la expresión de los receptores de
estrógenos (RE) y receptores de progesterona (RP) en el tumor [47]. Así algunos
autores [48] han descrito que la multiparidad y la edad temprana del primer
embarazo se asocian con una disminución del riesgo relativo de desarrollar
tumores RE/ RP (+) pero no mostraba ninguna relación con el desarrollo de
tumores RE/ RP (-) mientras la lactancia se asociada con un riesgo reducido para el
desarrollo de tumores que fuesen RE/ RP (+) y RE/ RP (-), lo que podría sugerir
que paridad y lactancia actúan por mecanismos diferentes [47, 49].
1.2.4. Terapia hormonal
Son muchos los estudios epidemiológicos que han analizado la relación entre la
terapia hormonal sustitutiva (THS) y el riesgo de desarrollar cáncer de mama. La
mama no hay duda que es un órgano estrógeno-dependiente y muestra de ello es
Joaquina Martínez-Galán Introducción
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que durante las etapas del desarrollo puberal y durante el embarazo, son altas las
tasas de hormonas circulantes intervienen de forma activa [50]. Concretamente en
relación con el cáncer, existen datos que apoyan la teoría según la cual la
exposición a tratamientos basados en estrógenos y especialmente cuando se
administran a mujeres postmenopáusicas y durante periodos de tiempo superiores
a 5 años, puede aumentar el riesgo relativo de desarrollar cáncer de mama hasta
en un 1.3 y un 1.7 [51]. Este hecho parece que está en relación con una mayor
sensibilidad de las células de la mama en las mujeres postmenopáusicas, a causa de
su deprivación estrogénica previa lo que ocasiona un proceso reactivo que
incrementa el índice de proliferación y favorece la atipia celular que podría
conducir al desarrollo del proceso tumoral [52]. Se ha sugerido que este proceder
sustitutivo triplica el riesgo relativo de padecer cáncer en mujeres con
antecedentes familiares de esta enfermedad [53]. Así y de acuerdo con los
resultados recientemente publicados del estudio “HABITS” tras un seguimiento de
5 años se observó que el empleo de THS en mujeres que habían sido tratadas
previamente por un cáncer de mama provocaba un incremento significativamente
superior del riesgo de desarrollo de segundos tumores de mama con un HR = 2.4
(95% CI = 1.3 a 4.2) del respecto a las mujeres que no realizaban este tratamiento
y una incidencia acumulada en 5 años del 22.2 % en el brazo que habían recibido
HT frente al 8.0 % del grupo control [54].
Sin embargo este hallazgo no ha podido ser confirmado en otros de los muchos
estudios que se han realizado en los últimos 25 años de una manera concluyente.
Por ello son numerosos los autores que opinan que seguir esta terapia durante 10
años, o menos, no implica riesgo de cáncer, o es tan pequeño que merece la pena
asumirlo, dado los beneficios que aporta la THS en la mujer menopáusica. Otros
investigadores indican que a partir de los 10 años de la toma de THS es cuando
puede aumentar el riesgo de cáncer, mientras que otros destacan que es
indiferente el tiempo de administración por afirmar que el riesgo de cáncer existe
entre las que siguen la terapia hormonal [55].
No obstante la actualización del ensayo clínico “Women’s Health Initiative”, en el
que se incluyeron 16600 mujeres de edades comprendidas entre 50-79 años de 40
Joaquina Martínez-Galán Introducción
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centros diferentes entre 1993-1998 y en el que se aleatorizaban a recibir
tratamiento con estrógenos equinos y acetato de medroxiprogesterona frente a
placebo, se observó un exceso de riesgo para el desarrollo de cáncer de mama para
las pacientes expuestas al tratamiento hormonal [56].
Las conclusiones que pueden extraerse de los estudios y metaanálisis realizados
es que actualmente no está suficientemente establecido el riesgo asociado al
empleo de hormonas exógenas y el desarrollo de cáncer de mama, si bien parece
que hay una mayor frecuencia de presentación de tumores de mama en mujeres
que han utilizado terapia hormonal sustitutiva durante más de 5 años que entre las
mujeres que no lo han hecho, y que esta circunstancia se describe
fundamentalmente en pacientes con tumores de mama que expresan receptores
hormonales [49]. En cualquier caso, la terapia hormonal sustitutiva, requiere de un
análisis preciso de los beneficios y los riesgos que puedan derivarse de su
prescripción y solicitar de la persona a la que se le vaya a indicar el tratamiento su
consentimiento. Esto exige una postura responsable tanto por parte del médico
como del paciente [57].
1.2.5. Exposición a radiación ionizante
El conocimiento que hoy día se posee sobre el mayor riesgo de desarrollar
cáncer de mama que presentan las mujeres expuestas a radiación ionizante a lo
largo de su vida procede fundamentalmente de los estudios epidemiológicos
realizados en pacientes que recibieron radiación con fines diagnósticos o
terapéuticos así como de aquellos sujetos que sobrevivieron a catástrofes
nucleares [58]. De estos estudios se ha derivado que la exposición reiterada a
radiaciones ionizantes, principalmente en etapas de la vida donde existe gran
proliferación y recambio celular como ocurre con edades inferiores de 20 años, se
acompaña de mayor riesgo de daño sobre el ADN y esto es un factor de riesgo para
el desarrollo de un carcinoma de mama especialmente en aquellas personas que
reciben radiación en la región torácica [59, 60]. Los datos epidemiológicos
disponibles han precisado que esta asociación entre dosis de radiación y cáncer
sigue un modelo lineal tal que el riesgo es mayor cuanto mayor es la dosis recibida
Joaquina Martínez-Galán Introducción
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[61]. Sin embargo otros factores emergieron como posibles factores involucrados y
moduladores del efecto lesivo que podría tener la exposición a la radiación
ionizante prolongada, si bien no existe unanimidad en las conclusiones de los
estudios publicados [62]. Entre estos factores se ha descrito que la presencia de
patología benigna de la mama o historia familiar de cáncer de mama podría estar
asociada al incremento de riesgo de padecer cáncer tras la exposición a radiación
ionizante a dosis relativamente bajas [63-65], también se ha publicado un
incremento del riesgo asociado a la exposición de la radiación durante el embarazo
[66] y una mayor susceptibilidad genética en relación con polimorfismos de los
genes encargados de la reparación del ADN [67, 68].
Por tanto múltiples factores como dosis total de radiación recibida, la edad al
inicio de la exposición, y el tiempo desde la primera exposición, son parámetros
relacionados con la incidencia de cáncer de mama después de la exposición a la
radiación ionizante. Sin embargo, estos riesgos han de ser considerados en el
contexto individual de sujetos que se pueden beneficiar de pruebas de cribado
poblacional para la detección precoz de un tumor de mama en situaciones en
donde el beneficio aportado por dichas pruebas es superior a los riesgos
estadísticos descritos [65].
1.2.6. Historia de lesiones benignas
El hallazgo de lesiones benignas en la mama representa la histopatología más
frecuentemente diagnosticada en el curso del diagnóstico de un tumor de mama.
La frecuencia de presentación a partir de análisis realizados en muestras de
autopsia dada la dificultad para conocer su prevalencia real por tratarse en la
mayoría de los casos de lesiones asintomáticas, se estiman que ésta podría ser
superior al 50% a partir de los 20 años de edad [69], existiendo una gran variedad
histológica. Dentro de esta gran variedad de tipos histológicos podemos encontrar
atendiendo al carácter proliferativo de las mismas; lesiones no proliferativas, como
son fibroadenomas, quistes, ectasias ductales y metaplasia apocrina, que
representarían el 66.7% de las lesiones encontradas, y un segundo grupo de
patología benigna que estaría constituído por lesiones proliferativas sin atipia
Joaquina Martínez-Galán Introducción
- 17 -
como el papiloma intraductal, hiperplasia moderada y adenosis esclerosante
(29.6%), y un tercer grupo que estaría representado por lesiones proliferativas con
atipia entre ellas la hiperplasia ductal con atipia y a hiperplasia lobular con atipia
(3.7%) [70].
Si bien la mayoría de estas lesiones no son precursoras de lesiones invasivas, en
algunas ocasiones y especialmente cuando se trata de lesiones proliferativas, o con
hiperplasia atípica, así como cuando se aíslan múltiples lesiones tras realizar una
biopsia de una lesión benigna de mama, se ha descrito que eventualmente pueden
evolucionar hacia el desarrollo de un cáncer de mama [71-75]. Autores como Page
y Dupont han encontrado que las lesiones proliferativas con atipias tienen un
riesgo relativo (RR) de 4-5 para cáncer de mama, en las lesiones proliferativas sin
atipias este riesgo disminuye al valor de 1.5-2 mientras que no han encontrado
asociación entre las lesiones benignas de tipo no proliferativo y el riesgo de
padecer cáncer de mama [70]. Sin embargo y a pesar de los múltiples estudios
realizados en este campo, aún siguen existiendo algunos aspectos controvertidos
[76]. Así en otros trabajos como los realizados por Wang y col. no se ha encontrado
asociación entre la presencia de lesiones benignas de mama, cualquiera que sea su
número y su histología, y el mayor riesgo para desarrollar cáncer de mama [74].
Recientemente se ha descrito que el riego para desarrollar cáncer a partir de
lesiones benignas de mama podría estar influenciado no sólo por la multiplicidad y
número de lesiones proliferativas y atípicas aisladas en una biopsia de mama, sino
también por la edad de presentación. Esta relación se ha descrito al encontrarse un
mayor riesgo de derivar en cáncer de mama las lesiones benignas cuando,
asociadas a los factores anteriormente expuestos, se detectan en mujeres con
edades comprendidas entre los 46-55 años frente a presentarse en mujeres con
edades menores a 45 años. Este hecho podría estar en relación con el mayor
número de ciclos ovulatorios y por tanto con la mayor duración del ambiente de
estímulo de la proliferación celular de la mama que conlleva un consiguiente
incremento del riesgo para desarrollar atipias celulares [73, 77].
Joaquina Martínez-Galán Introducción
- 18 -
No obstante lo que sí parece estar claro, es que las lesiones no proliferativas no
parecen incrementan el riesgo de cáncer de mama en mujeres sin historia de
cáncer mamario o con una débil historia familiar. Tan solo en mujeres con
importante carga familiar de cáncer de mama, estos hallazgos parecen asociarse al
aumento del riesgo, aunque tal aumento se podría explicar por la historia familiar
más que por la presencia de lesiones en la mama. Cabe sin embargo mantener que
las lesiones proliferativas, particularmente aquellas con atipia, sí parecen predecir
un sustancial aumento de riesgo de cáncer de mama [78].
1.2.7. Otros factores de riesgo
a) Dieta: El papel de la dieta y su relación con el cáncer, ha sido sugerido por
distintos autores, debido a la importante variabilidad en la prevalencia de cáncer
de mama entre distintos países. La hipótesis según la cual la obesidad, la ingesta
elevada de productos derivados de grasas animales y el alcohol aumentan el riesgo
del desarrollo de cáncer de mama mientras que la ingesta de frutas, fibra,
antioxidantes y fitoestrógenos son factores protectores, puede ser atribuida en
parte, a las propiedades antioxidantes de determinados alimentos, así como a la
influencia de estos en la reparación del ADN [79, 80]. El aumento de los niveles
circulantes de estrógenos endógenos, de insulin-like growth factor 1 y de otros
factores de crecimiento, producidos por algunos nutrientes también han sido
relacionados con el desarrollo del cáncer de mama.
b) Ingesta de alcohol: La asociación entre el consumo de alcohol y el
incremento del riesgo de desarrollar cáncer de mama ha sido una constante
descrita en numerosos estudios epidemiológicos realizados en las últimas dos
décadas, especialmente en mujeres postmenopáusicas [81]. Esta hipótesis parece
que está sustentada por distintas teorías. Una de ellas se basa en la hipótesis según
la cual el alcohol induciría un aumento de los niveles endógenos de estrógenos que
estimularía la proliferación del epitelio mamario pudiendo favorecer el desarrollo
de un cáncer de mama RE (+) pero no en casos de tumores RE (-) [82]. Otro de los
posibles mecanismos por los que la ingesta de alcohol podría favorecer el
desarrollo del cáncer de mama se apoya en la susceptibilidad de la mama al daño
Joaquina Martínez-Galán Introducción
- 19 -
producido al ADN por el alcohol [83, 84]. Sin embargo cuando se realiza una
revisión sistemática de la literatura analizando los resultados obtenidos se observa
que la asociación entre el consumo de alcohol y riesgo de desarrollar cáncer de
mama es débil y que la precisión de la estimación del riesgo relativo es baja en la
mayoría de los estudios [85]. Por tanto y como consecuencia de otros factores de
confusión [86] no se pueden extraer conclusiones sobre el riesgo padecer de
cáncer de mama en relación a la ingesta de alcohol.
c) Obesidad: Es bien conocido que la obesidad tiene un papel importante en el
desarrollo de graves problemas de salud, especialmente en enfermedades
cardiovasculares y en enfermedades endocrino-metabólicas como la diabetes
mellitus entre otras. Sin embargo su implicación en el desarrollo del cáncer si bien
se ha descrito en numerosos trabajos, sigue siendo controvertida y aunque no está
suficientemente probada parece que existe cierta relación entre el riesgo de
padecer cáncer de mama y los hábitos dietéticos [87]. En estudios realizados en
animales existe evidencia que las alteraciones en el equilibrio metabólico pueden
influir en el riesgo de desarrollar cáncer de mama así como en el pronóstico de la
enfermedad a través de distintos mecanismos relacionados con la producción de
hormonas de esteroideas extragonadales/ováricas [1,2], en particular el estradiol,
que han mostrado estar positivamente asociado con el riesgo de cáncer de mama
[3,4].
Este hecho parece estar en relación con la variación en el perfil hormonal que
ocurre en mujeres obesas especialmente durante la menopausia lo que podría
representar un estímulo importante para el crecimiento de células tumorales [88].
De hecho en mujeres sanas con alto índice de masa corporal (IMC) se ha descrito
que la obesidad se asocia con un estado de hiperinsulinismo e hiperandrogenismo
que contribuye a aumentar los niveles de insulin-like growth factor 1 (IGF-1),
implicado en procesos que inducen proliferación, crecimiento celular, mutagénesis
y que activan fenómenos antiapoptóticos [89, 90]. Parece ser que tanto IGF-1 como
los estrógenos actúan sinérgicamente aumentando los niveles de IGF-1 y su
receptor (IGF-1R) estimulando cascadas de señalización intracelulares que
estimulan la proliferación celular del epitelio mamario y con ello el aumento del
Joaquina Martínez-Galán Introducción
- 20 -
riesgo de desarrollar cáncer de mama [76]. En relación con ello se ha descrito, en
mujeres premenopáusicas, un aumento en el riesgo de desarrollar cáncer de mama
con peor supervivencia [87, 88, 90, 91]. De los estudios realizados puede extraerse
que un elevado IMC en mujeres que han desarrollado cáncer de mama parece
relacionarse con peor pronóstico, por lo que se aconsejan medidas destinadas a
controlar el peso de estas pacientes aún cuando es necesaria la realización de
nuevos estudios para clarificar esta cuestión [87].
1.3. FACTORES PRONÓSTICOS Y PREDICTIVOS DE RESPUESTA DEL CÁNCER
DE MAMA
El cáncer de mama sigue siendo en la actualidad una importante causa de
muerte en mujeres en los países industrializados, a pesar de los avances en el
diagnóstico precoz y tratamiento que se han producido en las últimas décadas.
Esto ha supuesto que junto a la necesidad de desarrollar tratamientos más
efectivos y específicos que consigan mayores tasas de curación, sea importante y
necesario la búsqueda y el estudio de nuevos marcadores pronósticos y predictivos
de respuesta que, sumados a los ya conocidos, permitan predecir de forma
individualizada cuál es el beneficio terapéutico de tratar a una paciente con cáncer
de mama, así como conocer cuál es el riesgo que tiene de recaída y qué tratamiento
es el más adecuado administrar de acuerdo no sólo con las características clínico-
patológicas sino también de acuerdo con el perfil molecular del tumor.
Históricamente la decisión terapéutica de aplicar un determinado tratamiento
oncológico a una paciente ha estado determinada por factores clínicos como la
edad y por factores anatomo-patológicos como son el tamaño tumoral, la
afectación ganglionar, el grado de diferenciación tumoral y la expresión de
receptores hormonales en el tumor [92, 93]. Sin embargo fue a partir del consenso
de expertos celebrado en Saint Gallen en el año 2005 [94], y como consecuencia de
los ensayos clínicos realizados al añadir al tratamiento estándar, un anticuerpo
monoclonal humanizado (Trastuzumab) se pudo demostrar que esta asociación
conseguía mejorar tanto el intervalo libre de enfermedad como la supervivencia
global de aquellas pacientes con cáncer de mama en cuyo tumor se sobreexpresaba
Joaquina Martínez-Galán Introducción
- 21 -
el receptor del factor de crecimiento epidérmico HER2. Este resultado se ha
explicado como una consecuencia de la inhibición de la proliferación tumoral, a
través de un mecanismo de citotoxicidad dependiente de los anticuerpos utilizados
que ha supuesto un cambio en la historia natural de uno de los tipos de cáncer de
mama de peor pronóstico [95-97].
Este hallazgo ha supuesto un importante avance en el tratamiento del cáncer de
mama al incorporar a la práctica clínica diaria las determinaciones moleculares
por medio de métodos como la inmunohistoquímica (IHQ), técnicas de hibridación
in situ (FISH) o la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que permiten
conocer marcadores moleculares que las células tumorales expresan y que
representan potenciales dianas terapéuticas contra las que es posible diseñar
fármacos biológicos que asociados a los tratamientos citotóxicos clásicos
consiguen alcanzar una mejor tasa de respuestas tanto en supervivencia como en
intervalo libre de enfermedad [98].
Desde entonces hasta nuestros días nuevas dianas moleculares han sido objeto
de estudio dando como resultado el desarrollo de nuevos agentes biológicos y
pequeñas moléculas que dirigiéndose contra los receptores de membrana que
expresa la célula tumoral, consiguen bloquear la unión del ligando al receptor y
con ello bloquean las distintas cascadas de transducción de señales que la célula
tumoral pone en marcha, permitiéndonos así impedir la transcripción de genes
implicados en supervivencia, proliferación celular y angiogénesis tumoral. Muestra
de ello son fármacos como Lapatinib un anticuerpo monoclonal contra los
dominios tirosín quinasa de HER1 y HER2 que ha demostrado ser eficaz en
pacientes con cáncer de mama metastásico que sobreexpresan HER2 y no
responden a Trastuzumab [99], o fármacos antiangiogénicos como bevacizumab un
anticuerpo contra el receptor del factor de crecimiento derivado del endotelio
vascular VEGFR [100]. Algunos de estos factores tienen un doble papel pronóstico
y predictivo, como es el caso del HER2/neu cuya amplificación se ha asociado por
un lado a un peor pronóstico, a la resistencia al Tamoxifeno y una mayor
sensibilidad a dosis altas de Antraciclinas y, por otro lado, a un factor predictivo de
respuesta al Trastuzumab especialmente cuando se combina con quimioterapia.
Joaquina Martínez-Galán Introducción
- 22 -
Paralelamente y gracias al desarrollo de tecnologías con microarrays de ADN se
han efectuado estudios que, analizando el perfil génico del tumor, consiguen
determinar aquellos genes que se correlacionan con el pronóstico y la respuesta
terapéutica. Esto ha favorecido la creación de una nueva clasificación pronóstica
del cáncer de mama de acuerdo con el llamado fenotipo molecular. En esta
clasificación se han descrito 5 tipos de cáncer de mama en función a la expresión
molecular de determinados receptores de membrana; Luminal A, Luminal B, Basal
Like (triple negativo) y subtipo Her2+ [101]. Estos perfiles génicos están siendo
utilizados en la actualidad como factores pronóstico y también como factores
predictivos de respuesta a la quimioterapia y al tratamiento hormonal.
Por tanto cada vez más nuevos factores pronósticos y predictivos de respuesta
al tratamiento oncológico se van añadiendo a los establecidos por las
recomendaciones consenso del National Institutes of Health Consensus
Development Conference Statementun 2000 (NIH) [102] y de la conferencia
consenso de St. Gallen 2009 [103]. Estos es consecuencia del mayor conocimiento
y de la caracterización de las múltiples vías de transducción de señales y de las
cascadas de señalización intracelular implicadas en la carcinogénesis que a su vez
ha facilitado la identificación de nuevas dianas terapéuticas sobre las que
desarrollar nuevos fármacos para aplicar al tratamiento del cáncer de mama.
No obstante no todos los factores anteriormente comentados están validados en
la actualidad como factores pronósticos a partir de los cuales poder estimar el
riesgo de recidiva y mortalidad que tiene una paciente diagnosticada de cáncer de
mama ni tampoco todos ellos son reconocidos como factores predictivos de
respuesta al tratamiento oncológico.
Por tanto y atendiendo a los factores pronósticos y predictivos de respuesta
actualmente validados se pueden establecer tres 3 categorías de elementos que
nos ayudan en la actividad clínica a planificar un tratamiento oncológico adecuado
[102].
Joaquina Martínez-Galán Introducción
- 23 -
1.3.1. Factores dependientes del paciente. Edad
El cáncer de mama se suele presentar en mujeres a partir de los 50 años de
edad, siendo poco frecuente su diagnóstico en mujeres de menos de 35 años [104].
Son muchos los estudios epidemiológicos que relacionan este dato con un factor
pronóstico adverso al correlacionarlo con una menor supervivencia global y una
mayor tasa de recidiva tumoral en las pacientes jóvenes respecto a las mujeres con
edad de presentación mayor a 35 años [105]. En este sentido y aunque no está
suficientemente aclarada la relación entre edad de presentación menor a 35 años y
mal pronóstico de cáncer de mama, algunos investigadores describen como
posibles causas que el cáncer de mama que se presenta en mujeres más jóvenes,
tienen una características biológicas comunes caracterizadas por tener un mayor
grado de indiferenciación histológica, una fracción de proliferación celular más
elevada, mayor frecuencia de invasión vascular así como mayor frecuencia de
afectación ganglionar y una menor expresión de receptores hormonales de
estrógenos y progesterona en comparación con los casos de cáncer de mama que
se presentan en mujeres de mayor edad [34]. Todos ellos factores que le confieren
mayor agresividad tumoral [106].
1.3.2. Factores dependientes de las características histológicas del tumor
a) Estadio ganglionar (N): El grado de afectación ganglionar en las pacientes
diagnosticadas de cáncer de mama con independencia del área ganglionar afecta
(axilar, supraclavicular etc.) así como del número de ganglios infiltrados (≥ 4 vs
<4) [107], se ha demostrado en numerosos estudios que representa el factor
pronóstico más importante para predecir tanto la supervivencia global (SG) como
la supervivencia libre de enfermedad (SLE) [108-110]. Aquellas pacientes con
afectación ganglionar tendrán un pronóstico más desfavorable que aquellas otras
pacientes en donde no se haya producido tal infiltración. De hecho se estima que el
70% de las pacientes con ganglios axilares positivos recidivarán a los l0 años
mientras que, en los pacientes con ganglios axilares negativos, el porcentaje de
recidivas se reduce a un 20-30% [111].
Joaquina Martínez-Galán Introducción
- 24 -
Para establecer con rigurosidad cuál es el grado de afectación axilar en estas
pacientes, se recomienda que sea examinado un número suficiente de ganglios. Los
estudios dirigidos a dilucidar esta cuestión indican que se deben obtener al menos
10 ganglios de la axila para definir el estado ganglionar, especialmente si este
resulta negativo [112-114].
Hoy día gracias a los avances quirúrgicos y técnicos, se dispone de una técnica
alternativa a la clásica disección axilar que se realizaba de forma sistemática en la
cirugía oncológica del cáncer de mama que es la biopsia del ganglio centinela. Esta
técnica actualmente ha reemplazado al vaciamiento ganglionar axilar como
método de elección para el estadiaje ganglionar de las pacientes afectas de cáncer
de mama en prácticamente la totalidad de los centros hospitalarios [115]. En los
últimos años numerosos estudios realizados para analizar si el estudio del ganglio
centinela podría reemplazar a la clásica estadificación por disección ganglionar,
han concluido que el procedimiento es seguro, factible y con menor morbilidad que
la técnica clásica de la disección ganglionar axilar [116]. Así estudios recientes en
este campo como los realizados por Turner ó Weaver afirman que aislar un ganglio
centinela negativo predice de forma significativa la ausencia de afectación del resto
de ganglios por ser este el ganglio que con mayor probabilidad será positivo en el
caso de existir afectación axilar, con una sensibilidad estimada en el 100% y una
tasa de recurrencias del 0.3% [117].
Sin embargo aún quedan algunos aspectos controvertidos por analizar entre
ellos es necesario saber cuál es el significado pronóstico de las micrometástasis
aisladas en el análisis por inmunohistoquímica del ganglio centinela y cuál es su
repercusión pronóstica [118].
Al analizar los ganglios extirpados en una disección ganglionar podemos hallar
la presencia de focos microscópicos metastásicos que según su tamaño se definen
como pN1mi cuando su tamaño está comprendido entre 2 mm y 0.2 mm y pN0 (i+)
cuando éste es menor de 0.2 mm [115, 119]. Estos pequeños focos de células
tumorales se han descrito que pueden detectarse entre el 9 y el 13% de los casos
con "axila negativa" con el análisis por técnicas de hematoxilina-eosina, y entre un
Joaquina Martínez-Galán Introducción
- 25 -
15% a un 20% de los casos con técnicas inmunohistoquímica [120]. Sin embargo,
actualmente siguen existiendo controversias acerca del valor pronóstico de estos
focos microscópicos metastásicos así como de la actitud terapéutica a seguir, si
bien se ha observado que su presencia se asocia de forma significativa a una peor
supervivencia cuando se compara con pacientes que no presentan afectación
ganglionar [110, 121].
En estudios realizados en Europa se considera de importancia pronóstica el
identificar la presencia de estos microscópicos focos metastásicos axilares; a esta
característica se le atribuye un mayor riesgo relativo (RR= 1.7) de desarrollar
metástasis a distancia en comparación con las pacientes sin metástasis
ganglionares ocultas [122]. Así mismo en otras investigaciones realizadas se ha
descrito una correlación significativa entre la presencia de micrometástasis en el
ganglio centinela con tumores de tamaño superior a 2 cm (T2-T3), grado tumoral
GIII y con invasión vascular como factores independientes para predecir la
afectación del resto de ganglios [123]. Por ello hay autores que aconsejan cuando
se detectan micrometástasis en el análisis del ganglio centinela, realizar una
disección axilar reglada aunque este recomendación sigue siendo motivo de
controversia [124].
Por lo tanto son necesarios nuevos estudios que investiguen factores
moleculares que asociados a los factores clínico-patológicos conocidos, ayuden a
identificar un subconjunto de pacientes en el grupo de pacientes con ganglio
centinela negativo, con alto riesgo de afectación ganglionar microscópica y así
omitir la disección axilar con la consecuente menor morbilidad en determinados
subgrupos de pacientes [125].
b) Tamaño tumoral (T): Es uno de los factores pronósticos más importantes
junto con la afectación ganglionar; en efecto el valor de “T” es uno de los tres
criterios utilizados para el estadiaje TNM (T: tamaño tumoral, N: número de
ganglios afectos y M: presencia de metástasis).
Joaquina Martínez-Galán Introducción
- 26 -
El tamaño tumoral se correlaciona con la presencia y el número de ganglios
linfáticos afectos, siendo además un factor pronóstico independiente que influye
sobre el riesgo de desarrollar metástasis a distancia en proporción directa al
tamaño del tumor [126]. Así en pacientes con tumores menores a 1 cm la
supervivencia global estimada a los 5 años es del 99 % comparado con el 89 %
para tumores entre 1- 3 cm y el 86 % para tumores entre 3-5 cm. Autores como
Rosen han estudiado la relación entre el tamaño tumoral y el intervalo libre de
enfermedad a los 20 años, encontrando una asociación significativa, con la
supervivencia sin recurrencia a los 20 años del 88 % para tumores de 1 cm, del 72
% para tumores 1.1 cm a 3 cm, y el 59 % para tumores entre 3.1 cm y 5 cm [127].
Se acepta de manera generalizada que las pacientes en las que el tumor es de 2 cm
o menos de diámetro máximo, tienen un pronóstico y una supervivencia
significativamente mejor comparada con las pacientes con tumores de mayor
tamaño [128, 129].
Así mismo en pacientes con tumores de pequeño tamaño se ha analizado el
papel del vaciamiento axilar con la intención de predecir en qué casos se podrían
evitar realizar disecciones axilares, observándose que tumores de tamaño < 0,5cm
no suelen presentar metástasis axilares en las series estudiadas, de manera que
son varios los autores que afirman que en estos casos, y en aquellos
correspondientes a tumores de bajo grado nuclear y de 0,6 a 1cm, podría ser
innecesario el vaciamiento axilar [130].
Por todo ello, la indicación precisa del tamaño tumoral debe de ser considerada
obligatoria en los informes anatomo-patológicos de patología quirúrgica mamaria.
c) Grado histológico (G): El grado histológico del tumor es otro de los
factores pronóstico utilizados en la clínica como criterio para considerar la
indicación de tratamiento adyuvante en las pacientes con cáncer de mama. Su
importancia como factor pronóstico independiente del tamaño tumoral y de la
afectación ganglionar, ha sido evaluada en números estudios tanto por la mayor
frecuencia de aparición de metástasis a distancia como por la menor supervivencia
global encontrada en aquellas pacientes que presentan tumores con mayor grado
Joaquina Martínez-Galán Introducción
- 27 -
histológico [131, 132]. Sin embargo y a pesar de requerir para su estudio de una
técnica sencilla como es la técnica de hematoxilina-eosina, no está exenta de
problemas derivados por un lado de los distintos sistemas de clasificación del
grado histológico que han ido apareciendo conforme nuevas revisiones y criterios
se han ido evaluando, así como de la subjetividad del observador a la hora de
evaluar los resultados [133].
Desde el primer sistema de clasificación histológica establecido por Bloom y col.
en 1950 [134, 135] que consideraba que el grado de formación tubular,
regularidad en el tamaño, forma y carácter de tinción del núcleo, y la
hipercromasia nuclear junto con la actividad mitótica, eran las características a
considerar hasta nuestros días, han ido apareciendo sucesivas clasificaciones
histológicas, la última de ellas la propuesta por Helpap en 1989 [136] que incluye
hallazgos nucleolares tales como su frecuencia, tamaño, número y localización.
De todas ellas una de las clasificaciones más usadas es la de Scarff-Bloom-
Richardson [137] que incluye el análisis del índice mitótico, el grado de
diferenciación y el pleomorfismo celular, asignando una puntuación de 1 a 3 a cada
variable siendo la suma de estas la que definiría el grado histológico en;
Grado 1 (Bien diferenciados): tumores con puntación final entre 3 a 5
puntos.
Grado 2 (Moderadamente diferenciados): tumores con puntación
final comprendida entre 6 a 7 puntos.
Grado 3 (Pobremente diferenciados): tumores con puntación final de
8 a 9 puntos.
d) Invasión linfovascular: La invasión linfovascular actualmente reconocida
como factor pronóstico de riesgo intermedio a partir del consenso de Saint Gallen
celebrado en 2007 [138], se sabe que representa uno de los eventos más
tempranos que se ponen en marcha en la cascada de la progresión del tumor
primario hacia los tejidos situados en su vecindad (invasión locoregional) como a
distancia (metástasis) [139]. La capacidad que tiene el tumor primario para
Joaquina Martínez-Galán Introducción
- 28 -
desarrollar nuevos vasos sanguíneos a través de los ya existentes e infiltrarlos
descrita inicialmente por Folkman en 1991, facilita que las células tumorales
penetren a través de ellos bien en los vasos sanguíneos o en los vasos linfáticos que
hay alrededor del tumor primario permitiendo que pequeños émbolos de células
tumorales pasen al torrente circulatorio y/o linfático y den lugar al desarrollo de
implantes metastásicos [100]. En diferentes estudios la identificación de este
evento de invasión linfovascular en el tumor primario ha sido relacionada como un
factor pronóstico independiente tanto para el riesgo de recidiva como para el
riesgo de muerte por cáncer de mama [140]. De igual forma se ha relacionado con
una mayor frecuencia de afectación ganglionar así como una mayor probabilidad
de desarrollar metástasis a distancia y menor supervivencia global con
independencia de la afectación ganglionar [141].
Sin embargo y a pesar de su importancia pronóstica, su determinación por la
técnica de hematoxilina-eosina no está libre de dificultades especialmente
relacionadas con la variabilidad inter-observador que existe en la identificación de
los pequeños racimos de células tumorales que se pueden aislar entre el espacio
vascular y las células endoteliales. Por ello nuevos estudios actualmente en curso
están evaluando el empleo de técnicas de inmunotinción para nuevos marcadores
antigénicos específicos de endotelio y vasos linfáticos, como D2-40 que hagan
posible diferenciar entre invasión vascular y linfática y ayuden a unificar y
estandarizar criterios de interpretación y análisis [142].
e) Tipo Histológico: El cáncer de mama es una enfermedad heterogénea
constituida por múltiples entidades histopatológicas asociadas cada una de ellas
con distintos factores biológicos y clínicos que le confieren significados
pronósticos diferentes [143]. La Organización Mundial de la Salud ha reconocido
hasta la fecha un total de 17 entidades histológicas cada una de ellas con
características moleculares distintas que le otorgan un comportamiento biológico
y pronóstico variable de acuerdo con el tipo histológico [101, 144]. No obstante
para simplificar y llevar a la práctica clínica esta clasificación, los parámetros que
en ella se incluyen se agrupan en 4 categorías que ayudan a precisar, e informar,
del pronóstico clínico en función de los datos histológicos [145];
Joaquina Martínez-Galán Introducción
- 29 -
Pronóstico Excelente: Supervivencia a 10 años > 80%. Incluye a los
subtipos: Tubular, Cribiforme, Mucinoso, Carcinoma Túbulo-lobulillar y
Adenoide Quístico.
Buen Pronóstico: Supervivencia a 10 años 60- 80%. Comprende a los
subtipos: Tubular Mixto, Ductal Mixto y Lobulillar Clásico.
Pronóstico Intermedio: Supervivencia a 10 años 60-50%. Constituído
por: Lobulillar Mixto, Medular y Medular Atípico.
Mal Pronóstico: Supervivencia a 10 años > 50%. Incluye; Ductal
Infiltrante, Ductal Mixto, Carcinoma Lobulillar Sólido, Micropapilar
Infiltrante y Carcinoma Inflamatorio.
1.3.3. Factores dependientes de las características biológicas y moleculares
del tumor
a) Expresión receptores hormonales (RH): La determinación de receptores
estrogénicos (RE) y receptores de progesterona (RP) por técnicas de
inmunohistoquímica (IHQ) en el estudio anatomopatológico del cáncer de mama,
se ha convertido en la actualidad en una práctica obligada por la repercusión tanto
pronóstica como predictiva de respuesta que tiene a la administración de
tratamientos hormonales [146, 147]. Aproximadamente entre un 55% a un 65%
de los carcinomas primarios de mama diagnosticados en la actualidad y entre un
45% a un 55% de las metástasis derivadas del tumor primario expresan
receptores hormonales. Clínicamente este hallazgo se ha correlacionado con un
moderado factor pronóstico a la vez que un importante factor predictivo de
respuesta al tratamiento hormonal tanto en adyuvancia como en pacientes en
estadio metastásico por ayudar a predecir la probabilidad de recidiva y
supervivencia de estas pacientes [148].
De hecho han sido muchos los estudios que han relacionado el estado de
expresión de receptores estrogénicos en el tumor como factor pronóstico al
asociar su falta de expresión con tumores de mayor grado histológico, mayor
Joaquina Martínez-Galán Introducción
- 30 -
riesgo de recidiva, menor supervivencia global y resistencia a terapia hormonal
[149], aunque existen algunas excepciones como ocurre con el carcinoma adenoide
quístico [150] y el carcinoma medular que a pesar de ser RH (-) tienen buen
pronóstico[151]. En relación a este parámetro se acepta que aquellas pacientes con
ausencia de expresión de RE (-) y/o RE-/RP- tienen un supervivencia a los 5 años
entre un 8% a un 35% más baja que aquellas pacientes con tumores RE (+) [148,
152].
De igual forma y aunque algunos autores cuestionan el valor del RP [153] se ha
descrito la importancia que tiene la expresión de RP como factor pronóstico ya que
los datos extraídos de los estudios clínicos realizados sugieren que en aquellos
pacientes que expresan RE+/RP- frente a los que expresan RE+/RP+ se observa una
menor respuesta al tratamiento hormonal con fármacos como el Tamoxifeno
describiéndose que sólo el 40% responden a dicho tratamiento [147]. Así mismo
se cree que la expresión de sólo uno de ellos en comparación con la positividad
para ambos receptores, se relaciona con tumores de mayor grado y mayor
porcentaje de expresión de HER2, por lo que se consideran entidades clínico-
patológicas distintas [154].
b) Expresión de Her-2/neu (erb-2). Oncogen cerb2: El oncogén HER2/neu
es un oncogén localizado en el cromosoma 17q21 que codifica una proteína de
membrana de 185 kD denominada p185, perteneciente a la familia de los
receptores tirosín quinasa del factor de crecimiento epidérmico (EGFR). Consta de
4 miembros denominados HER1 (EGFR), HER2, HER3 y HER4 y la proteína que
forma el receptor del factor de crecimiento epidérmico [155]. Posee un dominio
extracelular de 650 aminoácidos con dos regiones ricas en cisteína, que se enlazan
con el ligando, una región transmembrana y otro dominio intracelular de 580
amino ácidos con actividad de tirosín quinasa involucrada en la transducción de
señales relacionadas con procesos de proliferación y diferenciación celular [156].
Cuando el dominio extracelular de HER2 es ocupado por su ligando se produce una
dimerización del mismo que permite que se una a otro miembro de la familia HER
formando un complejo homo/ heterodímero que posibilita su fosforilación y
Joaquina Martínez-Galán Introducción
- 31 -
puesta en marcha de la cascada de transducción de señales responsable de un
determinado efecto biológico [157].
En el cáncer de mama esta proteína se ha observado que se encuentra
amplificada en alrededor del 20-30% de los casos, estableciéndose tras los
resultados obtenidos en múltiples estudios como un factor pronóstico
independiente tanto para la supervivencia global como para el intervalo libre de
enfermedad en pacientes con cáncer de mama, especialmente si presentan
ganglios linfáticos positivos [158]. La sobreexpresión de HER2 está relacionada
con mayor frecuencia con tumores RE (-) [159], con pobre grado de diferenciación
histológica y con una mayor proporción de pacientes con afectación axilar e
invasión vascular, todo lo cual explica el menor intervalo libre de enfermedad y
menor supervivencia global que caracterizan este grupo de pacientes [160].
También se ha descrito que la expresión de esta proteína se relaciona con la
respuesta al tratamiento con quimioterapia y hormonoterapia [161],
especialmente con la sensibilidad del tumor a tratamientos citotóxicos que
contengan Antraciclinas y Taxanos así como con la respuesta a terapias dirigidas
contra HER2; por otra parte los tumores que expresan esta macromolécula son
menos sensibles a esquemas con Ciclofosfamida, Metotrexate y 5-Fluorouracilo, y
muestran mayor resistencia al tratamiento con radioterapia y mayores niveles de
expresión de VEGF [162].
c) Proteína P53 (p53): El gen p53 se encuentra localizado en el brazo corto del
cromosoma 17 en la banda 17p. Es un gen tumor supresor que interviene en la
reparación del ADN por lo que se le ha denominado "guardián del genoma"
actuando como regulador negativo del crecimiento celular. Codifica una
fosfoproteína nuclear de 393 aminoácidos, cuya expresión se induce cuando se
ocasiona un daño en el ADN cualquiera que sea el mecanismo por el que tal daño se
induce -substancias carcinogénicas, radiaciones u otros-; tras este proceso la
proteína p53 que produce ocasiona la parada de la célula en fase G1 del ciclo
celular, induce la reparación del ADN y estimula la apoptosis de la célula cuando
no es posible la reparación del daño ocasionado al ADN. Por tanto alteraciones en
Joaquina Martínez-Galán Introducción
- 32 -
la función de p53 podrían dar lugar a que células que presentan alguna aberración
génica, proliferen y adquieran el carácter de transmisibilidad del daño a sus
descendientes dando como resultado el desarrollo del cáncer [163].
La mutación del gen p53 se ha descrito en el 20-50% de los cánceres de mama
aumentando su frecuencia en aquellos pacientes con antecedentes familiares. Se
asocia con un factor de mal pronóstico por causar la pérdida de la función
supresora y permitir el crecimiento celular ilimitado.
d) Ki-67 (mib 1): Es una proteína nuclear de 349kD que se aísla en aquellas
células que se encuentran en fases activas del ciclo celular como son la fase G1, S,
G2 y M, mientras que es imperceptible en aquellas células que se encuentran en
fase G0 ó quiescentes [164]. Por tanto su marcaje permite la identificación de la
proporción de células de un tumor que se encuentran en fase de proliferación
celular. Es decir, a través de su determinación por citometría de flujo nos informa
de cuál es la fracción de células de un tumor que se encuentran en división o que se
están preparando para duplicar su ADN, y es fácil entender que su presencia sea un
marcador de la actividad proliferativa celular [165]. Por esa razón se entiende su
valor como factor pronóstico adverso de la enfermedad, puesto que a mayor
proporción de Ki-67 aislado en una pieza tumoral, mayor índice mitótico y de
proliferación celular tienen las células del tumor y por tanto se considera que la
mayor agresividad y peor pronóstico se asocian con la presencia de este marcador
en niveles elevados mientras que un pronóstico más favorable podría asignarse a
los tumores que expresan Ki-67 en baja proporción [166].
También se sabe que la positividad de Ki-67 está relacionada con tumores mal
diferenciados, con la presencia de invasión vascular y metástasis en los ganglios
linfáticos mientras que es poco frecuente en tumores con receptores hormonales
positivos [167].
Joaquina Martínez-Galán Introducción
- 33 -
e) Otros factores moleculares pendientes de validar. Perfil Génico
La mama está formada por unidades funcionales denominadas unidad terminal
ducto-lobular (UTDL), constituidas por dos grupos principales de células; las
células epiteliales (luminales) y las células mioepiteliales (basales) yuxtapuestas a
la membrana basal denominadas así porque expresan características tanto de
células epiteliales como de músculo liso [168].
Las células luminales se caracterizan desde el punto de vista
inmunohistoquímico (IHQ) por expresar citoqueratinas (CK) del epitelio simple
como son CK7, CK8, CK18 y CK19, integrina α6 y moléculas de adhesión epitelial.
En cambio las células basales se caracterizan por expresar una serie de
marcadores propios como son las citoqueratinas 5 y 14, receptor del factor de
crecimiento epidérmico (EGFR), actina del musculo liso, S-100, p63 y 14-3-3 sigma
entre otros y no expresar las CK que expresan las células luminales como tampoco
expresan receptor de estrógenos ni receptor de progesterona [168-170].
Recientemente diversos trabajos publicados en la literatura han puesto de
manifiesto como los cánceres de mama asociados a expresión de marcadores tipo
basal se relacionan con peores resultados en términos de supervivencia y recaídas
más precoces frente a aquellos que expresaban marcadores tipo luminal [171,
172].
Atendiendo a estos hallazgos se ha desarrollado una clasificación molecular del
cáncer de mama que ayuda a predecir a partir de características moleculares del
tumor el pronóstico y sensibilidad a los tratamientos administrados y por lo tanto
contribuye a seleccionar tratamientos más personalizados.
Esta clasificación distingue 4 subtipos de cáncer de mama que se caracterizan
por persistir después de los tratamientos administrados y correlacionarse con las
características moleculares entre el tumor primario y las metástasis que puedan
aparecer secundariamente: [173, 174]:
Joaquina Martínez-Galán Introducción
- 34 -
Subtipo Basal (Triple negativo): Representan el 15-20% de los cánceres de
mama [175]. Se caracterizan por ser tumores de alto grado (G III), no expresar
receptores hormonales (RE y RP negativos) ni sobreexpresar HER2, presentar
marcadores mioepiteliales en la mayoría de los casos [176] y sobreexpresar
EGFR (HER1) y p53 [177, 178]. Se asocian a resistencia a tratamientos contra
dianas HER2 como Trastuzumab así como a terapia hormonal, tanto con
Tamoxifeno como con inhibidores de la Aromatasa, por lo que son tumores
donde la quimioterapia representa el pilar del tratamiento sistémico. Se dice
que hasta el 29% de los tumores RE (-) expresan receptores tipo mioepitelial
[179, 180]. Los cánceres de mama relacionados con mutaciones en BRCA
suelen tener este fenotipo molecular [181].
Subtipo Luminal A: Junto con el subtipo Luminal B representan el subgrupo de
mejor pronóstico. Se caracteriza por expresar RE y RP fuertemente positivos y
ser HER2 negativos [182], por lo que son muy sensibles a tratamientos
hormonales. Expresan marcadores de células epiteliales fundamentalmente CK
7,8, 18, y 19 [183].
Subtipo Luminal B: Se caracterizan por una expresión moderada de RE y una
expresión baja o negativa de RP. Pueden sobreexpresar HER2 y muestran
marcadores epiteliales. Se asocian a peor pronóstico [184, 185].
Subtipo HER2: Junto con el subtipo triple negativo se asocia a peor pronóstico.
Desde el punto de vista inmunohistoquímico se caracteriza por sobreexpresar
HER2 por lo que son tumores sensibles a terapia contra dianas HER y ser
negativo para la expresión de RE y RP [185].
Joaquina Martínez-Galán Introducción
- 35 -
1.4. PRUEBAS DIAGNÓSTICAS EMPLEADAS EN EL DIAGNÓSTICO DE CÁNCER
DE MAMA. LIMITACIONES ACTUALES EN EL DIAGNÓSTICO PRECOZ
La detección en etapas precoces del cáncer de mama sigue siendo unos de los
principales objetivos a alcanzar para conseguir mayores tasas de supervivencia y
de curación en las pacientes diagnosticadas de esta patología. Actualmente
conocemos que existen lesiones precursoras de cáncer que diagnosticadas
precozmente y tratadas de forma adecuada en etapas donde la enfermedad aún no
es invasiva son potencialmente curables. De igual forma se sabe que cuando la
enfermedad se hace invasiva y es diagnosticada en estadios iniciales la tasa de
supervivencia es mayor que cuando el cáncer se detecta en estadios más
avanzados.
En la actualidad gracias a las campañas de “screening” y a su mayor y mejor
difusión poblacional, junto con los avances producidos en técnicas de diagnóstico
por imagen así como al empleo de tratamientos oncológicos más eficaces, se ha
conseguido que alrededor de 2 millones de mujeres hayan sobrevivido tras el
tratamiento de un cáncer de mama [186, 187]. No cabe duda que parte de ese
incremento en la curación está en relación con la detección precoz de tumores de
mama en mujeres asintomáticas que consiguen llegar a un diagnóstico más
temprano y por tanto a la aplicación de tratamientos en estadios más incipientes lo
que hace que la enfermedad sea potencialmente curable.
No obstante y paralelamente a los métodos por imagen que clásicamente se
utilizan en las campañas de “screening”, cada vez son más los estudios en el campo
de la Proteómica y Genómica que están analizando el perfil molecular y genético a
partir del tejido tumoral y/o de la sangre de los sujetos diagnosticados de cáncer
para predecir poder ofrecer una aproximación al pronóstico de la enfermedad
[188] y por tanto administrar tratamientos más personalizados, como son el Kit
Oncotype DX [189] y el estudio Mammaprint [190]. Sin embargo la aplicación de
estos test genéticos a la práctica clínica aún dista de ser utilizados de forma
rutinaria.
Joaquina Martínez-Galán Introducción
- 36 -
Por ello todavía hoy día siguen siendo los métodos de diagnóstico por imagen y
exploración física, con sus limitaciones, los medios actualmente disponibles y
utilizados en clínica para llegar a un diagnóstico precoz. Estos métodos
principalmente son; la mamografía y la exploración física realizada por
profesionales expertos, seguidos de ecografía, autoexploración y resonancia
nuclear magnética (RNM).
1.4.1. Autoexploración
En décadas anteriores la autoexploración mamaria constituía uno de los
métodos por el que se diagnosticaban muchos de los casos de cáncer de mama. Hoy
día esta situación ha cambiado de forma significativa gracias a la divulgación de
nuevas técnicas de imagen como la mamografía, la resonancia magnética (RM) y la
ecografía mamaria que se han llevado a cabo a través de las campañas de cribado
poblacional y que han conseguido detectar lesiones de menor tamaño con la
consiguiente repercusión en un mejor pronóstico y supervivencia del cáncer de
mama [191-193].
A pesar de ello la autoexploración sigue teniendo su papel en el algoritmo de
cribado, de diagnóstico precoz y de recidiva, por ser una técnica de fácil uso, no
cruenta, asequible a toda la población y que no requiere de ningún tipo de
instrumentación compleja para su realización. La autoexploración mamaria
permite a la mujer familiarizarse con su propia anatomía pudiendo apreciar
cambios de textura, tamaño o apariencia de la mama como un signo de alarma a
partir del cual consultar al médico quien determinará la conveniencia, o no, de
realizar otras pruebas complementarias. Incluso se ha insistido que mediante este
procedimiento, en ocasiones, se han podido detectar tumores de tamaño inferior a
los que puede percibir el clínico. Sin embargo y a pesar de existir campañas
educativas y gran divulgación para conseguir su aplicación, son muchas las mujeres
que no la realizan de forma rutinaria por lo que junto con la existencia de mejores
técnicas diagnósticas y la disminución significativa en el tamaño de presentación al
diagnóstico de los tumores de mama, ha hecho que su uso quede desplazado por las
nuevas técnicas de imagen [194].
Joaquina Martínez-Galán Introducción
- 37 -
No obstante es necesario enfatizar que la autoexploración exclusiva no ha
demostrado ser un método eficaz para disminuir la mortalidad ni mejorar la
detección precoz del cáncer de mama [195, 196]. De hecho en recientes revisiones
se cuestiona su recomendación por ocasionar un aumento importante del número
de biopsias sin que de ello se derive un beneficio en supervivencia en el cáncer de
mama [197, 198]. Sí ocasiona en cambio, un incremento en el diagnóstico de
patología benigna y por tanto un mayor número de biopsias sin que con ello
podamos predecir si con posterioridad va a desarrollarse o no un proceso tumoral
[195, 199].
Aún así donde parece que la autoexploración mamaria tiene un papel más
importante es en el subgrupo de mujeres con historia familiar de cáncer de mama
hereditario especialmente las portadoras de la mutación en BRCA1 ya que con
frecuencia se acompañan de tumores pobremente diferenciados con mayor
velocidad de crecimiento y por lo tanto más fácilmente detectables por este
procedimiento [200].
1.4.2. Exploración mamaria por un clínico experto
Es junto con la mamografía una de las técnicas empleadas en la consulta diaria
para el diagnóstico precoz así como para el seguimiento postratamiento de las
paciente diagnosticadas de cáncer de mama. Cuando a ésta exploración clínica se le
une la mamografía se consigue detectar un mayor número de ganglios clínicamente
negativos y tumores de menor tamaño que si es realizada de forma exclusiva [201].
Por otra parte en pacientes más jóvenes donde la mamografía tiene menor
sensibilidad y no es realizada de forma habitual, la exploración física de la mama
adquiere un parel importante en la detección precoz de esta patología [202]. Sin
embargo no se ha podido demostrar que de su aplicación de derive un descenso en
los índices de mortalidad por cáncer de mama [203, 204].
Joaquina Martínez-Galán Introducción
- 38 -
1.4.3. Ecografía Mamaria
El uso de ultrasonidos en el campo de la Senología fue descrito inicialmente por
Kikuchi. K. y col. en el año 1957 [205]. Desde entonces hasta nuestros días, el
empleo de la ultrasonografía ha ido adquiriendo progresivamente un papel cada
vez más relevante por su amplia aplicación tanto como técnica de “screening” como
en el diagnóstico de la patología tumoral de la mama. Esta técnica está exenta de
efectos secundarios y que en muchos casos proporciona al clínico información que
puede sugerir si se trata de una lesión de características benignas o malignas.
Incluso en aquellos casos que es de difícil interpretación, puede ser utilizada como
guía para la realización de una punción aspiración o biopsia [206].
Una de las principales indicaciones de uso es en el “screening” de las mujeres de
edad comprendida entre los 30 y 39 años, en las cuales por la mayor densidad
radiológica del tejido mamario tiene menor resolución [207, 208]. Es en este rango
de edad donde la ecografía ha demostrado en estudios retrospectivos tener mayor
sensibilidad que la mamografía en el diagnóstico de carcinoma invasivo con un
99% frente al 85% respectivamente. Sin embargo cuando se trata de detectar la
presencia de microcalcificaciones características de ciertos tipos de lesiones
mamarias malignas la ventaja de la mamografía es indudable frente a la ecografía
con una sensibilidad aproximada del 22% [209].
A pesar de lo expuesto uno de los principales inconvenientes que tiene la
ecografía es que su sensibilidad al diagnóstico disminuye cuando se trata de
lesiones no palpables [210], que posee una baja especificidad y que hasta ahora no
hay estudios que demuestren que mediante su uso como test de despistaje tumoral
se haya conseguido disminuir la mortalidad por cáncer de mama [206, 211].
1.4.4. Mamografía
Son muchos los estudios randomizados que han analizado y evaluado el papel
que tiene el empleo de la mamografía como técnica diagnóstica en el “screening”
poblacional del cáncer de mama. De ellos se ha sugerido que de su uso se puede
derivar una reducción significativa de la mortalidad por esta enfermedad [212]. Y
Joaquina Martínez-Galán Introducción
- 39 -
hoy día se acepta que aplicada en programas de cribado poblacional sistemáticos la
mamografía ha supuesto un importante avance al conseguir disminuir los índices
de mortalidad por cáncer siendo este beneficio máximo en mujeres de edad
comprendida entre 60 y 69 años con un beneficio en términos de mortalidad
acumulada que sigue existiendo incluso después de 10 años [213].
La mamografía es una exploración no invasiva que utiliza radiación ionizante
(rayos X) de baja energía para detectar anomalías estructurales en la mama.
Actualmente se la considerada como una de las técnicas disponibles hoy día más
importantes para el diagnóstico precoz del cáncer de mama ya puede detectar
alteraciones en el parénquima mamario sospechosas de malignidad antes de que
sean evidentes en la exploración física. Presenta una sensibilidad en general de un
75%, encontrándose comprendida entre un 54% a un 58% para mujeres menores
de 40 años y entre un 80% a un 94% para aquellas mujeres de más de 65 años
[204].
Los programas de “screening” poblacional incluyen actualmente la mamografía
como una de las pruebas más importantes a realizar recomendando su realización
de forma bianual a partir de los 50 de edad. Son varios los metaanálisis que han
comparado las diferencias en cuanto a la mortalidad por cáncer de mama tras
realizar campañas de cribado que incluyesen la exploración mamográfica de forma
anual frente a realizarla cada 2 años. De esos estudios se sabe que el beneficio en
supervivencia en términos absolutos estaba en torno al 0.6% en 5 años y 1.2% en
10 años para aquellas pacientes que se realizaban una mamografía cada año en el
“screening” lo que no justifica la frecuencia anual en su empleo [214-216].
Actualmente una nueva modalidad de mamografía, la mamografía digital DMIST
(Digital Mammographic Imaging Screening Trial) parece que si bien tiene una
sensibilidad similar a la mamografía convencional, parece que es más exacta en
mujeres menores de 50 años y en perimenopáusicas, con mamas radiológicamente
más densas [217].
Joaquina Martínez-Galán Introducción
- 40 -
Sin embargo, por sí sola la mamografía no confirma el diagnóstico de malignidad,
siendo necesaria la realización de una prueba invasiva como es la biopsia para
alcanzar la confirmación histopatológica.
1.4.5. Resonancia Nuclear Magnética (RM)
El “screening” de cáncer de mama por mamografía ha conseguido disminuir la
mortalidad de la misma entre un 25 a un 30% en la población general como lo han
puesto de manifiesto numerosos estudios. Sin embargo existe un subgrupo de
pacientes de alto riesgo, especialmente si ocurre a edades jóvenes en donde el
diagnóstico precoz por mamografía no tiene una adecuada sensibilidad. Incluso en
aquellos casos de mujeres de alto riesgo donde la mamografía consigue detectar la
presencia de un tumor, en muchas ocasiones los detecta en un estadio subóptimo
[218].
La resonancia nuclear magnética (RM) es una técnica diagnóstica de gran
utilidad en la detección y la caracterización de la patología mamaria [219-221].
Inicialmente se empezó a realizar sin emplear medios de contraste hace más de 30
años [222]; posteriormente y como resultado de los estudios realizados se ha
indicado la importancia de emplear contraste como el gadolinio para conseguir
una mayor resolución y calidad de imagen y así poder discriminar mejor entre
lesiones benignas y malignas de la mama.
Presenta algunas ventajas sobre otras técnicas diagnósticas empleadas en el
“screening” del cáncer de mama. Entre ellas su alta sensibilidad de alrededor del
70-100% frente al 13-59% de la mamografía y al 13-65% de la ecografía para
detectar tumores de pequeño tamaño [223]. Sin embargo no está exenta de
algunas desventajas, entre las que destaca su moderada especificidad para
diferenciar entre lesiones benignas de aquellas que son de carácter maligno
obteniéndose alrededor de un 5% falsos positivos que requieren de la realización
de nuevas pruebas como la biopsia, así como su alto coste, largo tiempo de examen
y una menor disponibilidad de uso comparada con la mamografía y ultrasonido
[224].
Joaquina Martínez-Galán Introducción
- 41 -
Estos resultados propiciaron la puesta en marcha de 11 estudios prospectivos
que comparaban la adicción de la RM anual a la mamografía en los programas de
detección precoz del cáncer de mama. El resultado que se obtuvo fue un
incremento en la sensibilidad de la mamografía en cuanto a la detección precoz
superior al 90% (más del doble que la mamografía sola). Aunque los datos de
supervivencia no estén aún disponibles, la distribución por estadios de los tumores
diagnosticados predice una reducción significativa del índice de mortalidad de
cáncer de mama comparado con la obtenida al realizar sólo mamografía [218].
Por todo ello actualmente la recomendación de realización de una RM de mama
en las guías de práctica clínica son fundamentalmente en aquellas mujeres de alto
riesgo por ser portadoras de una mutación genética en BRCA relacionada con el
cáncer de mama hereditario [225-227], en aquellas otras en donde no se ha
descrito esta mutación pero si tienen antecedentes de primer grado portadores de
la mutación y por lo tanto también tienen un mayor riesgo de desarrollar cáncer de
mama, en aquellas mujeres que fueron sometidas a irradiación torácica entre los
10 a 30 años de edad y en las que su riesgo estimado de desarrollar cáncer de
mama al aplicarle un modelo estadístico de riesgo (ej. BRCAPRO) se encuentra
entre el 20-25% [228]. Sin embargo todavía hoy no se considera que existan
suficientes datos para recomendar su uso en mujeres con historia familiar de
cáncer de mama, con mamas densas mamográficamente, o con una biopsia previa
de alto riesgo de hiperplasia ductal o lobulillar atípica o de carcinoma lobular in
situ [229, 230]. También se recomienda en la revaluación de la respuesta del
tratamiento neoadyuvante y en pacientes que debutan con metástasis axilares de
origen desconocido [229].
Sin embargo hasta el momento no hay estudios sobre el impacto protector que
tiene la RM en términos de supervivencia [231].
Por todo ello se debe seguir en la búsqueda de nuevos métodos de “screening”
que puedan optimizar los resultados obtenidos en la detección precoz del cáncer
de mama bien asociando técnicas como ecografía y mamografía o quizás
Joaquina Martínez-Galán Introducción
- 42 -
incorporando determinaciones moleculares a las clásicas técnicas de imagen
conocidas.
1.5. ALTERACIONES EPIGENÉTICAS EN EL CÁNCER
El cáncer se produce como consecuencia de la pérdida de regulación del
crecimiento celular normal dando lugar a un clon celular con capacidad para crecer
de forma desorganizada e independiente de los mecanismos de regulación que en
condiciones fisiológicas rigen el correcto funcionamiento celular normal. Esta
cadena de eventos hace que la célula vaya adquiriendo progresivamente capacidad
para diseminar, invadir y dañar tejidos y órganos situados a distancia del lugar
donde se originó inicialmente el tumor produciendo metástasis.
En tejidos normales y en condiciones fisiológicas, existe un riguroso y complejo
control del crecimiento y la diferenciación celular perfectamente regulado
existiendo un equilibrio entre los factores que estimulan la proliferación y
diferenciación celular, de aquellos que estimulan la muerte celular programada o
apoptosis. Cuando este equilibrio se altera a favor de los procesos de proliferación
y supervivencia celular, los mecanismos de control que regulan la multiplicación y
la muerte celular dejan de actuar correctamente, iniciándose un proceso de
crecimiento y multiplicación celular anárquico carente de control y orden, que
puede derivar en el desarrollo de un proceso tumoral.
La expresión de la información genética a nivel celular que va a determinar el
fenotipo y diferenciación de un individuo va a estar sujeta a múltiples
acontecimientos a nivel molecular que van a influir en la expresión de proteínas
funcionales y en su funcionamiento. A lo largo de la vida, las células pueden ir
acumulando daños en el ADN como consecuencia de deleciones, translaciones,
mutaciones derivadas entre otras causas de la exposición a agentes químicos,
radiaciones y virus, que si bien en la mayoría de las ocasiones no tienen
repercusiones futuras, otras en cambio producen alteraciones en la maquinaria
genética que otorgan a la célula propiedades conductuales y de funcionamiento
como la capacidad de reproducirse de forma indefinida, ser indiferentes a las
Joaquina Martínez-Galán Introducción
- 43 -
señales que regulan el crecimiento celular normal tanto factores positivos como
factores inhibitorios, evasión de la muerte celular programada y desarrollo de
capacidad angiogénica lo que otorga a la célula tumoral y a su progenie la capacidad
para invadir y producir metástasis así como ventajas en supervivencia sobre las
células normales [232].
Durante décadas se ha cuestionado si la iniciación y progresión del cáncer, se
debía sólo a eventos genéticos. Actualmente se considera que el proceso de
carcinogénesis es el resultado de no sólo cambios en la secuencia de nucleótidos de
la cadena del ADN sino que también procesos epigenéticos (modifican la función
de un gen, sin modificar la secuencia de nucleótidos del ADN) van a intervenir a
través de modificaciones de la función de un gen, en la proliferación celular
pudiendo contribuir a la aparición de alteraciones moleculares responsables del
desarrollo de las enfermedades neoplásicas [233].
El código genético consta de 2 tipos de información: genética y epigenética. La
información contenida en el primero de los casos consiste en 64 tripletes de
nucleótidos llamados codones, tal que cada codón codifica para uno de los 20
aminoácidos utilizados en la síntesis proteica. Esta información genética contenida
en dichos genes puede sufrir alguna alteración como ocurre cuando se produce
una mutación, lo que provoca un cambio permanente en la secuencia del ADN y
consecuentemente la síntesis proteica anormal. Este hecho ocasiona dependiendo
de qué proteína está alterada y cuál es la función que realizaba en condiciones
fisiológicas, una alteración en la replicación, supervivencia celular etc. que puede
propiciar la puesta en marcha de la cascada de la carcinogénesis.
El otro tipo de información estaría representada por la epigenética donde
residen las instrucciones de cómo, dónde y qué información genética debe ser
utilizada en cada momento. Es decir aunque el genoma contiene toda la
información necesaria para poner en marcha la transcripción del código genético,
la expresión de esta información está regulada por la información epigenética
fundamentalmente representada hasta lo que sabemos hoy día, por el patrón de
Joaquina Martínez-Galán Introducción
- 44 -
metilación de las secuencias CpG contenidas en la región promotora del gen en
cuestión y la desacetilación de las histonas.
Sin embargo entre ambos tipos de información existen algunas diferencias que
son importantes conocer ya que nos podrían permitir su empleo en la
investigación y en la búsqueda de nuevas dianas terapéuticas en el cáncer. Así
mientras que los eventos genéticos como las mutaciones producen cambios
permanentes en la secuencia del ADN, la metilación de las regiones CpG de la
región promotora de un gen sólo silencia su expresión proteica sin modificar la
secuencia de nucleótidos. Esta característica unida a que hoy conocemos que es un
proceso reversible hace que sea un interesante mecanismo a desarrollar para
revertir el funcionamiento celular anormal de una célula tumoral.
El término epigenética se refiere a un cambio heredable en el patrón de
expresión génica, mediado por mecanismos diferentes a los eventos genéticos
como son las translocaciones, mutaciones, deleciones etc., que pueden producir
modificaciones secundarias de los componentes de la cromatina a través de
cambios en el patrón de metilación del ADN y de la acetilación/desacetilación de las
histonas. Ambos mecanismos pueden ocasionar cambios en la expresión proteica
de la célula anulando sus funciones fisiológicas por silenciamiento transcripcional
de un gen determinado sin cambiar con ello el código genético [234, 235]. Hoy se
sabe que estas aberraciones epigenéticas, pueden estar implicadas en etapas
tempranas de la carcinogénesis y que su estudio como biomarcador en la detección
precoz del cáncer podría tener determinadas ventajas frente al estudio de
alteraciones genéticas: i) en cáncer, la frecuencia de metilación aberrante en las
islas CpG situadas en la región promotora de numerosos genes es mayor que la
frecuencia con la que se encuentran alteraciones en el ADN ocasionadas por
mutaciones así como que este perfil de metilación aberrante se puede cuantificar;
ii) la metilación aberrante en las islas CpG puede ser detectada incluso cuando esta
anomalía está acompañada de gran cantidad de ADN normal y iii) las técnicas para
detección las islas CpG metiladas son relativamente sencillas [232, 236].
Joaquina Martínez-Galán Introducción
- 45 -
Durante la década de 1980 y 1990 disminuyó considerablemente el interés en el
estudio de los cambios epigenéticos en la carcinogénesis, al ponerse de manifiesto
que existía gran cantidad de cambios en la estructura primaria del ADN como
posibles responsables del desarrollo de procesos como el cáncer. Sin embargo
actualmente este enfoque ha cambiado sustancialmente debido a la observación de
que el silenciamiento de la región promotora de genes por metilación de las
citosinas en las células tumorales está claramente relacionada con la puesta en
marcha de mecanismos moleculares implicados en carcinogénesis a través de
alteraciones en la regulación del ciclo celular, la reparación del ADN, la interacción
célula a célula, la apoptosis o la angiogénesis tumoral [237-239].
El papel por tanto que ocupa el proceso de metilación del ADN y su implicación
en la fisiopatología del cáncer, se ha convertido en uno de los hallazgos de mayor
importancia en la investigación del cáncer. Uno de los principales avances en este
campo en los últimos 5 años, ha sido el reconocimiento del papel clave que
desempeña el estado de la cromatina como mediador entre la metilación del ADN y
el silenciamiento transcripcional de numerosos genes como son los genes tumor
supresor [240, 241].
Por lo tanto hoy día gracias a los trabajos en el campo de la Biología Molecular,
sabemos que el cáncer, es en parte una enfermedad de origen genético es decir,
debida a la aparición de alteraciones en el genoma celular pero también a la
aparición de cambios en la expresión de genes, o en la actividad biológica de
proteínas codificadas por ellos [8]. La mutación de oncogenes específicos o genes
supresores de tumores, debida a la presencia de lesiones de ADN no reparadas,
ocasiona una pérdida en la regulación normal del ciclo celular que favorece la
proliferación celular incontrolada lo que junto con el silenciamiento de genes
involucrados en regular la supervivencia y apoptosis celular podrá dar lugar al
desarrollo de un cáncer [8]. Estas alteraciones genéticas en ocasiones se producen
en la línea germinal (las mutaciones hereditarias son una excepción) pero la
mayoría de las veces son mutaciones somáticas (cambio genético en la secuencia
del ADN en células no derivadas de la línea germinal) que de no ser reparadas
correctamente pueden dar lugar a alteraciones en el ADN como son;
Joaquina Martínez-Galán Introducción
- 46 -
translocaciones, deleciones, inversiones, amplificaciones o mutaciones puntuales
[242].
Por tanto el estudio epigenético del cáncer en humanos desde su descubrimiento
en 1983, ha permitido avanzar en el conocimiento etiopatogénico del cáncer
incluyendo procesos de hipometilación global de la molécula de ADN, la
hipermetilación de las regiones promotoras de los genes, la pérdida de
“imprinting”, la modificación de la cromatina y estudios de microARNs [243]
poniendo todo ello en relación con la situación clínica de los pacientes afectos de
enfermedades neoplásicas.
1.5.1. Biología de las regiones CpG, metilación del ADN y acetilación/
desacetilación de las histonas
El ADN es la molécula responsable de almacenar la información genética; en ella
residen las claves para regular la diferenciación celular de los diferentes tejidos y
órganos que conforman un individuo. Estructuralmente está constituído por una
doble cadena de ADN enrollada sobre sí misma de tal manera que cada cadena
sencilla está dirigida en sentido antiparalelo (considerando la dirección de su
polimerización o crecimiento) formando una estructura en espiral con grupos
azúcar-fosfato orientados hacia el exterior constituyendo el esqueleto y bases
nitrogenadas que están orientadas hacia el eje central de la espiral. Esta molécula
de ADN no se encuentra en la célula como una molécula desplegada, sino que
habitualmente se repliega sobre sí misma asociándose a otras moléculas
fundamentalmente proteínas denominadas histonas formando una estructura más
estable y compleja llamada cromatina.
En condiciones fisiológicas cuando un estímulo extracelular llega a la célula, éste
se une a su receptor de membrana produciendo la activación de distintas vías de
transducción de señales intracelulares que finalmente conducen a la activación de
factores de transcripción y la síntesis proteica derivada de la activación de un
determinado gen. En este contexto la cromatina que estructuralmente está
condensada en el núcleo de las células (forma inactiva), se “descompacta” ante la
Joaquina Martínez-Galán Introducción
- 47 -
llegada de señales intracelulares permitiendo así que las ARN polimerasas inicien
el proceso de transcripción y transducción proteica en respuesta a un determinado
estímulo extracelular. De esta forma se activan o inhiben rutas de señalización
implicadas en los procesos fisiológicos de proliferación, diferenciación,
supervivencia, transformación y muerte celular necesarios para mantener la
homeostasis tisular [244].
En esta cadena de eventos que ocurren en el interior de la célula, son de gran
importancia determinadas fenómenos epigenéticos que tienen un peso importante
en la maquinaria de regulación de los procesos de transcripción génica. Entre ellos
se encuentran las modificaciones covalentes que suceden en las histonas por
procesos de acetilación-desacetilación de las mismas, así como las reacciones de
metilación/desmetilación de las citosinas en el ADN. En el primer caso se sabe que
cuando se produce la acetilación de los residuos de lisina (unión grupo acetilo) de
los extremos amino-terminales de las histonas (NH2-terminal) realizados por
enzimas con actividad histona-acetilasa (HAT), se produce una reducción de la
carga positiva de estas proteínas lo que disminuye por tanto su afinidad de unión
al ADN (cargado negativamente) “descompactando” la cromatina y permitiendo la
transmisión de señales y la entrada de los factores de transcripción a la cadena de
ADN. Así se puede iniciar la síntesis proteica. Por contra, cuando se producen los
procesos de desacetilación de las histonas mediados por enzimas con actividad
desacetilasas se provoca el efecto inverso, es decir se mantiene la estructura
cerrada de la cromatina impidiendo la transcripción proteica [245].
El segundo de los caso representa otro de los eventos decisivos en la regulación
transcripcional y expresión génica conocido como metilación del ADN, mecanismo
fisiológico esencial para el desarrollo normal de mamíferos y plantas. Este evento
en el genoma de los seres vertebrados tiene lugar en las secuencias CpG localizadas
en la región promotora de los genes. Hoy conocemos que la metilación del ADN es
un fenómeno epigenético que tiene un papel decisivo en la regulación de los
procesos de transducción de señales actuando a dos niveles; a) directamente sobre
la secuencia promotora del gen que al ser metilada ocasiona el silenciamiento de la
transcripción proteica de dicho gen y por tanto anula su función, y b)
Joaquina Martínez-Galán Introducción
- 48 -
indirectamente actuando sobre la transcripción génica al favorecer que la
cromatina se encuentre en su forma inactiva (cerrada/ compacta) cuando la región
promotora del gen se encuentra metilada; de esta manera se impide la unión de
factores de transcripción al ADN. En condiciones fisiológicas este evento
epigenético tiene un papel fundamental a la hora de dictaminar qué genes se
activan durante el proceso de diferenciación de la célula comprometida normal
[246], así como en el mantenimiento del “imprinting” genético [247], inactivación
del cromosoma X [248], represión transcripcional genética [249] y en la supresión
de regiones “parasitarias” del ADN [250]. Sin embargo, también juega un papel
determinante en el desarrollo de un proceso tumoral maligno cuando se produce
de forma aberrante [251].
La metilación del ADN consiste en la adicción covalente de grupos metilos
generalmente al carbono 5´ de residuos de citosinas (C) del ADN situadas previa y
contiguamente a bases de guanina (G) por medio de unas enzimas denominadas
ADN-Metiltransferasa (DNMTs). Hasta la fecha se han descrito dos tipos de
enzimas ADN Metiltransferasas: una inicial que se conoce como ADN
Metiltransferesa de “novo” y un segundo tipo conocida como ADN Metiltransferasa
de “mantenimiento”. La primera de ellas, las DNMTs de “novo” (DNMT3A y
DNMT3B) serían las encargadas de establecer el perfil de metilación del genoma en
etapas tempranas del desarrollo mientras que las DMNTs de mantenimiento
(DNMT1) se encargan posteriormente de propagar con rigurosa fidelidad este
perfil de metilación CpG en cada una de las generaciones posteriores derivadas de
la célula progenitora [252].
Estas enzimas es muy importante que actúen correctamente ya que cuando se
altera su función y se produce una metilación aberrante puede favorecer el
silenciamiento génico y por tanto la falta de transcripción proteica de
determinados genes reguladores encargados de controlar el adecuado
funcionamiento celular y así permitir la expresión de oncogenes que ponen en
marcha la cascada de la carcinogénesis. De hecho en estudios experimentales
realizados en ratón se ha descrito que la ausencia de función de cualquiera de estas
enzimas DNMTs (DNMT1, DNMT3A y DNMT3B) ocasiona la muerte del ratón
Joaquina Martínez-Galán Introducción
- 49 -
durante el periodo embrionario o inmediatamente después. En células tumorales
humanas también se ha descrito que la deficiencia en DNMT1 induce mitosis
atípicas que provocan la muerte celular mientras que las enzimas DNMT3A y 3B
parece que median en la transformación neoplásica y la progresión tumoral [253].
La metilación de las “citosinas” en el ADN ocurre en regiones del gen ricas en
dinucleótidos de citosina y guanina (CpG), que aparecen agrupados en formaciones
de unas 1000-1500 pb conocidas como “islas CpG” y que se encuentran localizadas
en regiones que son decisivas para la regulación de la transcripción génica.
En efecto aún cuando el dinucleótido CpG se distribuye de forma repetitiva y al
azar por todo el genoma humano, esta secuencia se encuentra preferentemente
ubicada en la región promotora del gen (secuencia del gen donde tiene lugar la
iniciación para la síntesis de ARNm), en los exones y en las regiones 3´. Así cuando
la ADN-Metiltransferasa durante la replicación del ADN metila el carbono 5´ de las
citosinas de la cadena recién sintetizada, la conversión de citosina en 5-
metilcitosina de los islotes CpG de la región promotora, puede causar cambios en la
conformación estructural de la cromatina que impidan su descompactación,
bloqueando la entrada de los factores de transcripción y con ello provocando el
silenciamiento y no expresión de un determinado gen [254, 255].
En la célula normal en aproximadamente el 70% de los casos estas secuencias
CpG se encuentran de forma fisiológica en estado no metilado es decir funcionante,
con expresión proteica derivada de la transcripción de dicho gen. Sin embargo, en
las células tumorales estas regiones CpG se encuentran en la mayoría de los genes
relacionados con actividades supresoras de tumores y de control del crecimiento
celular normal en estado metilado es decir, silenciado, determinando con ello que
genes que en condiciones fisiológicas se expresan actuando como genes supresores
de tumores, a causa de la metilación de su promotor dejen de estarlo permitiendo la
expresión de oncogenes que ponen en marcha la cascada de la carcinogénesis
aunque aún no son bien conocidas las circunstancias por las que esto sucede [256-
258].
Joaquina Martínez-Galán Introducción
- 50 -
Actualmente sabemos que tanto la metilación del ADN como la acetilación/
desacetilación de las histonas son procesos que están interrelacionados entre sí, ya
que según se ha descrito la metilación del promotor favorece la desacetilación de
las histonas y con ello el que la estructura de la cromatina esté cerrada y por tanto
inaccesible a los factores de transcripción, y viceversa, cuando las histonas están
acetiladas la cromatina se descompacta y permiten la entrada del complejo de
transcripción si bien el ADN parece ser más sensible a la metilación aunque estos
mecanismos no son bien conocidos. Además cuando existen bajos niveles de
acetilación de las histonas se sensibiliza el ADN a los procesos de metilación [259]
y aún cuando en este proceso de interrelación entre cambios epigenéticos en el
ADN y en la cromatina hay todavía cierto nivel de incertidumbre se acepta que la
modulación de la transcripción génica de acuerdo con la acetilación de las histonas
puede actuar produciendo una acetilación global de las histonas o bien acetilando
las histonas de la región promotora. En el primer caso este proceso se
correlacionaría con la actividad general transcriptional, mientras que la acetilación
específica del promotor representaría un mecanismo crítico para el control de
actividad específica del gen, existiendo un nivel de acetilación equilibrado de
acuerdo con los mecanismos de regulación entre enzimas desacetiladoras y
acetiladoras [260].
Según los trabajos de Felsenfeld y col. [261] la acetilación de las histonas actúa
como mecanismo de protección frente a la metilación de la región promotora del
gen que ha de expresarse manteniendo su estado no metilado. Esto parece que es
debido a que al metilarse la región promotora de un determinado gen, existen
enzimas metiladoras de histonas que pueden reconocer citosinas metiladas y
metilar las histonas próximas. Del mismo modo, encimas que metilan el ADN
pueden reconocer histonas metiladas, y así seguir con la metilación a nivel de ADN.
El resultado final derivado de todo ello que se produzca un cambio en el perfil de
metilación del gen que da lugar al silenciamiento del gen metilado y por lo tanto la
ausencia de expresión derivada de su transcripción [236].
Cuando un determinado gen se expresa en un tejido normal las secuencias CpG
de la región promotora de ese gen, se encuentran no metiladas y las histonas en
Joaquina Martínez-Galán Introducción
- 51 -
torno a la cromatina están acetiladas. Sin embargo cuando acontece un evento
epigenético que favorece la progresión hacia un tejido preneoplásico y
posteriormente tumoral, gradualmente se producen reacciones de desacetilación
de las histonas y metilación de las regiones CpG favoreciendo el silenciamiento
génico de genes encargados de regular la correcta homeostasis celular
ocasionando la pérdida de expresión de genes supresores de tumor [259]. Estos
acontecimientos tienen un papel importante en la regulación de la expresión y
silenciamiento de los genes, ya que se sabe que aunque todos los genes están
presentes en las células de un determinado tejido, sólo una pequeña proporción de
ellos se expresarán mientras que la mayoría permanecerán silentes. Es decir, los
genes que se deben expresar en los tejidos en condiciones fisiológicas tienen las
regiones de sus promotores no metiladas, mientras que los genes que se deben
desactivar en los tejidos diferenciados tienen estos islotes metilados (silenciados).
Por tanto el que se expresen determinados genes y se silencien otros tendrá un
papel determinante tanto en el desarrollo normal de los tejidos como en la
aparición de un proceso tumoral al silenciarse genes implicados en la regulación
de fenómenos de proliferación, regulación del ciclo celular, reparación del daño al
ADN etc. [255].
Este hecho, ha revelado una importante relación entre cambios epigenéticos con
patrones anormales de metilación y enfermedades como el cáncer. Esta relación
entre metilación aberrante y cáncer se ha hecho evidente al encontrarse hace pocos
años que la ausencia de metilación conducía a la activación de oncogenes mientras
que la metilación anulaba la acción protectora de los genes supresores de tumores
[237, 262-264].
Por tanto, el mantenimiento del perfil de metilación de los dinucleótidos CpG en
el genoma es crucial para la homeostasis celular adecuada, de forma que cuando
este equilibrio se altera, ocasiona patrones de metilación aberrantes que producen
silenciamiento de genes que deberían expresarse como son los genes tumor
supresores y en cambio permite la expresión de genes que deberían estar
silenciados como los oncogenes pudiendo resultar de todo ello la aparición de un
proceso tumoral [265].
Joaquina Martínez-Galán Introducción
- 52 -
Este mecanismo por el que la metilación del ADN afecta a la expresión de los
genes sigue siendo un tema de intenso estudio, al que se han propuesto dos
explicaciones. La primera es que la metilación de las islas de CpG en los sitios de
unión del promotor con los factores de transcripción bloquearía dicha unión, con la
consiguiente falta de expresión del gen. La segunda se basa en la existencia de una
familia de proteínas nucleares específicas, las proteínas de unión a metilcitosinas,
que reconocen y se unen a las secuencias metiladas del ADN (dmCpG). Estas
proteínas podrían inhibir las interacciones con los factores de transcripción
necesarios para que el gen se exprese; además, podrían atraer hacia sí otros
elementos –por ejemplo, histona-desacetilasas– que, al eliminar los grupos acetilos
de las histonas, inducirían la compresión de los nucleosomas imposibilitando la
transcripción. Este proceso puede ser revertido mediante histona-
acetiltransferasas y desmetilación del ADN [266, 267].
Estos cambios epigenéticos que ocurren debido a cambios de la conformación de
la cromatina, acetilación de las histonas, y la metilación de las islas CpG, podrían ser
potencialmente utilizados para identificar las diferentes etapas del desarrollo del
cáncer, especialmente en el diagnóstico precoz, pronóstico y tratamiento [268-
271].
Especialmente en el cáncer, los patrones de metilación aberrante pueden
contribuir al desarrollo de esta enfermedad por facilitar la expresión de genes que
en condiciones fisiológicas no se expresarían como los oncogenes e inhibir en
cambio la expresión de otros que actuarían regulando el correcto funcionamiento
como son los genes tumor supresor de tumores.
1.5.2. Aplicación del estudio del perfil de metilación aberrante del ADN en el
cáncer de mama
El cáncer de mama es una enfermedad que diagnosticada precozmente es
potencialmente curable. Sin embargo y aún en estadios iniciales, hasta un 30 % de
las mujeres diagnosticadas de cáncer de mama localizado a lo largo de su vida, la
Joaquina Martínez-Galán Introducción
- 53 -
enfermedad se hace metastásica sin haberse podido anticipar a su detección con las
técnicas que habitualmente disponemos en la clínica [272].
En los últimos años, gracias al avance en técnicas de Biología Molecular, se han
desarrollando nuevos procedimientos que dirigidos fundamentalmente a su
aplicación en el diagnóstico precoz de distintas patologías incluyendo las
propiamente infecciosas, especialmente virales, pasando por las estrictamente
hereditarias hasta las enfermedades neoplásicas están ofreciendo resultados
prometedores que nos aproximan a un diagnóstico más precoz, un tratamiento y
pronóstico cada vez más personalizado y en definitiva un mejor abordaje
terapéutico [273]. En el cáncer y hasta fechas recientes, desde las primeras
determinaciones de marcadores tumorales característicos de determinados tipos
de tumores mediante su análisis en sangre periférica por técnicas de RIA o ELISA,
se ha dispuesto de cierta información que nos ha orientado hacia el posible origen
del tumor y también en el seguimiento de la respuesta a los tratamientos aplicados
[274]. Sin embargo, y aunque la utilización en la práctica clínica de estas técnicas
suponen un aporte sustancial, su especificidad y sensibilidad es limitada en la
mayoría de los casos [275]. Esta característica unida a que los niveles de
marcadores cuantificados en sangre periférica rara vez se encuentran elevados en
las etapas preinvasivas de la enfermedad, hace que su utilidad como método de
diagnóstico precoz tenga relativamente poco valor.
Sin embargo actualmente conocemos que sucesos como la metilación aberrante
de las regiones de promotoras de múltiples genes ocurren en etapas tempranas de
la carcinogénesis y que su determinación es posible a través del análisis del ADN
aislado en sangre periférica o fluídos naturales (como el aspirado de los ductos
mamarios) por técnicas poco cruentas, lo que permitiría ser utilizado como un
potencial biomarcador en el diagnóstico precoz y quizás de recidiva de un proceso
tumoral así como en la identificación temprana de aquellos individuos con alto
riesgo de desarrollar cáncer de mama [276, 277]. Una de las técnicas de la que
disponemos para este estudio del perfil de metilación es la reacción en cadena de la
polimerasa o PCR, con la que podemos amplificar pequeñas cantidades de ácidos
nucleicos circulantes en sangre periférica, mejorando así las limitaciones tanto de
Joaquina Martínez-Galán Introducción
- 54 -
sensibilidad como de especificidad que tenían técnicas anteriores y abrir una
puerta más al diagnóstico molecular de la enfermedad neoplásica. De hecho por
medio del estudio de metilación por PCR (MSP) se describe que es posible detectar
una única célula tumoral con ADN aberrantemente metilado de entre 104 células
normales [278]. Además el estudio de la metilación del ADN frente al estudio de
proteínas o moléculas como el ARN presentan algunas otras ventajas a parte de
poder ser amplificadas por PCR y son su mayor estabilidad y el que puede ser
aislado del tejido fijado con formol e integrado en parafina.
Las alteraciones genéticas y epigenéticas que inician y promueven cascadas
intracelulares relacionadas con la carcinogénesis en su etapa más temprana,
podrían ser por tanto utilizadas para predecir la presencia de enfermedad tumoral
en pacientes que desde el punto de vista clínico aún no presenta síntomas ni signos
relevantes que hagan sospechar el diagnóstico de una determinada enfermedad
tumoral pudiendo aproximarnos al mismo tiempo a información sobre su
pronóstico y tratamiento necesario [279].
En la actualidad ya han sido descritas alteraciones específicas en suero de perfil
de metilación de regiones promotoras de genes tanto supresores de tumores como
de genes implicados en la proliferación y supervivencia celular relacionadas con el
cáncer de mama que en los pacientes con cáncer se encuentran metilados y en
cambio se encuentran no metilados en personas sanas. La detección de este perfil
de metilación a través del estudio de fluídos corporales como el aspirado de los
ductus mamarios o de su análisis en sangre periférica, son técnicas poco cruentas y
accesibles en la práctica diaria a través de las cuáles podríamos analizar este patrón
de metilación en un subgrupo de población de mayor riesgo para a partir de él
anticiparnos a un diagnóstico más precoz [280].
En este sentido recientes estudios realizados han mostrado que es posible
observar alteraciones específicas derivadas de la presencia de un tumor a través
del estudio del ADN disuelto en suero en tumores del área de cabeza y cuello,
pulmón, cáncer de colon etc. en etapas precoces [263, 281] e incluso en el cáncer de
mama se ha descrito este hallazgo en tumores in situ [272]. Estos avances pueden
Joaquina Martínez-Galán Introducción
- 55 -
derivar en un importante impulso para el desarrollo de nuevas terapias contra el
cáncer así como en el estudio individualizado de los pacientes que podrían resultar
beneficiados de un tratamiento más específico adaptado a su tumor en particular
[282].
Por lo tanto el estudio del patrón de metilación del ADN, podría ser aplicado al
estudio molecular del cáncer de acuerdo las siguientes hipótesis:
• En primer lugar, si la metilación aberrante de las islas CpG de la región
promotora de un determinado gen, se encuentra metilada en un alto
porcentaje de las células tumorales y no en células sanas, esta característica
podría ser utilizada para detectar la presencia de células cancerígenas a
partir de muestras obtenidas de biopsia o tejido tumoral o bien a través del
análisis del ADN libre en el plasma del paciente [283].
• En segundo lugar, si un conjunto de genes se encentran metilados de forma
patológica en un determinado tipo histológico de tumor, y a su vez se
relaciona con un determinado comportamiento en cuanto a la sensibilidad a
distintos tratamientos de quimioterapia u hormonoterapia, o al pronóstico
de la enfermedad, estas determinaciones podrían ser utilizadas como un
marcador molecular que ayude a orientarnos sobre el origen del tumor, a
predecir un pronóstico más preciso, a decidir el tratamiento más adecuado
de acuerdo con las características moleculares del mismo y quizás poder ser
utilizado como marcador de recidiva precoz [283].
• Por último, si la metilación de la región CpG de un determinado gen/genes
en tejido no tumoral se asocia con un riesgo aumentado para el desarrollo de
un tumor, estas determinaciones podrían ser utilizadas como un futuro
marcador de riesgo para desarrollar cáncer [283] lo que nos podría permitir
realizar mejores campañas de “screening” en la población avanzando en los
métodos de diagnóstico precoz.
Joaquina Martínez-Galán Introducción
- 56 -
1.5.3. Muestras y fluídos en los que se puede estudiar el perfil de metilación
El análisis del estado de metilación del ADN se puede efectuar en cualquier
fluido biológico: en el supuesto de que con este estudio se busque el despistaje de la
presencia de un tumor hay que aceptar que la lisis celular en el seno del tumor
produce detritus que en su proceso normal de eliminación pasan a los fluidos
biológicos, donde pueden ser identificados.
Se ha descrito la aplicación del estudio de biomarcadores de ADN metilado en los
siguientes medios:
a) Detección de ADN libre extraído de suero o plasma
La presencia de ADN libre en plasma/suero de pacientes con cáncer fue descrita
inicialmente en la década de los 70 [284]. Este hallazgo describió como parte del
ADN disuelto en plasma procedía del ADN liberado al torrente circulatorio como
consecuencia de los fenómenos de apoptosis y necrosis celular que sufrían las
células tumorales [285]. Sin embargo su estudio analítico con fines diagnósticos no
avanzó hasta décadas después cuando, gracias a la investigación translacional se
asociaron las técnicas de PCR y PCR específica de metilación al estudio del ADN
circulante en pacientes diagnosticados de cáncer. Sólo así se pudo distinguir ADN
procedente del tumor y ADN procedente de los tejidos sanos y por ello hasta
entonces el hallazgo inicial de mutaciones en el ADN asociadas al cáncer concentró
el mayor interés científico [286]. Sin embargo, este planteamiento no estaba exento
de limitaciones ya que localizar una mutación concreta en un gen generalmente
desconocido y amplificar específicamente esa secuencia del ADN que contiene la
mutación a partir del material genético obtenido de una muestra en donde
predominaban células normales suponía un complejo y difícil proceso [283].
Hoy día los avances en el campo de la epigenética han permitido mediante el
análisis del patrón de metilación del ADN aislado en suero de sujetos afectos de
cáncer, poder determinar si este sigue un patrón de metilación fisiológico o, como
sucede con las células tumorales, es un patrón de metilación aberrante [287, 288].
Este tipo de estudios nos han permitido saber que en el cáncer se encuentran
Joaquina Martínez-Galán Introducción
- 57 -
metilados ciertas secuencias de promotores de genes que en la población sana y en
condiciones fisiológicas se encuentran no metilados, y además que estas
alteraciones epigenéticas están presentes en etapas tempranas de la carcinogénesis
[289-291]. Para la detección del perfil de metilación de las regiones CpG a partir del
análisis en suero por PCR cualitativa se han sometido a estudio grupos de pacientes
con tumores de diferentes orígenes, entre ellos: cáncer de pulmón [292-294],
cabeza y cuello [295], esófago [296], hígado [297], colo-rectal [298], próstata [299],
vejiga [268, 300], melanoma y mama [301].
De los resultados de estos trabajos se ha podido constatar la importancia de la
técnica en el detección de las anomalías de la metilación y del papel de la metilación
como biomarcador en la detección temprana y el diagnóstico del los distintos tipos
de cáncer.
b) Detección del ADN tumoral a partir del lavado de los conductos
galactóforos
El análisis del perfil de metilación a partir de células tumorales aisladas de
fluídos naturales como la orina, el esputo, el lavado bronquiolo-alveolar (BAL) o el
lavado de los ductos galactóforos de la mama, saliva etc. puede ser especialmente
interesante asociada al estudio citológico puesto que utilizando ambas
metodologías se puede confirmar el diagnóstico especialmente cuando el material
que se aísla procede de restos de células tumorales que están degradadas o es
escaso. Como ejemplo de ello en algunos trabajos se ha correlacionado el análisis
del estado de metilación aberrante de Ciclina D2, RARb, Twist, GSTP1, p16, p14,
RASSF1A y DAPK en el aspirado de los ductos de mujeres con cáncer de mama y
con una citología sugerente de malignidad para cáncer de mama en un alto
porcentaje [302, 303].
A continuación describimos los posibles campos de aplicación del estudio del
ADN metilado de forma patológica:
Joaquina Martínez-Galán Introducción
- 58 -
1.5.4. Posibles campos de aplicación del estudio del ADN metilado de forma
patológica
a) ADN metilado como marcador de riesgo en cáncer
Los marcadores tumorales que habitualmente se emplean en clínica son
fundamentalmente proteínas que medidas en el suero o en el plasma pueden
ayudar a identificar precozmente población afecta de un proceso tumoral.
Igualmente son de utilidad en aquellas personas diagnosticadas de cáncer para
determinar el pronóstico de la enfermedad, monitorizando la respuesta terapéutica
y el seguimiento de acuerdo con su determinación periódica en sangre periférica.
Sin embargo tienen algunas limitaciones importantes como es que en la mayoría de
las ocasiones no es órgano-específica e incluso se puede detectar elevada en
patología no tumoral [188].
En la práctica habitual además del empleo de estos marcadores tumorales,
existen distintos modelos matemáticos capaces de estimar el riesgo individual que
una mujer sana tiene de desarrollar cáncer de mama; este tipo de modelos de
riesgo están basados en datos epidemiológicos y etiológicos obtenidos de estudios
llevados a cabo incluyendo grandes muestras de población de mujeres afectas de
cáncer de mama. Bajo el denominador común de modelos predictivos de riesgo se
apoyan en el método matemático de la regresión logística multivariante. Entre ellos
uno de los más usados es el modelo de Gail, que basado en factores de riesgo
epidemiológicos, utiliza la edad al diagnóstico del tumor, edad de la menarquia,
edad del primer embarazo, número de biopsias previas, y número de familiares en
primer grado (madre o hermana) con cáncer de mama, para estimar dicho riesgo.
Así se considera que una mujer es de riesgo elevado cuando el riesgo de desarrollar
cáncer de mama es superior al 1,7% en los próximos 5 años [304]. Sin embargo,
estos modelos predictivos de riesgo presentan también algunas limitaciones,
incertidumbres y omisiones. Entre estas últimas señalaremos que en la
aproximación matemática predictiva no se consideran la edad a la que se
diagnosticaron los casos de cáncer de mama en la familia, no se incorporan los
resultados de test genéticos ni se considera a los familiares de segundo grado.
Joaquina Martínez-Galán Introducción
- 59 -
Además los estudios de validación realizados han demostrado que el modelo
sobreestima ligeramente el riesgo en poblaciones sin “screening” mamográfico,
especialmente en mujeres premenopáusicas [305], así como en poblaciones con
menor incidencia basal y que incluso en el mejor de los casos la estimación del
riesgo se encuentra entre el 58-59% [304]. Por lo tanto es necesario desarrollar
nuevos modelos predictivos que añadieran y/o modificaran otros factores de riesgo
a los ya descritos. [306].
Actualmente se ha descrito que el estudio molecular de las alteraciones
epigenéticas en sangre periférica podría ser de utilidad para predecir el riesgo de
desarrollar cáncer [307]. El dogma según el cual el cáncer es una enfermedad de
origen genético fue el principal pilar que lideró el campo de la investigación del
cáncer durante muchas décadas [308]. Ese paradigma ha contribuido al avance de
la investigación y del conocimiento y, gracias a él, hoy conocemos la secuencia del
Genoma Humano así como gran cantidad de información molecular en la que se
describen mapas de mutaciones genéticas relacionadas con las enfermedades, entre
ellas el cáncer, junto con potenciales marcadores moleculares que posteriormente
podrían ser utilizados en el diagnóstico y tratamiento del cáncer [309]. Sin embargo
y considerando que cada vez existen más evidencias de que en el cáncer los eventos
epigenéticos contribuyen tanto en la patogénesis como en la progresión de la
enfermedad se ha puesto de manifiesto que en el cáncer además de alteraciones
genéticas hay cambios epigenéticos de singular importancia [278, 281, 299, 310-
315].
En este sentido conviene precisar que, quizás, el primer evento en la cascada de
la carcinogénesis reside en el daño producido al ADN bien por alteraciones
genéticas como son mutaciones, pérdida de heterocigosidad, inestabilidad en los
microsatélites o bien por eventos epigenéticos como es la metilación del ADN. Hoy
día sabemos que tanto las alteraciones genéticas como epigenéticas son fenómenos
que realmente están interrelacionados entre sí. Esto se ha observado en el cáncer
colo-rectal donde se ha demostrado que la metilación la región promotora de los
islotes CpG en un gen silencia exclusivamente el alelo no mutado (wild type) [316]
y que la metilación puede potenciar que se produzcan mutaciones al contribuir al
Joaquina Martínez-Galán Introducción
- 60 -
silenciamiento durante la evolución de la especie de las secuencias CpG y dar lugar
a una mutación por ej. CG a TG frecuentemente aislada entre las mutaciones del gen
p53 [317, 318]. Además, se sabe que el silenciamiento transcripcional tanto de
genes tumor supresor como de aquellos otros encargados de reparar el daño
producido al ADN es un hallazgo frecuente en estadios precoces y subclínicos de la
enfermedad [319, 320]. Por ejemplo, en algunos estudios tanto p16ink4A como el
gen MGMT han sido encontrados metilados en el ADN de esputo 35 meses antes de
que pudiese clínicamente ser demostrada la presencia del cáncer de pulmón [321];
o como la metilación patológica del ADN que parece inducida por la infección de la
bacteria Helicobacter pylori en el antro gástrico, ha sido propuesta como un factor
predictivo del riesgo para el desarrollo del cáncer gástrico [322].
Si tenemos en cuenta estos resultados observacionales se podría sugerir que los
cambios epigenéticos ocurren antes que los eventos genéticos y que la combinación
de ambas alteraciones en el genoma desencadena la inducción de los mecanismos
carcinogénicos. De hecho la pérdida de impresión genética (LOI), un hecho
importante en la regulación de la homeostasis, en el gen IGF2 que promueve
proliferación celular y que se ha descrito en el coriocarcinoma y teratocarcinoma
[323], fue aislada tanto en el epitelio colónico normal como en los linfocitos
circulantes de individuos con riesgo aumentado de desarrollar cáncer de colon
[307].
b) ADN metilado como marcador pronóstico en cáncer
La afectación ganglionar y el tamaño del tumor son los factores pronóstico más
importantes hasta hoy día conocidos en el cáncer de mama [324-327]. Sin embargo,
aproximadamente 1/3 de mujeres con cáncer de mama sin afectación ganglionar
recaen a lo largo del seguimiento de la enfermedad, mientras que otro tercio de
pacientes no recaen tras 10 años de evolución a pesar de tener afectación
ganglionar en el momento del diagnóstico [328, 329]. Esto resultados podrían
indicar que los factores pronóstico utilizados actualmente para predecir qué
pacientes recaerán y, por consiguiente, cuáles necesitan realizar tratamiento
sistémico más agresivo, no son suficientes a la hora de identificar a aquellos
Joaquina Martínez-Galán Introducción
- 61 -
pacientes en los que se puede obviar dicho tratamiento y con ello las toxicidades
que de él derivan, por tener un bajo riesgo de recidiva de la enfermedad. En este
sentido debemos esperar que el estudio de nuevos marcadores moleculares
dependientes del tumor, asociados a los ya conocidos, nos permitan discernir con
mayor sensibilidad y especificidad en qué subgrupo de pacientes existe un mayor
riesgo de recaída de la enfermedad y por lo tanto cual es el tratamiento a
administrar en función de su nivel de riesgo [330, 331].
Este objetivo se ha intentado alcanzar en muchas ocasiones a partir del estudio y
aplicación de test genéticos diseñados para buscar en pacientes afectos de cáncer
datos moleculares que ayuden a predecir e identificar el grado de agresividad de un
tumor. Sin embargo los estudios realizados hasta el momento se han encontrado
con dos importantes problemas. El primero de ellos es que el porcentaje de
mutaciones somáticas que se aíslan en los tumores sólidos es muy bajo, de ellos la
mutación del oncogén K-Ras y del gen tumor supresor p53 son las más conocidas.
En segundo lugar el que las poblaciones de células tumorales del tumor primario
son muy heterogéneas, por lo que ningún marcador puede por sí solo predecir con
exactitud cuál será el comportamiento de un determinado tumor [332].
La aplicación de técnicas basadas en el análisis de la metilación de los islotes CpG
de genes implicados en procesos de apoptosis, adhesión celular, reparación de ADN
y el ciclo celular no ha permitido hasta el momento resolver el problema de la
heterogeneidad celular; sin embargo, analizando la metilación del ADN como
marcador molecular en pacientes con cáncer de pulmón y cáncer de colon se han
observado un peor pronóstico en aquellos pacientes en los que en los que fue
posible identificar alteraciones en la metilación en los promotores de los genes
DAPK y p16INK4a respectivamente [333, 334].
c) ADN metilado como marcador predictivo de respuesta clínica en cáncer
La identificación de nuevos marcadores predictivos de respuesta que añadidos a
los ya utilizados en clínica, ayuden a seleccionar el tratamiento más adecuado de
acuerdo con factores moleculares y biológicos del tumor, representa en la
Joaquina Martínez-Galán Introducción
- 62 -
actualidad una importante área de investigación hacia el que la práctica oncológica
avanza paralelamente con el desarrollo de las nuevas tecnologías en el campo de la
Biología Molecular. Poder conocer las posibilidades de respuesta a los tratamientos
con QT, HT y nuevas dianas moleculares en las pacientes candidatas de recibir un
tratamiento adyuvante o paliativo, es un reto que todavía hoy sólo está resuelto
parcialmente.
En el cáncer de mama, los métodos que actualmente están disponibles para
determinar con precisión la agresividad de la enfermedad y la probabilidad de
respuesta a un determinado tratamiento de forma individualizada son todavía
insuficientes. En la actualidad la QT adyuvante debe ser considerada en la mayoría
de las pacientes con cáncer de mama a excepción de un pequeño subgrupo con una
predicción de riesgo de recaída muy bajo basado en factores clínicos y moleculares
conocidos hasta el momento. Sin embargo, no todas las pacientes se beneficiarán de
estos tratamientos ya sea porque tienen un pronóstico excelente o porque su tumor
no responde a determinada QT y en cambio sí estarán expuestas a presentar
efectos secundarios derivados de dicho tratamiento [335]. Por tanto es necesario la
búsqueda de nuevos marcadores predictivos de respuesta que sumados a los
actualmente conocidos nos ayuden a indicar tratamientos más individualizados y
selectivos para cada paciente.
En el cáncer de mama concretamente la identificación de 5 subtipos moleculares
y la expresión en tumor de RE y/o RP, representan uno de los factores más
importantes predictivos de respuesta al tratamiento hormonal y con valor
pronóstico [172, 336]. En este sentido también se ha descrito que la metilación
también puede tener un papel predictivo de respuesta importante. Así se ha
descrito que la metilación de ESR1 es factor predictivo de respuesta en aquellas
pacientes tratadas con Tamoxifeno y la metilación de ARH1 es predictivo de
respuesta para las pacientes no tratadas con antiestrógenos, mientras que la
metilación de CYP1B1 es factor predictivo de supervivencia [337].
Joaquina Martínez-Galán Introducción
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d) Aplicación de la metilación aberrante del ADN a la terapéutica del
cáncer
La metilación del ADN es uno de los eventos epigenéticos más frecuente e
importantes que ocurre durante etapas tempranas de la caricinogénesis y que
incidiendo directamente en la inactivación de genes supresores de tumores
ocasiona una pérdida de control del ciclo celular y un déficit en los procesos de
reparación del ADN dañado que promueve, fenómenos de proliferación celular
incontrolada y confiere ventajas a la supervivencia celular a través de la función de
genes involucrados en el desarrollo tumoral [338, 339]. Actualmente se sabe que
las alteraciones genéticas que se van acumulando en el ADN añadidas a las
alteraciones epigenéticas que si modificar la secuencia de nucleótidos ocasionan
cambios postranscripcionales contribuyen a desarrollar un fenotipo tumoral. Los
eventos epigenéticos son un mecanismo de regulación fisiológico y necesario que
posee el organismo para definir la expresión génica y para conferir estabilidad
genómica al asegurar el adecuado orden y funcionamiento celular. Sin embargo,
este patrón de metilación que por otra parte puede heredarse [340], en
determinadas situaciones patológicas deja de regular el correcto funcionamiento de
la división y desarrollo celular, confiriendo ventajas a la célula a favor de una
proliferación celular descontrolada carente de control y de la pérdida de los
fenómenos apoptóticos que favorece el desorden celular y en el desarrollo de los
procesos tumorales.
Este fenómeno ha sido descrito en varios distintos tipos de tumores lo que ha
permitido establecer patrones específicos de metilación en diferentes subgrupos
de tumores [341, 342]. Por tanto probablemente la adecuada comprensión de los
perfiles de metilación tumoral puede tener un impacto positivo y ayudar en la
búsqueda de soluciones a importantes problemas clínicos como son; la detección
precoz del cáncer, quimioprevención, pronóstico y tratamiento de las
enfermedades neoplásicas [338].
Se ha demostrado en experimentos llevados a cabo en modelos de ratón, que si
se revierte o disminuye el nivel de metilación existente en los promotores de
Joaquina Martínez-Galán Introducción
- 64 -
determinados genes se consigue prevenir la aparición de tumores. Este resultado es
demostrativo de la importancia del papel de la metilación aberrante sobre el
crecimiento tumoral in vivo y su papel patogénico [257, 343, 344]. En estudios
iniciales que trataran de explicar el papel de la metilación en células tumorales
humanas, se ha observado al analizar comparativamente el tejido tumoral y el
tejido sano que en tejido tumoral existen cuantitativamente mayor cantidad de
grupos 5-metilcitosina, que en el tejido sano que rodeaba al tumor y este hallazgo
se ha asociado al predominio del silenciamiento de genes en el especimen tumoral
[345]. Posteriormente se pudo demostrar que este mecanismo de silenciamiento
génico también existía en las células sanas como mecanismo regulación de
expresión de proteínas y que la ausencia de metilación permitía que un
determinado gen se expresara, sugiriendo que la metilación actúa como un
mecanismo de regulación génica fisiológico. Sin embargo y a diferencia de lo que
ocurre en células sanas, en las células tumorales, existe un predominio de genes
encargados de regular el ciclo celular que se encuentra metilados mientras que tal
metilación está ausente en oncogenes. Es decir existe por tanto una desregulación
del ciclo celular y un aumento de expresión oncogénica.
Todo esto llevó a plantear como hipótesis de una futura diana terapéutica, que
revirtiendo el estado de metilación y, por tanto, el silenciamiento génico derivado
de este mecanismo, se podría favorecer la expresión y recuperar la funcionalidad
de aquellos genes encargados de regular el ciclo celular normal que, debido a una
alteración en el patrón de metilación se encuentran anormalmente silenciados. Esto
dio lugar a la aplicación en terapéutica oncológica de dos moléculas análogas de
citosina; la 5-Azacitidina y la 2-Deoxicitidina que dirigidas contra la enzima DNAMT
impiden la transferencia de grupos metilos y por tanto el silenciamiento de los
genes a través de la metilación de sus promotores [346]. Los datos acumulados en
la actualidad demuestran un efecto beneficioso de estos fármacos con respuestas
clínicas positivas en estudios realizados en pacientes especialmente en el
tratamiento de procesos hematológicos, aunque el mecanismo exacto de actuación
de dichos fármacos no está aun totalmente aclarado [347, 348].
Joaquina Martínez-Galán Introducción
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Quizás el campo de la terapia epigenética represente un futuro esperanzador en
el tratamiento del cáncer. De hecho ya se han descrito estudios in vitro en los que
agentes como Decitabina (5-Azacitidina-2-Deoxicitidina) revierten la resistencia a
varios agentes citotóxicos utilizados en el tratamiento del cáncer como Cisplatino,
Epirrubicina y Temozolamida en líneas celulares de cáncer en humanos [349-351].
1.6. GENES ANALIZADOS EN ESTE TRABAJO Y RUTAS METABÓLICAS EN LAS
QUE INTERVIENEN
En el presente trabajo de investigación analizamos el perfil de metilación por
PCR cuantitativa de la región promotora de un panel de 5 genes implicados cada
uno de ellos en distintas rutas de regulación celular para estudiar su posible
utilidad como biomarcador en el cáncer de mama.
1.6.1. Metilación en genes supresores de tumores
Uno de los mecanismos implicados en el proceso de carcinogénesis es la pérdida
de función de genes supresores de tumores, que en condiciones fisiológicas actúan
como un regulador negativo de la proliferación celular o regulador positivo de la
diferenciación celular en respuesta al daño producido en el ADN. Así suprime la
división celular cuando no existe necesidad de reparar un daño en el ADN. La
inactivación de estos genes supresores de tumores por tanto contribuye al proceso
de carcinogénesis por conferir ciertas ventajas al crecimiento celular indefinido
estimulando la activación de la división celular desorganizada carente de
retrocontrol negativo.
Esta anulación de la actividad de estos genes en parte, está relacionada con el
proceso de metilación de citosinas de las islas CpG situados en la región promotora
de dichos genes supresores de tumores, produciendo un silenciamiento de su
expresión por anulación en la transcripción del ADN, favoreciendo así una pérdida
de control del ciclo celular al hacer que las células sean insensibles al control de
señales antiproliferativas.
Joaquina Martínez-Galán Introducción
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En el cáncer de mama existe una amplia lista de genes supresores de tumores
que se han encontrado metilados en etapas tempranas de la carcinogénesis. Entre
ellos se encuentran; BRCA1 y BRCA2, p16 INK4a, RAR-Beta, p53, FHIT [352, 353]
De todos ellos nosotros cuantificamos el estado de metilación del promotor de
RAR- Beta.
a) RAR-Beta: Constituye una familia de receptores del ácido retinoico (RAR)
situados en el núcleo de la célula, que tienen como función intervenir en los
mecanismos de control del crecimiento y diferenciación celular, estableciendo un
equilibrio entre procesos de proliferación y apoptosis. Actúan como factores de
transcripción activados por ligandos que uniéndose a la región promotora de
numerosos genes diana, dan lugar a su expresión o represión transcripcional[354].
Dentro de cada clase de receptor, existen tres subtipos: α, β y γ. Recientemente se
han localizado los genes que codifican para estos receptores RAR-α, RAR-β y RAR-γ
humanos y se ha visto que se localizan, respectivamente, sobre los cromosomas
17q21.1, 3p24 and 12q13 [355].
El gen RAR-Beta es un importante gen tumor supresor que mientras en líneas
celulares de mama no tumorales se encuentra en estado no metilado y por lo tanto
se expresa regulando que la célula no prolifere de forma indefinida, en cambio en
líneas celulares de cáncer de mama se ha observado que se encuentra metilado en
una 3ª parte de los casos y por tanto no se expresa favoreciendo consecuentemente
el crecimiento celular continuado, en diversos tumores sólidos como son el cáncer
de pulmón, cáncer de cabeza y cuello y cáncer de mama [356, 357]. Concretamente
en el cáncer de mama se ha encontrado metilado hasta en un 43% de los tumores
infiltrantes [352, 358] relacionándose su estado de metilación en pacientes con la
presencia de metástasis óseas, cerebrales y pulmonares [359]. Por tanto el
determinar el estado de metilación en suero de este gen y la consiguiente pérdida
de expresión proteica derivada de la ausencia de su transducción proteica, podría
ser utilizado como biomarcador para predecir el riesgo de metástasis en el cáncer
de mama. Incluso autores como Widschwendter y col. estudiando la repercusión y
papel del estado metilado del gen RAR-Beta en cuatro líneas celulares de cáncer de
Joaquina Martínez-Galán Introducción
- 67 -
mama, observó que cuando este estaba metilado se confería una situación de
refractariedad al ácido trans-retinoico (ATRA) que hoy día conocemos que actúa
como inductor de su expresión por medio del ARN mensajero del RAR-B2 (ARNm)
y que sólo se podía revertir esta situación y por lo tanto inducir su expresión
cuando estas líneas celulares eran tratadas con agentes desmetilantes como el 5-
aza-28-deoxicitidina (Aza-CdR), consiguiéndose así su expresión [360]. Además, en
diversos trabajos se ha observado que es posible la reactivación endógena de RAR-
B al inducir la reacetilación de histonas en la secuencia promotora RARB P2 en
líneas celulares de cáncer de mama sugiriendo que RAR-B podría ser un objetivo
importante para la terapia contra el cáncer [361, 362].
1.6.2. Metilación en genes relacionados con los mecanismos de control celular
El ciclo celular consiste en una serie de eventos perfectamente coordinados que
permiten el crecimiento y la proliferación celular de forma organizada. Para
asegurar la correcta progresión a través del ciclo, las células han desarrollado una
serie de puntos de control que previenen la entrada en una nueva fase del ciclo
hasta que hayan completado exitosamente la anterior. Los principales
componentes de la maquinaria del ciclo celular son las quinasas dependientes de
ciclinas (CDK), las que, cuando son activadas, permiten a las células pasar de una
fase del ciclo a la siguiente.
Existen puntos de control en el ciclo celular que aseguran la progresión del
mismo:
Punto de control del ADN no replicado, en la entrada de fase M. Actúa
inhibiendo a Cdc25, el cual es un activador de la Ciclina A/B Cdk1.
Punto de control del ensamblaje del huso, antes de la telofase. Se activa una
proteína Mad2 que impide la degradación de la segurina, lo que impide la
segregación de las cromátidas hermanas.
Joaquina Martínez-Galán Introducción
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Punto de control de la separación de cromosomas, al final de la mitosis. En
el caso de que fuera incorrecto, se impediría la degradación de la Ciclina B
por APC.
Punto de control del daño del ADN, en G1, S o G2. El daño celular activa a
p53, proteína que favorece la reparación el ADN, detiene el ciclo
promoviendo la transcripción de p21, inhibidor de Cdk, y, en el caso de que
todo falle, estimula la apoptosis.
En el cáncer de mama, fundamentalmente resaltar el papel de la Ciclina D2 y
proteína 14-3-3 sigma:
a) Ciclina D2: Se sintetizan en fase G1, siendo responsables de la transición de
G1 a S tras activar a Cdk4 y Cdk6. Las ciclinas de tipo D desempeñan un papel
importante en la integración de las señales mitogénicas y, se puede decir, que
constituyen el punto de conexión entre el medio extracelular y el ciclo celular. Una
vez que los factores de crecimiento interaccionan con sus receptores localizados en
la membrana plasmática, se dispara una cascada de transducción de señales cuyo
eje principal es la vía Ras/Raf/MAPK, uno de cuyos principales lo constituye la
síntesis de Ciclina D. Su estado metilado que implicaría el silenciamiento y por tanto
su no expresión se ha descrito en distintos tumores como el cáncer de mama
provocando una pérdida de regulación del ciclo celular normal [363].
b) 14-3-3 sigma: Pertenece a una familia de genes con hasta 7 isoformas, cuyo
producto proteico actúa a través de la fosforilación de los residuos de serina o
treonina, inhibiendo la progresión del ciclo celular en fase G2/M una vez se ha
producido el daño en el ADN. Después de producirse dicha lesión en el ADN, se
activa un programa transcripcional en el que el interviene el gen tumor supresor
p53 como inductor de 14-3-3 sigma, provocando la detención del ciclo celular y la
muerte celular programada [364].
Se ha descrito que la pérdida de expresión de 14-3-3 sigma por metilación de su
región promotora, está presente en más del 90% de los casos de cáncer de mama.
Este silenciamiento epigenético, puede contribuir al desarrollo de una neoplasia
Joaquina Martínez-Galán Introducción
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por impedir la comprobación de la correcta progresión del ciclo celular en G2/M
cuando se produce una lesión en el ADN. De esta forma permitiría la acumulación
de defectos y aberraciones genéticas responsables del desarrollo tumoral. Este
hecho se ha descrito en diversos tipos de tumores, entre ellos el cáncer de próstata,
pulmón, mama y varios tipos de cáncer de piel [364, 365].
1.6.3. Metilación de genes implicados en la reparación de ADN
Los genes reparadores de ADN constituyen un grupo de genes que codifican
proteínas cuya función es corregir errores que surgen cuando las células duplican
su ADN antes de dividirse. Las mutaciones en estos genes, puede conducir al
fracaso en la reparación de ADN, permitiendo que mutaciones posteriores no se
reparen y se acumulen, pudiendo como consecuencia favorecer el desarrollo de un
proceso tumoral.
En cáncer de mama, se ha observado la implicación de la metilación de genes
reparadores del ADN con la aparición del cáncer. De ellos el más destacado, el
hMLH1[366].
a) hMLH1: Gen MM (Human Mut. L. Momolog.), ubicado en el cromosoma
3p21. Codifica una proteína que interviene en uno de los mecanismos de
reparación del ADN al detectar errores en las secuencias de nucleótidos por falta de
complementariedad entre las dos hebras de ADN durante la fase de apareamiento.
Esta proteína reconoce el par de bases erróneas, las separa y reemplaza por el par
correcto, garantizándose la fidelidad del proceso de transmisión de la información
genética. Se conocen al menos 6 genes reparadores; hMLH1, hMSH2, hMSH6,
hMLH3, PMS1 y PMS2 [367].
1.6.4. Metilación de genes implicados en la adhesión celular
a) E-Cadherina: La Cadherina E (CDH1) ubicada en el cromosoma 16q22.1
corresponde a un tipo de molécula de adhesión fuertemente relacionada con el
desarrollo del cáncer especialmente con aspectos asociados a la invasión y
metástasis. El gen CDH1 codifica una glicoproteína transmembrana llamada
Joaquina Martínez-Galán Introducción
- 70 -
E-Cadherina que tiene un papel importante en el mantenimiento de la adherencia
de célula a célula en tejidos epiteliales [368]. La E-Cadherina pertenece a la familia
de moléculas de adherencia Ca2+ dependientes que permiten la asociación
homofílica entre las células, manteniendo así la integridad del tejido.
Las células están interconectadas por "moléculas adhesivas", entre las que se
incluyen dos moléculas claves llamadas beta-catenina y E-Cadherina, que se
encuentran sobre la superficie de las células. Cuando se produce una falta de
función de estas moléculas de adhesión, la célula puede así "desprenderse" del
tejido del que procede y migrar para formar otro tumor en un lugar distante
invadiendo tejidos vecinos hasta entrar en el torrente sanguíneo adquiriendo
capacidad metastatizante. Por tanto, la escasez de E-Cadherina dificultará que la
célula se adhiera a las células adyacentes favoreciendo su migración a un nuevo
tejido donde se podrá multiplicar y originar metástasis confiriéndole a la
enfermedad un comportamiento invasivo.
En el cáncer, se considera que como prerrequisito para que las células epiteliales
malignas invadan el tejido cercano y lleven a cabo la diseminación metastásica, se
requiere que se disocien fácilmente del resto de las otras células tumorales y a la
vez, que se vea incrementada la movilidad celular de las células tumorales. Dichos
eventos son favorecidos por la pérdida de la expresión de la E-Cadherina.
Las alteraciones en la expresión de esta proteína, han sido relacionadas en
varios tipos de cáncer y correlacionadas con rasgos patológicos como la pobre
diferenciación tumoral, crecimiento infiltrante, la presencia de metástasis
ganglionares y la menor supervivencia de los pacientes [369]. Las mutaciones de
línea germinal en este gen predisponen en los individuos afectados al cáncer
gástrico tipo difuso y cáncer de mama de inicio temprano.
Recientemente, fue demostrado que el silenciamiento del gen CDH1 por la
metilación de isla CpG de su región de promotora, ocurre en algunas líneas
celulares de cáncer de mama [370].
Joaquina Martínez-Galán Introducción
- 71 -
1.6.5. Metilación de genes implicados en la proliferación celular
a) Receptor de Estrógenos (RE): El receptor de estrógenos codificado por el
gen ESR1, forma parte de la familia de factores de transcripción activados por
ligandos nucleares que regulan la expresión de genes sensibles a estrógenos en
distintas células diana. Entre sus funciones se encuentran la de controlar distintos
procesos celulares incluyendo el crecimiento, la diferenciación y función del
sistema reproductivo así como ser responsable del crecimiento, mantenimiento del
esqueleto y el funcionamiento normal del sistema cardiovascular y nervioso.
Concretamente en la mama es bien conocida que la interacción entre RE y su
ligando el 17b-estradiol, tiene un papel importante no sólo en su desarrollo normal
sino también en la carcinogénesis del cáncer de mama al poder estimular el
crecimiento celular tumoral en aquellos tumores que expresan RE, lo que también
representa un factor predictivo de respuesta al tratamiento hormonal en este
subgrupo de pacientes [371]. Sin embargo sólo 2/3 de las pacientes diagnosticadas
de cáncer de mama expresan RE al diagnóstico, mientras que el otro 1/3 de los
casos no lo expresan [372]. Incluso en algunas ocasiones, tumores que en el
momento del diagnóstico son RE positivos pasan a ser RE negativos a lo largo de la
enfermedad [373]. Esta ausencia de expresión de RE se asocia a tumores poco
diferenciados, con mayor índice de proliferación celular, pobre respuesta al
tratamiento hormonal y peor un pronóstico.
El gen del RE se encuentra localizado en el cromosoma 6q25.1. Concretamente
en su región promotora consta de una secuencia CpG ubicada en el exón 1, que en
líneas celulares de cáncer de mama que expresan RE como MCF-7, T47-d y ZR75-1
se ha observado que se encuentran en estado no metilado al igual que ocurre en
tejido normal. Sin embargo en líneas celulares de cáncer de mama RE negativo
como MDA-MB-231, MDA-MB-435, MDA-MB-468, Hs578t y MCF-7/Adr se
encuentra en estado metilado en más del 50% de los casos [374]. Por tanto analizar
si la metilación de la región promotora de ERS1 representa uno de los mecanismos
por el que acontece la pérdida de expresión de RE en pacientes diagnosticadas de
cáncer de mama podría representar un importante hallazgo a desarrollar para
Joaquina Martínez-Galán Introducción
- 72 -
bloquear e incluso revertir dicho proceso en las pacientes con cáncer de mama
[375].
HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
Joaquina Martínez-Galán Hipótesis y Objetivos
- 75 -
2.1. HIPÓTESIS.
El cáncer es una enfermedad en la que las células sufren múltiples cambios
genéticos y epigenéticos, cuyo resultado es la expresión aberrante de muchos
genes. Recientes estudios han mostrado que es posible observar alteraciones
específicas derivadas de la presencia de un tumor a través del estudio del ADN
disuelto en suero de los pacientes diagnosticados de cáncer en etapas precoces de
la enfermedad.
La metilación de la región promotora de determinados genes, representan una
alteración epigenética clave en la carcinogénesis por la cual se silencian genes a
través de la unión de un grupo metilo al carbono 5´ de las citosinas de las islas CpG
situadas en su región promotora. Este suceso que otorga a las células tumorales
ventajas en su crecimiento, ocurre en genes que en ausencia de enfermedad
tumoral maligna se encuentran no metilados en sujetos sanos mientras que en
pacientes diagnosticados de cáncer frecuentemente están metilados. El
descubrimiento de conjuntos de genes específicamente metilados asociados a
determinados tipos de cáncer, puede proporcionar nuevas vías en el diagnóstico
precoz, el control evolutivo de los pacientes sometidos a tratamiento e, incluso,
contribuir a la individualización de la terapéutica oncológica. También sabemos
que los fenómenos epigenéticos de metilación de citosinas y de desacetilación de
histonas, en cáncer, son farmacológicamente reversibles.
Los datos, que en nuestra introducción hemos presentado, son demostrativos de
que durante el proceso de oncogénesis, desde la iniciación a la progresión tumoral,
distintos genes pueden sufrir cambios epigenéticos que ocasionan que la expresión
de las proteínas resultantes de su trancripción esté ausente en el tumor. Esto
puede tener consecuencias funcionales (desequilibrio de la homeostasis celular) y
terapéuticas diversas (cambios en la respuesta a los agentes genotóxicos).
Joaquina Martínez-Galán Hipótesis y Objetivos
- 76 -
Nuestra hipótesis de trabajo se resume en los siguientes postulados:
2.1.1. Es posible detectar en el suero de los pacientes oncológicos, ADN
procedente de su tumor.
2.1.2. Existe una correlación entre las alteraciones genéticas, y epigenéticas,
que se desarrollan en el tumor y las que se pueden encontrar en sangre periférica
de los pacientes.
2.1.3. Los métodos de amplificación del ADN y el estudio del patrón epigenético
de metilación, en pacientes con cáncer, puede proporcionar elementos de valor
para el diagnóstico precoz, el pronóstico y el diseño racional de las estrategias
terapéuticas en pacientes afectos de procesos neoplásicos malignos.
Estudiar la incidencia, y la especificidad, de las anomalías de metilación en el
ADN extraído de pacientes con cáncer de mama mediante su cuantificación por
PCR en tiempo real y comprobar la posible utilidad, de los promotores de
determinados genes aberrantemente metilados, como marcadores tumorales, y/o
de agresividad, de la enfermedad, así como buscar parámetros indicativos de
control tumoral, y de probabilidad de complicaciones asociadas al tratamiento, son
los objetivos generales de este proyecto de investigación.
Joaquina Martínez-Galán Hipótesis y Objetivos
- 77 -
2.2. OBJETIVOS
2.2.1. Poner a punto los procedimientos de análisis de los promotores de genes
específicos mediante (MS-PCR) para identificar sobre las muestras de ADN extraídas
al grupo casos y control, la presencia y el estado de metilación de: APC, 14-3-3sigma,
RE, RARβ, y E-Cadherina. Preparar las muestras para estudiar específicamente y
mediante amplificación (MS-PCR), la presencia de ADN procedente del tumor en el
suero de pacientes y cuantificar, globalmente, el estado de metilación de las
secuencias correspondientes a las islas CpG ensayadas.
2.2.2. Conseguir de pacientes que vayan a ser tratadas por cáncer de mama, antes
de la cirugía, y previa petición de consentimiento informado, una muestra de sangre
(5ml). De las muestras de suero se extraerá el ADN y se conservará
convenientemente hasta que se proceda a su utilización. Además se conseguirán
muestras de sangre (5 ml) procedentes de mujeres sin ningún tipo de enfermedad
(Grupo Control) y de mujeres con patología mamaria benigna, mastitis fibroquística
esencialmente, (Grupo Patología No-Tumoral).
2.2.3. Cuantificar el ADN en suero de las pacientes diagnosticadas de cáncer de
mama y del grupo control.
2.2.4. Valorar los datos obtenidos y las diferencias existentes al comparar el
patrón de metilación encontrado en el suero de mujeres con cáncer con el que
caracteriza a las mujeres libres de enfermedad. El estudio comparativo de estos
resultados debe permitirnos definir cuáles, de entre los genes estudiados, son
candidatos a ser marcadores tumorales del cáncer de mama.
2.2.5. Comparar los resultados obtenidos tras la valoración de promotores
metilados en el suero de mujeres en las siguientes situaciones clínicas:
a) Mujeres sin enfermedad alguna (grupo control).
b) Mujeres con patología benigna de mama.
c) Pacientes con cáncer de mama (grupo casos).
Joaquina Martínez-Galán Hipótesis y Objetivos
- 78 -
d) Mujeres tratadas de cáncer de mama sin evidencia de enfermedad
tumoral clínica que durante el seguimiento desarrollan recurrencia de la
enfermedad o metástasis. De esta manera pretendemos identificar cuales,
de entre los genes seleccionados, pueden ser útiles como marcadores de la
presencia y/o la extensión del tumor.
2.3.7. Estudiar la evolución del estado de metilación de esos genes antes de
cualquier maniobra terapéutica y al final del tratamiento, para conocer si existe
correlación o no con el estado clínico-patológico de curación en el caso de
descenso de dicho nivel de metilación en suero de la paciente o de persistencia
tumoral en el caso de ascenso o persistencia de los niveles de proteínas metiladas
al final del tratamiento.
2.3.8. Correlacionar el perfil de metilación con las variables clínico-patológicas
habitualmente empleadas en la clínica para conocer su relación con los factores
pronóstico y predictivos de respuesta que se utilizan en la actualidad.
2.3.9. Contrastar la relación entre la presencia o ausencia de la proteína
resultado de la metilación de la región promotora del gen RE (receptor
estrogénico) en el suero de la paciente y el estado RE negativo en pieza tumoral, ya
que la pérdida de expresión de RE en tumor está asociada con la metilación de su
región promotora 5´CpG y a su vez con tumores de mama de peor evolución y
pronóstico.
MATERIAL Y MÉTODOS
Joaquina Martínez-Galán Material y Métodos
- 81 -
3. MATERIAL Y MÉTODOS
3.1. DISEÑO
El presente trabajo de investigación es un estudio de tipo prospectivo. Se ha
efectuado sobre un grupo de pacientes diagnosticadas de cáncer de mama, que
fueron incluidas y seguidas desde el momento inmediato a iniciar el primer
tratamiento oncológico, que en todas ellas fue la cirugía, hasta la fecha final de
estudio. Así mismo, se ha incluido un grupo control formado por dos subgrupos de
mujeres. Un primer subgrupo constituído por mujeres sanas sin patología alguna
de mama (Grupo Control Normal) y un segundo subgrupo formado por mujeres
con patología benigna de mama (Grupo Control con Patología Benigna).
3.2. PERIODO DE ESTUDIO
El estudio comenzó en Mayo 2001 y concluyó en Julio de 2008; periodo de
tiempo en el que hemos conseguido incluir un total de 107 pacientes con cáncer
de mama y 110 mujeres sin cáncer de mama. Durante el tiempo de observación y
de estudio, se realizó una primera extracción de 5 ml de sangre justo antes de la
cirugía. Esta muestra se tomó en todas las pacientes incluidas en el grupo casos y
en todas las mujeres que fueron incluidas en el grupo control. Al final del
tratamiento se obtuvo una segunda muestra de sangre de 5 ml en
aproximadamente, la tercera parte de las pacientes diagnosticadas de cáncer de
mama. En algunos casos se realizó una determinación intermedia que podría
coincidir con el final del tratamiento con Radioterapia (RT) o de Quimioterapia
(QT). En este subgrupo de pacientes cuando el tratamiento prescrito se completó
se obtuvo una nueva muestra de sangre. En el grupo control sólo se realizó una
única extracción sanguínea inicial.
Joaquina Martínez-Galán Material y Métodos
- 82 -
3.3. MATERIAL
3.3.1. FUENTES DEL MATERIAL DE ESTUDIO
Este trabajo de investigación, ha sido aprobado por el Comité Ético del Hospital
Universitario Virgen de las Nieves y la Universidad de Granada. En todos los casos,
fue condición indispensable que todas las pacientes, y las personas que se
incluyeron como controles, conocieran y aceptaran participar en el estudio de
forma voluntaria y que hubiesen firmado el documento del consentimiento
informado que se facilitaba en la primera entrevista, antes de proceder a la
extracción de la muestra de sangre.
La inclusión de pacientes y la recogida de datos de las pacientes diagnosticadas
de cáncer de mama, se efectuó en el periodo de tiempo comprendido entre Mayo
de 2001 y Junio de 2005. El procesamiento de las muestras y el análisis de los
datos resultantes del estudio, incluyendo el seguimiento clínico de las enfermas,
se realizó entre Junio 2006 y Mayo 2009. El seguimiento medio fue de 56 meses.
El grupo control estuvo compuesto por mujeres sin patología oncológica
reclutadas entre las mujeres que acuden al Servicio de Medicina Preventiva del
Hospital Virgen de las Nieves. A dichas mujeres se les propuso entrar en el estudio
y tras explicarles los objetivos y obtener su consentimiento se les realizó una
pequeña historia clínica y se les extrajo una muestra de 5 ml de sangre.
a) Fuentes de los datos biográficos, clínicos y anatomo-patológicos
La recogida de los datos clínicos y biográficos de las pacientes, se realizó a
través de tres fuentes: i) el análisis de las historias clínicas convenientemente
archivadas en el Servicio de Documentación Clínica del Hospital Virgen de las
Nieves; ii) la entrevista clínica que realizamos de forma sistemática a todas las
pacientes que son valoradas en las consultas externas del Servicio de Oncología
Radioterápica del mismo Hospital, y iii) los informes anatomopatológicos e
inmunohistoquímicos aportados por el Servicio de Anatomía Patológica como
documentos de diagnóstico y estudio del espécimen tumoral extraído tras la
Joaquina Martínez-Galán Material y Métodos
- 83 -
cirugía efectuada sobre las pacientes afectas de tumoraciones mamarias (Grupo
Casos y Grupo Patología Benigna).
Para proceder de forma sistemática al inicio de nuestro proyecto de Tesis
Doctoral, diseñamos una ficha de recogida de datos en las que se incluían distintos
parámetros, entre ellos:
• Datos Biográficos:
- Edad.
- Edad de la menarquia.
- Edad primer embarazo.
- Lactancia materna.
- Fórmula obstétrica.
- Edad de la menopausia.
- Antecedentes familiares de primer y segundo grado con cáncer de
mama.
• Datos Clínicos:
- Localización por cuadrante del tumor.
- Estadio clínico cTNM.
• Datos Anatomo-patológicos:
- Histología.
- Grado de diferenciación celular.
- Estadio patológico pTNM.
- Invasión perineural, rotura capsular ganglionar y trombos.
endolinfáticos.
• Datos Inmuno-histoquímicos en tumor:
- Cerb2/ FISH.
- P53
- Receptor de Estrógenos (RE) y Receptor de Progesterona (RP).
Joaquina Martínez-Galán Material y Métodos
- 84 -
• Datos referentes a los tratamientos administrados:
- Tratamiento con Quimioterapia (QT).
- Tratamiento con Radioterapia (RT).
- Tratamiento Hormonal (HT).
Las fichas fueron rellenadas de forma sucesiva a lo largo del tiempo incluyendo
los correspondientes datos conforme se podía disponer de ellos.
b) Fuente de datos analíticos
Los datos analíticos se obtuvieron a partir de las muestras de sangre que se
tomaron a las pacientes (grupo casos) y a las personas sanas (grupo control)
incluidas en el estudio. El procesamiento de las muestras y los estudios
epigenéticos sobre el ADN extraído de las muestras de sangre, se realizaron en el
Laboratorio de Investigaciones Médicas “Mora Lara” del Hospital Universitario
“San Cecilio” de Granada.
La metodología seguida se resume a continuación;
• En todas las mujeres afectas de cáncer de mama las extracciones de
sangre se realizaron en los quirófanos del Servicio de Ginecología antes de
la cirugía y de la administración de cualquier medicación intravenosa.
Posteriormente las sucesivas extracciones pertenecientes a cada paciente
se efectuaron en la Unidad de Braquiterapia, en el Hospital de día del
Servicio de Ginecología o en el Servicio de Oncología Médica del Hospital
Virgen de las Nieves.
• Se recogieron muestras de un total de 107 mujeres con cáncer de mama
(grupo casos), a las que se les realizó una primera extracción de sangre
antes de cualquier maniobra terapéutica y una segunda extracción a las dos
semanas de finalizar el tratamiento oncológico (QT o RT) indicado en cada
caso.
• Las muestras sanguíneas una vez obtenidas, se guardaron a temperatura
ambiente en recipientes que las preservaban de la luz y eran transportadas
Joaquina Martínez-Galán Material y Métodos
- 85 -
lo más rápidamente posible al laboratorio de Investigaciones Médicas
“Mora Lara” del Hospital Clínico Universitario “San Cecilio” donde se
procedía a la centrifugación de las mismas y la separación del suero para
proceder a su posterior almacenamiento en congelador a una temperatura
de -80oC. Las muestras sólo se descongelaron para proceder a su análisis
por PCR en Tiempo Real.
• Simultáneamente a la toma de estas muestras, se incluyeron en el estudio
las muestras pertenecientes a 36 mujeres con patología benigna de mama y
a 74 mujeres sin evidencia de patología mamaria alguna. Ambos grupos
fueron reclutados de entre las mujeres que por cualquier causa (no
tumoral) acudían al Servicio de Medicina Preventiva. Las muestras
tomadas en estas mujeres fueron incluidas y estudiadas con los mismos
métodos que se emplearon para el estudio de las personas pertenecientes
al Grupo Casos.
• Sobre todas las muestras de suero se estudió, por PCR Cuantitativa en
Tiempo Real, la concentración de amplificados de ADN representativos de
la región donde se sitúa el promotor del gen de cada uno de los
biomarcadores investigados en este trabajo.
• Mediante la técnica de PCR específica de metilación se cuantificó el nivel
de hipermetilación en las islas CpG de la región de los promotores de los
siguientes genes: Receptor de Estrógenos (RE), RAR-Beta, 14-3-3 Sigma, APC
y E-Cadherina.
3.3.2. INSTRUMENTACIÓN
A lo largo del presente trabajo de investigación hemos utilizado entre otros, los
instrumentos que a continuación se refieren:
a) Centrífugas
Centrífuga refrigerada: Para el proceso de extracción del ADN y para la
concentración de las soluciones agitadas previamente se ha utilizado una
Joaquina Martínez-Galán Material y Métodos
- 86 -
centrífuga convencional marca Beckman, modelo TJ/6, dotada con una
unidad adicional de refrigeración que permite centrifugar muestras a baja
temperatura. La centrífuga consta de un rotor con soportes
intercambiables para la centrifugación simultánea de un número de
muestras variable (entre 4 a 120 muestras). La máxima velocidad de
centrifugación depende del rotor utilizado.
Micro-centrífuga: Para la técnica de modificación con bisulfito de las
muestras de DNA se ha usado una centrífuga "microfuge" marca DESAGA
de Sarstedt-ccuppe MC2, con capacidad para 18 muestras, programable en
tiempo hasta 15 minutos y de una velocidad máxima de centrifugación de
13.000 rpm.
Centrífuga convencional: Se ha utilizado una centrífuga Orto (Clino)
para la obtención de los sueros a partir de las muestras de sangre,
trabajando a 3.500 rpm durante 5-7 minutos.
b) Baño termostatizado: Para someter las muestras a incubación a las
temperaturas indicadas en el protocolo de modificación del DNA metilado se ha
utilizado un baño digital marca Accu BlockTM, con un bloc específico para tubos
eppendorf de 1.5ml y otro para tubos eppendorf de 0.5ml, con capacidad para 48
muestras en total.
c) Congeladores: Para el almacenamiento de muestras de suero y de DNA y
DNA modificado se ha usado un arcón congelador, marca Selecta, modelo 455,
capaz de alcanzar la temperatura de -80C. La temperatura de operación durante
todo el tiempo de almacenamiento de las muestras fue de -70C.
Para almacenar los reactivos, las enzimas y tampones se ha usado un
congelador, marca Liebherr, capaz de alcanzar la temperatura de -20C. Se han
utilizado también congeladores y frigoríficos convencionales para el
almacenamiento de otros reactivos y disoluciones.
Joaquina Martínez-Galán Material y Métodos
- 87 -
d) pH-Metro: Para la regulación del pH de las soluciones de tampón
empleadas se ha usado un pHmetro suministrado por la firma Orion Research,
modelo 501, cuya precisión se estima en 0.01 unidades de pH.
e) Balanza de precisión: Para la preparación de reactivos y disoluciones
tampón se ha utilizado, cuando fue necesario, una balanza de precisión Mettler
Toledo AB 104 capaz de alcanzar la décima de miligramo.
f) Termociclador: Todas las reacciones necesarias para completar el proceso
de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se han realizado de manera
automática utilizando un equipo de PCR a tiempo real iCyclerTM Optical Module
Serial Nº 584BR-02159 (Bio Rad). Parte fundamental del protocolo es la
utilización de un dispositivo para regular las modificaciones de la temperatura de
la reacción y su control. Para ello el equipo cuenta con block capaz de admitir
placas multi-well de 96 pocillos. Mediante el ordenador que controla el sistema se
puede programar la temperatura y el tiempo de cada uno de los pasos de la
reacción.
g) Sistema de electroforesis: Se ha utilizado un equipo para electroforesis
convencional suministrado por TDI, con cubeta de electroforesis sumergida,
marca Minicell, modelo EC370 M, con el que nos fue posible separar, en función de
su tamaño, fragmentos de ADN. El sistema incluye además de la cubeta de
electroforesis, la fuente de alimentación (modelo Ps-1-VC), y permite alcanzar los
150 voltios, 500mA.
Para la preparación del gel se ha utilizado el mismo soporte de la cubeta
suministrada. El "pocillo" en el gel se prepara utilizando un "peine" apropiado
(peines de 8 ó 12 pocillos). Como norma general se establecieron los parámetros
de voltaje y tiempo siguientes: 100 V durante 30 minutos.
h) Transiluminador: Para la visualización de geles teñidos con bromuro de
etidio se ha usado un transiluminador ultravioleta 20 x 20 (312nm de longitud de
onda) suministrado por TDI, modelo TC-312 A. En todos los casos, para la
Joaquina Martínez-Galán Material y Métodos
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visualización de los amplificados se ha empleado una pantalla de protección UV
facial completa.
i) Sistema de reproducción fotográfica y video: Los geles, bajo iluminación
ultravioleta, fueron fotografiados utilizando una cámara Polaroid, modelo CU-5
88-48 y una cámara de vídeo SONY CCD IRIS, estando ésta última acoplada a un
sistema de análisis de imagen.
j) Análisis de imagen: Para la evaluación de los geles obtenidos en el
desarrollo de los métodos descritos, se ha empleado un sistema de análisis de
imagen compuesto por una videocámara, acoplada a un ordenador que almacena
la información y la procesa utilizando el programa de análisis de imagen "Visilog
Geles", comercializado por Microoptic. El programa permite analizar la
distribución de bandas en los geles y estimar el tamaño de la molécula de DNA
amplificado por comparación con marcadores de tamaño conocidos.
k) Otros: Se han usado otros pequeños aparatos existentes en el laboratorio
como son: microondas, picadora de hielo, vortex, etc.
3.3.3. REACTIVOS QUÍMICOS
a) Etanol 99%, Pellets de NaOH, β-mercaptoetanol y Buffer TE: Para
diluir los buffer AW1 y AW2 y para realizar el paso nº 5 del protocolo del Kit de
extracción de DNA QIAAmp Blood Midi/Maxi, así como para la modificación con
reactivo bisulfito sódico del ADN, se ha usado etanol al 96-100%.
En el mismo protocolo del kit de modificación de DNA se usó hidróxido sódico
4M (Panreac Química SA), β-Mercaptoetanol (Merck) y tampón TE (10mM Tris-
HCl; 0.1nM EDTA; pH 7.5).
b) Agarosa: En la preparación de geles para electroforesis se ha utilizado
Agarosa (Promega) al 2-2.5%.
c) Tampón de carga: Las muestras se cargaron en el gel junto con un tampón
de carga compuesto por: azul de bromofenol 0.25% y sacarosa en 50mM de EDTA
Joaquina Martínez-Galán Material y Métodos
- 89 -
40%. Este tampón se preparó a una concentración 6x añadiendo en el momento
de la carga 1.5μl de tampón por cada 10μl de muestra. La sacarosa precipita la
muestra hasta el fondo del pocillo impidiendo que se salga de la matriz del gel y el
colorante nos permite observar el frente de la electroforesis.
d) Bromuro de etidio: Para la tinción del DNA sometido a electroforesis en
gel se ha utilizado una disolución de bromuro de etidio (Serva) de concentración
0.5μg/ml. Se incorporó tanto al gel como al tampón de electroforesis.
e) Otros reactivos químicos: Para la regulación del pH de las disoluciones
tampón se han utilizado, cuando fue necesario, disoluciones de HCl, NaOH y de
ácido acético glacial para ajustar el pH del acetato sódico.
f) Solución de ClONa al 10%: Todas las superficies del laboratorio sobre las
cuales se trabajó así como todos los materiales que estuvieron en contacto con el
suero, fueron lavados con una solución de hipoclorito sódico al 10% (que debe
prepararse cada día); seguido de un aclarado con etanol al 70% o similar. Se
extremaron las medidas higiénicas siendo obligado el uso de guantes en todo
momento.
Todos los restos bio-contaminantes (restos de sueros, células sanguíneas, etc.)
se vertieron en contenedores destinados a tal fin para su posterior incineración.
3.3.4. REACTIVOS BIOLÓGICOS PARA PCR
a) DNA estándar CpGenomeTM: Para la preparación de las muestras que
definieron la recta estándar en la PCR en tiempo real hemos empleado ADN
universalmente metilado (Bio. Rad. Cat. nº 57821). Alícuotas preparadas a partir
del vial se conservaron entre -15 oC y -25 oC hasta el momento de su uso.
b) Extracción del ADN: Para la extracción del ADN se a empleado el Kit de
QIAGEN QIAamp® DNA Blood Midi/Maxi. (Cat. nº 51185). El kit contiene
suficientes reactivos para 100 muestras de suero, sangre total, plasma, fluidos
corporales o células mononucleares de sangre periférica a partir de las que se
extrae el ADN siguiendo los procedimientos recomendados por el fabricante.
Joaquina Martínez-Galán Material y Métodos
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El producto de la extracción final queda en 200µl de solución de ADN con una
concentración estimada de 3.0µg/ml de ADN cuando en el inicio de la extracción
se parte de 2ml de suero. El proceso de extracción completa del ADN de las
muestras se sitúa en torno a las dos horas de duración.
Los reactivos que contiene el kit se enumeran a continuación:
Producto Unidades
QIAamp Midi Spin Columnas 100
Tubos recolectores (15ml) 100
Buffer AL 265ml
Buffer AW1 (concentrado) 95ml
Buffer AW2 (concentrado) 66ml
Buffer AE 60ml
QIAGEN®Protease 4 viales
El contenido del kit no incluye los reactivos químicos que se han descrito en el
apartado anterior de protocolo de extracción del ADN. Todos los reactivos son
estables a 4 oC.
c) Modificación del ADN metilado: Para la modificación bisulfítica del ADN
se ha utilizado el kit CpGenomeTM Modification Kit (Cat. nº S7820) de CHEMICON
International. Este sistema contiene suficiente reactivos para la modificación del
ADN de aproximadamente 70 muestras de DNA. El producto final debe quedar en
un volumen de, aproximadamente, 20µl de solución de ADN modificado. El tiempo
necesario para realizar toda la secuencia de reacciones necesaria es de 28 horas.
Los reactivos contenidos en el kit son:
Producto Cantidad
DNA Modification Reagent I 23g
DNA Modification Reagent IV 200µl
DNA Modification Reagent II 135g
DNA Modification Reagent III 700µl
Joaquina Martínez-Galán Material y Métodos
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El contenido del kit no incluye los reactivos químicos que se han descrito en el
apartado anterior de protocolo modificación del ADN. Todos los reactivos son
estables a -20 oC.
d) Amplificación
iQTM SYBR® Green Supermix: Esta mix contiene los reactivos
suficientes para la realización de la reacción de PCR, usando la enzima
térmica iTaqTM DNA Polymerase que es activada después de una etapa de
desnaturalización inicial de 3 minutos a 95oC. Contiene 100mM KCl,
40mMTris-HCl, pH 8.4, 0.4mM de cada uno de los dexosirribonucleótidos
(dATP, dCTP, dGTP y dTTP), iTaq polymerase, 50 units/ml, 6mM MgCl2,
SYBR Green I, 20nM fluoroseína y estabilizantes. La adición de fluoroseína
no afecta ni a la eficiencia ni a la sensibilidad de la reacción. Esta mezcla de
reactivos (mix) contiene la cantidad suficiente para la realización de la
reacción de PCR, usando la enzima térmica iTaqTM DNA Polymerase. Las
alícuotas de la mezcla se conservan a -20oC para evitar congelaciones y
descongelaciones repetidas. A 4oC una alícuota de supermix es estable
durante 6 meses.
Primers (cebadores): Las secuencias de los primers necesarios para
amplificar el fragmento de ADN se obtuvieron de la literatura científica
relacionada con el tema: E-Cadherina [376]; 14-3-3 sigma [377]; retinoic-
acid-receptor- (RAR-) [363]; adenomatous polyposis coli (APC) [378] y
receptor de estrógenos-α (ER-α) [379]. Las secuencias de los primers
utilizadas en este estudio se han incluido en la tabla 1:
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- 92 -
Tabla1. Secuencias de los primers y datos de la reacción de PCR
Primer Secuencia
Sentido/ Antisentido pb*
Tª
anniling
Tª
add oC
E- Cad.
5’-GCGTTTGGTCGCGGAGTTC
5’-TTCCCTCAAAAATCGTCCCCAC
144 62 oC no
14-3-3σ
5´-TGGTAGTTTTTATGAAAGGCGTC
5’-CCTCTAACCGCCCACCACG
107 62.3 oC 78
RAR-β
5’-GAACGCGAGCGATTCGAGT
5’-GACCAATCCAACCGAAACG
142 63.5 oC no
APC
5’-TATTGCGGAGTGCGGGTC
5’-TCGACGAACTCCCGACGA
108 63 oC no
REα
5´-GATACGGTTTGTATTTTGTTCGC
5’-CGAACGATTCAAAAACTCCAACT
123 62.2 oC 74
*pb: pares de bases
Marcadores de tamaño de peso molecular: Para determinar el
tamaño en pb. (pares de bases) de los fragmentos amplificados para cada
uno de los primers se usó el marcador: 50pb DNA Step Ladder (Promega nº
G452A). Consiste en 16 fragmentos de ADN comprendidos entre 50pb y
800pb incrementándose su tamaño de 50 en 50pb.
Se suministra a una concentración final de 340µg/ml. Viene disuelto en el
tampón: 10mM Tris-ClH (pH 8.0), 1mM EDTA. Es estable a -20 oC .
3.3.5. MATERIAL FUNGIBLE
a) Material plástico para el aislamiento del ADN, modificación bisulfítica
del DNA metilado y amplificación por Real Time PCR
Como norma general, todo el material fungible fue utilizado en condiciones de
esterilidad y limpieza para asegurar la calidad de las reacciones previas y de la
PCR final.
Tubos de ensayo: Se usaron tubos de ensayo convencionales de
plástico, de 10 ml de capacidad, y estériles.
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- 93 -
Tubos eppendorf: Se usaron tubos de polipropileno de 1500μl, 500µl y
de 200µl estériles de capacidad marca BIO-RAD® para la realización de las
técnicas biológicas.
Puntas de pipetas con filtro (Tips): Estas puntas de pipetas son de
plástico y estériles y están protegidas con filtros de algodón para evitar el
arrastre de contaminación con amplificados de unas muestras a otras ya
que dicho algodón ejerce de barrera contra los aerosoles que propagan los
amplificados. Este material fue suministrado por Eppendorf® y dispusimos
de puntas para dispensar volúmenes comprendidos entre 1 a 10µl, 2 a
100µl, 20 a 300µl y 100 a 1000µl.
Puntas de pipetas sin filtro: Se usaron puntas estériles de 1250μl de
capacidad, suministradas por GILSON®.
Otro material: Micropipetas: se usaron micropipetas graduadas
convencionales de volumen variable: 1-2.5µl, 2-20µl, 10-100µl, 20-200µl y
100-1000µl; suministradas por Eppendorf®. Igualmente se usó una pipeta
suministrada por Gilson® graduada de 1-1250µl que permite dispensar
alícuotas entre 10µl hasta 125µl.
También se ha utilizado diverso material tanto de vidrio como de plástico para
la realización de las técnicas. Entre este material cabe citar: gradillas, vasos de
precipitado, probetas, matraces Erlenmeyer y otros dispositivos.
3.4. MÉTODOS
3.4.1. Obtención de las muestras sanguíneas incluidas en el estudio
El procedimiento empleado para la obtención de las muestras fue por veno-
punción, utilizando heparina sódica como anticoagulante. La cantidad de muestra
obtenida por extracción fue de 10 ml que se depositaron en 2 tubos de bioquímica
con 5 ml de muestra cada uno de ellos.
Joaquina Martínez-Galán Material y Métodos
- 94 -
Posteriormente una vez en el Laboratorio de Investigaciones Médicas, las
muestras fueron centrifugadas a 3500 rpm durante 10 minutos a temperatura
ambiente. La cantidad de suero recuperada tras la centrifugación nunca fue
inferior a 2ml por tubo, el suero resultante fue a continuación transferido a tubos
eppendorf (≈ 1ml de suero por tubo eppendorf) donde permaneció almacenado a
-80 oC hasta su análisis. A cada muestra se le asignó un número por orden de
llegada para identificar a quién pertenecía cada una de ellas. Las muestras se
almacenaron en el congelador a -80 oC hasta su análisis por PCR.
Este mismo procedimiento fue utilizado para las muestras procedentes del
grupo control.
El suero obtenido de los grupos casos y control, fueron codificados y
randomizados antes de los análisis y la interpretación de los resultados, para
asegurar el adecuado tratamiento doble ciego de la información clínica y de los
estudios de epigenética.
Las muestras recogidas, correspondían a los siguientes grupos:
a) Grupo Casos
1ª determinación: Se han conseguido las muestras sanguíneas a 107
pacientes diagnosticadas de cáncer de mama sin evidencia de enfermedad
metastásica (grupo precirugía de casos), justo antes de realizar cualquier
tratamiento oncológico. En todos los casos el primer tratamiento realizado
fue la intervención quirúrgica.
2ª determinación: Se realizó unas 2 semanas tras finalizar el tratamiento
oncológico indicado en cada caso fuese este cirugía seguida de
quimioterapia y radioterapia, cirugía seguida de quimioterapia o cirugía
seguida de radioterapia. En total de se recogieron 58 muestras de sangre.
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- 95 -
b) Grupo Control sin patología benigna de mama
Para el Grupo Control se han acumulado muestras de sangre de un total de
74 mujeres sanas elegidas al azar entre los profesionales del Hospital
cuando acudían al Servicio de Medicina Preventiva para realizar la revisión
anual reglamentaria, así como de otras mujeres sin antecedentes
personales oncológicos, las cuales eran derivadas al Servicio de Medicina
Preventiva por otros servicios del Hospital. De todas ellas se obtuvo el
consentimiento informado, por escrito, y en todos los casos se facilitó la
pertinente información a la persona antes de la extracción de la muestra.
Las muestras de sangre, fueron tratadas con la misma metodología
anteriormente expuesta en el grupo casos.
c) Grupo control con patología benigna de mama
Durante el tiempo de realización de nuestro estudio hemos podido recoger
muestras de sangre de 38 mujeres con patología mamaria benigna que
fueron intervenidas quirúrgicamente en el Hospital de dichas lesiones
benignas. Estas 38 pacientes fueron elegidas al azar y constituyen el grupo
de pacientes afectas de patología benigna de la mama. De ellas, 15 mujeres
fueron diagnosticados de Fibroadenoma, 14 de Mastopatía fibroquística, 6
de Hiperplasia Ductal DIN 1 y un caso de Papiloma. En todos estos casos
previamente a la exéresis de la lesión, se obtuvo el consentimiento
informado y la muestra de sangre. Las muestras fueron codificadas y
procesadas con la misma metodología comentada en los apartados
anteriores.
3.4.2. Extracción del ADN de la muestra de suero de los sujetos
Para la extracción del ADN se procede a la descongelación de las muestras y su
tratamiento utilizando el Kit QIAamp Blood Kit (Quiangen Inc. CA) siguiendo el
protocolo recomendado por el fabricante. Al final del procedimiento se obtiene un
volumen aproximado de 200 µl de disolución de ADN cuya concentración se
cuantificó por espectrofotometría (260/280) en todos los casos.
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- 96 -
El procedimiento seguido se resume a continuación:
1.- Pipetear 200µl de proteasa en tubos de centrífuga de 15 ml.
2.- Adicionar 2ml de suero.
3.-Adicionar 2.4ml del buffer Al (buffer de lisis) y mezclar vigorosamente
invirtiendo el tubo durante un minuto.
4.- Incubar a 70 oC durante 10 minutos.
5.- Adicionar 2ml de etanol (96-100%) y mezclar invirtiendo el tubo y agitando
vigorosamente.
6.- Seguidamente transferir la mitad de la solución obtenida en el paso 5 a una
columna de las suministradas en el kit con cuidado de no mojar los bordes.
Cerrar la tapa y centrifugar a 3000rpm durante 3 minutos.
7.- Descartar el filtrado y colocar otro tubo de 15ml bajo la columna con filtro y
transferir la solución restante obtenida en la etapa 5 sobre esta misma
columna. Cerrar la tapa y centrifugar a 3000 rpm durante 3 minutos.
8.- Descartar el filtrado y colocar otro tubo de 15ml bajo la columna con filtro.
9.- Cuidando de no mojar los bordes, adicionar 2ml de Buffer AW1 y
centrifugar a 5000rpm durante 1 minuto.
10.-Cuidando de no mojar los bordes, adicionar 2ml de Buffer AW2 y
centrifugar a 5000rpm durante 15 minutos.
11.- Descartar el filtrado y colocar la columna en otro tubo de 15ml.
12.- Añadir 200µl de Buffer AE o agua destilada y estéril, cerrar la tapa, incubar
a temperatura ambiente (15-25oC) durante 5 minutos y centrifugar a
5000rpm durante 2 minutos.
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- 97 -
13.- Trasvasar el DNA así obtenido a un tubo eppendorf de 1400µl y congelar a
-20oC. Se obtuvo un volumen final de 200 µl.
El ADN extraído, fue cuantificado por espectrofotometría. La cantidad de ADN
extraído, medido en g/ml suero, fue 0.431 ± 0.019 (valor media ± error estándar
de la media). Las muestras de ADN fueron almacenadas a -80oC hasta posteriores
análisis.
3.4.3. Modificación Bisulfítica
Una vez extraído el ADN se procede a su modificación con bisulfito sódico. Este
procedimiento descrito por Herman y col. [380] en 1996 consiste en la
transformación de los residuos de citosina no metilados en uracilos al tratar el
ADN con bisulfito, permaneciendo sin modificarse los residuos de citosina
metilados. De esta forma las regiones genómicas metiladas y las no metiladas del
ADN tras la modificación bisulfítica, son diferentes y por tanto distinguibles
utilizando primers (cebadores) específicos. Las diferencias en el estado de
metilación de la misma región del genoma pueden ponerse de manifiesto
utilizando la técnica de reacción en cadena de la polimerasa específica de
metilación (MS-PCR) o más recientemente el procedimiento de PCR cuantitativa
específica de metilación (QMS_PCR).
Para la modificación se ha utilizado el kit de reactivos CpGenomeTM
Modification (Chemicon® Internacional). Como se muestra en el esquema que se
presenta a continuación en la reacción bisulfítica todas las citosinas son
desaminadas y desulfonadas convirtiéndose en uracilos, solamente las 5’metil
citosinas permanecen inalteradas. Así, la secuencia del ADN tratado se
diferenciará dependiendo de si el ADN está metilado o no. Además, las cadenas
complementarias volverán a serlo después de la conversión de la citosina. Los
primers usados en la técnica de PCR-metilación específica (MSP) pueden ser
diseñados para amplificar expresamente una cadena no metilada (bisulfito
sensible) y/o una cadena metilada (bisulfito resistente) basándose en estas
diferencias químicamente inducidas.
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- 98 -
Fundamento bioquímico de la modificación del ADN con bisulfito:
ADN Metilado
ADN No Metilado
Los reactivos necesarios para esta reacción han sido enumerados en el
apartado de material y métodos. El proceso fue realizado siguiendo las
recomendaciones del fabricante.
El ADN necesario para realizar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR),
puede obtenerse a partir de una cantidad inicial de material genético tan pequeña
como 0.001µg. Del total del ADN extraído, un volumen de 100µl se trató con
bisulfito sódico durante 16 horas, de esta manera se convirtieron las citosinas no
metiladas en uracilos, quedando inalteradas las metilcitosinas.
El ADN obtenido fue disuelto en 20µl de tampón TE y el ADN modificado fue
cuantificado por espectrofotometría. La eficacia de recuperación de ADN después
de la modificación bisulfítica ha estado en todas las ocasiones comprendida dentro
del rango del 55-90%. En la reacción de cuantificación mediante PCR se ha
utilizado 1 µl del ADN. Una vez modificado el ADN la muestra es estable durante al
menos 6 meses a -80 oC.
Como ADN de referencia para hacer cuantitativas las determinaciones se ha
utilizado ADN universalmente metilado (ADN Universal Methylated CpGenomeTM
GGG GCm
G GAC Cm
GCm
G
Modificación con
Bisulfito sódico GGG GCm
G GAU Cm
GCm
G
GGG GCG GAC CGC G
Modificación con
Bisulfito sódico GGG GUG GAU UGU G
Joaquina Martínez-Galán Material y Métodos
- 99 -
Nueva York, EE.UU) que fue tratado con bisulfito de la misma manera que las
muestras. Tras cuantificar el ADN espectroscópicamente su concentración final se
ajustó a 2 g/ml. A partir de esta muestra se preparó la curva de calibración
utilizando diluciones sucesivas comprendidas entre 1/1 y 1/128 de la muestra
original utilizando agua destilada de la máxima calidad y esterilizada.
La reacción de PCR se realizó sobre placas de 96 pocillos. En ella se incluían las
muestras de las pacientes, las sucesivas del ADN de referencia para construir la
curva de calibración, dos controles positivos, y dos pocillos sin muestra que
fueron etiquetados como controles negativos. El programa del sistema permite
ajustar la curva de calibración a un modelo lineal y obtener los parámetros
estadísticos del ajuste. En todos los casos, los coeficientes de correlación para las
curvas de calibración fueron iguales o superiores a 0.98, las pendientes de las
rectas de calibración se situaron en el rango de 3.02 a 3.2 y la eficacia de la PCR
resultó estar entre el 85 y el 110%.
A continuación se describe el protocolo de modificación de ADN con bisulfito.
Se recomienda partir de 1µg de ADN aunque el método es sensible para una
cantidad de 0,001µg. En todos los casos en nuestro estudio se ha partido de un
volumen de 100µl de ADN con una cantidad comprendida entre 1-5µg/100µl. Este
procedimiento experimental se describe brevemente a continuación.
3.4.4. Procedimiento experimental
• Reactivos (Día 1)
• Na OH 3M (se debe preparar en el momento de su utilización).
Para ello se disuelven 1 g de Na OH en 8.3ml de agua.
• R.I: Reactivo de Modificación de ADN I (se debe preparar en el
momento de su utilización). Para ello se usan 571µl de agua
destilada a 227mg de R I. Se ajusta el pH a 5 (normalmente es
suficiente con adicionar 20 µl de NaOH 3M por muestra). El pH se
debe comprobar con papel indicador).
Joaquina Martínez-Galán Material y Métodos
- 100 -
• Modificación (Día 1)
• En un eppendorf de 1.5 ml se ponen: 100 ml de muestra (que
contenga al menos 1,0 µg de ADN), 2 µl de Reactivo de modificación
de ADN (IV) y 7 µl de NaOH 3M; la mezcla se incuba durante 10
minutos a 37 oC al cabo de los cuales se adicionan 550µl de reactivo
R.I (recién preparado) y se deja incubar a 50oC durante 16-20 horas.
• Reactivos (Día 2)
• Reactivo de Modficación II: Se prepara la disolución A utilizando
20 ml de agua y 1 µl de 2-mercapto-etanol. Para cada muestra se
utilizan 750 µl de disolución A y 1.35 mg del reactivo R.II, se mezcla
bien y se añade NaOH 20mM/90% Etanol (se debe preparar en el
momento de su utilización). Para ello se mezclan 900µl de etanol
absoluto con 93,4 µl de agua y 6,6 µl de NaOH 3M.
• Modificación (Día 2)
• Reactivo de Modificación III: Resuspender vigorosamente en el
vórtex el DNA y adicionar a cada uno de los tubos 5 µl del mismo.
• Adicionar a cada uno de los tubos 750 ml de R.II y mezclar
suavemente. Incubar 10 minutos a temperatura ambiente.
• Centrifugar 1 minuto a 13000 rpm. Eliminar el sobrenadante.
• Adicionar al pellet 1 ml de etanol 70%. Agitar con vórtex.
• Centrifugar 1 minuto a 13000 rpm. Eliminar el sobrenadante.
• Repetir este paso tres veces más.
• Eliminar el sobrenadante del tercer lavado, centrifugar los tubos 3
minutos a 13000 rpm y la gota de líquido que ha quedado,
eliminarla con una micropipeta con mucho cuidado.
Joaquina Martínez-Galán Material y Métodos
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• Adicionar 50 µl de 20 mM NaOH/ 90% Etanol (recién preparado).
Agitar con vórtex suavemente para resuspender el pellet e incubar 5
minutos a temperatura ambiente.
• Centrifugar 1 minuto 1 13000 rpm y adicionar 1 ml etanol al 90%.
Agitar con vórtex.
• Centrifugar 1 minuto 1 13000 rpm. Eliminar el sobrenadante.
• Repetir este paso una vez más.
• Una vez eliminado el sobrenadante del 2º lavado, centrifugar los
tubos 5 minutos a 13000 rpm y la gota de líquido que ha quedado,
eliminarla con una micropipeta.
• Adicionar 25 µl de tampón TE y agitar suavemente e incubar 15
minutos a 50-60 oC para disolver el ADN.
• Centrifugar los tubos 3 minutos a 13000 rpm y transferir el
sobrenadante a un nuevo tubo. Congelar a -20 oC.
3.4.5. PCR en tiempo Real QMS-PCR utilizando SYBR Green
Las reacciones de PCR cuantitativa en tiempo real han sido realizadas
utilizando el Kit iQ SYBR-Green Supermix (Laboratorios de BioRad, Hercules, CA)
según el protocolo del fabricante.
La mezcla de reacción para la PCR cuantitativa en todos los casos contiene:
• l μl de ADN modificado de cada muestra (estándar o desconocida)
como plantilla para cada PCR en tiempo real QMS-PCR.
• 0.5 μM de cada oligonucleótido (primer).
• 12.5 μl de 2X SYBR Green Supermix (Bio-rad).
• Agua estéril hasta completar 25μl.
Joaquina Martínez-Galán Material y Métodos
- 102 -
Todos los experimentos de PCR fueron realizados en un volumen de 25l
utilizando placas de 96 pocillos. Las secuencias de los primers, fueron elegidas a
partir de publicaciones previas.
La amplificación de ADN por PCR, se hizo de acuerdo con el siguiente
procedimiento:
Primera Etapa: 95oC durante 3 minutos.
Segunda Etapa: 40 ciclos compuestos por 30 segundos a 94oC;
30 seg. a la temperatura de hibridación encontrada para cada uno de
los promotores (ER-α: 62.2oC; E-Cad: 62.0oC; 14-3-3-σ: 62.3oC; RAR-
β: 63.5 oC; APC: 63.0 oC) y 30 segundos a 72.
Tercera Etapa: Fue necesario un paso adicional (durante 30 seg.)
a 74oC para el promotor del gen ER-α y a 78oC para 14-3-3-σ.
Mediante esta etapa se consigue disminuir la sobre-estimación del
producto debida a la formación de dímeros de los primers utilizados
(el producto del dímero permanece en forma de doble cadena
cuando se alcanza una temperatura capaz de disociar el dímero).
Cuarta Etapa: En todos los casos se realizó un análisis de la curva
de disociación del ADN para comprobar la especificidad de los
productos obtenidos. Para ello se estudió la fluorescencia relativa en
un gradiente de temperatura comprendido entre 60 y 90 grados
utilizando incrementos sucesivos de 0.5oC.
Quinta Etapa: El valor de fluorescencia correspondiente a cada
muestra se convirtió en unidades relativas de ADN universalmente
metilado (μg/ml) usando la correspondiente recta de calibración
ajustada mediante el programa del equipo de PCR a tiempo real.
De forma general, las medidas para trabajar con ADN requieren, entre otras
consideraciones el uso exclusivo del material y reactivos para PCR; uso de guantes
Joaquina Martínez-Galán Material y Métodos
- 103 -
en todo momento y cambio frecuente (mejor los que no llevan talco pues éste
inhibe la PCR) y material de contacto directo con la muestra (puntas de pipeta y
tubos "eppendorf") esterilizados. Se trabaja siempre sobre hielo picado y
extremando las precauciones para evitar posibles contaminaciones ambientales.
Para preparar la mezcla de la reacción se trabaja en tubos cilíndricos de tapón
verde esterilizados en óxido de etidieno. La mezcla de reacción para el caso de RE
sería (tabla 2):
Tabla 2. Volúmenes apropiados para la PCR de ESR1
ADN
.............................
1.0 μl.
P1 .........................
.... 0.19μl. (50 pmoles)
P2 .........................
.... 0.22 μl (50 pmoles)
SYBR Green I .........................
.... 12.5 μl
H2O .........................
.... 11.0 μl
Seguidamente se transfieren 24µl de dicha mezcla a cada uno de los pocillos de
la placa multiwell, se incorpora 1µl de la solución de DNA modificado y se somete
a agitación suave para, a continuación, someter la mezcla a la acción del
termociclador.
La señal de fluorescencia de amplificación en la PCR cuantitativa, se genera por
la Mx SYBR Green Super Mix (BioRad, Hercules, CA).
Joaquina Martínez-Galán Material y Métodos
- 104 -
3.4.6. ANÁLISIS ESTADÍSTICO
La asociación entre los 5 biomarcadores/genes estudiados, la presencia de
cáncer de mama y la capacidad para discriminar entre mujeres con y sin cáncer de
mama, ha sido analizada de acuerdo con el siguiente procedimiento:
a) Análisis descriptivo de 3 grupos de mujeres (casos, controles y mujeres con
enfermedad benigna) correspondiente a cada biomarcador, para expresar los
resultados a través de su valor medio, medianas, percentiles, rangos y
desviaciones estándar. El coeficiente de correlación de Spearman ha sido
utilizado para analizar la asociación entre las variables de cada grupo.
b) El test de Kruskal-Wallis con la corrección de Bonferroni ha sido utilizado
para estudiar las diferencias entre los grupos (casos, control y enfermedad
benigna de mama).
c) El test de Mann-Whitney ha sido utilizado para analizar diferencias entre
los valores medios encontrados en los grupos pacientes y control.
d) El análisis de regresión logística multivariante ha sido utilizado para
encontrar las variables significativas y la relación óptima entre ellas.
e) Finalmente las curvas ROC (Receiver Operator Curve) han sido usadas para
cuantificar la validez del test de diagnóstico tanto para cada biomarcador aislado
como para la combinación de los que resultan significativos e independientes
entre sí tras el estudio de regresión logística.
RESULTADOS
Joaquina Martínez-Galán Resultados
- 107 -
4. RESULTADOS
4.1. CARACTERÍSTICAS DEL GRUPO CASOS Y CONTROLES INCLUIDOS EN
ESTE ESTUDIO
En esta memoria hemos incluido el estudio de un total de 217 mujeres. En
todas ellas, tras informarles de la naturaleza y de los objetivos del estudio que
estábamos realizando, y una vez obtenido su consentimiento, procedimos a
tomar, por punción intravenosa, una muestra de sangre (aproximadamente 5 ml)
que en se introdujo en un tubo con heparina como anticoagulante para, con la
mayor rapidez posible, trasladarla al Laboratorio de Investigaciones Médicas del
Hospital Clínico San Cecilio donde se realizaron los ensayos de PCR específica de
metilación. En todas esas muestras se han cuantificado las concentraciones
séricas de los promotores de ADN hipermetilados siguientes: APC, E-Cadherina,
14-3-3-Sigma; RAR-beta, y Receptor de Estrógenos (RE).
Las características generales de las personas incluidas en el estudio y su
distribución de frecuencias se resumen a continuación.
4.1.1. ANÁLISIS DESCRIPTIVO UNIVARIANTE DEL GRUPO CONTROL
Para obtener los valores de referencia de los niveles séricos previsibles en las
muestras de sangre hemos incluido dos subconjuntos de pacientes. El primero de
ellos constituido por un total de 74 mujeres sin evidencia de enfermedad
mamaria alguna (Grupo Control Normal) y el segundo formado por 36 mujeres
afectas de patología mamaria benigna (Grupo Patología Benigna).
a) Datos Epidemiológicos-biográficos
Del análisis de los datos obtenidos en este estudio, resulta que el prototipo de
mujer tomada como control, es una mujer premenopáusicas de edad media
superior a 40 años y, en la mayoría de los casos, sin antecedentes familiares de
cáncer de mama.
Joaquina Martínez-Galán Resultados
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Edad: Para el grupo control el intervalo de edad abarca desde los 18 hasta
los 79 años, siendo la edad media 43 años (desviación típica S= 13.51). La
distribución de las personas incluidas en cada subgrupo de control en función de
la edad se ha incluido en la tabla 3. La edad media por subgrupos en mujeres sin
patología alguna fue 41años (22-64 años) y de 48 años (37-56 años) en el caso de
considerar el subgrupo de mujeres con enfermedades benignas de la mama. La
distribución de casos de acuerdo con 3 puntos de corte según edad se hizo para
los siguientes intervalos: edad < 35 años, edad entre 35- 50 y, finalmente, edad
≥ 50 años.
Tabla 3. Distribución de los controles según intervalo de edad
(Total de mujeres incluidas como grupo control)
Edad según intervalos
Frecuencia Porcentaje
<35 30 27,3
35-49 45 40,9
≥50 24 21,8
Subtotal 99 90,0
Desconocida 11 10,0
Total 110 100,0
Antecedentes Familiares: Tuvieron antecedentes familiares de cáncer de
mama el 19% de las mujeres incluidas como controles. De acuerdo a que la
persona que padeció cáncer de mama fuese familiar de primer o segundo grado
las mujeres de este grupo se distribuyeron como sigue:
Antecedentes de Primer grado (madre y/o hermana): La proporción de
mujeres en nuestro grupo control con antecedentes de cáncer de mama de
primer grado fue del 6%. Si consideramos el subgrupo de mujeres con patología
benigna esa misma proporción alcanzó la cifra del 8.6%.
Antecedentes de Segundo grado (abuela, tía y prima): En el grupo
control se encontró este antecedente en el 14.5% de las mujeres. Por subgrupos
en el subgrupo con patología benigna la proporción fue de 23% y en el subgrupo
de mujeres sanas del 11%.
Joaquina Martínez-Galán Resultados
- 109 -
Edad de la menarquia: Para el grupo control la edad media de
presentación de la menarquía fue de 12 años (9-18 años) con desviación típica
1.6 años.
Edad de la menopausia: La edad media de presentación de la menopausia,
fue de 50 años (30-59 años) con desviación típica 5.6 años.
Estado menopáusico: El grupo predominante, en el momento de la toma
de la muestra, fue de mujeres premenopáusicas (tabla 4).
Tabla 4. Distribución de los controles según el estado menstrual
Estado menopáusico Frecuencia Porcentaje
PREMENOPAUSICA 72 72,0
POSTMENOPAUSICA 28 28,0
Total 100 100,0
Desconocidos 10
Total 110
Gestación y edad de presentación: El 61% de los controles habían tenido
algún embarazo a término antes de la toma de la muestra. La distribución por
edad de presentación de los embarazos ha sido la siguiente:
Edad del primer embarazo: La edad media de primer embarazo, fue de 25
años (18-38 años) con desviación típica 4.1.
Edad del último embarazo: La edad media del último embarazo para el
grupo casos fue de 30 años (20-44 años) con desviación típica.
Lactancia materna: El porcentaje de controles que dieron lactancia
materna fue de un 54%.
Meses de lactancia materna: La mediana de meses de lactancia materna
en el grupo control fue de 3 meses (1-24 meses).
Joaquina Martínez-Galán Resultados
- 110 -
b) Datos histopatológicos en grupo control con patología benigna
En el grupo control se incluyeron 36 controles con patología benigna. El
diagnóstico histopatológico final figura resumido en la tabla 5.
Tabla 5. Distribución de los controles con patología benigna
Histología Frecuencia Porcentaje
Fibroadenoma 15 41,7
Mastopatía Fibroquística (MFQ) 14 38,9
Hiperplasia Ductal (DIN1) 6 16,7
Papiloma 1 2,8
Total 36 100
4.1.2. ANÁLISIS DESCRIPTIVOS UNIVARIANTE DEL GRUPO CASOS
a) Datos Epidemiológicos-biográficos
A continuación hemos resumido de forma detallada los datos epidemiológicos
y demográficos más relevantes. Esta información ha sido recogida de las historias
clínicas del grupo de 107 pacientes afectas de cáncer de mama que se han
incluido en este estudio.
Del análisis de los datos extraídos en este estudio a partir de las historias
clínicas, resulta que la paciente prototipo, es una mujer postmenopáusica de 58
años de edad media y sin antecedentes familiares de cáncer de mama en la
mayoría de los casos.
Edad: La edad oscila entre 32 y 88 años siendo la edad media de 58 años
(desviación típica 12.4). Para estudiar la curva de distribución de la edad en
nuestra serie se han elegido tres intervalos de edad diferentes que
aproximadamente podemos denominar como: mujeres jóvenes, mujeres en edad
perimenopáusica y mujeres postmenopáusicas. Así hemos encontrado las cifras
que para mujeres con cáncer de mama menores a 35, entre 35 y 50 años y
mayores a 50 años figuran en la tabla 6.
Joaquina Martínez-Galán Resultados
- 111 -
Tabla 6. Distribución de las enfermas incluidas en la serie
según los intervalos de edad
Edad Frecuencia Porcentaje
<35 3 2,8
35-49 34 31,8
≥50 70 65,4
Total 107 100
Antecedentes familiares: Tuvieron antecedentes familiares de cáncer de
mama el 27% de las pacientes. De acuerdo a que la persona que padeció cáncer
de mama fuese de primer o segundo grado los casos de nuestra serie se
distribuyeron como sigue;
Con antecedentes de primer grado (madre y/o hermana): En el grupo
casos un 14% de las mujeres incluidas tuvieron familiares de primer grado
afectos de cáncer de mama.
Con antecedentes de segundo grado (abuela, tía y prima): En el grupo
casos un 13% de las mujeres tuvieron familiares de segundo grado afectos de
cáncer de mama.
Edad de la menarquia: La edad media de presentación de la menarquia fue
de 13 años (10-17 años) con desviación típica 1.4. Se eligieron dos puntos de
corte uno para edad menor o igual que 11 años y otro para edad igual o mayor
que 12 años (tabla 7).
Tabla 7. Distribución de la serie según edad menarquia
Edad menarquia Frecuencia Porcentaje
≥ 12 53 49.5
≤ 11 53 49.5
Total 106 99,1
Desconocidos 1 0.9
Total 107 100.0
Joaquina Martínez-Galán Resultados
- 112 -
Edad de menopausia: La edad media de presentación de la menopausia,
fue de 49 años (39-59 años) con desviación típica 3.8.
Estado menopáusico: El grupo predominante fue de mujeres
postmenopáusicas con un 69% (tabla 8).
Tabla 8. Distribución de los casos según el estado menstrual
Estado menopausia Frecuencia Porcentaje
POSTMENOPAUSICA 74 69,2
PREMENOPAUSICA Total
33
107 30,8
100,0
Gestación y edad de presentación: El 93% de las pacientes habían tenido
algún embarazo a término antes del diagnóstico. La distribución por edad de
presentación fue;
Edad primer embarazo: La edad media de primer embarazo, fue
de 25 años (18-41años) con desviación típica 3.9.
Edad del último embarazo: La edad media del último embarazo
para el grupo casos fue de 32 años (20-42 años) con desviación típica
5.2.
Lactancia materna: El porcentaje de pacientes que dieron lactancia
materna fue de un 78% frente al 23% de los casos que no dieron lactancia
materna.
Meses de lactancia materna: La mediana de meses de lactancia materna
en el grupo casos fue de 5.76 meses (S: 5.11). Tabla 9.
Joaquina Martínez-Galán Resultados
- 113 -
Tabla 9. Distribución de los datos Epidemiológicos-biográficos de casos y controles
Casos
Controles
Media S* Media S*
Edad media 58 años (32-88)
12.4 43años (18-59) 13.5
Antecedentes Familiares
27% 19%
1er Grado 14% 6%
2º Grado 13% 14.5%
Edad Menarquia 13 años (10-17) 1.4 12 años (9-18) 1.6
Estado Menopáusico
Premenopáusicas 30.8% 72%
Postmenopáusicas 69.2% 28%
Edad Menopausia 49 años (39-59) 3.8 50 años (30-59) 5.6
Edad primer embarazo 25 años (18-41) 3.9 25 años (18-38) 4.1
Edad último embarazo 32 años (20-42) 5.2 20 años (30-44) 5.3
Lactancia materna 78% 54%
Meses lactancia materna
5.8 meses (1-36) 5.1 4.87 meses (1-24) 4.7
*S: Desviación típica.
b) Datos referentes a las características clínicas del tumor
Exponemos de forma detallada los datos referentes a las características
clínicas de los tumores de mama de las 107 pacientes incluidas en este trabajo.
Localización del tumor y cuadrante: Por localización el tumor se
presentó en el 48.6% (52 pacientes) en la mama derecha y el 51.4% (55
pacientes) en la mama izquierda.
En cuanto a la situación del tumor en la mama dividida por cuadrantes, hay un
claro predominio de los cuadrantes externos con 57 casos (53.3%) del total,
especialmente el súpero-externo con un 29% de los casos (tabla 10).
Joaquina Martínez-Galán Resultados
- 114 -
Tabla 10. Distribución de los casos según localización del tumor por cuadrante
Cuadrante Frecuencia Porcentaje
CSE 49 29,0
CSI 8 4,7
CIE 8 4,7
CII 6 3,6
OTROS 36 21,3
Total 107 100
Estadio clínico: El estadio clínico más frecuente con el que se diagnosticó
el tumor a las pacientes en nuestro estudio fue el estadio IIA (T2N0M0) de la
American Joint Committe on Cancer (AJCC) con un porcentaje del 43% (tabla 11).
Tabla 11. Distribución de los casos según Estadio Clínico
Estadios Clínicos Frecuencia Porcentaje
ESTADIO 0 15 14,0
ESTADIO I 32 29,9
ESTADIO IIA 46 43,0
ESTADIO IIB 9 8,4
ESTADIO IIIA 3 2,8
ESTADIO IIIB 2 1,9
Total 107 100
c) Datos referentes al tipo de cirugía
La técnica quirúrgica preferentemente realizada fue la tumorectomía con
margen de seguridad y linfadenectomía axilar homolateral en el 73.8%. Sólo se
realizó mastectomía radical modificada tipo Madden en el 6.5 % (tabla 12).
En cuanto al vaciamiento axilar, se realizó en el 93.5% del total, extirpándose
una media de 15 ganglios por caso (Desviación típica S, 5.8). Máximo: 39 ganglios.
Mínimo: 10 ganglios.
CSE: Cuadrante Súpero Externo; CIE: Cuadrante Infero Externo; CSI: Cuadrante
Súpero Interno; CII: Cuadrante Infero Interno; OTROS: Unión de cuadrantes
superiores, unión de cuadrantes inferiores y retroareolar.
Joaquina Martínez-Galán Resultados
- 115 -
Tabla 12. Distribución de los casos según Tipo de Cirugía
Técnica quirúrgica Frecuencia Porcentaje
CONSERVADORA 79 73,8
RADICAL 21 19,6
TUMORECTOMIA 7 6,5
Total 107 100
d) Datos referentes al resultado anatomo-patológico
En este apartado describimos las características anatomo-patológicas
encontradas tras el estudio histológico del tumor y de los ganglios aislados.
Histología: El tipo histológico de cáncer de mama más frecuente
encontrado en el estudio antomo-patológico de la muestra fue el carcinoma
ductal infiltrante con un 76.6% de los casos seguido del carcinoma lobulillar
infiltrante con un 8.4% de los casos. El resto de variedades histológicas suponían
un 14% (tabla 13).
Tabla 13. Distribución de los casos según la histología del tumor
Histología Frecuencia Porcentaje
C.DUCTAL.INFILTRANTE 82 76.6
C.LOBULILLAR INFILTRANTE 9 8,4
CA. APOCRINO INVASOR 1 0,9
CA. COLOIDE 4 3,7
FIBROHISTIOCITOMA MALIGNO 1 0,9
MIXTO 5 4,7
CA. MEDULAR 1 0,9
T.PHYLLODES MALIGNO 2 1.8
CA. METAPLASICO 1 0,9
EPIDERMOIDE 1 0,9
Total 107 100
Grado de diferenciación histológica: El grado de diferenciación GII o
moderadamente diferenciado fue el más frecuente encontrado en este trabajo.
Hubo un 11.21% de valores desconocidos (tabla 14).
Joaquina Martínez-Galán Resultados
- 116 -
Tabla 14. Distribución de los casos según
Grado de diferenciación histológica del tumor
Grado de diferenciación
Frecuencia Porcentaje
GI 20 18,7
GII 40 37,4
GIII 35 32,7
NO G 12 11,2
Total 107 100
Tamaño Tumoral: El tamaño medio más frecuente fue menor de 2 cm en el
68% de los casos en nuestra serie de casos (tabla 15).
Tabla 15. Distribución de los casos según el tamaño tumoral
Tamaño Frecuencia Porcentaje
T1 (≤ 2 cm) 62 57,9
T2 (2-5 cm) 38 35,5
T3 (> 5 cm) 3 3,5
T4 4 3,5
Total 107 100,0
Afectación Ganglionar: No hubo afectación ganglionar en la mayoría de las
pacientes de nuestra serie 63.6%. En las que sí hubo afectación ganglionar, la
mayoría fueron N1 (1-3 ganglios afectos). Tabla 16.
Tabla 16. Distribución de los casos según afectación ganglionar
Ganglios afectos Frecuencia Porcentaje
N0/ Nx 68 63,6
N1 (1-3 g) 32 29,9
N2 (≥ 4g) 7 6,5
Total 107 100
Ruptura Capsular: Se observó en el análisis anatomo-patológico del
vaciamiento axilar la presencia de ruptura capsular en el 10% de los casos (tabla
17).
Joaquina Martínez-Galán Resultados
- 117 -
Tabla 17. Distribución de los casos según la presencia de
ruptura capsular
Ruptura Capsular Frecuencia Porcentaje
NO 90 90
SI 10 10
NO DISECCION 7
Total 107 100
Trombos Tumorales Endolinfáticos: La presencia de trombos tumorales
endolinfáticos se describió en el 6% de nuestra serie (tabla 18).
Tabla 18. Distribución de los casos según la presencia de
trombos endolinfáticos
Trombos endolinfáticos Frecuencia Porcentaje
NO 94 94
SI 6 6
NO DISECCION 7
Total 107 100
Infiltración perineural: La presencia de trombos tumorales endolinfáticos
se describió en el 1% de nuestra serie (tabla 19).
Tabla 19. Distribución de los casos según la presencia de
Infiltración perineural
Infiltración perineural Frecuencia Porcentaje
NO 99 99
SI 1 1
NO DISECCION 7
Total 107 100
Estadio Patológico: El estadio patológico más frecuente tras el tratamiento
quirúrgico fue el estadio IIA (T2N0M0) de la American Joint Commite on Cancer
(AJCC) con un porcentaje del 43% (tabla 20).
Joaquina Martínez-Galán Resultados
- 118 -
Tabla 20. Distribución de los casos según Estadio Clínico
Estadios AJCC Frecuencia Porcentaje
ESTADIO 0 10 9,3
ESTADIO I 34 31,8
ESTADIO IIA 31 29,0
ESTADIO IIB 19 17,8
ESTADIO IIIA 7 6,5
ESTADIO IIIB 4 3,7
Total 105 98,1
2* 1,9
Total 107 100,0
*Fibrohistiocitoma maligno y Ca. Phyllodes.
Estado de Receptores de Estrógenos en el tumor (RE): La mayoría
fueron receptor estrogénico positivo 65.4% (tabla 21).
Tabla 21. Distribución de los casos según estado de RE
Receptor Estrogénico Frecuencia Porcentaje
RE POSITIVO 70 65,4
RE NEGATIVO 27 25,2
NO INDICADO 10 9,3
Total 107 100,0
Estado de Receptores de Progesterona en el tumor (RP): La mayoría de
las pacientes fueron receptor de progesterona positivo 55.1% (tabla 22).
Tabla 22. Distribución de los casos según estado de RP
R. Progesterona Frecuencia Porcentaje
RP POSITIVO 59 55.1
RP NEGATIVO 37 34.6
NO INDICADO 11 10,3
Total 107 100,0
Receptores hormonales en el tumor (RH): El estado del receptor
hormonal en el tumor teniendo en cuenta tanto RE como RP fue
predominantemente positivo 75% (tumores hormono-sensibles). Tabla 23.
Joaquina Martínez-Galán Resultados
- 119 -
Tabla 23. Distribución de los casos según estado de RH
R. Hormonal Frecuencia Porcentaje
NO HORMONOSENSIBLE 22 20,6
SÍ HORMONOSENSIBLE 75 70,1
NO INDICADO 10 9,3
Total 107 100,0
Estado del Cerb2: Los tumores que no sobreexpresaban Cerb2 fueron más frecuentes que los que sí lo hacían (tabla 24).
Tabla 24. Distribución de los casos según estado Cerb2
Estado Cerb2 Frecuencia Porcentaje
Cerb2 NEGATIVO 78 72,9
Cerb2 POSITIVO 19 17,8
NO INDICADO 10 9,3
Total 107 100,0
Fenotipo Molecular: De acuerdo con la clasificación molecular del cáncer
de mama el subtipo más frecuente en nuestra serie fue el fenotipo Luminal A con
un 36.4% (tabla 25).
Tabla 25. Distribución de los casos según Fenotipo Molecular
Fenotipo
Molecular Frecuencia Porcentaje
LUMINAL A 39 36.4
LUMINAL B 22 20.5
TRIPLE NEGATIVO 15 14
HER2+ 10 9.3
Desconocidos 21 19.6
Estado del P53: En nuestra serie la mayoría de los casos fueron P53
negativos (tabla 26).
Joaquina Martínez-Galán Resultados
- 120 -
Tabla 26. Distribución de los casos según estado p53
P53 Frecuencia Porcentaje
P53 NEGATIVO 51 47,7
P53 POSITIVO 44 41,1
NO INDICADO 12 11,2
Total 107 100,0
e) Datos referentes al tratamiento Adyuvante:
Quimioterapia: Se administró QT adyuvante al 63.6% de los casos (68
casos). El esquema de QT más empleado fue EC en el 23.8% de los casos seguido
de EC-Taxol en el 14.3% (tabla 27).
Tabla 27. Distribución de los casos según Esquema de QT
Esquema QT Frecuencia Porcentaje
EC 25 23.4
EC-TAXOL 15 14.0
CMF 14 13.1
FEC 10 9.3
ADM 1 9.0
CDDP+5-FU 1 9.0
NO QT 39 36.4
Sub-Total 105 98.1
Perdidos 2 1.9
Total 107 100
EC: Epirrubicina+ Ciclofosfamida; CDDP+ 5FU: Cisplatino + 5 Fluorouracilo; EC-T: Epirrubicina+
Ciclofosfamida seguido de Taxol; ADM: Adriamicina; CMF: Ciclofosfamida+ Metrotezate+ 5 Fluorouracilo;
FEC: 5 Fluorouracilo+ Epirrubicina+ Ciclofosfamida.
Radioterapia Externa (RTE): Se realizó radioterapia externa en el 90%
de los casos, siendo la irradiación exclusiva con dos campos tangenciales el
campo más realizado en un 77% de los casos. El fraccionamiento estándar de 2
Gy por sesión durante 5 días a la semana hasta completar 50 Gy de dosis total, fue
el fraccionamiento que se empleó en el 100% de los casos. De igual forma en
cuanto a la energía utilizada en los tratamientos con RTE todos ellos fueron
Joaquina Martínez-Galán Resultados
- 121 -
realizados en un Acelerador Lineal de Electrones (ALE) con una energía de 6 Mv
(tabla 28).
Tabla 28. Distribución de los casos según campos de RT realizados
Campos RT Frecuencia Porcentaje
TANGENCIALES 77 72.0
TANGENCIALES-SC 8 7,5
TANGENCIALES-SC-AP 9 8,4
NO RT 11 10,3
Sub-Total 105
Perdidos 2 1.9
Total 107 100.0
Sobreimpresión: La sobreimpresión se realizó en el 52.3% de los casos.
De ellos el 57.14% lo hicieron mediante la aplicación de braquiterapia recibiendo
una media de dosis de 16Gy (tablas 29 y 30).
Tabla 29. Distribución de los casos según Técnica de Sobreimpresión
Tipo sobreimpresión Frecuencia Porcentaje
NO SOBREIMPRESION 48 44.9
BRAQUITERAPIA 32 29.9
ELECTRONES 24 22.4
Sub-Total 104
Perdidos 3 2.8
Total 107 100.0
Tabla 30. Distribución de los casos según Dosis de Sobreimpresión
Dosis Sobreimpresión
Frecuencia Porcentaje
10 1 1,8
14 1 1,8
16 52 92,9
18 1 1,8
20 1 1,8
Total 56 100,0
Hormonoterapia (HT): Realizaron tratamiento hormonal tras finalizar el
tratamiento con QT y RT el 79% de las pacientes (83 pacientes). El esquema de
Joaquina Martínez-Galán Resultados
- 122 -
hormonoterapia más empleado fue con inhibidores de la aromatasa en un
61.77%%, seguido de antiestrógenos con un 37% (tabla 31 y 32).
Tabla 31. Distribución de los casos según tipo de Hormonoterapia
Hormonoterapia Frecuencia Porcentaje
SI 83 77.6
NO 22 20.6
Sub-Total 105
Desconocidos 2 1.9
Total 107 100.0
Tabla 32. Distribución de los casos según tipo de Hormonoterapia
Tipo de
Hormonoterapia Frecuencia Porcentaje
NO HT 22 20.6
ANATROZOL 42 39.3
TAMOXIFENO 28 26,2
LETROZOL 9 8,4
TOREMIFENO 2 1,9
GOSERELINA 1 0.9
Total 104
Perdidos 3 2.8
Total 107 100.0
f) Datos del seguimiento.
Recidiva locorregional: No hubo ningún caso de recidiva local en nuestra
serie. El 3.7% recayeron a nivel ganglionar en el área áxilo-supraclavicular (tabla
33).
Tabla 33. Distribución de los casos según Recaída locoregional
Recaída locoregional
Frecuencia Porcentaje
LOCAL 0 0
REGIONAL 4 3,7
Joaquina Martínez-Galán Resultados
- 123 -
Recaída a distancia: Un 12% de los casos recayeron a distancia en algún
momento del seguimiento. El 88% restante no presentó recaída a distancia en
nuestro estudio (tabla 34).
Tabla 34. Distribución de los casos según Recaída a distancia
Recaída a distancia
Frecuencia Porcentaje
NO 94 87,9
SI 13 12,1
Total 107 100,0
Localización de las metástasis: La mayoría de las metástasis a distancia
se presentaron a nivel óseo y hepático (tabla 35).
Tabla 35. Distribución de los casos según localización metástasis
Recaída Frecuencia Porcentaje
ÓSEAS 6 1,9
HEPÁTICAS 5 1.9
CEREBRALES 3 0.9
PULMONARES 2 0.9
MAMA CONTRALATERAL
1 0.9
Supervivencia libre de enfermedad (SLE): La supervivencia libre de
enfermedad para las pacientes de nuestro estudio fue de 51 meses de media
(Máximo: 74. Mínimo: 4.5 Desviación típica: 18.5). A los 2 años de seguimiento el
100% de los casos estaban libres de enfermedad y a los 5 años lo estaban el 87%.
Si analizamos el patrón de fallo tanto locoregional como a distancia,
diagnosticado durante dicho seguimiento la tasa de fallo fue de 12%, siendo el
tiempo mínimo de recaída de 4.5 meses y el máximo de 48 meses (4 años).
Figura 4.
Joaquina Martínez-Galán Resultados
- 124 -
Supervivencia Libre Enfermedad
Seguimiento en meses
80706050403020100
Supe
rvive
ncia
acu
mul
ada
1,021,00
,98,96,94,92,90,88,86,84,82,80,78,76,74,72,70
Función de
supervivencia
Censurado
Figura 4.- Curva de supervivencia libre de enfermedad (actuarial) para el conjunto de mujeres afectas de
cáncer de mama incluidas en este estudio.
Estado al final del estudio: Si analizamos la situación de los pacientes al
final del estudio; encontramos un porcentaje global de éxitus del 12% de los
casos. El 8.4% fue específicamente por tumor y el resto por enfermedades
intercurrentes. El 94% de los casos estaban vivas siendo el 84% de los casos
pacientes vivas libres de enfermedad y el 3.7% de pacientes vivas pero con
enfermedad (tabla 36).
Tabla 36. Distribución de los casos según Situación al final del Estudio
Situación final estudio Frecuencia Porcentaje
VIVO SIN ENFERMEDAD 90 84,1
VIVO CON ENFERMEDAD 4 3,7
EXITUS TUMOR 9 8,4
EXITUS OTRAS CAUSAS 4 3,7
TOTAL 107 100,0
Joaquina Martínez-Galán Resultados
- 125 -
Supervivencia Global (SG): La supervivencia global media fue de 52.6
meses (Mínimo: 4.5. Máximo: 74. Desviación estándar S: 17.3) con una tasa de
muertes por tumor del 12% (figura 5).
Función de Supervivencia Global
Seguimiento en meses
80706050403020100
Supe
rviv
enci
a ac
umul
ada
1,021,00,98,96,94,92,90,88,86,84,82,80,78,76,74,72,70
Función de supervivencia
Censurado
Figura 5. Supervivencia global (actuarial) para la serie de mujeres afectas de cáncer de mama incluidas en
este estudio.
Joaquina Martínez-Galán Resultados
- 126 -
4.2. METILACIÓN DE LOS PROMOTORES DE LOS GENES ESTUDIADOS EN
ESTE TRABAJO
4.2.1. Determinación del estado de metilación en el grupo control
Para realizar esta parte del trabajo experimental se han dispuesto de muestras
de sangre extraídas a 110 mujeres sin cáncer de mama. De ellas 74 muestras
pertenecían a mujeres sanas sin patología de mama benigna y 36 a mujeres sanas
con algún tipo de patología tumoral benigna de mama. Las muestras fueron
analizadas por PCR cuantitativa en Tiempo Real. Así, a partir de los valores
relativos de fluorescencia, y utilizando la correspondiente recta de calibración,
obtuvimos, para cada una de las muestras estudiadas, un valor cuantitativo cuya
cifra estaba comprendida entre 0 y 2 ng/ml de promotor metilado. Con estos
valores hemos construidos los histogramas de la figura 6.
Figura 6. Valores medios y error estándar de la media de cada uno de los biomarcadores metilados
estudiados. Los datos corresponden a los grupos de personas sin evidencia de enfermedad tumoral mamaria
alguna (Grupo Normal) y a las personas afectas de tumoraciones benignas de la mama (Grupo Patología
Benigna).
RE E-Cadh RAR- APC 14-3-3-0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
Biomarcador
Control Normal
Un
idad
es R
ela
tivas
RE E-Cad RAR- APC 14-3-3-0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35Enfermedad tumoral benigna
Biomarcador
Un
idad
es R
ela
tivas
Joaquina Martínez-Galán Resultados
- 127 -
4.2.2. Determinación del estado de metilación en el grupo de pacientes con
cáncer de mama
Los datos incluidos en la siguiente figura resumen en idéntica forma gráfica,
los valores medios y el error estándar de la media para el grupo de pacientes con
cáncer de mama en dos situaciones distintas: a) antes de la cirugía y b) al término
del tratamiento.
Figura 7. Histograma de los valores encontrados para cada uno de los biomarcadores estudiados antes y
después del tratamiento de las pacientes afectas de cáncer de mama.
4.2.3. Análisis inicial de los resultados
Con el fin de simplificar esta parte del análisis de resultados, sobre las cifras
cuantitativas obtenidas del análisis del nivel de metilación de los genes
analizados, hemos elegido un valor de corte (véase línea roja punteada en las
figuras 8 y 9, que nos
permite clasificar los
resultados como: a)
presencia en el suero del
promotor aberrantemente
metilado en cantidad
suficiente como para
poder ser definida como
positiva, es decir
patológica y b) presencia
Casos Control
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
VP FP
FN VN
Figura 8. "Distribución de los valores de la concentración sérica del promotoraberrantemente metilado del gen del RE. La línea roja muestra un umbral de decisión. Enbase a él se distinguen las fracciones: VP = verdadero positivo; FN = falso negativo; FP=falsopositivo y VN = verdadero negativo" aberrantemente metilado del gen del RE. La línea rojamuestra un umbral de decisión. En base a él se distinguen las fracciones: VP = verdaderopositivo; FN = falso negativo; FP=falso positivo y VN = verdadero negativo"
Un
idad
es R
ela
tivas
Pacientes con Cáncer
RE E-Cadh RAR- APC 14-3-3-0.0
0.1
0.2
0.3
Biomarcador
Un
idad
es R
ela
tivas
RE E-Cad RAR- APC 14-3-3-0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
Pacientes tras tratamiento
Biomarcador
Un
idad
es R
ela
tivas
a) b)
Joaquina Martínez-Galán Resultados
- 128 -
de este biomarcador por debajo del valor mínimo para ser considerado como
nivel fisiológico de metilación. En este segundo caso la muestra será clasificada
como negativa.
Para ello, se tomó como punto de corte para distinguir entre nivel de
metilación “fisiológica” y “patológica” de los promotores de los genes: Receptor de
estrógenos (RE), E-Cadherina, APC,
Rar-βeta y 14-3-3 Sigma, el límite
inferior del intervalo de confianza del
95% de la media calculado a partir
de los resultados cuantitativos
obtenidos del grupo control sano, y
diremos, que las muestras de
aquellos controles con resultados por
encima de este límite se
considerarían metilados positivos
(patológicos) y aquellos otros por
debajo del umbral elegido, se considerarían metilados negativos (fisiológicos). La
tabla 37 contiene un resumen de los parámetros estadísticos de tendencia central
para el conjunto de valores encontrados: media, desviación típica, error estándar
e intervalo de confianza del 95% en la serie de controles sanos y controles con
patología benigna.
Casos Control
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
VP FP
FN VN
Figura 9. Distribución de los valores de la concentración sérica delpromotor aberrantemente metilado del gen del 14-3-3-sigma. La línea rojamuestra un umbral de decisión. En base a él se distínguen las fracciones:VP= verdadera positiva; FN= falsa negativa; FP=falsa positiva y VN=verdadera negativa.
Un
idad
es R
ela
tivas
Joaquina Martínez-Galán Resultados
- 129 -
Tabla 37. Estadística descriptiva de los biomarcadores estudiados en los grupos control
S* : desviación típica. e *: S/n. error típico de la media
De acuerdo con los resultados obtenidos se tomó como punto de corte para
distinguir entre metilación patológica de metilación fisiológica, el límite inferior
del intervalo de confianza del 95% de la media obtenida para cada uno de los
biomarcadores estudiados del grupo de mujeres sin evidencia de enfermedad
tumoral alguna (Controles Normales). Es cierto que el umbral elegido puede ser
criticado como arbitrario, pero consideramos que, para esta parte descriptiva de
nuestro estudio, es un nivel de corte razonable. Estos puntos de corte como se
muestran en la tabla 37 fueron; APC: 0.01, E-Cadherina: 0.01, 14-3-3 Sigma: 0.04,
Rar-βeta: 0.01, RE: 0.01.
Este primer análisis responde a la pregunta: ¿Es diferente el nivel de
biomarcador encontrado en el grupo de pacientes con cáncer de mama del que
caracteriza a las mujeres sin evidencia de enfermedad tumoral alguna?; si esto es
así, ¿Con qué seguridad podemos considerar que el biomarcador discrimina entre
una persona afecta de cáncer y otra que está sana?
Las figuras 8 y 9 muestran la representación en puntos dispersos de los
valores encontrados para las medidas cuantitativas de metilación del promotor
del gen RE y del promotor del gen 14-3-3-sigma para los grupos cáncer y control
normal. En ambas figuras con una línea punteada se ha dibujado el umbral de
decisión. Mediante este umbral pretendemos distinguir la presencia y la ausencia
CONTROLES NORMALES
CONTROLES
CON PATOLOGIA BENIGNA
GENES Media S* e*
IC 95% Media S* e*
IC 95%
APC 0.028 0.056 0.007
0.015-0.04 0.047 0.145 0.024 0.002- 0.09
E-Cadh. 0.024 0.062 0.007 0.009-0.03 0.046 0.093 0.016 0.015-0.07
14-3-3 s. 0.080 0.179 0.021 0.039-0.12 0.247 0.514 0.086 0.079-0.41
Rar-β 0.047 0.164 0.019 0.009-0.08 0.023 0.059 0.010 0.003-0.04
RE 0.018 0.053 0.006 0.006-0.02 0.020 0.031 0.005 0.010-0.02
Joaquina Martínez-Galán Resultados
- 130 -
de cáncer de mama, y diremos que el marcador nos informa correctamente
cuando a valores superiores al marcado le corresponden pacientes con cáncer,
mientras que encontramos que los valores inferiores al considerado como límite
se asocian a personas sin enfermedad. Hablaremos así de Verdadero Positivo
(VP), Falso Negativo (FN), Verdadero Negativo (VN) y Falso Negativo (FN).
Nótese que la modificación del umbral de decisión, hacia arriba o hacia abajo,
cambia de manera importante el porcentaje global de aciertos y de fallos
(verdaderos y falsos resultados positivos y verdaderos y falsos resultados
negativos, del test). La tabla 37 nos permitirá definir ese primer nivel de
discriminación.
Teniendo en cuenta esos valores los resultados del nivel de metilación
cuantificado en el suero para los biomarcadores estudiados en el grupo de
personas tomadas como Controles Normales y en el grupo de mujeres con
Patología Mamaria Benigna fueron los que se resumen en la tabla 38.
Tabla 38. Distribución de Metilación en el grupo control (+/-).
CONTROL NORMAL CONTROL CON PATOLOGÍA BENIGNA
Positivos Negativos Positivos Negativos
Genes % N % n % N % N
APC 44.6 33 55.4 41 58.3 21 41.7 15
E-Cadherina 28.4 21 70.3 52 38.9 14 61.1 22
14-3-3 sigma 35.1 26 64.9 48 44.4 16 55.6 20
Rar-βeta 39.2 29 60.8 45 66.7 24 33.3 12
RE 29.7 22 70.3 52 47.2 17 52.8 19
n: número de casos. %: porcentaje de casos.
4.2.4. Determinación del estado metilación en el grupo de mujeres afectas
de cáncer de mama
Procediendo de manera análoga a lo expuesto en párrafos anteriores en este
apartado describimos los resultados obtenidos, para cada uno de los
biomarcadores epigenéticos analizados, en el grupo de mujeres afectas de cáncer
de mama. El resumen de los resultados obtenidos se ofrece en la tabla 39. En ella
Joaquina Martínez-Galán Resultados
- 131 -
que se incluyen los parámetros estadísticos habituales, Media, Desviación típica,
Error típico de la media e intervalo de confianza del 95% de la media.
Tabla 39. Estadística descriptiva metilación promotores: Casos CASOS
GENES Media S* e* IC 95%
APC 0.037 0.120 0.0116 0.014-0.059
E-Cadherina 0.061 0.273 0.0265 0.009-0.111
14-3-3 sigma 0.205 0.398 0.0386 0.129-0.280
Rar-βeta 0.046 0.202 0.0196 0.007-0.084
R. Estrógenos 0,102 0.326 0.0316 0.040-0.163
S*: desviación típica. ( e*: S/n): error típico de la media
El resultado cuantitativo del análisis se calificó como positivo (o negativo)
tomando en consideración el umbral de decisión elegido sobre el grupo de
mujeres sin evidencia de enfermedad mamaria alguna. Para ello se dispusieron
de un total de 107 muestras de sangre procedentes de mujeres con diagnóstico
de certeza de padecer cáncer. Todas las muestras fueron extraídas antes de
realizar ningún tratamiento oncológico. Los resultados obtenidos se muestran en
la tabla 40.
Tabla 40. Distribución de Metilación en el grupo casos (+/-)
Positivos Negativos
Genes Porcentaje % Frecuencias Porcentaje % Frecuencias
APC 55.1 59 44.9 48
E-Cadherina 43.0 46 57.0 61
14-3-3 sigma 59.8 64 40.2 43
Rar-βeta 38.3 41 61.7 66
R. Estrógenos 52.3 56 47.75 51
Los valores de metilación se consideraron positivos (patológicos) cuando la
cifra superó los niveles siguientes: APC: 0.01, E-Cadherina: 0.01, 14-3-3 Sigma:
0.04, Rar-βeta: 0.01, R.E: 0.01. Por el contrario, la metilación se consideró
negativa (fisiológica) cuando la cifra obtenida para una paciente concreta
quedaba por debajo de ese nivel.
Joaquina Martínez-Galán Resultados
- 132 -
Una vez definido el criterio, y asignado un estado de metilación (positivo o
negativo) para cada uno de los distintos biomarcadores epigenéticos estudiados,
es posible conocer si existen diferencias en cuanto a la presencia (y al nivel) de la
metilación que se cuantifica en las muestras de suero de las personas incluidas en
cada uno de los grupos considerados. Para ello utilizando los datos de las tablas
38 y 40, para construir simples tablas de contingencia y aplicar el test exacto de
Fisher que nos permite conocer el valor del estadístico P. Este análisis nos ha
permitido poner de manifiesto que las diferencias entre la cantidad de resultados
de metilación positiva en el grupo de mujeres con cáncer de mama y de mujeres
sin evidencia de enfermedad mamaria alguna son claramente significativas
cuando se comparan los biomarcadores: RE (P=0.0036) y 14-3-3-sigma
(P=0.0015). No encontramos diferencias significativas para el resto de
biomarcadores estudiados. Las diferencias entre casos y controles para RE y para
14-3-3-sigma pierden validez cuando en la comparación se incluyen los grupos de
casos y de controles con patología mamaria benigna las diferencias carecen de
significación estadística.
4.2.5. Estadística descriptiva general por grupo
Para alcanzar los objetivos propios del estudio se llevó a cabo un análisis
estadístico que incluyó, para cada uno de los grupos el análisis descriptivo de los
cinco biomarcadores. En la tabla 41 que sigue aparecen las medidas básicas de
resumen (número de caso, media, desviación típica y percentiles) para cada una
de las variables (biomarcadores aberrantemente metilados) objeto de nuestro
estudio, en el suero de pacientes afectas de cáncer de mama y en los grupos de
control que hemos establecido.
De los resultados que presentamos llama la atención el hecho de que hay un
gran número de valores a los que se les ha asignado el valor cuantitativo 0
(figuras 8 y 9 y tabla 41, percentiles del 25 y a veces del 50). Estos valores
cuantificados como 0 proceden de las que, tras el ensayo, resultaron
indetectables para cada uno de los biomarcadores y de los que resultaron con un
valor inferior a 0.002 ng/ml; esto lo hemos hecho así por cuanto la sensibilidad
Joaquina Martínez-Galán Resultados
- 133 -
del test de PCR específica de metilación, teniendo en cuenta la recta de
calibración, no permite cuantificar con precisión valores por debajo de esa cifra.
Por la misma razón (límite en la recta de calibración del ensayo) el valor máximo
resultante del test se ha tomado como 2 ng/ml en aquellos casos que el valor
medido superaba esta cifra. Este ajuste de datos explica también, de una manera
indirecta, la asimetría de las variables y por tanto la no normalidad de las
mismas. La tabla 41 recoge estos datos.
Tabla 41. Parámetros estadísticos resultantes del estudio de casos y controles
Grupo RE E-cad. Rar-beta APC 14-3-3 sigma
Control N Válidos 74 73 74 74 74
Perdidos 0 1 0 0 0
Media ,0189 ,0246 ,0475 ,0287 ,0806
Desv. Típ. ,05308 ,06235 ,16476 ,05653 ,17983
Mínimo ,00 ,00 ,00 ,00 ,00
Máximo ,38 ,43 1,35 ,26 1,04
Percentiles 25 ,0000 ,0000 ,0000 ,0000 ,0000
50 ,0000 ,0000 ,0000 ,0028 ,0137
75 ,0120 ,0253 ,0350 ,0382 ,0543
Casos N Válidos 105 105 105 105 106
Perdidos 2 2 2 2 1
Media ,1864 ,1820 ,1233 ,0377 ,2510
Desv. Típ. 1,01918 1,15902 ,97542 ,12064 ,70258
Mínimo ,00 ,00 ,00 ,00 ,00
Máximo 2,00 2,00 2,00 1,19 2,00
Percentiles 25 ,0000 ,0000 ,0000 ,0000 ,0000
50 ,0114 ,0000 ,0001 ,0131 ,0620
75 ,0572 ,0321 ,0291 ,0365 ,1615
Patología
Benigna
N Válidos 36 36 36 36 36
Perdidos 0 0 0 0 0
Media ,0236 ,0469 ,0236 ,0479 ,2472
Desv. Típ. ,03120 ,09332 ,05934 ,14520 ,51427
Mínimo ,00 ,00 ,00 ,00 ,00
Máximo ,13 ,46 ,33 ,87 2,00
Percentiles 25 ,0000 ,0000 ,0000 ,0000 ,0080
50 ,0023 ,0000 ,0000 ,0067 ,0696
75 ,0473 ,0720 ,0232 ,0439 ,2803
Joaquina Martínez-Galán Resultados
- 134 -
4.3. ESTUDIO DE LA RELACIÓN ENTRE LAS VARIABLES EPIGENÉTICAS
Una de las condiciones esenciales, cuando se estudia una serie de potenciales
biomarcadores de enfermedad, es que las variables cuantificadas para cada uno
de ellos sean independientes de los valores que resulten al medir los otros. Para
estudiar las correlaciones entre las variables, dentro de cada grupo, se ha
empleando el coeficiente de correlación de Spearman. La tabla 42 resume estos
resultados. Observando las correlaciones en los diferentes grupos se ve que los
biomarcadores APC y 14-3-3-sigma son los que más se correlacionan con los otros
marcadores.
Tabla 42. Correlación entre los biomarcadores ensayados y los grupos de casos y controles
Correlaciones de Spearman por grupo
Grupo RE E-Cadher. RAR-beta APC 14-3-3s.
Control
RE r 1,000 0,128 0,169 0,270 0,385
P - 0,280 0,149 0,020 0,0007
N 74 73 74 74 74
E-Cadh. r 0,128 1,000 0,121 0,177 0,128
P 0,280 - 0,309 0,133 0,282
N 73 73 73 73 73
RAR-beta r 0,169 0,121 1,000 0,329 0,286
P 0,149 0,309 - 0,004 0,013
N 74 73 74 74 74
APC r 0,270 0,177 0,329 1,000 0,527
P 0,020 0,133 0,004 - 0,000
N 74 73 74 74 74
14-3-3 s. r 0,385 0,128 0,286 0,527 1,000
P 0,000 0,282 0,013 0,000 -
N 74 73 74 74 74
Casos
RE r 1,000 0,160 0,183 0,184 0,153
P - 0,103 0,061 0,060 0,119
N 107 107 107 107 107
E-Cadh. r 0,160 1,000 0,102 0,156 0,279
P 0,103 - 0,299 0,111 0,003
Joaquina Martínez-Galán Resultados
- 135 -
Correlaciones de Spearman por grupo
Grupo RE E-Cadher. RAR-beta APC 14-3-3s.
N 107 107 107 107 107
RAR-beta r 0,183 0,102 1,000 0,413 0,140
P 0,061 0,299 - 0,000 0,153
N 107 107 107 107 107
APC r 0,184 0,156 0,413 1,000 0,315
P 0,060 0,111 0,000 - 0,001
N 107 107 107 107 107
14-3-3 s. r 0,153 0,279 0,140 0,315 1,000
P 0,119 0,003 0,153 0,001 -
N 107 107 107 107 107
Control
Patología
Tumoral
Benigna
RE
r
1,000
0,263
0,194
0,307
0,111
P - 0,120 0,257 0,068 0,519
N 36 36 36 36 36
E-Cadh. r 0,263 1,000 0,089 0,353 0,168
P 0,120 - 0,604 0,034 0,326
N 36 36 36 36 36
RAR-beta r 0,194 0,089 1,000 0,461 0,132
P 0,257 0,604 - 0,004 0,443
N 36 36 36 36 36
APC r 0,307 0,353 0,461 1,000 0,338
P 0,068 0,034 0,0046 - 0,043
N 36 36 36 36 36
14-3-3 s. r 0,111 0,168 0,132 0,338 1,000
P 0,519 0,326 0,443 0,043 -
N 36 36 36 36 36
En la tabla anterior hemos sombreados los cruces en los que, tras el estudio de
correlación, hemos encontrado la existencia de significación estadística para la
relación entre las dos variables investigadas.
Joaquina Martínez-Galán Resultados
- 136 -
Del análisis de esa tabla se deduce que los valores de concentración del
promotor del gen RE no muestran correlación con ninguno de los otros
biomarcadores, ni en el grupo de pacientes afectas de cáncer de mama (casos), ni
en el grupo de mujeres con patología tumoral benigna. También es notoria la
diferencia entre el número de veces (10 veces) que encontramos correlación
entre los resultados obtenidos para las variables cuantificadas en la serie de
mujeres sin evidencia alguna de enfermedad tumoral mamaria (Grupo Control)
frente las veces en la que esta correlación se encuentra al estudiar los resultados
de la serie de mujeres afectas de cáncer (Grupo casos: 6 veces) y la serie de
pacientes afectas de patología tumoral benigna (6 veces).
Los biomarcadores que muestran mayor tendencia a correlacionar con otros
son APC y 14-3-3-sigma. Una explicación sencilla a este hallazgo es el elevado
número de veces que el resultado cuantitativo del ensayo, para esos dos
biomarcadores epigenéticos, corresponde con el valor cero. Esto tiene como
resultado que la coincidencia, en uno y otro biomarcador, del valor 0 cuando se
estudia la relación entre dos biomarcadores, produzca un resultado estadístico
significativo aun cuando tal correlación probablemente carece de significado
biológico alguno. Por el contrario, nos parece biológicamente relevante, y
significativo, el hecho de que entre el Receptor de Estrógenos y el 14-3-3-sigma no
se encuentren indicios de relación de uno con el otro en ninguno de los tres
grupos estudiados (Tabla 41). Y siendo estos los dos biomarcadores los únicos
que el estudio estadístico elemental parecen distinguir entre pacientes con
cáncer y personas sin enfermedad, podemos sugerir que tanto el RE como el 14-3-
3-sigma pueden ser considerados como biomarcadores independientes del
cáncer de mama.
4.3.1. Contraste de la hipótesis
Nuestra hipótesis es que los niveles de un biomarcador cuantificado en el
suero de una paciente con cáncer de mama debe ser mayor que el que los que se
miden en personas con enfermedad benigna de la mama y mayor que los que
aparecen en el suero de una mujer sin evidencia alguna de enfermedad mamaria.
Joaquina Martínez-Galán Resultados
- 137 -
Con objeto de determinar las diferencias entre los tres grupos de personas que
hemos establecido en este trabajo se llevó a cabo el test de Kruskal-Wallis, en su
versión exacta y cuando fue significativo se llevaron a cabo las comparaciones
por parejas siguiendo la penalización de Bonferroni. Realizado el test exacto de
Kruskal-Wallis para cada uno de los biomarcadores, en la tabla 43 se han
recogido los datos correspondientes a la comparación entre casos y controles.
Tabla 43. Comparación de las diferencias entre los grupos de pacientes con cáncer y de mujeres sin enfermedad
Niveles de Significación exactos del test de Kruskal-Wallis
RE E- Cadher. RAR beta APC 14-3-3 sig.
Significación 0,0007 0,3686 0,7238 0,4044 0,0064
Como se ve en la tabla 43, los únicos dos marcadores que muestran diferencias
significativas cuando se comparan los resultados obtenidos para el Grupo Casos
con los encontrados en el Grupo Control, son el RE y el 14-3-3-sigma. Esto
confirma al análisis preliminar que anteriormente exponíamos.
Por otra parte, al realizar las comparaciones por parejas se obtiene que las
significaciones que se encuentra provienen de la comparación controles-casos, no
llegándose a obtener significaciones en ninguna de las dos comparaciones cuando
en el proceso de cálculo figura el grupo de mujeres afectas de patología tumoral
benigna de la mama.
Para buscar las diferencias individuales entre el grupo de enfermas y el grupo
de controles se llevó a cabo un análisis mediante el test de Mann-Whitney. Como
ya se había dicho anteriormente, hemos encontrado diferencias significativas
entre casos y controles, pero sólo en el caso de los biomarcadores RE y del 14-3-3-
sigma. De estos resultados (tabla 44) se puede sugerir que las pacientes con
cáncer de mama tienden a tener niveles de metilación patológica de RE
superiores a los que muestran las personas sin evidencia alguna de enfermedad
(Grupo Control). Lo mismo podemos decir del biomarcador 14-3-3-sigma.
Joaquina Martínez-Galán Resultados
- 138 -
Tabla 44. Comparación de medias. Aplicación Test U de Mann-Whitney en casos/ control
CASOS/ CONTROLES NORMALES CASOS/ CONTROLES
CON Patología Benigna
GENES U Mann-Whitney
P Significación
IC 95% U Mann-Whitney
P Significación
IC 95%
APC
3360,000
0.07
ns
1710,000
0.305
ns
E-Cad. 3589,000 0.315 ns 1850,000 0.741 ns
14-3-3 s. 3269,000 0.046 s 1014,500 < 0.001 s
Rar-βeta 3819,000 0.743 ns 1831,000 0.690 ns
RE 2734,500 < 0.001 s 1656,500 0.223 ns
A partir los resultados obtenidos (tabla 44) podemos decir que del conjunto de
genes analizados en nuestras series de casos y controles, dos de ellos (RE y 14-3-
3 Sigma) alcanzaron suficiente potencia estadística para discriminar entre grupo
casos y controles normales.
Las diferencias entre los grupos de pacientes con cáncer (Grupo Casos) y de
personas sin patología tumoral alguna (Grupo Normal) fueron apreciadas
también cuando se compararon los valores correspondientes a APC entre grupo
casos y controles normales pero su magnitud no alcanzó la significación
estadística (P=0.07). Tampoco se encontraron diferencias estadísticamente
significativas en los promotores de los genes Rar-βeta y E- Cadherina.
4.3.2. Análisis multivariante
Para estudiar la posible asociación entre diferentes biomarcadores y la
presencia de enfermedad e intentar fabricar una regla clasificatoria que
combinara varios de los marcadores empleados, se empleó la regresión logística
multivariante incluyendo en los modelos los diferentes marcadores. Para llevar a
cabo este análisis los resultados obtenidos se ajustaron a un modelo de regresión
logística en el que la variable dependiente era el grupo (controles/casos) y las
variables independientes eran los cinco biomarcadores.
Ajustado el modelo de regresión logística de este análisis resulta claro que tres
biomarcadores estaban muy lejos de la significación, E-Cadh., RAR-β y APC. Con
Joaquina Martínez-Galán Resultados
- 139 -
objeto de ver si esas tres variables aportaban algo de información sobre la
variable dependiente los datos de nuestro estudio se ajustaron a un modelo
utilizando sólo las variables significativas y se calculó la diferencia entre los
logaritmos de las verosimilitudes de ambos modelos (el resultante del
tratamiento de las cinco variables y el que se obtiene tras el ajuste de sólo las dos
significativas). El estudio de estas verosimilitudes nos proporciona un valor de
χ2exp=4.22, 3g.l., P=0.2385, lo que nos permite afirmar que las tres variables
categorizadas como carentes de significación no aportan información alguna
sobre la variable dependiente, y que su inclusión en el modelo tampoco añade
valor a la capacidad discriminante de los dos biomarcadores significativamente
asociados (RE y 14-3-3-sigma) y con capacidad para distinguir entre casos y
controles sin enfermedad alguna.
Desde un punto de vista teórico el modelo global resultó significativo,
P<0.001, aunque las variables consideradas individualmente (debido a su
relación) no alcanzan la significación al 5%. No obstante ambas variables resultan
informativas sobre la presencia/ausencia de enfermedad por lo que con ellas se
puede construir un discriminador lineal basándonos en las estimaciones de los
coeficientes del modelo, según propone P. Margaret [381].
Joaquina Martínez-Galán Resultados
- 140 -
4.3.3. Validación de la capacidad discriminatoria del test
Es claro que la distribución de los valores de los biomarcadores estudiados en
los grupos de casos y de control (véanse las figuras 8 y 9) han resultado, en parte,
estar solapadas. Como consecuencia el número de de predicciones correctas
sobre la presencia o la ausencia de cáncer de mama –verdaderos positivos y
verdaderos negativos- identificados utilizando uno u otro marcador son
dependientes del umbral de decisión elegido. Para hacer fácil de entender lo que
sigue hemos dibujado el esquema idealizado que se incluye en la figura 10. Si
utilizando los datos de esa figura se adopta un nivel de corte muy bajo (umbral 1)
la fracción de
diagnósticos
positivos (puntos
rojos en la
columna
correspondiente al
grupo casos, que se
sitúan sobre la
línea marcada
como Umbral 1
será muy alta, pero
también habrá un
elevado número de resultados falsos positivos (puntos verdes que se sitúan por
encima de la misma línea en la columna que corresponde al Grupo Control). Si,
por el contrario, adoptamos como nivel de decisión un valor alto los resultados
serán muy diferentes con pocos diagnósticos falsos positivos (puntos verdes
situados sobre la línea que marca el umbral 2) pero también con un descenso
muy fuerte en la fracción de diagnósticos verdaderos positivos (puntos rojos que
quedan por encima de la misma línea). Así pues, cuando las distribuciones de los
valores del biomarcador de enfermedad se solapan en los grupos de casos y
controles. La elección de un umbral de decisión que consiga la máxima eficacia
diagnóstica: Máxima probabilidad de acierto (Fracciones Verdadera Positiva y
Casos Control
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
Umbral 1
Umbral 2
Figura 10. Influencia del umbral de decisión sobrelos porcentajes de aciertos VP y VN y fallos FP y FN
Unid
ades R
ela
tivas
Joaquina Martínez-Galán Resultados
- 141 -
Verdadera Negativa máximas) unido a la Mínima probabilidad de error es un
problema clínico frecuente que se resuelve mediante la obtención de sucesivos
pares de valores verdaderos positivos (Especificidad del test) y falsos positivos (1
– Sensibilidad del test), que se representa en un eje de coordenadas cartesianas
dando lugar a un curva que se denomina Curva ROC atendiendo a las siglas que
resultan de su denominación inglesa (Reciver Operator Characteristic Curve, ROC
curve).
Este método lo hemos empleado con las variables que en este trabajo han
resultado significativas (RE y 14-3-3-sigma) y con la combinación lineal de las
mismas tomadas conjuntamente a partir de la ecuación que surge de los
coeficientes de regresión logística encontrados (tabla 43). Una vez construidas las
tres curvas ROC posibles se calculó, por la regla del trapecio, el área bajo la curva
ROC para cada uno de los biomarcadores y para el discriminador lineal resultante
de la combinación de los mismos. Con este análisis se concluyó en la calidad
discriminante de los diferentes marcadores y de una combinación de ellos.
La ecuación lineal que resulta de la combinación de ambas variables es:
21 ·5.1·5.5 XXY
Donde Y es la variable dependiente; X1 la concentración del biomarcador
basado en la determinación cuantitativa de promotor del gen del Receptor de
estrógenos aberrantemente metilado y X2 la concentración del biomarcador
basado en la determinación cuantitativa de promotor del gen de 14-3-3-sigma
aberrantemente metilado. Así cada muestra (tanto de casos como de controles)
tendrá además de los valores de cada uno de los biomarcadores un valor
resultante de su combinación. La comparación de los resultados de casos y
controles y el cálculo de los índices de sensibilidad y especificidad que resultan
para sucesivos umbrales de decisión nos ha permitido para cada una de las
variables por separado, y para el discriminante de su combinación, medir la
calidad diagnóstica final empleando el área bajo la curva ROC. Los resultados de
ese cálculo figuran en la tabla 45.
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- 142 -
Tabla 45. Área bajo la curva ROC para los dos biomarcadores y para su combinación línea
Variables contraste
Área
Error típico a)
Significación asintótica(b)
Intervalo de confianza asintótico al 95%
Límite inferior
Límite superior
RE
,655
,041
,000
,574
,735
14- 3- 3 sigma ,618 ,042 ,007 ,535 ,700
Combinación ,692 ,040 ,000 ,614 ,770
Las tres estimaciones del área bajo la curva ROC son significativamente
distintas de 0,5 (área de una curva ROC correspondiente a una variable que no
discrimina). Los valores de las áreas estimadas no son muy altos pero, aunque no
haya diferencias significativas, parece ligeramente más discriminante la que
corresponde a la variable RE que la que se obtienen utilizando la variable 14-3-3-
sigma y, desde luego, el área bajo la curva correspondiente a la combinación
lineal de ambas variables es mayor que las de las variables por separado.
Obsérvese que aún así el área bajo la curva ROC que resulta, es inferior al valor de
0,75 que se considera como el nivel mínimo necesario para que un test
diagnóstico sea calificado como bueno y por ello útil en clínica. Es así que el test
que en este trabajo hemos desarrollado para discriminar entre presencia y
ausencia de cáncer de mama en una mujer en particular, debe ser calificado como
pobre o de valor escaso. Sin duda que ampliar nuestro trabajo y encontrar otro
biomarcador que añadiera información a la ecuación combinatoria resultante
podría resolver mejor el problema de la discriminación y ayudarnos a conseguir
un mejor diagnóstico del cáncer de mama.
Los resultados obtenidos para las curvas ROC generadas se han incluido en la
figura 11. En ella se puede comprobar cómo la curva obtenida tras el cálculo del
discriminante combinado se sitúa por encima de las otras dos.
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- 143 -
4.3.4. Sensibilidad y especificidad del test diagnóstico
Una vez demostrado que existen diferencias en los valores cuantitativos de los
biomarcadores: RE y 14-3-3-sigma, que están determinadas por la presencia, o la
ausencia, de enfermedad tumoral maligna, nos queda cuantificar cual es la valía
clínica del test diagnóstico que en este trabajo hemos aplicado sobre una amplia
serie de mujeres con cáncer de mama y de mujeres elegidas como control.
En efecto, los datos de concentración sérica de los biomarcadores estudiados
en este trabajo nos permiten calcular la especificidad y la sensibilidad del test. Y
la sensibilidad (S) y la especificidad (E) son los parámetros clínicamente
relevantes. Pero en este cálculo, la elección del umbral de decisión, para definir
como positivo o negativo el resultado, adquiere una importancia fundamental
puesto que a cada umbral de decisión se asocian valores de S y E. Por ello la
elección del mejor umbral debe hacerse atendiendo a criterios científicos. Para
Figura 11. Curva ROC.
Joaquina Martínez-Galán Resultados
- 144 -
ello es también posible acudir al análisis de las curvas ROC. Con este análisis se
determinó para los genes RE y 14-3-3-sigma el punto de corte que optimizaba los
valores de E y S atendiendo al parámetro de Likelihood Ratio.
Los datos de nuestro trabajo nos han permitido concluir que el valor de corte y
los índices de S y E, para el biomarcador RE, son:
Umbral de decisión = 0.02 Unidades Relativas (ng/ml de ADN patrón)
S = 82,4, 95% IC (71.8% - 90.3%)
E = 41,9, (95% IC 32.4% - 51.9%; likelihood ratio = 1,4
(las cifras se han redondeado a un decimal);
Para el biomarcador 14-3-3-sigma los mejores valores fueron:
Umbral de decisión = 0.05 Unidades Relativas (ng/ml de ADN patrón)
S = 75.7 (95% IC 64.3% - 84.9%)
E = 54.7 (95% IC 44.7% - 64.4%; likelihood ratio = 1.6
El objetivo ideal de este trabajo era conseguir un procedimiento diagnóstico
que permitiese identificar con certeza a las mujeres afectas de cáncer de mama y
que, al mismo tiempo, informase de la ausencia de enfermedad en las mujeres en
las que clínicamente la situación de salud era un hecho objetivo. De nuestros
resultados se desprende que los valores de Sensibilidad y Especificidad obtenidos
no responden a las exigencias que debe respetar un test diagnóstico aplicado a la
oncología clínica. En efecto, aun cuando tolerable la cifra correspondiente a la
fracción de diagnósticos en los que en presencia de la enfermedad, el test informa
positivamente este hecho (sensibilidad), el método de cuantificar la metilación
aberrante en los promotores de los genes RE y 14-3-3-sigma fracasa en identificar
como libres de enfermedad a una importante proporción de las personas que
hemos incluidos el grupo como controles (especificidad). Podemos por ello
ambos biomarcadores pueden definirse como aceptablemente sensibles pero, al
ser altamente inespecíficos, su utilidad en clínica es limitada.
Otra forma de abordar el problema es considerar que el diagnóstico de
presencia de enfermedad debe hacerse cuando uno, otro, o los dos
Joaquina Martínez-Galán Resultados
- 145 -
biomarcadores se encuentren elevados, mientras que la ausencia de enfermedad
debe considerarse cuando ambos biomarcadores se den resultados que
cuantitativamente se encuentren por debajo del punto de corte elegido.
Procediendo así hemos construido la tabla 46 en la que se resumen los datos
relevantes de este cálculo.
Tabla 46. Valores de Sensibilidad y Especificidad del test para el diagnóstico de cáncer de mama
usando RE y 14-3-3-sigma como biomarcadores
RE ó 14-3-3 Sigma
Cáncer mama
Controles Sanos
RE ó 14-3-3 Sigma
Cáncer mama
Controles Sanos
Enfermedad (+) +/- -/+ +/+
87a
33a
Enfermedad (+) +/+
39b
9b
Enfermedad (-) -/-
20a
41a
Enfermedad (-) +/- -/+ -/-
67b
65b
P < 0.0001
P = 0.0003
Sensibilidad = 81% (95% IC: 72-88) Sensibilidad = 37% (95% IC: 73-47)
Especificidad = 55% (95% IC: 40-67) Likelihood ratio = 1.82
Especificidad = 88% (95% IC: 78-94) Likelihood ratio = 3.03
De acuerdo con lo anterior hemos supuesto dos situaciones:
Situación 1: (zona izquierda de la tabla 46): El diagnóstico de enfermedad
tumoral presente (+) se hará cuando uno de los marcadores, u otro, o los dos
resultasen superiores a los umbrales elegidos (+/-, -/+, +/+) mientras que el
diagnóstico de enfermedad ausente se haría sólo cuando ambos biomarcadores
estuviesen por debajo del valor umbral (-/-). Del recuento de casos y controles
resulta la tabla de contingencia cuyos números están marcados por el subíndice
“a” y que hace máximo el valor de Sensibilidad diagnóstica. Esto es casi todos los
casos con enfermedad maligna de la mama serán correctamente diagnosticados
(S=88%) aun cuando una importante proporción de mujeres sin enfermedad
serán incorrectamente clasificadas como portadoras de cáncer de mama
(porcentaje de resultados falsos positivos FP = 100 – E = 45%).
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- 146 -
Situación 2 (zona derecha de la tabla 46): Se hará el diagnóstico de
enfermedad tumoral presente sólo cuando ambos biomarcadores sean positivos
(+/+). Por el contrario se asignará el diagnóstico de ausencia de enfermedad
cuando uno, u otro o ambos biomarcadores sean negativos (+/-, -/+, -/-).
Procediendo así los números que definen la nueva tabla de contingencia están
incluidos en las cuadrículas del lado derecho de la Tabla 45 y han sido destacados
con el subíndice “b”. Esta nueva decisión diagnóstica permite llevar la
Especificidad a un nivel aceptable E= 88%. Esto equivale a decir que casi todas
las mujeres sin enfermedad serán correctamente diagnosticadas pero ese
incremento se produce a costa de fallar en el diagnóstico en un porcentaje muy
elevado de casos de cáncer (porcentaje de diagnósticos falsos negativos FN = 100
– Sensibilidad = 73%).
Añadamos al análisis anterior una condición importante que resulta de la
simple observación clínica: Para que un test de diagnóstico en cáncer sea eficaz,
el valor del biomarcador en el grupo de personas afectas de cáncer debe ser
superior al que se cuantifica en personas sin enfermedad y, además, en el caso de
que existan enfermedades tumorales benignas que afecten al mismo órgano, un
marcador tumoral ideal, debe distinguir también entre la presencia y la ausencia
de éstas, y los niveles que se cuantifiquen cuando existen tumores benignos
deberían permitir la diferenciación entre esta enfermedad tumoral y el cáncer. La
condición anterior es especialmente importante en la mama por cuanto que,
además de enfermedades tumorales malignas, la mama es asiento de frecuentes
patologías de carácter benigno. Para estudiar esta posibilidad hemos incluido en
nuestro trabajo un grupo de 36 mujeres afectas de tumoraciones mamarias de
carácter benigno en el que se han cuantificado los mismos biomarcadores que en
el grupo casos y en el grupo control. Los datos referentes a la posibilidad de
distinguir entre personas con enfermedades benignas y personas sin evidencia de
enfermedad tumoral mamaria alguna se han resumido en la tabla 47 y su lectura
e interpretación añade más dudas a la aplicabilidad de estos biomarcadores para
el diagnóstico del cáncer de mama.
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Tabla 47. Valores de Sensibilidad y Especificidad del test cuando se compara el Grupo casos con
enfermedad tumoral benigna de la mama con el Grupo control
RE ó 14-3-3 Sigma
Patología Benigna mama
Controles Sanos
RE ó 14-3-3 Sigma
Patología Benigna mama
Controles Sanos
Enfermedad (+) +/- -/+ +/+
24
33
Enfermedad (+) +/+
9
9
Enfermedad (-) -/-
10
41
Enfermedad (-) +/- -/+ -/-
25
65
P < 0.0136 P = 0.09
Sensibilidad = 70% (95% CI: 53–85) No significación estadística
Especificidad = 55% (95% CI: 43–67)
4.4. CORRELACIÓN DEL PERFIL METILACIÓN DE ESR1 EN SUERO CON EL
SILENCIAMIENTO EXPRESIÓN DE RE EN TUMOR
De acuerdo a lo ya comentado en capítulos anteriores, la metilación
epigenética de la región promotora de un determinado gen, da lugar a la ausencia
transcripcional de este y por tanto a la falta de expresión proteica derivado de
ello o lo que es lo mismo su silenciamiento génico. Este hecho que podemos
conocer a través del análisis por PCR del ADN extraído a partir de muestras de
los pacientes, tiene una repercusión directa en la pieza tumoral. Es decir,
aquellas pacientes que tuviesen metilado el gen RE y por lo tanto este no se
expresara es decir estuviese silenciado, esto debería correlacionarse con la
ausencia de expresión de receptores estrogénicos en tumor lo que desde el punto
de vista terapéutico es importante conocer para aproximarnos desde una prueba
analítica a un futuro tratamiento hormonal en caso de estar presente en tumor
así como factor predictivo de respuesta.
Para conocer si en nuestra serie de casos se cumplen o no las hipótesis
anteriormente expuestas, se realizaron las siguientes pruebas estadísticas
mediante el test no paramétrico para dos muestras relacionadas de Wilconxon:
Joaquina Martínez-Galán Resultados
- 148 -
1. Se estudió la correlación de RE no metilado en suero con RE (+) en tumor
obteniendo el correspondiente valor para el estadístico de Z del test Wilconxon
junto con grado de significación P. De los resultados obtenidos para el estadístico
Z (-5.891) y valor P < 0.001, se puede deducir que existe correlación en la
hipótesis planteada y que esta es significativa. Por lo tanto en nuestra serie de
casos el tener el promotor de RE no metilado en suero se correlacionaba con la
presencia de RE positivo en tumor. No se obtuvo correlación entre RE no
metilado en suero y RE (+) en tumor como era de esperar de acuerdo a lo ya
explicado anteriormente (tabla 48).
2. Igualmente se analizó si existía correlación entre RE metilado en suero y
RE (-) en tumor de nuestra serie de casos. Tras aplicar el test de Wilconxon para
muestras apareadas se obtuvieron los valores de P < 0.03 y Z -3.873 que
apoyaban esta relación de forma significativa. Tampoco en este caso se observó
correlación entre RE metilado en suero y RE (-) en tumor como igualmente era de
esperar (tabla 48).
Tabla 48. Frecuencia de casos RE
Receptor Estrógenos
Metilado Suero
No Metilado Suero
RE (-) Tumor 15 12
RE (+) Tumor 37 33
RE No Metilado Suero
Nº
Casos Z P
RE (+) Tumor
33 -5.891 < 0.001
RE Metilado Suero
Nº
Casos Z P
RE(-) Tumor
15 -3.873 < 0.003
RE Metilado Suero
Nº
Casos Z P
RE (+) Tumor
37 0 1
RE No Metilado Suero
Nº
Casos Z P
RE (-) Tumor
12 0 1
Joaquina Martínez-Galán Resultados
- 149 -
Así mismo en este trabajo de investigación y partiendo del mecanismo de
silenciamiento de la expresión génica mediante metilación del promotor de ESR1,
quisimos correlacionar su silenciamiento epigenético de acuerdo al fenotipo
luminal y a partir de ella poder extraer conclusiones de la implicación y papel
predominante que tiene la metilación en dicho silenciamiento génico en el tumor.
Para ello aplicamos el test no paramétrico para dos muestras relacionadas de
Wilconxon.
De los resultados obtenidos, observamos un mayor porcentaje de metilación
del promotor de RE en aquellos fenotipos de peor pronóstico concretamente el
80% de las pacientes triple negativas y 60% de las pacientes HER2 frente al 28%
y al 5.9% de las pacientes con fenotipos de mejor pronóstico como Luminal A y
Luminal B respectivamente con p < 0.05 (tabla 49).
Tabla 49. Porcentaje de metilación RE de acuerdo con el fenotipo luminal
RE LUMINAL
A LUMINAL
B TRIPLE
NEGATIVO HER2(+) P
NO METILADO 28
(71%)
14
(64%)
3
(20%)
4
(40%)
<< 00..0055
METILADO 11
(28%)
8
(36%)
12
(80%)
6
(60%)
<< 00..0055
A partir de estos datos analizamos si dentro de cada fenotipo luminal podrían
existir subgrupos de pacientes de acuerdo con el perfil de metilación que pudiera
explicar en parte por qué en algunos casos a pesar de pertenecer a un fenotipo de
buen pronóstico acaban desarrollando metástasis a distancia. Observamos que
dentro de cada subgrupo de acuerdo al estado de metilación de RE en suero,
existía una tendencia a presentar menor supervivencia a 4.5 años de seguimiento
en cada fenotipo cuando RE estaba metilado frente a cuando estaba no metilado,
aunque estas diferencias no fueron significativas (tabla 50).
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- 150 -
Tabla 50. Diferencias de presentación de metilación aberrante RE por subgrupos dentro del fenotipo luminal
FENOTIPO Nº SG 4.5 años P
RE NO
METILADO luminal A 28 93% >0.05
luminal B 14 92% >0.05
Triple Negativo 3 80% >0.05
Her2 4 75% >0.05
RE
METILADO luminal A 11 81,8% >0.05
luminal B 8 86% >0.05
Triple Negativo 12 75% >0.05
Her2 6 66,7% >0.05
A la vista de estos resultados en nuestra serie de casos probablemente la
metilación deba ser considerada como un factor pronóstico más que considerar
en la práctica clínica diaria si bien son necesarios más estudios prospectivos para
validar esta hipótesis.
4.5. VARIACIÓN DEL PERFIL DE METILACIÓN PRE Y POST-TRATAMIENTO
En este apartado del trabajo de investigación realizado, analizamos si existían
diferencias entre los resultados analíticos obtenidos por PCR cuantitativa de los 5
genes estudiados antes y después del tratamiento. Con este cálculo se pretendía
responder a la hipótesis de si conforme la paciente se fuese sometiendo a
distintos tratamientos oncológicos, esto repercutiría en una menor cuantificación
proteica derivada de cada uno de los genes por PCR cuantitativa como signo de la
menor presencia de ADN procedente de células tumorales y por lo tanto
indirectamente relacionarse con una evolución favorable o viceversa. Para ello
aplicamos el test no paramétrico para pruebas apareadas de Wilconxon con el
que no se observaron diferencias estadísticamente significativas.
Joaquina Martínez-Galán Resultados
- 151 -
No obstante al calcular el estudio descriptivo para comparar las distintas
medianas de cada gen antes y después de administrados los diferentes
tratamientos así como el percentil 75 mediante el empleo de un diagrama de
cajas y vigotes, se observó en todos los genes una menor cuantificación proteica
al analizar las muestras post-tratamiento respecto a las muestras pre-tratamiento
aunque de escasa magnitud. Probablemente una tendencia más marcada del
descenso de estos biomarcadores en muestras sanguíneas podría haberse
obtenido si dicha determinación hubiese sido realizada transcurridos varios
meses de finalizado el tratamiento (tabla 50 y representación gráfica figura 12).
Tabla 50. Perfil de metilación Pre y Pos-tratamiento
Pre-tratamiento
M S ẋ P 75% IC 95%
APC 0,012 0,040 0,026 0,036 0,03-0.01
E-Cad 0,000 0,045 0,024 0,030 0,03-0,01
14-3-3 0,047 0,108 0,082 0,119 0,10-0,05
Rar-β 0,0001 0,051 0,023 0,027 0,03-0,01
R. E. 0,009 0,049 0,031 0,044 0,02-0,04
Post-tratamiento
M S ẋ P 75% IC 95%
APC 0,001 0,082 0,025 0,020 0.04-0.003
E-Cad 0.000 0,048 0,019 0,015 0,03-0.006
14-3-3 0,038 0,096 0,075 0,125 0.10-0.048
Rar-β 0.000 0,038 0,017 0,023 0.02-0.007
R. E. 0,003 0,062 0,031 0,027 0,04-0,014
ẋ*: media. M: mediana
Joaquina Martínez-Galán Resultados
- 152 -
Figura 12. Representación niveles de metilación de los genes pre y postratamiento.
Joaquina Martínez-Galán Resultados
- 153 -
4.6. ESTUDIO DE LA CORRELACIÓN DE LAS VARIABLES CLÍNICO-
PATOLÓGICAS CON EL PERFIL DE METILACIÓN DE LOS GENES RE, 14-3-3
SIGMA, E-CADHERINA, APC Y RAR- BETA
En este apartado hemos realizado un análisis descriptivo de las variables
clínico-patológicas del tumor con el perfil epigenético de los promotores de los 5
genes analizados para conocer sus frecuencias de presentación y estudiar si
existe o no relación estadísticamente significativa entre ellas. Para ello se realizó
aplicó el test estadístico de Chi-cuadrado con la corrección de Yates.
De los resultados obtenidos se observó que se obtuvieron niveles más
elevados de metilación aberrante para el gen 14-3-3 sigma en aquellas pacientes
que tenían mayor afectación ganglionar y mayor tamaño del tumor con resultado
estadísticamente significativo. Para el resto de variables clínico-patológicas no se
observó relación estadísticamente significativa (tabla 51).
Tabla 51. PROMOTORES GENES METILADOS
RE APC E-Cad. RAR-β 14-3-3 SIGMA
Factores Clínico Patol.
+ - + - + - + - + -
Edad Diagnóstico
≤ 35 años > 35 años
P
54 2
49 2 0.67
3
56
1 47 0.76
3 43
1 60 0.42
1 40
3 63 0.97
2 62
2 41 0.911
Edad Menarquia
< 12 años ≥13 años
P
29 26
24 27 0.69
33 26
20 27 0.27
24 21
29 32 0.69
22 19
31 34 0.69
33 30
20 23 0.629
Edad Menopausia
< 45 años ≥ 45 años
P
35 1
37 2 0.94
36 1
36 2 0.98
30 3
42 0 0.16
26 1
46 2 0.60
39 2
33 1 0.868
Estado Menopáusico
Premenop. Postmenop.
P
21 35
12 39 0.17
23 36
10 38 0.07
14 32
19 42 0.89
15 26
18 48 0.42
24 40
9 34 0.108
Grado diferenciación
GI GII- III
P
11 40
10 34 0.91
11 42
10 32 0.91
10 31
11 43 0.82
9 26
12 48 0.69
13 43
8 31 0.951
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Joaquina Martínez-Galán Resultados
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PROMOTORES GENES METILADOS
RE APC E- Cadher. RAR-β 14-3-3 SIGMA
Factores Clínicopat. + - + - + - + - + -
Estadio Tumor
T1 T2
T3-4 P
30 22 4
32 16 3 0.63
37 20 2
25 18 5 0.27
24 19 3
38 19 4 0.36
27 12 2
35 26 5 0.42
26 7 2
36 31 5 <0.05
Estadio Ganglionar
N0 N1 N2 P
36 17 3
32 15 4 0.87
40 16 3
28 16 4 0.56
32 12 2
36 20 5 0.49
28 10 3
40 22 4 0.61
47 14 4
21 18 3 <0.05
Metástasis M0 M1 P
51 5
43 8 0.43
52 7
42 6 0.84
38 8
56 5 0.25
37 4
57 9 0.76
56 8
38 5 0.867
Cerb2 + - P
12 41
7 37 0.56
11 43
8 35 0.96
7 36
12 42 0.63
10 26
9 52 0.19
13 43
6 34 0.461
P53 + - P
23 28
21 23 0.96
23 29
21 22 0.80
21 21
23 30 0.66
15 18
29 33 0.92
29 25
15 26 0.147
QT Si No P
40 16
28 23 0.11
41 18
27 21 0.22
32 14
36 25 0.09
26 15
42 24 0.85
41 23
27 16 0.943
RT Si No P
47 9
49 2 0.08
54 5
42 6 0.71
41 5
55 6 0.88
37 4
59 7 0.85
56 8
40 3 0.550
HT Si No P
45 10
38 12 0.62
46 13
37 9 0.94
35 11
48 11 0.67
32 8
51 14 0.95
48 16
35 6 0.304
Joaquina Martínez-Galán Resultados
- 155 -
4.7. ANÁLISIS DE SUPERVIVENCIA
4.7.1. Análisis univariante de los factores pronósticos clínico-patológicos
relacionados con la supervivencia libre de enfermedad
Los datos a 6 años resultantes de la estimación de supervivencia libre de
enfermedad (SLE), en relación con los distintos factores pronósticos en el cáncer
de mama conocidos hasta hoy día tales como; edad <35 años, estado de
menopausia, tamaño tumoral, afectación ganglionar, grado de diferenciación
histológica, receptores hormonales, p53, estado del Cerb2 y triple negativas se
presentan a continuación.
En todos los casos se ha aplicado el procedimiento de cálculo de supervivencia
actuarial mediante el método de Kaplan-Meier así como el test de log-rank para
valorar si las diferencias encontradas entre las curvas de supervivencia poseen o
carecen de significación estadística.
Edad: La SLE a 6 años fue del 50% en el grupo de pacientes menores a 35
años y del 87.80% para las mayores de 35 años. Estas diferencias observadas
fueron significativas. (p= 0.03). Figura 13.
Joaquina Martínez-Galán Resultados
- 156 -
Supervivencia libre de enfermedad
SLE meses
8070
6050
4030
2010
0
Supe
rviv
enci
a ac
umul
ada
1,1
1,0
,9
,8
,7
,6
,5
,4
EDAD MENOR 35 AÑOS
edad < 35 años
edad < 35 años -censurado
edad > 35 años
edad > 35 años
-censurado
Edad de la menarquía: La SLE a 6 años fue del 89.20% en el grupo de
pacientes con edad de la menarquía mayor o igual a 12 años y del 82.63% para
las pacientes con edad de la menarquía menor a 12 años. Estas diferencias
observadas no fueron significativas (p= 0.3504).
Estado de la menopausia: La SLE a 6 años en las pacientes
premenopáusicas fue del 83.78% y del 87.18% en las pacientes
postmenopáusicas. Estos resultados fueron estadísticamente no significativos (p=
0.6877).
Tipo histológico: Con resultados de supervivencia a 6 años se encontró
que la SLE para los carcinoma ductales infiltrantes fue del 84.69%, para los
lobulillares infiltrantes del 88.89% y del 88.21% para el resto de histologías. Las
diferencias observadas no fueron significativas (p= 0.7468).
Figura 13. SLE en función de la edad.
Joaquina Martínez-Galán Resultados
- 157 -
Grado de diferenciación histológica: La SLE a los 6 años en las pacientes
con buen grado de diferenciación histológico fue del 94.74 y 83.50 para aquellas
con grado de diferenciación moderado o mal diferenciado. Los tumores en los que
no se determinó el grado histológico se analizaron como una categoría
independiente obteniendo una SLE del 75%. Las diferencias observadas no
fueron estadísticamente significativas (p=0.4137).
Tamaño tumoral: La SLE a 6 años para las pacientes con tumores ≤ 2 cm
(T1) fue del 89.16%, para tumores entre 2 y 4 cm (T2) del 81.86% y para
tumores ≥ 5 cm (T3) o con infiltración en dermis (T4) fue del 80%. Las
diferencias encontradas no fueron estadísticamente significativas (p= 0.6751).
Afectación ganglionar: Respecto al número de ganglios afectos, los
resultados de SLE a los 6 años fueron del 92.50% en el grupo sin afectación
ganglionar, del 79.34% en el grupo de pacientes que presentaron de 1-3 ganglios
afectos y del 50% para las pacientes que tenían 4 o más ganglios afectos. Dichas
diferencias fueron estadísticamente significativas (p= 0.0008). Figura 11.
Supervivencia libre de enfermedad
SLE meses
80706050403020100
Supe
rvive
ncia
acum
ulada
1,2
1,0
,8
,6
,4
,2
Estadio ganglionar
N2
N2-censurado
N1
N1-censurado
N0/Nx
N0/Nx-censurado
Figura 14. SLE en función de afectación ganglionar.
Joaquina Martínez-Galán Resultados
- 158 -
Estado del receptor hormonal: La SLE a 6 años para pacientes que
expresaban receptores hormonales (RH) en el tumor fue del 88.75%, mientras
que aquellas que presentaban receptores hormonales negativos fue del 77.01%.
El grupo de pacientes con RH desconocidos fue analizado de forma independiente
obteniéndose una SLE del 85.71%. Dichas diferencias no fueron estadísticamente
significativas (p=0.2777).
Estado del Cerb2: Las pacientes Cerb2 negativo tuvieron un ILE a 6 años
del 86.88% mientras que en aquellas pacientes con Cerb2 positivo fue del 89.47%
sin alcanzar significación estadística (p= 0.8565).
Estado del p53: La SLE a 6 años para pacientes con P53 positivo en el
tumor fue del 73.99%, mientras que aquellas que presentaban P53 negativo fue
del 95.61%. El grupo de pacientes con P53 desconocido fue analizado de forma
independiente obteniéndose una SLE del 88.89%. Las diferencias encontradas
fueron estadísticamente significativas (p=0.0145). Figura 15.
Supervivencia Libre Enfermedad
SLE meses
8070
6050
4030
2010
0
Supe
rvive
ncia
acum
ulada
1,1
1,0
,9
,8
,7
P53 POSITIVO/NEGATIV
NO INDICADO
NO INDICADO-censurad
o
P53 POSITIVO
P53 POSITIVO
-censurado
P53 NEGATIVO
P53 NEGATIVO
-censurado
Figura 15.SLE en función de expresión de p53.
Joaquina Martínez-Galán Resultados
- 159 -
Triple negativo: La SLE a 6 años para pacientes no triple negativas fue del
89.74%, mientras que aquellas que no fueron triple negativas fue del 65%. Las
diferencias fueron estadísticamente significativas p= 0.0009 (figura 13).
Supervivencia Libre de Enfermedad
SLE meses
80706050403020100
Supe
rvive
ncia
acum
ulada
1,1
1,0
,9
,8
,7
,6
TRIPLE NEGATIVAS
si
si-censurado
no
no-censurado
QT Adyuvante: Respecto a la SLE a 6 años para las pacientes que
recibieron QT fue del 80.17% frente al 96.55% para aquellas pacientes que no
recibieron QT. Estas diferencias fueron estadísticamente significativas p= 0.029.
Este resultado casa con ser mujeres con factores de mal pronóstico las que
reciben QT y no aquellas con factores de buen pronóstico (figura 14).
Figura 13.SLE en función de fenotipo luminal
Joaquina Martínez-Galán Resultados
- 160 -
Supervivencia Libre de Enfermedad
SLE meses
80706050403020100
Supe
rvive
ncia
acum
ulada
1,1
1,0
,9
,8
,7
QT
SI
SI-censurado
NO
NO-censurado
RT Adyuvante: En cuanto a SLE a 6 años y haber o no recibido RT, fue de
un 90.91% para aquellas pacientes que realizaron RT y de un 85.55 para las que
no recibieron RT. Las diferencias no fueron significativas p= 0.8425.
HT Adyuvante: Respecto a la SLE a 6 años para las pacientes que
recibieron HT fue del 90.13% frente al 71.08% para aquellas pacientes que no
recibieron HT. Estas diferencias fueron estadísticamente significativas p= 0.020
(figura 15).
Figura 14. SLE en función de administración de QT.
Joaquina Martínez-Galán Resultados
- 161 -
Supervivencia Libre de Enfermedad
SLE meses
8070605040302010
Supe
rvive
ncia
acum
ulada
1,1
1,0
,9
,8
,7
HORMONOTERAPIA
SI
SI-censurado
NO
NO-censurado
De los resultados obtenidos en nuestra serie, podemos decir que con una SLE
media de 51 meses, el grupo de pacientes que presentó menor intervalo de
tiempo a la recaída fueron aquellas pacientes con edad de presentación del tumor
menor a 35 años, edad de la menarquia menor a 12 años, con tumores con
estadio T3-T4 con grado de diferenciación histológica GII-III e
inmunohistoquímica triple negativas, con afectación ganglionar y P53 positivo.
De todos estos factores clínico patológicos se alcanzó la significación estadística
en el caso de edad menor a 35 años, afectación ganglionar, triple negativas y P53
positivas.
4.7.2. Análisis univariante de los niveles de metilación de los genes RE y
14-3-3-sigma en relación con la supervivencia libre de enfermedad
Del estudio estadístico respecto a la SLE y al perfil de metilación aberrante
para los promotores de los genes RE y 14-3-3 Sigma, no se observaron diferencias
estadísticamente significativas respecto a la supervivencia libre de enfermedad
Figura 15.SLE en función de administración de HT.
Joaquina Martínez-Galán Resultados
- 162 -
aunque sí una leve tendencia a menor SLE en aquellos donde estaban metilados
sin alcanzar significación estadística.
Receptor Estrogénico metilado positivo/ negativo: La SLE a 6 años
para pacientes con Receptor de estrógenos (RE) metilado positivo en suero de las
pacientes fue del 86%, mientras que aquellas que presentaban RE no metilado fue
del 87%. Las diferencias encontradas no fueron estadísticamente significativas
(p=0.9565).
14-3-3 Sigma metilado positivo/ negativo: Respecto a la SLE a 6 años
para 14-3-3 Sigma metilado positivo en suero fue del 89.80% y para aquellas con
14-3-3 Sigma metilado negativo fue de un 83.71%. Las diferencias tampoco
fueron significativas p= 0.4371.
4.7.3. Análisis univariante de los factores pronósticos clínico-patológicos
relacionados con la supervivencia global de cáncer de mama
Al igual que se realizó el estudio de supervivencia libre de enfermedad de
acuerdo con los distintos factores clínico-patológicos del cáncer de mama
utilizados en clínica, también se analizaron los datos a 6 años resultantes de la
estimación de supervivencia global (SG). Los resultados se presentan a
continuación.
En todos los casos se ha aplicado el procedimiento de cálculo de supervivencia
actuarial mediante el método de Kaplan-Meier así como el test de log-rank para
valorar si las diferencias encontradas entre las curvas de supervivencia poseen o
carecen de significación estadística.
Edad: La SG a 5 años fue del 86.76% en el grupo de pacientes mayores a
35 años y del 75% para las pacientes menores de 35 años. Estas diferencias
observadas no fueron significativas (p= 0.5129).
Joaquina Martínez-Galán Resultados
- 163 -
Edad de la menarquía: La SG a 5 años fue del 91.30% en el grupo de
pacientes con edad de la menarquía mayor o igual a 12 años y del 83% para las
pacientes con edad de la menarquía menor a 12 años. Estas diferencias
observadas no fueron significativas (p= 0.2371).
Estado de la menopausia: La SG a 6 años en las pacientes
premenopaúsicas fue del 93.74% y del 82.90% en las pacientes
postmenopáusicas. Estos resultados fueron estadísticamente no significativos (p=
0.1836).
Tipo histológico: Con resultados de supervivencia a 6 años se encontró
que la SG para los carcinoma ductales infiltrantes fue del 86.91%, para los
lobulillares infiltrantes del 77.78% y del 87.69% para el resto de histologías. Las
diferencias observadas no fueron significativas (p=0.6700).
Grado de diferenciación histológica: La SG a los 6 años en las pacientes
con grado de diferenciación histológico bueno fue del 100% y del 83.12% para
aquellas con grado de diferenciación moderado o mal diferenciado. Los tumores
en los que no se determinó el grado histológico se analizaron como una categoría
independiente obteniendo una SG del 83.33%. Las diferencias observadas no
fueron estadísticamente significativas (p=0.1564).
Tamaño tumoral: La SG a 6 años para las pacientes con tumores ≤ 2 cm
(T1) fue del 91.71%, para tumores entre 2 y 4 cm (T2) del 86.51% y para
tumores ≥ 5 cm (T3) o con infiltración en dermis (T4) fue del 42.86%. Las
diferencias encontradas fueron estadísticamente significativas (p= 0.0002).
Figura 16.
Joaquina Martínez-Galán Resultados
- 164 -
Supervivencia Global
SG MESES
80706050403020100
Supe
rvive
ncia
acu
mul
ada
1,1
1,0
,9
,8
,7
,6
,5
,4
Estadio T
T3-T4
T3-T4-censurado
T2
T2-censurado
Tx-T1
Tx-T1-censurado
Afectación ganglionar: Respecto al número de ganglios afectos, los
resultados de SG a los 6 años fueron del 95.57% en el grupo sin afectación
ganglionar, del 83.25% en el grupo de pacientes que presentaron de 1-3 ganglios
afectos y del 19% para las pacientes que tenían 4 ó más ganglios afectos. Dichas
diferencias fueron estadísticamente significativas (p=0.001). Figura 17.
Figura 16. SG en función de estadio T.
Joaquina Martínez-Galán Resultados
- 165 -
Supervivencia Global
SG MESES
80706050403020100
Supe
rvive
ncia
acu
mul
ada
1,2
1,0
,8
,6
,4
,2
0,0
Estadio Ganglionar
N2
N2-censurado
N1
N1-censurado
N0/Nx
N0/Nx-censurado
Estado del receptor hormonal: La SG a 6 años para pacientes que
expresaban receptores hormonales (RH) en el tumor fue del 87.27%, mientras
que aquellas que presentaban receptores hormonales negativos fue del 81.06%.
El grupo de pacientes con RH desconocidos fue analizado de forma independiente
obteniéndose una SG del 90%. Dichas diferencias no fueron estadísticamente
significativas (p=0.7284).
Estado del Cerb2: Las pacientes Cerb2 negativo tuvieron un SG a 6 años
del 85.23% mientras que en aquellas pacientes con Cerb2 positivo fue del 89.47%
sin alcanzar significación estadística (p= 0.8565).
Estado del p53: La SG a 6 años para pacientes con P53 positivo en el
tumor fue del 76.30%, mientras que aquellas que presentaban P53 negativo fue
del 93.37%. El grupo de pacientes con P53 desconocido fue analizado de forma
Figura 17.SG en función del estadio N.
Joaquina Martínez-Galán Resultados
- 166 -
independiente obteniéndose una SG del 91.67%. Las diferencias encontradas no
fueron estadísticamente significativas (p=0.088).
Triple negativo: La SG a 6 años para pacientes con triple negativas fue del
76.15%, mientras que aquellas que no fueron triple negativas fue del 87.58%. Las
diferencias no fueron estadísticamente significativas p= 0.1979.
De los resultados obtenidos en nuestra serie, podemos decir que con una SG
media de 52.6 meses, el grupo de pacientes que presentó mayor supervivencia
global fue aquellas pacientes con edad de presentación del tumor mayor a 35
años, edad de la menarquia mayor a 12 años, con tumores con estadio T1, bien
diferenciados sin afectación ganglionar, con RH positivos y P53 negativo. De
todos estos factores clínico patológicos sólo se alcanzó la significación estadística
en el caso de la afectación ganglionar y tamaño tumoral.
Presencia de metástasis: Respecto a la SG a 6 años para las pacientes que
recayeron fue del 93.19% frente al 32.05% para aquellas pacientes que
presentaron metástasis a lo largo del seguimiento. Estas diferencias fueron
estadísticamente significativas p= 0.001 (figura 18).
Joaquina Martínez-Galán Resultados
- 167 -
Supervivencia Global
SG MESES
80706050403020100
Supe
rviv
enci
a ac
umul
ada
1,1
1,0
,9
,8
,7
,6
,5
,4
,3
METASTASIS
si
si-censurado
no
no-censurado
QT Adyuvante: La SG a 6 años respecto a aquellas paciente que recibieron
QT fue del 83.17% frente a aquellas que no recibieron QT con un 92.31%. Las
diferencias fueron no significativas p= 0.3417.
RT Adyuvante: En cuanto a SG a 6 años y haber recibido RT, fue de un
89.22% para aquellas pacientes que realizaron RT y de un 62.34 para las que no
recibieron RT. Las diferencias fueron significativas p= 0.0114. Este resultado se
explica porque la mayoría de las pacientes que no recibieron RT fue por
habérseles practicado mastectomía por tratarse de tumores con T elevado (figura
19).
Figura 18. SG en función del estadio M.
Joaquina Martínez-Galán Resultados
- 168 -
Supervivencia Global
SG MESES
80706050403020100
Supe
rviv
enci
a ac
umul
ada
1,1
1,0
,9
,8
,7
,6
RT
SI
SI-censurado
NO
NO-censurado
HT Adyuvante: Respecto a la SG a 6 años para las pacientes que
recibieron HT fue del 89.85% frente al 80.74% para aquellas pacientes que no
recibieron HT. Estas diferencias no fueron estadísticamente significativas p=
0.2295.
Figura 19.SG en función de administración de RT.
Joaquina Martínez-Galán Resultados
- 169 -
Tabla resumen resultados SLE y SG:
SLE a 6 años SG a 6 años
Factores Clínico-patl.
% IC 95% P % IC 95% P
Edad diagnóstico ≤ 35 años > 35 años
50 87.80
(81-94.6) (45-55)
0.033
86.76 75
(70.8-79.2) (79.65-93.96)
0.512
Edad menarquia < 12 años ≥13 años
82.63 89.20
(71.43-93.83) (80-98.4)
0.3504
83 91.30
(72.07-94.07) (82.9-99.7)
0.237
Estado menopáusico Premenopausia Postmenopausia
83.78 87.18
(70.34-97.22) (78.58-95.78)
0.6877
93.74 82.90
(85.34-102.1) (73.28-92.5)
0.183
Grado de diferenciación No indicado GI GII- III
75 94.74 83.50
(84.54-100) (74.5-92.5)
0.4137
83.33 100 83.12
(63.33-103.3) (73.72-92.52)
0.156
Estadio Tumor (T) T1 T2 T3-4
89.16 81.86 80
(80.76-97.57) (68.46-95.26) (40-100)
0.6751
91.97 86.51 42.86
(83.51-99.91) (75.31-97.71) (39.26-46.46)
0.002
Estadio Ganglionar (G) N0 N1 N2
92.50 79.34 50
(85.3-99.7) (64.34-94.34) (46-54)
< 0.001
95.57 83.25 19
(90.57-100.57) (69.68-96.85) (15.85-22.25)
0.001
RH Suero No Indicados + -
85.71 88.75 77.01
(83.11-88.31) (80.75-96.75) (59.01-05.01)
0.2777
90 94.65 81.06
(15.85-108.8) (90.57-100.57) (69.68-96.64)
0.728
Cerb2 + -
89.47 86.98
(75.47-103.7) (79.14-94.62)
0.8565
89.47 85.23
(75.47-103.47) (76.43-94.03)
0.856
P53 No indicados + -
88.89 73.99 05.61
(68.89-100) (59.59-88.39) (89.61-100)
0.0145
91.67 76.30 93.37
(75.87-107.4) (85.97-100.7) (62.1-90.5)
0.08
Triple (-) + -
60.58 89.64
(34.58-86.58) (82.96-96.96)
0.0009
76.15 87.55
(52.15-100) (80.18-94.98)
0.197
HT + -
90.13 71.08
(83.13-97.13) (51.08-91.08)
0.020
89.85 80.74
(82.45-97.25) (63.34-98.14)
0.229
Joaquina Martínez-Galán Resultados
- 170 -
4.7.4. Análisis univariante de los niveles de metilación de los genes RE y 14-
3-3-sigma en relación con la supervivencia global de cáncer de mama
Con respecto al estudio estadístico respecto a la SG y al perfil de metilación
aberrante para los promotores de los genes RE y 14-3-3 Sigma, no se observaron
diferencias estadísticamente significativas respecto a la supervivencia global al
aplicar el método de libre de enfermedad aunque sí una leve tendencia a menor
SG en aquellos casos donde se encontraron niveles más elevados de metilación
aberrante sin alcanzar significación estadística.
Receptor Estrogénico metilado positivo/ negativo: La SG a 6
años para pacientes con Receptor de estrógenos (RE) metilado positivo
en suero de las pacientes fue del 86.77%, mientras que aquellas que
presentaban RE no metilado fue del 85.63%. Las diferencias
encontradas no fueron estadísticamente significativas (p=0.9341).
14-3-3 Sigma metilado positivo/ negativo: Respecto a la SG a 6
años para 14-3-3 Sigma metilado positivo en suero fue del 88.33% y
para aquellas con 14-3-3 Sigma metilado negativo fue de un 82.66%.
Las diferencias tampoco fueron significativas p=0.4183.
4.7.5. Modelo de regresión multivariante de COX
En cuanto al riesgo de muerte en nuestra serie de casos se asoció de forma
estadísticamente significativa con la edad al diagnóstico menor a 35 años.
Aquellas pacientes con edad al diagnóstico menor a 35 años tienen 34 veces más
riesgo de muerte por cáncer que aquellas pacientes con edad al diagnóstico
mayor a 35 años, p= 0.039.
El estado menopáusico se relacionó de forma significativa con el riesgo de
muerte con un riesgo relativo 20 veces superior para aquellas pacientes que
fuesen pre-menopáusicas en el momento del diagnóstico frente a aquellas que
fuesen post-menopáusicas, p= 0.023.
Joaquina Martínez-Galán Resultados
- 171 -
El tamaño tumoral fue otro de los factores pronóstico con el que se relacionó el
riesgo de muerte, siendo éste 15 veces superior al observado en el grupo de
pacientes con T3-T4 frente a T1 con valor p=0.007. No se encontraron diferencias
estadísticamente significativas entre T2 y T1.
El grado de afectación ganglionar también influyó de forma significativa en
nuestra serie en el riesgo relativo de muerte siendo 14 veces superior en el
subgrupo de pacientes con afectación ganglionar N2 frente a N0, p=0.016. No se
observaron diferencias significativas cuando el número de ganglios afectos era de
1 a 3 frente a ningún ganglio afecto.
El resto de variables analizadas; estado Cerb2, P53, Receptores Hormonales,
Grado Histológico y niveles de metilación aberrante de RE y 14-3-3 Sigma no se
asociaron de forma estadísticamente significativas con el riesgo de muerte (tabla
52).
Joaquina Martínez-Galán Resultados
- 172 -
Tabla 52. Resultado del análisis multivariante para el riesgo de muerte
P RR Error Estándar
Edad diagnóstico ≤ 35 años > 35 años
0.039 34.17 1.71
Estado menopáusico Pre-menopáusica Post-menopáusica
0.023 20.9 1.33
Estadio Tamaño Tumoral T1 T2 T3
0.364 0.007
2.4 15
0.966 1.012
Estadio Ganglionar N1 N2 N3
0.959 0.016
1.04 14
0.912 1.100
Grado Histológico GI GII/III
0.244
0.262
1.150 Estado de RH (-) (+)
0.995 0 0.010
Estado Cerb2 (+) (- )
0.291 7.264 1.876
P53 tumor (+) (- )
0.967 12.9 11.7
RE Metilado (+) (-)
0.842 1.189 0.870
14-3-3 Sigma Metilado (+) (-)
0.168 0.317 0.833
DISCUSIÓN
Joaquina Martínez-Galán Discusión
- 175 -
5. DISCUSIÓN
5.1. DIAGNÓTICO PRECOZ EN EL CÁNCER DE MAMA. JUSTIFICACIÓN
5.1.1. Despistaje del cáncer de mama mediante las técnicas actuales. Sus
ventajas, limitaciones, costes y riesgos
El cáncer de mama continúa siendo el tipo de cáncer que con más frecuencia se
diagnóstica entre las mujeres de todo el mundo. En efecto, en este sector de
población la causa más frecuente de muerte específica por cáncer. Cada año se
diagnostican más de 1-2 millones de casos nuevos de cáncer de mama lo que
representa que el cáncer de mama lo padecerá aproximadamente un 10-12% de la
población femenina mundial. Si a estos datos añadimos que la cifra global de
muertes que se producen por cáncer de mama es aproximadamente de 500.000
muertes al año y que se está observando un aumento de la incidencia de nuevos
casos en edades comprendidas entre los 35 a 39 años, la perspectiva de que nos
encontremos ante un importante problema de salud pública a nivel mundial hace
necesario que se busquen métodos de cribado poblacional que hagan posible que
el diagnóstico precoz permita alcanzar mayores tasas de supervivencia y un mejor
pronóstico de la enfermedad [5].
Actualmente se dispone de un importante despliegue de medios y técnicas de
imagen que puestas al servicio de las campañas de detección precoz del cáncer de
mama a nivel poblacional asisten como población de riesgo incluso al estudio de
determinadas mujeres que puedan presentar una mayor probabilidad de
desarrollar cáncer de mama ligado a la herencia familiar. Todo ello ha permitido
divulgar y concienciar a la población global para participar en las campañas de
“screening” con la consiguiente repercusión en alcanzar un diagnóstico más
temprano y en definitiva una mejora en el pronóstico de la enfermedad. Se estima
que gracias al cribado poblacional del cáncer de mama la mortalidad derivada de
su diagnóstico se ha reducido en aproximadamente un 20-15% de los casos. Sin
embargo y a pesar de ello los programas de “screening” tienen importantes
limitaciones como es el hecho de que actualmente alrededor de un 32% de los
Joaquina Martínez-Galán Discusión
- 176 -
casos de cáncer de mama se siguen diagnosticando en estadios localmente
avanzados y un 6% en estadio metastásico donde la enfermedad no es curable
[382].
Entre las técnicas que habitualmente se emplean en el diagnóstico precoz del
cáncer de mama se incluyen fundamentalmente la autoexploración y exploración
de la mama por el clínico y la mamografía como una de las técnicas que han
supuesto una mayor aportación en los programas de cribado poblacional. Hoy
sabemos que el diagnóstico del cáncer de mama en etapas tempranas de la
enfermedad por medio de técnicas de imagen como la mamografía con una
sensibilidad global para el diagnóstico de la enfermedad situada en torno al 75%
de los casos, ha demostrado en diferentes estudios aleatorizados realizados en
población sana, un impacto positivo en la reducción del número de muertes por
cáncer de mama especialmente en mujeres con edades comprendidas entre los 50-
69 años siendo algo menor su beneficio en mujeres con edades entre los 40-49 ó
mujeres mayores a 70 años de edad. Sin embargo aunque la mamografía es una
prueba de imagen razonablemente sensible para el diagnóstico precoz en mujeres
postmenopáusicas, en el caso de mujeres más jóvenes su sensibilidad desciende de
forma significativa al igual que sucede en aquellas mujeres que tienen una
predisposición genética al desarrollo del cáncer de mama en las que la enfermedad
suele presentarse en edades más tempranas y con mayor índice de proliferación
celular que en la población general. Este hecho que parece estar relacionado con la
mayor densidad del parénquima mamario que presenta la glándula mamaria de las
mujeres premenopáusicas, puede ocultar los signos y matices radiológicos
característicos que permiten el diagnóstico de un tumor dificultando así su
visualización en los momentos iniciales de la enfermedad. En particular en el
cáncer de mama asociado con mutaciones del gen BRCA (concretamente BRCA1) es
frecuente la presentación de una imagen mamográfica con un aspecto radiológico
ambiguo y que en ocasiones puede confundirse con el de una patología benigna de
la mama. Esto, que ha dado lugar a falsos negativos, es una fuente de error
conocida que debe ser considerada para examinar cuidadosamente estas
imágenes.
Joaquina Martínez-Galán Discusión
- 177 -
Unida a esta limitación, la mamografía tampoco está exenta de un porcentaje
nada desdeñable de falsos positivos que aunque en términos generales son
resultados que pueden ser esperados y que son asumidos por la población de
mujeres que aceptan participar en los programas de “screening”, no deja de
generar un cierto estado de ansiedad y preocupación así como ocasionar que se
pongan en marcha otras técnicas diagnósticas para intentar confirmar –o
descartar- el diagnóstico. No se puede dejar de tomar en consideración que
cualquier inseguridad en el diagnóstico que obliga a la realización de nuevas
pruebas lo que ocasiona gastos que se deberían evitar en la medida de lo posible.
La cifra de falsos positivos que según los datos estadísticos publicados podría
variar ampliamente entre un 0.7% a un 17% de los casos (6.5% como promedio),
probablemente esté en relación con la existencia de diferencias en las políticas de
actuación de los programas de cribado poblacional en los que la mamografía puede
estar, o no, asociada a otros medios diagnósticos complementarios con lo que se
disminuye el porcentaje de error al definir de forma más precisa si el hallazgo
radiológico es compatible con malignidad o por el contrario si el diagnóstico más
probable es el de lesión benigna [383]. Incluso se ha descrito que en aquellas
mujeres en las que se emite un diagnóstico falso positivo como resultado de un
primer “screening” en posteriores controles mamográficos se ha observado en
algunos casos un efecto deletéreo por ser atendidas por segunda vez con menos
frecuencia de la debida. Esto explica el hecho de que los tumores que se
diagnostican en este grupo de personas sean de mayor tamaño que los que se
objetivan en las mujeres que son seguidas con arreglo al protocolo y la frecuencia
establecida. Por ello se han de analizar los factores que predisponen a la obtención
de falsos-positivos y animar a las mujeres en las que este error se produce a seguir
el programa en la forma prevista [384].
A parte de lo comentado anteriormente el “screening” con mamografía puede
ocasionar un sobre diagnóstico de casos de cáncer de mama y también que algunas
personas resulten sobre tratadas. En efecto, de acuerdo con los datos publicados
en la base de datos Cochrane se estima que aunque el cribado poblacional con
mamografía para el cáncer de mama reduzca su mortalidad, realmente la magnitud
Joaquina Martínez-Galán Discusión
- 178 -
de este efecto es impreciso ya que también dará lugar a que se diagnostiquen y se
traten de cáncer de mama a algunas mujeres cuya lesión se comportaría de forma
indolente sin que su presencia se le pueda atribuir el fallecimiento por causa de
cáncer. A pesar de lo anterior tenemos que aceptar que, actualmente, a partir de las
pruebas de “screening” no es posible determinar cuáles ni cuantas son las mujeres
sobre tratadas y en quién el tumor se comportará de forma más agresiva. Esta
incertidumbre determina que se realicen en algunos casos, tratamientos
quirúrgicos y se apliquen tratamientos con radioterapia de forma innecesaria
[385].
Estudios recientes han sugerido que, además de presentar las limitaciones
anteriormente subrayadas, la utilización de la mamografía también puede
conllevar algunos riesgos. La dosis media de radiación que recibe la mama durante
la realización de una mamografía bilateral es aproximadamente de 4 a 5 mGy
aumentando ésta en relación directa a la densidad de la mama. Por otro lado la
dosis media acumulativa que recibe una mujer sana incluida en el programa de
“screening” durante 10 años es de 60 mGy. Hoy sabemos que el riesgo de
desarrollar cáncer de mama radioinducido sigue una tendencia lineal que aumenta
conforme lo hace la dosis recibida (P=0.0001) describiéndose un aumento de la
incidencia tras la realización de mamografías seriadas, realizadas por causa del
control evolutivo de la patología benigna de la mama fundamentalmente en
mujeres que presentan alteraciones en uno de los alelos de genes encargados de
reconocer y reparar el daño ocasionado al ADN aún a dosis bajas de radiación
[386].
En este sentido la Resonancia Magnética (RM) es otra de las pruebas de imagen
que aunque actualmente no se realiza de forma sistemática en las campañas de
“screening poblacional”, cada vez son más los estudios que coinciden en la mejora
de la sensibilidad diagnóstica (alcanzándose porcentajes en torno al 90%) cuando,
en determinados subgrupos de población, se asocia al estudio mamográfico la RM.
Concretamente se ha descrito que la Resonancia Magnética parece tener una
mayor sensibilidad que la mamografía en la detección precoz del cáncer de mama
especialmente en mujeres de edades más jóvenes donde por tener mayor densidad
Joaquina Martínez-Galán Discusión
- 179 -
el parénquima mamario la mamografía pierde en resolución pudiendo la RM
detectar lesiones que son ocultas para la mamografía. Sin embargo la RM no está
exenta de desventajas como es su moderada especificidad a la hora de discriminar
entre patología benigna y patología maligna. Esto conduce a que la indicación de
biopsias se realice con mayor frecuencia con la finalidad de asegurar mejor el
diagnóstico y reducir el porcentaje de falsos positivos. Sin embargo no disponemos
aun de datos que demuestren de forma concluyente los posibles beneficios que se
derivarían a la asociación de la RM a la mamografía en las campañas de cribado
poblacional.
En resumen todavía, y a pesar de las mejoras en las técnicas de imagen que
actualmente se utilizan en el diagnóstico precoz del cáncer de mama, siguen
existiendo ciertas limitaciones que dificultan en algunos casos el poder alcanzar un
diagnóstico lo más precoz posible. Considerando estas limitaciones creemos que
del estudio de nuevos biomarcadores pueden surgir datos que ayuden a predecir el
comportamiento biológico del cáncer de mama y a partir de él, conseguir una
aproximación al conocimiento de la capacidad de diseminación de un determinado
tumor, para a partir de él poder predecir el riesgo de progresión de lesiones
benignas a malignas, de carcinoma intraductal a carcinoma infiltrante, así como a
diferenciar el perfil molecular de los tumores que potencialmente tiene el mayor
riesgo de recidivar o producir metástasis a distancia para indicar el tratamiento
que mejor se adapte a sus características moleculares evitando que, en los casos
más favorables, se realicen tratamientos loco-regionales o sistémicos innecesarios.
5.1.2. Papel de los Marcadores Tumorales empleados actualmente en la
clínica, sus ventajas y limitaciones
El principal papel que tiene actualmente los marcadores tumorales que
habitualmente se determinan en muestras de sangre periférica de los pacientes
diagnosticados de cáncer de mama, se centra fundamentalmente en su aplicación
para evaluar la respuesta clínica al tratamiento oncológico aplicado, así como en la
detección temprana del desarrollo de metástasis. En líneas generales aunque han
sido propuestos un amplio número de marcadores tumorales son el CA 15.3, CA
Joaquina Martínez-Galán Discusión
- 180 -
27.29, el CEA (Antígeno Carcinógeno Embrionario) y las citoqueratinas (por ej.
TPA, TPS o Cyfra 21.1) los que más comúnmente se indican determinar siendo de
todos ellos el CA 15.3 el marcador tumoral que más frecuentemente se utiliza en la
práctica clínica asistencial.
Sin embargo y a pesar de su utilidad en la práctica clínica diaria, ninguno de los
marcadores tumorales actualmente determinados en sangre periférica ha
demostrado ser lo suficientemente útil para poder aplicarlo en los programas de
diagnóstico precoz del cáncer en general, y del cáncer de mama en particular,
debido a las limitaciones que presentan tanto por la baja sensibilidad como por la
falta de especificidad que su determinación analítica ha demostrado tener cuando
se aplican a los propósitos del diagnóstico precoz. El factor limitante de la
sensibilidad es la cantidad de proteína producida por el tumor así como por la
transferencia de esta proteína desde el proceso neoplásico hasta el torrente
circulatorio donde va a ser analizada. Ambos procesos biológicos, junto con las
limitaciones analíticas de la técnica, determinan cuál es el límite de concentración
que es detectable en la muestra sanguínea. Concretamente para el CA 15.3, uno de
los marcadores tumorales más empleados en la actualidad en cáncer de mama, se
ha publicado que su utilidad en el diagnóstico inicial de la enfermedad es muy baja
como se demuestra por los valores de sensibilidad que presenta su determinación
en el diagnóstico inicial del cáncer de mama. En efecto, de acuerdo con el estadio
de la enfermedad en el momento del diagnóstico la sensibilidad oscila entre un 10-
15 % en estadio I, el 20-25 % en estadios II y el 30-45 % en estadios III de la
enfermedad [387] .
Por otro lado asociado a esta baja sensibilidad se añade la falta de especificidad
que también caracteriza la utilización de los marcadores tumorales en la clínica.
Esta falta de especificidad está relacionada, entre otras causas, con la producción
del marcador por células normales pertenecientes a los tejidos donde asienta el
tumor primario o, incluso a otros tejidos del mismo organismo. Ambas
posibilidades encuentran una explicación lógica en el hecho de que los marcadores
tumorales hasta ahora conocidos son sustancias más órgano-específicas que
tumor-específicas. Por ello es frecuente la observación de niveles elevados de
Joaquina Martínez-Galán Discusión
- 181 -
marcadores tumorales en personas sin enfermedad así como en personas afectas
de algún otro tipo de patología no tumoral. Así se ha demostrado que el CA 15.3 se
encuentra frecuentemente elevado en la patología benigna de la mama, en las
alteraciones crónicas del metabolismo hepático y en enfermedades del sistema
inmune [387]. Por tanto estos problemas de especificidad que afectan a los
marcadores tumorales clásicamente utilizados como el CA 15.3 limitan sus
aplicaciones en el “screening” del cáncer de mama.
De igual forma los marcadores tumorales en cáncer de mama actuales también
presentan determinadas limitaciones cuando se les utiliza como factores
indicativos del pronóstico de la enfermedad. En relación con esta cuestión se ha
descrito que el nivel de CA 15.3 cuantificado en las pacientes con cáncer de mama
antes de la cirugía es un factor pronóstico tanto para la supervivencia libre de
enfermedad (SLE) como para supervivencia global (SG), ya que niveles iniciales
elevados se correlacionan con una menor SLE y SG. Sin embargo estudios más
detallados no han podido demostrar que el CA 15.3 sea un marcador que
independientemente de los clásicos marcadores de pronóstico (tamaño tumoral,
estado de los linfáticos, etc.) permita precisar la evolución clínica de la paciente
afecta por el tumor. Por ello la utilidad de esta proteína como factor pronóstico ha
sido muy cuestionada. No obstante en algunos estudios se ha descrito que el nivel
de CA 15.3 en el momento del diagnóstico de la enfermedad se relaciona con el
riesgo de recidiva y de mortalidad que puede presentar la paciente, tanto en
estadios iniciales como cuando la enfermedad alcanza una extensión metastásica.
En este contexto su determinación no de forma aislada en el tiempo sino de forma
sucesiva a lo largo del seguimiento de la paciente, ha mostrado tener un papel
importante en el diagnóstico de la enfermedad metastásica. De hecho se ha
descrito en diferentes estudios que la sensibilidad del CA 15.3 para detectar a
partir de su elevación progresiva la recidiva de la enfermedad y el desarrollo de
metástasis oscila entre el 50 % al 90 % en función del sitio anatómico en donde
aparezca el nuevo foco de enfermedad, siendo más alta cuando asienta en el hígado
seguida de la localización ósea y pulmonar así como del número de localizaciones y
el tamaño de los focos metastásicos [388]. Aún menos resultados existen a favor de
Joaquina Martínez-Galán Discusión
- 182 -
la utilidad del CEA para predecir el pronóstico de las pacientes con cáncer de
mama obteniéndose resultados que están en desacuerdo unos de otros por lo que
su determinación es de una utilidad muy limitada.
Todo lo anterior refleja que la utilidad de los marcadores tumorales en la clínica
está limitada por el hecho de que no son lo suficientemente sensibles para que a
través de su elevación se pueda asegurar la existencia de un proceso tumoral
incipiente, y por ello potencialmente curable, o de descubrir la enfermedad
metastásica cuando ésta se encuentra en un momento en el que por su menor
carga tumoral sea posible conseguir mejoras en la calidad de vida y en las
expectativas de supervivencia de las pacientes.
5.2. NECESIDAD DE BUSCAR NUEVOS BIOMARCADORES EN EL CÁNCER DE
MAMA
En la actualidad y debido a las limitaciones derivadas de la falta de sensibilidad
y especificidad que presenta la determinación de los habituales marcadores
tumorales aplicados a la búsqueda del diagnóstico precoz en cáncer, han surgido
múltiples iniciativas de investigación que pretenden identificar nuevos
biomarcadores y factores moleculares a partir de los cuales establecer vías de
investigación y desarrollo que, basadas en técnicas de biología molecular,
genómica y proteómica, mejoren los actuales resultados. Los datos publicados
hasta ahora resultan prometedores y se confía en que nuevas moléculas permitirán
alcanzar el objetivo de conseguir el diagnóstico del cáncer de mama en su estadio
más inicial. También los nuevos biomarcadores tumorales deberían ser útiles en la
identificación de los individuos con mayor riesgo de padecer cáncer de mama, y su
utilidad se reforzaría si aportasen datos válidos para precisar el pronóstico de la
enfermedad o predecir la respuesta al tratamiento efectuado, incluyendo el
despistaje de la recidiva tumoral o el desarrollo de enfermedad metastásica del
paciente.
Se sabe desde la década de los 70 que en el suero de los pacientes con cáncer es
posible demostrar la presencia de niveles elevados de ADN. Años más tarde se
Joaquina Martínez-Galán Discusión
- 183 -
demostró que parte de ese ADN corresponde a ácidos nucleicos liberados por el
propio tumor. Esto ha supuesto un importante avance en la aplicación y estudio de
los ácidos nucleicos en la sangre de pacientes con cáncer buscando su utilidad en la
patología oncológica y más concretamente en el cáncer de mama [389, 390].
Actualmente conocemos que el defecto primario en el cáncer reside en el ADN
genómico en el que, distintas alteraciones moleculares como son las mutaciones,
amplificaciones, translocaciones, pérdida de heterocigosidad, inestabilidad de
microsatélites así como cambios epigenéticos entre ellos la alteración del perfil de
metilación, conducen a la puesta en marcha de cascadas de transducción de
señales intracelulares anómalas que, finalmente, pueden dar lugar al desarrollo de
una enfermedad tumoral por fracaso de los mecanismos de reparación del ADN y
de regulación del ciclo celular normal. Por tanto poder aislar el ADN que se
encuentra en el torrente circulatorio y analizar la existencia de deleciones o
translocaciones de nucleótidos o de metilación de regiones promotoras de genes
con función supresor de tumores podría ayudar a alcanzar el diagnóstico en etapas
en donde el tumor aún no se ha manifestado clínica ni radiológicamente o incluso
no se ha desarrollado y sólo existen cambios moleculares en el ADN circulante.
En los últimos años han sido muchos los intentos de desarrollar técnicas no
invasivas persiguiendo lograr el diagnóstico precoz del cáncer de mama. Muchas
de ellas han estado basadas en el análisis de ADN extracelular libre que se
encuentra circulando en la sangre. En efecto en el plasma se ha demostrado la
existencia de niveles elevados de ADN libre circulante lo que, por sí solo, se ha
vinculado como un indicador del desarrollo tumoral. Sin embargo, esta
determinación carece de especificidad al observarse que en otras patologías como
en los pacientes afectos de lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoidea,
glomerulonefritis, pancreatitis, hepatitis, etc. también se describe este aumento en
la concentración de ADN libre circulante [391]. No obstante numerosos estudios
han demostrado que existen diferencias entre el patrón de metilación hallado en la
región promotora de numerosos genes, cuando se estudia el ADN circulante en el
plasma de pacientes diagnosticados de cáncer mientras que estos cambios en el
patrón de metilación no son tan frecuentes al estudiar el ADN circulante extraído
Joaquina Martínez-Galán Discusión
- 184 -
de la sangre de personas sanas [314]. Hoy es posible afirmar que los cambios del
estado de metilación de ADN representan una de las alteraciones moleculares más
comunes en el cáncer [346], [346], incluyendo el cáncer de mama [238]. Por lo
tanto, el análisis de la metilación en los promotores de diversos genes en el suero
de la población en general podría ser de gran importancia para la detección
temprana de la enfermedad.
Además el empleo del ADN en suero de los pacientes con cáncer como marcador
tumoral tiene una serie de ventajas respecto a otras moléculas como ARNm,
ARNmi y ciertas proteínas. En primer lugar, la molécula de ADN es muy estable. En
contraste con lo que le sucede al ARNm y muchas proteínas, el ADN puede
sobrevivir incluso en condiciones hostiles durante largos períodos de tiempo
permitiéndonos su almacenaje para su posterior análisis. Por otro lado el ADN
relativamente intacto se puede aislar y fijar en parafina así como y a diferencia de
las proteínas, puede ser amplificado por PCR de manera que partiendo de
pequeñas cantidades de material genético, es posible obtener importantes
cantidades del mismo. Este proceso de multiplicación del ADN facilita su estudio y
análisis [392].
Se ha demostrado que las anomalías de metilación en el ADN circulante, en
pacientes con cáncer, ofrece los mejores porcentajes de especificidad en el
diagnóstico de las enfermedades neoplásicas [393] y de ello se supone que estas
moléculas pueden ser potenciales biomarcadores de la enfermedad tumoral
mínima. Sin embargo el hallazgo de resultados falsos positivos es relativamente
frecuente y conduce al seguimiento de la persona y a la aplicación de nuevas
técnicas analíticas buscando la confirmación diagnóstica lo cual no siempre es real.
Por ello, en este asunto hay que tener muy en consideración los costos que el
procedimiento global de despistaje de la enfermedad puede acarrear y el
sufrimiento provocado en el paciente a causa del estrés y la inseguridad producida
por la ausencia de un pronunciamiento diagnóstico claro. Estos hechos han
llevado a recomendar que en el despistaje de la enfermedad se asocien los
biomarcadores que más específicos hayan resultado en cada caso. Por ejemplo
biomarcadores de ADN metilado en combinación con el antígeno PSA en cáncer de
Joaquina Martínez-Galán Discusión
- 185 -
próstata y en combinación con CA 125 para el “screening” del cáncer de ovario o
asociados a la mamografía en el “screening“ del cáncer de mama: es decir, el panel
de las pruebas de mayor especificidad y sensibilidad asociadas debe superar la
fiabilidad diagnóstica de un simple test aislado [394].
La metilación de citosinas que sucede en el carbono situado en la posición 5´
tiene un papel importante tanto durante el desarrollo celular normal como en el
proceso de la carcinogénesis. Este evento que ocurre casi exclusivamente en los
dinucleótidos CpG que se encuentran agrupados en pequeñas secuencias (islas
CpG) de 0.5 a 5kb repartidas por el genoma humano, se localizan preferentemente
-en más del 70% de los genes- en la región promotora del gen y concretamente en
el primer exón aunque en ocasiones se encuentran localizadas en el extremo final
3´ [237].
En las células de los tejidos sanos las regiones CpG en condiciones fisiológicas,
se encuentran en estado no metilado reflejando un estado transcripcional activo
del gen capaz de formar proteínas que, por tanto, ejercen la acción para la que se
ha transcrito. Sin embargo, en situaciones de transformación neoplásica acontecen
eventos epigenéticos entre ellos, la metilación de citosinas en las regiones CpG de
la región promotora del gen; esta alteración que parece ocurrir en etapas
tempranas de la carcinogénesis ocasiona el silenciamiento del gen y la ausencia de
su expresión proteica lo que, cuando ocurre en genes supresores de tumores,
conduce a la pérdida de su función y en consecuencia a la alteración de los
procesos de regulación normal del ciclo celular, proliferación, apoptosis y
supervivencia celular [13, 263, 393].
Por tanto la detección del estado de metilación del ADN por técnicas
cuantitativas como es mediante PCR en tiempo real y basándonos en un
tratamiento del ADN genómico mediante la técnica de modificación bisulfítica, que
convierte sólo citosinas no metiladas en uracilos dejando inalteradas las citosinas
metiladas, nos podrá permitir inspeccionar y poner de manifiesto este estado
metilado de la región promotora del gen a estudiar. A partir de aquí y sabiendo que
este proceso ocurre en fases iniciales de la tumorogénesis podría utilizarse su
Joaquina Martínez-Galán Discusión
- 186 -
cuantificación como potencial marcador para identificar a individuos con un mayor
riesgo para desarrollar un proceso cancerígeno o para ayudar al diagnóstico de la
enfermedad en un estadio temprano, mientras que aquellos genes que sufren este
proceso de metilación durante la progresión de la enfermedad podrían ser
utilizados como potenciales marcadores pronóstico así como para conocer la
resistencia o sensibilidad al tratamiento y por tanto poder ser un factor predictivo
de respuesta.
Por otra parte una cuestión importante a tratar es la especificidad de órgano
que es una de las características que debería reunir un marcador tumoral ideal.
Actualmente sabemos que los únicos marcadores específicos de órgano son la
Tiroglobulina para el cáncer diferenciado de tiroides [395] y el marcador PSA
(antígeno prostático específico), que si bien es específico de la próstata, su
elevación no siempre es debida a un proceso cancerígeno es decir carece de
especificidad tumoral. Sin embargo y aunque tampoco existe especificidad en
cuanto al perfil de metilación y su correlación con un tumor maligno, algunos
genes sí que poseen una significativa especificidad de tejido en su patrón de
metilación del promotor. Así, el gene hMLH1 se encuentra frecuentemente
metilado en el cáncer colo-rectal y el cáncer gástrico mientras que es raro
encontrarlo metilado en el cáncer esofágico y en el hepatocarcinoma; el gen BRCA1
está frecuentemente metilado en el cáncer de mama y ovario y no en otros tipos de
tumores y la metilación de p73 y p15INK4B parece estar presente de manera casi
exclusiva en procesos tumorales hematológicos [396]. Por lo tanto probablemente
sean necesarios más estudios prospectivos que analicen el patrón de metilación
del ADN y su correlación un determinado tipo histológico que quizás incluso
podría ser una herramienta de ayuda en la identificación de los tumores
metastásicos de origen desconocido.
5.3. JUSTIFICACIÓN DEL ADN METILADO COMO BIOMARCADOR EN EL
CÁNCER DE MAMA
En la actualidad y después de décadas de investigación en las que se han
estudiado los patrones de expresión de determinados genes y las anomalías que en
Joaquina Martínez-Galán Discusión
- 187 -
ellos es frecuente encontrar, creemos que el cáncer es en gran parte debido al
acúmulo de alteraciones genéticas y epigenéticas que, actuando sinérgicamente
sobre la cinética celular promueven la ausencia de control del ciclo celular y
cascadas de transducción de señales que dan lugar a una pérdida de control y
regulación del crecimiento y proliferación celular que conduce en la puesta en
marcha del proceso de carcinogénesis. Recientemente Hanahan y Weinberg [397]
han descrito las alteraciones moleculares y las cualidades que adquire la célula
tumoral hasta conseguir capacidad de crecimiento y proliferación celular
independiente de la regulación celular fisiológica que define el crecimiento celular
tumoral. Estas características son; i) el potencial ilimitado de las células para
replicarse, ii) su autonomía para generar señales autocrinas estimulantes del
crecimiento celular, iii) ser insensibles a las señales inhibitorias de proliferación
celular, iv) la evasión a los mecanismos de señalización que inducen a las células en
condiciones fisiológicas a entrar en apoptosis, v) la secreción de sustancias
proangiogénicas a partir de las cuales se estimula la formación de vasos por los
que el tumor consigue nutrientes y vi) la capacidad de invadir otros tejidos y dar
lugar al desarrollo de metástasis.
Entre los eventos que pueden favorecer que la célula adquiera estas
capacidades se encuentran las alteraciones que ocurren en la estructura de la
cromatina como consecuencia del proceso de desacetilación y metilación de las
histonas así como la metilación de las citosinas situadas en el promotor del gen;
todo ello afecta a la estructura de la cromatina alterando la expresión génica y
ocasionando un cambio en la función proteica derivada de la falta de transcripción
de determinados genes. De hecho actualmente se piensa que los procesos
epigenéticos que alteran la conformación de la cromatina juegan un papel
importante tanto en la iniciación como en la progresión tumoral de numerosos
procesos oncológicos. Es así que se considera que los cambios epigenéticos pueden
ser tan importantes como las mutaciones genéticas en el desarrollo y proliferación
del cáncer [398]. La organización de la cromatina y el estado de metilación de la
misma que son responsables de la homeostasis de la expresión proteica en
condiciones fisiológicas, en el cáncer esta regulación de la expresión se altera hasta
Joaquina Martínez-Galán Discusión
- 188 -
hacer que las células tumorales sean reconocibles por sus cambios morfológicos al
tiempo en que son independientes de la maquinaria de regulación normal de las
células normales. Así el genoma de la célula tumoral adquiere una distribución
atípica de los grupos metilos respecto a la célula sana exhibiendo un estado de
metilación en la región promotora de determinados genes que contrasta con la
ausencia de metilación en las regiones CpG reguladoras de la expresión génica de
esos mismos genes en la célula normal en condiciones fisiológicas. Consecuencia
de esos cambios puede ser la activación de secuencias parasitarias endógenas del
ADN, la inestabilidad cromosómica, la pérdida de la actividad génica heredable
(imprinting) y cambios en el genoma que conlleven aneuploidía, mutaciones, etc.,
que responden a algunos de los interrogantes que empezando por ¿cómo ocurre?
se formulan en relación al fenómeno de la carcinogénesis.
Este patrón aberrante de metilación del ADN puede afectar a diferentes genes
implicados cada uno de ellos en distintas etapas del proceso de proliferación,
crecimiento o muerte celular. Hoy disponemos de técnicas extraordinariamente
sensibles y mínimamente invasivas para el paciente a través de las cuales podemos
determinar y cuantificar el ADN metilado correspondiente a la región promotora
del gen que deseemos cuantificar en cualquier sujeto diagnosticado de cáncer.
Además estas determinaciones son posible en muestras de fluidos naturales como
son el suero, orina o esputo tal que cuando se realizan utilizando la técnica de PCR
en tiempo real específica para la metilación, podemos conocer la concentración de
ADN metilado en la muestra. La utilidad de ADN metilado como un potencial
biomarcador para el estudio de los pacientes con cáncer de mama ha sido descrita
por diversos autores [278, 280]. Si los hallazgos publicados se confirman en series
de pacientes más extensas, la determinación de ADN procedente del tumor a partir
de muestras de fluidos biológicos podría convertirse en una herramienta válida
para el despistaje y diagnóstico precoz del cáncer de mama.
Basándonos en resultados previos y en la propia experiencia de nuestro grupo
de investigación [268] hemos realizado este trabajo de investigación para analizar
si existen diferencias en el patrón de metilación entre un grupo de pacientes
diagnosticadas de cáncer de mama frente a dos grupos control, el primero de ellos
Joaquina Martínez-Galán Discusión
- 189 -
constituido por mujeres sanas y el segundo formado por mujeres con patología
benigna de mama. Nuestro objetivos se centraban en evaluar la relevancia clínica
de esto biomarcadores en el diagnóstico del cáncer de mama, incluyendo la
posibilidad de avanzar hacia un diagnóstico precoz de la enfermedad, y analizar la
relación de los biomarcadores elegidos con las variables clínico-patológicas
actualmente utilizadas en la práctica clínica diaria, su papel como posible factor
pronóstico y su quizás implicación en la no expresión de receptores hormonales de
estrógenos como mecanismo de silenciamiento génico mediante metilación.
Para ello se seleccionaron 5 genes implicados en diferentes rutas metabólicas
importantes en la dinámica y las funciones celulares y que, en estudios previos,
habían sido identificados como genes cuya expresión resultaba modificada, por
metilación de su promotor, en el espécimen tumoral de mujeres afectas de cáncer
de mama [280, 363]. Los biomarcadores así seleccionados fueron: 14-3-3 Sigma,
RAR-Beta, RE, APC y E-Cadherina.
El gen 14-3-3 Sigma es un gen tumor supresor implicado en la regulación de
múltiples procesos biológicos fundamentales para la célula como son los
mecanismos de apoptosis, migración, progresión del ciclo celular y mantenimiento
de la integridad del citoesqueleto. Se ha descrito que la ausencia de expresión de la
proteína a la que codifica causada por metilación de las citosinas incluidas en las
islas CpG del promotor correlaciona con la presencia del tumor. Esto es así porque
en condiciones fisiológicas cuando se produce un daño en el ADN y no es reparado,
p53 induce la expresión de 14-3-3 Sigma que a través de p21 detiene la progresión
del ciclo celular en fase G2 y, en asociación con CDK2 y CDK4, parece que también
pueda regular la progresión en fase G1/S haciendo que la célula que contiene un
daño en su ADN entre en apoptosis protegiéndose así el tejido de que en él se
alberguen células con alteraciones en el material genético importantes puedan dar
lugar a la iniciación del proceso carcinogénico. Sin embargo cuando este
mecanismo de protección fisiológico que la célula utiliza para hacer frente al daño
producido en el ADN celular es bloqueado por distintos eventos como el
silenciamiento génico mediante metilación, la célula no entra en apoptosis y
continúa el proceso de diferenciación y proliferación celular transmitiendo a
Joaquina Martínez-Galán Discusión
- 190 -
futuras células hijas información errónea y aberrante que puede iniciar y, más
adelante, promover el proceso carcionogenético [399, 400].
Otro de los genes incluidos en este trabajo de investigación ha sido RAR-Beta
(RAR-B). La proteína que este gen codifica es importante por su implicación como
gen tumor supresor en los mecanismos de control crecimiento y diferenciación
celular, estableciendo un equilibrio entre procesos de proliferación y apoptosis. El
gen RAR-Beta actúa como factor de transcripción dependiente de ligando que
uniéndose a la región promotora de numerosos genes diana, dan lugar a su
expresión o represión transcripcional. Es un importante gen tumor supresor que
se ha observado que se encuentra metilado y por tanto no se expresa favoreciendo
consecuentemente el crecimiento celular ininterrumpido, en diversos tumores
sólidos como son el cáncer de pulmón, cáncer de cabeza y cuello y cáncer de mama
[356]. Se cree que el silenciamiento del gen RAR-Beta favorece el crecimiento
celular ininterrumpido. Concretamente, en muestras tisulares de cáncer de mama
el promotor del gen se encuentra metilado hasta en un 43% de los tumores
infiltrantes [352] relacionándose su estado de metilación con la mayor frecuencia
de metástasis óseas, cerebrales y pulmonares [359]. Esto es, la metilación del gen
podría, además, corresponderse con pacientes que presentan enfermedad tumoral
diseminada. Por tanto determinar el estado de metilación en suero de este gen y
derivado de ello, la consiguiente pérdida de expresión proteica derivada de la
ausencia de su transducción proteica, podría servir como biomarcador predictivo
del riesgo de metástasis en el cáncer de mama. Además, en diversos trabajos se ha
observado que es posible la reactivación endógena de RAR-B al inducir la re-
acetilación de histonas en la secuencia promotora RAR-B P2 en líneas celulares de
cáncer de mama sugiriendo también que RAR-B podría ser un objetivo importante
para la terapia contra el cáncer [361].
Por otro lado la importancia pronóstica y predictiva de respuesta a la
hormonoterapia que, con seguridad científica, se atribuye a la expresión
intracelular de la proteína receptora de estrógenos nos hizo considerar el interés
de analizar el perfil de metilación del promotor del gen RE en mujeres afectas de
cáncer de mama. Es clásica la división del cáncer de mama en tumores, unos que
Joaquina Martínez-Galán Discusión
- 191 -
son hormonosensibles y aquellos otros que son hormono-independientes. El
primer grupo lo constituyen aquellos tumores que expresan receptores
hormonales y por lo tanto son subsidiarios de recibir tratamiento con
hormonoterapia, tienen mejor pronóstico. En cambio aquellos que son hormono-
resistentes por carecer de la expresión de estos receptores hormonales y que como
consecuencia de la ausencia de esta proteína no se benefician del tratamiento
hormonal, circunstancia además, les confiere un peor pronóstico.
Otro de los genes que decidimos estudiar fue E-Cadherina por su implicación en
el desarrollo de metástasis, al estar directamente relacionada con el
mantenimiento de la correcta adhesión y polaridad existente de célula a célula, e
implicada a su vez en los procesos de diferenciación celular, así como en el
mantenimiento de la correcta homeostasis tisular. La proteína E-Cadherina es una
glicoproteína transmembrana de 120kDa que interviene en la adhesión celular
mediada por calcio indispensable para mantener la adhesividad e integridad de las
células normales de los ductos mamarios. El papel de E-Cadherina es ligar las
células epiteliales entre sí y mantener la integridad del epitelio estratificado y se ha
descrito que su ausencia o su débil expresión contribuye a la pérdida o a la
reducción de la adhesión celular favoreciendo la diseminación de las células del
tumor y así la progresión tumoral, la invasión tisular y el desarrollo de metástasis
en el cáncer a partir de estudios que se remontan a 1990 [401, 402]. En líneas
generales se sabe que los tumores epiteliales pierden a menudo la expresión de E-
Cadherina parcial o completamente y que esta pérdida se acompaña de la
progresión hacia un proceso neoplásico invasivo debido a que los cambios en rutas
de señalización y la pérdida de inhibición del contacto celular, actúan estimulando
la migración celular así como interacciones estromales aberrantes que son
responsables del desarrollo de metástasis a distancia [403]. El gen CDH1 que
codifica para E-Cadherina, es un gen supresor de tumores asociado a las
características de multicentricidad, invasividad, metástasis y mal pronóstico del
carcinoma de mama principalmente en el cáncer lobulillar. Los mecanismos
moleculares implicados en la disminución o pérdida de la expresión de E-
Cadherina, pueden ser variables, mutaciones, pérdida de uno de los alelos con
Joaquina Martínez-Galán Discusión
- 192 -
pérdida de heterocigosis y procesos de metilación en el promotor del gen CDH1. Se
ha descrito en al menos 8 tipos de tumores entre ellos el cáncer de mama, que el
promotor de E-Cadherina se encuentra aberrantemente metilado
correlacionándose este evento con la ausencia de su expresión proteica y
consecuentemente con un mayor riesgo de desarrollo de metástasis [404, 405].
Finalmente también se incluyó en este trabajo la cuantificación de APC. La
mayor parte de las veces las deficiencias en la función de APC son debidas a
mutaciones dentro de la secuencia codificante del gen, y esto conduce a la falta de
degradación, y a la acumulación nuclear de b-catenina que actúa como un
activador transcripcional causando la pérdida del control del crecimiento celular
[406]. Además las funciones de APC se centran en las rutas metabólicas que
contrarrestan la diseminación metastásica a través de la mediación de esta
proteína en la adhesión celular y la estabilización del cito esqueleto [407]. La
pérdida de la expresión de APC y la regulación incrementada de b-catenina han
sido descritas en líneas celulares de cáncer de mama humano y en células de los
tumores mamarios [408]. Las mutaciones somáticas de APC han sido encontradas
en una minoría de los casos de cáncer de mama[409], a pesar de la alta frecuencia
con la que ocurre la pérdida de un alelo en el locus cromosómico 5q21. Sin
embargo la inactivación epigenética de APC debida a la metilación del AND
correspondiente a su región promotora es un hecho que ocurre con alta frecuencia
tanto en las líneas celulares derivadas de cáncer de mama humano como en el
tejido tumoral mamario. En la mayor parte de células de cáncer de mama que se
han conseguido cultivar existe una complete concordancia entre la metilación de
promotor de APC y el silenciamiento de su transcrito [410]. Lo anterior nos indujo
a seleccionar este fragmento de ADN como posible biomarcador del cáncer de
mama y a incluirlo en este estudio.
5.3.1. Discriminación entre casos - controles y entre controles sanos -
controles con patología benigna
En el caso del cáncer de mama, recientemente se ha propuesto que las
alteraciones en el perfil de metilación del ADN aislado a partir de muestras de
Joaquina Martínez-Galán Discusión
- 193 -
pacientes con cáncer de mama pueden ser utilizadas como posibles marcadores
del aumento del riesgo de desarrollar cáncer de mama en mujeres sanas. En este
sentido se han descrito recientemente dos alteraciones en el perfil de metilación
del ADN presentes en pacientes con cáncer y que podrían indicar que existe un
patrón de metilación distinto en estos sujetos predispuestos. En una de estas
observaciones se describe que la activación del REα que a su vez se encuentra
relacionado con el riesgo aumentado de desarrollar cáncer de mama, se
correlaciona con un bajo nivel de metilación del gen que codifica para RE (ERT) y
por otro lado como un conjunto de genes (polycomb group target genes PCGT) que
se encuentran relacionados con la biología de las células madre, se encuentran
metilados con mayor frecuencia que otros genes en pacientes afectas de cáncer de
mama. A partir de estos hallazgos se ha sugerido [411] que el análisis del estado de
metilación de RE y PCGT podrían en un futuro contribuir a predecir el riesgo de
desarrollar cáncer de mama.
De igual forma también se ha descrito en estudios moleculares realizados una
posible relación entre el estado de metilación de los genes RASSF1A y RAR-B en
relación con un aumento del riesgo de desarrollar cáncer de mama incluso con
independencia de una historia familiar de lesiones benignas y malignas de mama
[412]. Incluso se ha publicado por autores como Lewis y col. que en mujeres que
presentan lesiones benignas de mama en las que al aplicar el modelo predictivo de
riesgo de Gail se obtienen cifras de ≥ 2, es decir en mujeres que presentan un
riesgo elevado para desarrollar cáncer de mama, el porcentaje de metilación de los
genes tumor supresor RASSF1A y APC se sitúa en torno a un 70% para RASSF1A y
un 56% para APC frente al 29% y 20% encontrado en aquellas otras mujeres no
afectas de cáncer de mama, en las que el modelo de Gail ofrece un resultado bajo o
intermedio para el riesgo de padecer cáncer. De igual forma la ausencia de
expresión transcripcional por silenciamiento de otros genes como RAR-B
fundamentalmente correlacionado con la presencia de una historia familiar de
cáncer de mama, se ha asociado con la presencia de cambios histológicos en el
epitelio benigno de mama previo al desarrollo de un proceso tumoral. Estos
Joaquina Martínez-Galán Discusión
- 194 -
hallazgos podrían ser utilizados para la estratificación del riesgo de cáncer de
mama de forma individualizada [352, 392].
Otros trabajos que han encontrado diferencias significativas en el perfil de
metilación del ADN al comparar los resultados extraídos del estudio de mujeres
sanas y compararlos con los procedentes de muestras tomadas en mujeres con
cáncer de mama y que podrían contribuir al diagnóstico precoz han sido los
realizados por Krassensteiny col. [302], Dulaimi y col. [272] y Hoque y col. [413]. En
efecto de estos estudios se sabe que tras analizar un panel de genes, entre ellos
p16INK4A, p14ARF, RASSF1 y DAP kinasa, en pacientes afectas de cáncer de mama,
al menos uno de ellos se encuentra metilado en una proporción que oscila entre el
100 y el 94% de las pacientes con cáncer de mama mientras que no está metilado
en las mujeres sanas. Paralelamente se han correlacionado los niveles de
metilación obtenidos en muestras tomadas de la sangre periférica y en muestras
procedentes del lavado de los conductos galactóforos en pacientes diagnosticadas
de cáncer de mama, obteniéndose una correlación del 82%, sin observarse
diferencias significativas entre las muestras apareadas.
Estos datos preliminares sobre el análisis del perfil de metilación en suero
sugieren que el estudio de la metilación del ADN puede ser superior al CA 15-3
como marcador para el desarrollo de un cáncer de mama. Si se confirman estos
resultados en nuevos estudios prospectivos, la metilación de determinados genes
podría ser utilizada conjuntamente con la mamografía en el cribado poblacional
del cáncer de mama. Así, en las mujeres en las que, por factores epidemiológicos, se
pensase que tienen un mayor riesgo de desarrollar cáncer de mama y en las que, al
hacerles el estudio mamográfico éste fuese negativo, se podría realizar el análisis
de un determinado panel de genes tal que si se encontrara ADN metilado para esos
genes específicos se podría indicar el estudio de la mama mediante técnicas como
la RNM y recomendar el seguimiento estrecho de la paciente para tratar de
alcanzar un diagnóstico más precoz [392].
Por tanto, en nuestra opinión, deberían realizarse más estudios que comparasen
el perfil de metilación del ADN en fluídos biológicos de sujetos sanos y en pacientes
Joaquina Martínez-Galán Discusión
- 195 -
con cáncer para así poder conocer, a través de su análisis, si es posible establecer
un diagnóstico precoz del cáncer de mama y poder aplicarlo en la clínica.
Este trabajo de investigación se ha realizado con el objetivo de evaluar la
frecuencia y relevancia clínica que tiene la metilación de la región promotora de 5
genes implicados en distintas rutas de transcripción y que se han descrito como
frecuentemente alterados en cáncer de mama así como analizar si este patrón de
metilación aberrante puede ser utilizado como biomarcador plasmático de la
presencia de enfermedad. Todo lo anteriormente expuesto parte del conocimiento
de que el ADN derivado del tumor puede detectarse en el suero sanguíneo de los
pacientes con cáncer, en nuestro caso cáncer de mama y que es posible aislar y
cuantificar este ADN por medio de técnicas caracterizadas por su alta sensibilidad
como es el caso de la PCR específica de metilación en tiempo real [414, 415].
Los resultados que hemos obtenido en este trabajo demuestran que existen
diferencias en el patrón de metilación encontrado en las muestras extraídas de las
personas incluidas en el grupo de pacientes con cáncer de mama y en las muestras
de sangre extraídas a las personas que formaron parte del grupo control.
Concretamente se ha observado que los niveles medios de los promotores de ESR1
y de 14-3-3-sigma que se detectan en las muestras de suero son estadísticamente
diferentes cuando se comparan los valores correspondientes a las pacientes con
cáncer de mama y los valores que pertenecen a las personas constituyentes del
grupo de controles sanos (p= 0.0112 para ESR1 y p= 0.0047 para 14-3-3-sigma); no
hemos encontrado diferencias estadísticamente significativas al comparar los
niveles medios de metilación encontrados en el subgrupo de controles sanos y en
el subgrupo de controles sanos con patología benigna; en este último subgrupo es
frecuente encontrar valores relativamente altos para algunos de los promotores de
los genes estudiados, y esto es especialmente frecuente en el caso del promotor de
14-3-3-sigma.
No obstante es importante comentar que aunque las diferencias cuantitativas de
metilación entre los genes analizados en el grupo control sano y con patología
benigna en nuestro trabajo no han resultado ser estadísticamente significativas, en
Joaquina Martínez-Galán Discusión
- 196 -
otras series de pacientes en las que se han se han analizado patologías pre-
malignas como hiperplasia DIN3 o CDIS estos niveles han sido estadísticamente
diferentes respecto a los obtenidos en sujetos sanos. Este resultado sugiere que el
proceso de metilación y su alteración juega un papel importante y temprano en el
proceso de carcinogénesis de la mama y que es posible detectar pequeñas
diferencias, y anomalías en este perfil de metilación, en etapas pre-invasivas de la
enfermedad lo que confiere a estos procedimientos el potencial suficiente para ser
utilizados en el diagnóstico precoz de la enfermedad [416]. En nuestra serie de
controles sanos con patología benigna de mama este resultado no ha podido ser
confirmado creemos que debido al bajo número de muestras recogidas y
posiblemente también al hecho de haber incluido dentro del grupo a personas con
lesiones benignas de la mama consideradas como no pre-invasivas.
Nuestros resultados están en consonancia con recientes publicaciones en las
que también se ha observado la existencia de diferencias entre el patrón de
metilación en pacientes con cáncer de mama respecto al patrón de metilación
encontrado estudiado en población sana. Esta concordancia sugiere que este tipo
de ensayos podrían ser de aplicación para el “screening” del cáncer de mama [416,
417].
Sabemos que no existe ningún biomarcador que, con independencia del
resultado anatomo-patológico correspondiente al estudio del tumor, pueda
aportar información fidedigna que ayude a distinguir entre lesiones premalignas
como el CDIS y lesiones benignas de la mama en etapas previas a hacerse invasivas.
Es así que no podemos identificar aquellas lesiones premalignas que tiene mayor
potencial para evolucionar y dar origen a un proceso tumoral maligno. Quizás el
estudio del perfil de metilación pueda ayudar en un futuro a reconocer estas
lesiones identificando las que tienen mayor potencial para hacerse infiltrantes. Si
esto se consiguiese se avanzaría hacia una detección más temprana de la
enfermedad, diagnosticando las lesiones pre-malignas antes de que se conviertan
en procesos tumorales malignos propiamente dichos.
Joaquina Martínez-Galán Discusión
- 197 -
Los resultados obtenidos demuestran la existencia de diferencias significativas
en los valores de concentración sérica de metilación en el promotor de los genes
ESR1 y 14-3-3-sigma entre las pacientes con cáncer de mama y el grupo de
pacientes sanas. De los resultados obtenidos en nuestro trabajo es posible calcular
la sensibilidad y la especificidad diagnóstica que tendría un hipotético test basado
en la determinación cuantitativa de ESR1 y 14-3-3-sigma al aplicado al estudio de la
población en general para el diagnóstico de personas con cáncer de mama. El
primer paso fue elegir el punto de corte a partir del cual se considera que una
concentración de promotor metilado excede del valor normal. Para ello hicimos
uso del método de análisis estadístico basado en las curvas ROC (figura 8) y
utilizando el programa GraphPad Prism, seleccionamos como punto de corte, tanto
para ESR1 como para 14-3-3-sigma, aquel valor de concentración de promotor que
ofreciese los índice de Sensibilidad (S) y Especificidad (E) de manera que la razón
de probabilidades fuera máxima (likelihood ratio). Estos valores han resultado ser
de 0.02 para ESR1 y 0.05 para 14-3-3 sigma. Para estos valores los resultados para
14-3-3-sigma fueron Sensibilidad (S)= 75 % (IC del 95 %: 64-85) y Especificidad
(E) = 53 % (IC del 95 %: 45-65) y de S = 65 % (IC del 95 %: 53-76) y E = 62 % (IC
del 95 %: 52-71) para ESR1 respectivamente.
Como quiera que los valores de S y de E difieren claramente de los óptimos (S =
1; E = 1) nuestros resultados no son los suficientemente consistentes como para
que el test pueda ser aplicado al diagnóstico del cáncer. No obstante al ser ESR1 y
14-3-3 sigma factores independientes (p=0.9721), es posible analizar los valores de
sensibilidad y especificidad que se obtienen cuando se combina el resultado de la
determinación del nivel de metilación de ambos promotores, ESR1 y 14-3-3 sigma,
aplicando para ello el test exacto de Fisher. Con esta nueva aproximación se
observa que mejoraba sustancialmente tanto la sensibilidad como la especificidad.
Así si definimos la presencia de enfermedad en un sujeto elegido al azar cuando
uno de los dos genes (+/-, -/+) o ambos (+/+) estuviesen metilados y la ausencia de
ésta cuando ninguno de los dos estuviesen metilados (-/-), la sensibilidad del test
sería del 81% (95% IC: 72-88) y la especificidad del 55% (95% IC: 40-67) con
p<0.001. Es decir mejoramos el índice de sensibilidad a cambio de una
Joaquina Martínez-Galán Discusión
- 198 -
relativamente baja especificidad. En cambio si consideramos como enfermedad
sólo aquellos casos en los que ambos genes se encuentran metilados (+/+) y
ausencia de enfermedad en el resto de los casos (+/-, -/+, -/-), alcanzaríamos una
baja sensibilidad 37% (95% IC: 73-47) a consta de una alta especificidad 88%
(95% IC: 78-94) p=0.0003. Tabla 53.
Tabla 53. Valores de Sensibilidad y Especificidad del test para el diagnóstico de cáncer de mama
usando RE y 14-3-3-sigma como biomarcadores
RE ó 14-3-3 Sigma
Cáncer mama
Controles
Sanos
RE ó 14-3-3 Sigma
Cáncer mama
Controles
Sanos
Enfermedad (+) +/- -/+ +/+
87
33
Enfermedad (+) +/+
39
9
Enfermedad (-) -/-
20
41
Enfermedad (-) +/- -/+ -/-
67
65
P < 0.0001
P = 0.0003
Sensibilidad = 81% (95% IC: 72-88) Sensibilidad = 37% (95% IC: 73-47)
Especificidad = 55% (95% IC: 40-67) PPV = 72% (95% CI: 63–80)
Especificidad = 88% (95% IC: 78-94)
El análisis de estos resultados es un ejemplo de un clásico dilema que nos
encontramos habitualmente en la decisión diagnóstica. Es decir si el objetivo es
diagnosticar el mayor número de casos de cáncer de mama, el teórico caso es
descrito como un “caso potencial” cuando los valores de ESR1 y/o los valores de
14-3-3 sigma están por encima de los valores definidos como normales, por lo
tanto necesitaríamos un test con una alta sensibilidad. Sin embargo, si el objetivo
es identificar el mayor número de individuos sin cáncer, el sujeto caso es
considerado sin enfermedad cuando los valores de ambos marcadores biológicos
son inferiores a los puntos de corte identificados y por lo tanto necesitaríamos un
test con una alta especificidad.
De igual forma si analizamos lo que ocurriría al aplicar este hipotético test en
población sana incluyendo dentro de esta población a las mujeres afectas con
patología mamaria benigna, es fácil entender que si consideramos como
completamente sanas aquellas mujeres en las que los niveles de metilación en
Joaquina Martínez-Galán Discusión
- 199 -
ambos genes están por debajo del rango de la normalidad (-/-), existe una mayor
proporción de sujetos con niveles bajos de ambos biomarcadores en el grupo de
mujeres incluidas dentro del grupo control sin enfermedad alguna que en el grupo
de mujeres afectas de patología benigna con p <0.0136. Este hecho sugiere que un
test de este tipo también podría ayudar a diferencias entre ambos grupos de
mujeres (tabla 54).
Tabla 54. Valores de Sensibilidad y Especificidad del test cuando se compara el Grupo casos con
enfermedad tumoral benigna de la mama con el Grupo control.
RE ó 14-3-3 Sigma
Patología Benigna mama
Controles Sanos
RE ó 14-3-3 Sigma
Patología Benigna mama
Controles Sanos
Enfermedad (+) +/- -/+ +/+
24
33
Enfermedad (+) +/+
9
9
Enfermedad (-) -/-
10
41
Enfermedad (-) +/- -/+ -/-
25
65
P < 0.0136
P = 0.09
Sensibilidad = 70% (95% CI: 53–85) No significación estadística
Especificidad = 55% (95% CI: 43–67)
Incluso si analizamos lo que sucedería al encontrarse metilado alguno o ambos
genes los resultados serían estadísticamente no significativos. Esto podría ayudar
en el diagnóstico de patologías benignas que en ocasiones puede ser una potencial
fuente de confusión para el diagnóstico de lesiones malignas. Así, el empleo de
biomarcadores unidos a los estudios mediante la imagen que habitualmente se
realizan ante la presencia de una lesión mamaria sospechosa de malignidad, quizás
pueda ser en un futuro un complemento importante para mejorar la exactitud
diagnóstica “no cruenta” preoperatoria. No obstante, estas son sólo observaciones
iniciales que requieren más investigaciones y estudios que permitan esclarecer la
importancia de los biomarcadores en clínica así como encontrar las combinaciones
óptimas de promotores génicos metilados a estudiar en cada caso.
Joaquina Martínez-Galán Discusión
- 200 -
5.3.2. Monitorización y respuesta biológica de los biomarcadores en sangre
periférica tras tratamiento
Uno de los actuales desafíos en la práctica clínica oncológica es el poder evaluar
la respuesta al tratamiento durante la administración del mismo para poder
anticiparnos a una posible resistencia, a la recurrencia o a la progresión de la
enfermedad durante el tratamiento. Hasta el momento, ningún método de imagen,
tampoco ningún test analítico, ha resultado ser lo suficientemente sensible ni
específico para, supervisando la eficacia de los tratamientos administrados, pueda
servir para alertar sobre la resistencia terapéutica, la reaparición de la enfermedad
o la presencia de metástasis a distancia. Actualmente uno de los métodos que hoy
día se emplean con este fin, se basan en la monitorización de la respuesta al
tratamiento mediante la determinación en sangre de marcadores tumorales
durante el tratamiento y, posteriormente, a lo largo del tiempo en el que el
paciente está sometido a revisiones periódicas. De esta forma intentamos
identificar aquellas pacientes que son resistentes al tratamiento, progresan
durante éste o presentan una recurrencia de la enfermedad. Sin embargo sabemos
que estas determinaciones bioquímicas están sujetas a múltiples limitaciones y que
en ocasiones fracasan en el intento de alertarnos sobre la mala evolución de la
enfermedad sometida a tratamiento.
En este sentido la determinación cuantitativa de nuevos biomarcadores como el
estudio del estado de metilación de determinados genes quizás podría ser una
herramienta válida potencialmente más sensible para la predicción y
monitorización de la respuesta al tratamiento a partir de la cuantificación de
fragmentos de ADN tumoral metilado obtenidos de muestras del suero de las
pacientes. En nuestro trabajo de investigación hemos observado que existen
diferencias entre los valores de concentración sérica de los biomarcadores 14-3-3-
sigma y ESR1 cuando se comparan los grupos constituidos por pacientes con
cáncer de mama y por sujetos sanos. Partiendo de este resultado y del supuesto de
que una vez resecado el tumor y tratado con RT y/o QT adyuvante, por lo tanto
quedara eliminada la fuente de ADN metilado procedente del tumor, hemos
Joaquina Martínez-Galán Discusión
- 201 -
querido analizar los cambios que se producen en los niveles séricos de metilación
correspondientes a los 5 genes estudiados. Esta parte de nuestro trabajo tenía
como objetivo investigar si alguno de los biomarcadores ensayados puede ser
utilizado como indicador capaz de predecir el riesgo de desarrollar metástasis o de
recidiva de la enfermedad con anterioridad a que la enfermedad recurrente o la
metástasis fuesen clínicamente manifiestas. Para ello cuantificamos los niveles
séricos de metilación de los promotores de E-Cadherina, RAR-β, 14-3-3 sigma, RE y
APC antes y después de realizado el tratamiento indicado en cada caso.
Los resultados obtenidos en este trabajo nos permiten describir que al término
del tratamiento se observa un descenso en el nivel de metilación con respecto al
nivel de metilación que se encontró en las mismas enfermas antes de iniciar el
tratamiento. En la comparación estadística de los resultados obtenidos no pudimos
encontrar diferencias significativas los que puede atribuirse al bajo intervalo de
tiempo transcurrido, aproximadamente 2 semanas, entre el fin del tratamiento y la
extracción sanguínea final. Probablemente hubiese sido necesario medir estos
biomarcadores después períodos de tiempo más largos para clarificar su
importancia y comportamiento al final del tratamiento.
Sin embargo lo que sí hemos podido demostrar es que, en el subgrupo de
pacientes que desarrollaron metástasis a distancia en nuestra serie (12 pacientes)
y de las que dispusimos de muestras (7 pacientes), de ESR1 y 14-3-3-sigma
metilado a partir de las muestras extraídas inmediatamente tras finalizar el
tratamiento fue inferior que en el resto de las pacientes que no desarrollaron
metástasis a distancia y que incluso en una tercera toma sanguínea que pudo
conseguirse en el momento de la aparición de la metástasis en 5 de las pacientes
con metástasis se observó un aumento de los valores de ESR1 y 14-3-3-sigma
metilado lo que podría indicarnos que, la escasa disminución inicial, y el
subsiguiente ascenso de los niveles de biomarcadores presentes en el suero de las
enfermas, correspondiese con la existencia de masa tumoral residual y con su
crecimiento posterior.
Joaquina Martínez-Galán Discusión
- 202 -
En cualquier caso nos parece claro que la metilación aberrante de las regiones
promotoras en determinados genes es un acontecimiento clave en el desarrollo y
progresión del cáncer, y que estos cambios epigenéticos ocurren en etapas
tempranas del desarrollo tumoral, manifestándose como alteraciones específicas
de los tumores. Por todo ello pensamos que la determinación cuantitativa del nivel
de metilación de las regiones del promotor de determinados genes puede
contribuir de forma significativa a la detección temprana del cáncer, ayudar a
determinar de forma más precisa el pronóstico de la enfermedad así como
contribuir a la predicción de la respuesta al tratamiento indicado. Una revisión de
la literatura científica en relación con este tema nos permite saber que la
determinación del estado de metilación de GSTP1 puede ayudar al diagnóstico
precoz del cáncer de próstata, la metilación de MGMT a la predicción de respuesta
a la terapéutica con agentes alquilantes en pacientes diagnosticados de
Glioblastoma Multiforme y que la determinación del estado de metilación de PITX2
ayuda a predecir la supervivencia en pacientes afectas de cáncer de mama sin
afectación ganglionar, aun cuando la validación de estos resultados exige su
confirmación mediante estudios prospectivos en los que se incluyan un mayor
tamaño muestral [418, 419]
5.3.3. Correlación de los Biomarcadores hipermetilados y las variables
clínico patológicas
La afectación ganglionar, la sobreexpresión de Her2-neu, así como el tamaño
tumoral y la expresión de receptores hormonales son algunos de los factores
pronóstico más importantes conocidos en el cáncer de mama [420]. Otros factores
han sido investigados para analizar su potencial para predecir el pronóstico de la
enfermedad en los pacientes diagnosticados de cáncer de mama aun cuando los
resultados obtenidos carecen de significación. Así, se ha sido investigado el papel
de las proteínas reguladoras del ciclo celular [421], y la presencia de células
tumorales en médula ósea de las pacientes, en donde si bien los resultados
obtenidos sugieren cierta validez indican, también, que estos hallazgos precisan de
una evaluación aun más rigurosa [422].
Joaquina Martínez-Galán Discusión
- 203 -
Sin embargo hasta ahora, hemos encontrado muy pocos trabajos en los que se
haya estudiado el valor pronóstico de las alteraciones epigenéticas encontradas en
el ADN extraído de muestras de sangre de las pacientes afectas de cáncer de mama,
o que se haya estudiado la correlación de estos parámetros con los aspectos clínico
patológicos que caracterizan el tumor o con la expresión de los receptores
hormonales.
En este trabajo de investigación hemos evaluado el potencial pronóstico de ADN
metilado cuantificado en el suero de las pacientes diagnosticadas de cáncer de
mama y, específicamente hemos centrado nuestro trabajo en la cuantificación de
RE, E-Cadherina, 14-3-3-sigma, RAR-Beta y APC para conocer si los niveles
plasmáticos de estos fragmentos de ADN añaden información de utilidad para
estimar de forma más precisa el pronóstico de las pacientes con cáncer de mama y
que pudiese ser complementaria a la que nos proporcionan los parámetros que
actualmente utilizamos en la clínica diaria. Para avanzar en este supuesto hemos
estudiado las posibles correlaciones entre los distintos genes analizados y las
variables pronósticas tanto demográficas como aquellas dependientes del tumor.
De acuerdo con nuestros resultados parece que la metilación aberrante de 14-3-3-
sigma se correlaciona con factores pronósticos adversos como son la afectación
ganglionar y el tamaño tumoral; así, las pacientes con afectación ganglionar
presentan niveles de metilación de 14-3-3-sigma superiores a los que se
encuentran pacientes sin afectación ganglionar y estas diferencias son
estadísticamente significativas (p<0.05). De igual forma se observó que cuanto
mayor es el “T” mayores son los niveles de metilación de 14-3-3 sigma siendo las
diferencias encontradas estadísticamente significativas. La explicación que
podríamos dar a este hecho está relacionada con la implicación que tiene 14-3-3
sigma en los procesos que conducen a la proliferación y a las ventajas que las
células tumorales tienen para prolongar su supervivencia.
Sin embargo hasta ahora, pocos estudios han analizado el valor pronóstico de
las alteraciones epigenéticas a partir de muestras sanguíneas de las pacientes así
como su correlación e influencia en el tumor de la expresión de marcadores
moleculares como la expresión de los receptores hormonales.
Joaquina Martínez-Galán Discusión
- 204 -
En este trabajo de investigación evaluamos el potencial pronóstico de ADN
metilado en el suero de las pacientes diagnosticadas de cáncer de mama a partir de
la cuantificación de RE, E-Cadherina, 14-3-3- sigma, RAR-Beta y APC para conocer si
podía aportar algún dato más que nos aproximara a estimar de forma más precisa
el pronóstico de las pacientes con cáncer de mama y que pudiese ser
complementaria a la información pronóstica que actualmente utilizamos en la
clínica diaria. Para ello correlacionamos los distintos genes analizados con las
variables pronósticas tanto demográficas como aquellas dependientes del tumor.
De acuerdo con ello observamos que la metilación aberrante de 14-3-3-sigma se
correlacionaba con factores pronósticos adversos como son la afectación
ganglionar y el tamaño tumoral, tal que se observó que las pacientes con afectación
ganglionar presentaban niveles de metilación de 14-3-3-sigma superiores de forma
estadísticamente significativas respecto a las pacientes sin afectación ganglionar
(p<0.05). De igual forma se observó que cuanto mayor es el “T” mayores niveles de
metilación de 14-3-3 sigma se obtuvieron de forma estadísticamente significativa.
La explicación que podríamos dar a este hecho está relacionada con la implicación
que tiene 14-3-3 sigma en la proliferación y supervivencia celular tumoral [423].
Actualmente ssabemos que 14-3-3 sigma, es un gen tumor supresor que actúa
regulando negativamente el ciclo celular promoviendo la parada de las células en
fase G2-M. Su incremento de expresión, cuando se estudian líneas celulares de
cáncer de mama, parece ser antagonista de la promoción del crecimiento celular
impulsada por oncogenes y de la transformación de las células hacia elementos con
mayores características malignas [399]; mientras que por otra parte su
silenciamiento permite a los queratinocitos humanos primarios crecer
indefinidamente alcanzando características de inmortalización evadiendo la
senescencia [424].
Nuestros resultados no nos han permitido encontrar ninguna otra relación
entre variables clínicas tales como la edad de la menarquía, la menopausia o la
paridad y las variables moleculares introducidas en este trabajo.
Estos resultados están en consonancia con recientes estudios realizados donde
se ha observado como el encontrarse metilado de forma aberrante los genes APC y
Joaquina Martínez-Galán Discusión
- 205 -
RASSF1A en mujeres afectas de cáncer de mama antes de cualquier tratamiento
oncológico es factor pronóstico independiente para la supervivencia global,
asociándose a una peor supervivencia que aquellas otras pacientes en las que estos
mismos genes se encontraban metilados [425]. Otros estudios como los realizados
por Feng Jing [426] obtuvieron resultados similares al analizar la repercusión de
presentar metilados los genes p16 y BRCA1 en mujeres con cáncer de mama
concluyendo que se asociaba junto a la afectación ganglionar a un peor pronóstico
y a un mayor riesgo relativo (RR) de muerte por cáncer de 6.4 y 5.5
respectivamente.
En este sentido se ha sugerido que la presencia de anomalías epigenéticas en el
ADN extraído de muestras del ganglio centinela afectas por metástasis de cáncer
de mama podría aumentar la sensibilidad para la predicción de una recidiva
ganglionar y alertar sobre el peor pronóstico de la paciente afecta si bien son
necesarios más estudios, incluyendo un mayor seguimiento de las pacientes para
extraer conclusiones fidedignas [281].
5.4. CORRELACIÓN DE FENOTIPOS LUMINALES EN CÁNCER DE MAMA Y
METILACIÓN
El cáncer de mama es una patología compleja en la que múltiples factores
histológicos, anatomo-patológicos, moleculares y clínicos se interrelacionan. De su
análisis pormenorizado es posible extraer datos que, aproximándonos al
pronóstico de la enfermedad, nos permiten ofrecer las opciones terapéuticas más
adecuadas a cada caso. Recientemente y gracias a los avances producidos en el
campo de la Biología Molecular, la Proteómica y la Genómica, se ha conseguido
avanzar en el conocimiento molecular del cáncer y, través del análisis de rutas de
transcripción de señales y de la funcionalidad de los receptores de membrana,
avanzar hacia tratamientos determinados por el perfil molecular que expresan las
células del tumor. Todo esto ha permitido el avance del conocimiento molecular en
el cáncer de mama y la descripción de distintos subtipos fenotípicos
principalmente atendiendo a su perfil de expresión. Esta clasificación es
importante porque contiene elementos que facilitan el pronóstico y permiten la
Joaquina Martínez-Galán Discusión
- 206 -
predicción de la respuesta al tratamiento oncológico. Es bien sabido que la
expresión de receptores de estrógenos (RE) en el espécimen tumoral representa
uno de los principales factores pronóstico de supervivencia a largo plazo y es
predictivo de la respuesta de la enfermedad al tratamiento hormonal. También se
sabe que esta proteína juega un importante papel en la iniciación y progresión del
cáncer del cáncer de mama. Así aquellas pacientes con tumores que expresan RE-
positivos se asocian a un pronóstico más favorable y, en su tratamiento se debe
incluir la terapia hormonal con Tamoxifeno y/o Inhibidores de la Aromatasa; sin
embargo en aquellas pacientes que presentaban tumores con RE-negativos el
tratamiento hormonal carece de utilidad terapéutica aunque sí es un elemento que
incide sobre el pronóstico de la enfermedad al asociarse más frecuentemente con
los casos en los que el curso de la enfermedad es más adverso. Sabemos que
alrededor del 25 % de los cánceres de mama no expresan RE en el momento del
diagnóstico siendo por lo tanto resistentes al tratamiento hormonal [372].Incluso
en algunos casos la expresión de RE inicial puede negativizarse a lo largo del curso
de la enfermedad perdiendo la sensibilidad a dicho tratamiento hormonal [427].
Explicar este hecho y encontrar la causa por la que el cambio de fenotipo sucede es
complejo sin que actualmente se haya podido describir una causa genética como
deleciones, translocaciones, reagrupamientos o inserciones que puedan ser
responsables del cambio en el perfil de expresión de RE [428].
En nuestra revisión de la literatura relacionada con este tema no hemos podido
encontrar que se hayan realizado estudios que correlacionen el perfil epigenético
de metilación y su relación con el estado de expresión de RE o con otros factores
pronósticos como la amplificación de HER2-neu. Distintos autores han descrito que
la expresión de RE en el tumor correlaciona con la metilación de diferentes genes y
a su vez con un mejor o peor pronóstico, pero aún no se ha analizado la metilación
del promotor del gen RE con la ausencia de expresión de RE en tumor. Así autores
como Widschwendter y col.[337] han descrito la existencia de relación entre el
estado de metilación de APC y casos de cáncer de mama RE-positivo mientras que
otros trabajos como el de Li y col. [429] han sugerido que en pacientes RE-positivo
parecía existir hipermetilación de los promotores del gen Twist con mayor
Joaquina Martínez-Galán Discusión
- 207 -
frecuencia mientras que la metilación del promotor del gen CDH1 ocurría con
mayor frecuencia en pacientes con tumores RE-negativos.
En este trabajo de investigación y partiendo de los casos en los que hemos
encontrado hipermetilación del promotor de ESR1 en el suero de las pacientes con
cáncer de mama, hemos sometido a análisis esta señal de silenciamiento
epigenético del gen ESR1 con el fenotipo luminal encontrado al estudiar
histopatológicamente el tumor con la ausencia de expresión de la proteína RE en el
tumor. Para ello hemos analizado la correlación entre el estado de expresión de RE
en el tumor y el estado de metilación de la región promotora de ESR1 aislado en el
suero de las pacientes. De los resultados obtenidos se observó que el estado
metilado de ERS1 en el suero se correlacionaba de forma estadísticamente
significativa con la ausencia de expresión de RE en tumor y viceversa (p=0.0179).
Este resultado concuerda con los datos publicados por Lapidus y col. y Ottaviano y
col. [375, 430] en líneas celulares de cáncer de mama. En efecto, estos autores han
descrito que el promotor ubicado en el exón 1 del gen RE se encuentra altamente
metilado en las líneas celulares que no expresan RE y en cambio no está metilado
en el tejido mamario normal y en las líneas celulares de cáncer de mama que
expresan una proteína receptora de estrógenos funcionante.
Al analizar lo que sucede al correlacionar el fenotipo luminal con estado de
metilación de RE, observamos que en los casos con fenotipo de mejor pronóstico
(luminal A y luminal B) predomina la forma molecular no metilada del promotor
del gen ESR1, es decir, existe cierto nivel de correlación entre la expresión de RE y
mejor pronóstico, mientras que en los fenotipos con peor pronóstico (Her2-neu y
triple negativo) predomina la forma molecular metilada (p<0.05). Incluso al
analizar en cada fenotipo luminal el porcentaje de ESR1 metilado frente a ESR1 no
metilado, observamos como dentro de cada subgrupo aquellos que presentan ESR1
no metilado y por lo tanto expresan receptores de estrógenos tienen una tendencia
a mejor supervivencia que aquellos que son ESR1 metilados. Por lo tanto parece
que el la variante molecular del promotor del gen ESR1 –metilada, no-metilada,
aporta información pronóstica adicional a los factores pronósticos que
actualmente manejamos en oncología clínica del cáncer de mama.
Joaquina Martínez-Galán Discusión
- 208 -
Es decir a la vista de estos resultados podemos decir que el silenciamiento
génico por metilación de la región promotora del gen del receptor de estrógenos
ESR1 tiene un importante papel en la expresión de la proteína que dicho gen
codifica, que repercute sobre su presencia en el tumor primario, encontrándose
que la proteína está ausente en el tumor (RE-negativo) cuando en sangre periférica
el promotor del gen está metilado y viceversa. Estos datos demuestran que el ADN
del tumor llega a la circulación periférica donde puede identificarse y que de su
estudio pueden surgir elementos que faciliten el pronóstico o indiquen cual puede
ser la respuesta a determinado tipo de tratamiento. Por otra parte como la
metilación en cáncer es un evento reversible también es claro que su modulación
pueda en un futuro constituirse como una diana terapéutica sobre la que sea
posible actuar clínicamente.
CONCLUSIONES
Joaquina Martínez-Galán Conclusiones
211
6. CONCLUSIONES.
Los resultados obtenidos en este trabajo nos han permitido formular las siguientes
conclusiones:
6.1 Las alteraciones epigenéticas del genoma como la metilación de la región
promotora del ADN y remodelación de la cromatina que tienen un papel clave en la
iniciación y progresión del cáncer, pueden ser detectadas y cuantificadas a partir de
muestras procedentes del suero de pacientes mediante la técnica de detección del ADN
por la reacción cadena de la polimerasa específica de metilación.
6.2 La cuantificación en sangre periférica del perfil de metilación en población sana
a partir de los resultados obtenidos podría ser utilizada como prueba complementaria a las
conocidas en el momento actual en el diagnóstico precoz si bien aún son necesarios más
estudios prospectivos que validen esta técnica para dicho fin.
6.3 Así mismo la cuantificación en sangre periférica del perfil de metilación en
población afecta de cáncer de mama de los promotores 14-3-3 sigma y RE puede ser de
utilidad para monitorizar la respuesta al tratamiento así como para aportar información
pronóstica adicional sobre la evolución de las pacientes tratadas de cáncer de mama.
6.4 De la correlación entre ESR1 metilado en suero y la ausencia de expresión de RE
en el tumor, podemos deducir que la metilación representa un importante mecanismo de
silenciamiento génico en la carcinogénesis del cáncer de mama que explica en gran parte
la ausencia de expresión de receptores hormonales en el tumor y con ello la
hormonoresistencia al tratamiento hormonal.
6.5 La metilación del ADN puede diferenciar subgrupos pronósticos dentro del
fenotipo luminal que nos aproximan a un mejor conocimiento de los mecanismos de
silenciamiento implicados en la ausencia de transcripción de factores implicados la
correcta regulación del ciclo celular favoreciéndose la actividad de factores estimulantes
de proliferación y supervivencia celular incontrolado.
PUBLICACIONES Y COMUNICACIONES
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7. COMUNICACIONES A CONGRESOS Y ARTÍCULOS DE REVISTA.
CONGRESO: Fourth AACR International Conference on Molecular Diagnostics in
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CONGRESO: XII CONGRESO DE LA SOCIEDAD ESPAÑOLA DE ONCOLOGÍA
MÉDICA (SEOM). Análisis epigenético del perfil de metilación de un panel de genes en
cáncer de mama. Octubre 2009, Barcelona. Comunicación oral.
CONGRESO: XII CONGRESO DE LA SOCIEDAD ESPAÑOLA DE ONCOLOGÍA
MÉDICA (SEOM). Correlación del estado de metilación en tumor y suero del
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2009, Barcelona. Comunicación oral.
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CONGRESO: ECCO 15 and 34th ESMO Multidisciplinary Congress. Methylation in
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Supplement European Journal of Cancer. Vol 7. Nº2. ISSN: 1359-6349. Berlin,
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for screening breast cancer and association with molecular breast cancer subtypes.
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Publicado: Supplements European Journal of Cancer. ISSN:1359-6349. Vol. 7. Nº 4.
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CONGRESO: 32nd ANNUAL SAN ANTONIO BREAST CANCER SYMPOSIUM.
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CONGRESO: ECCO 7th European Breast Cancer Conference. Relation between
methylation promoters gene and estrogen receptor (ERS1) and her2/neu status in
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Joaquina Martínez-Galán Abreviaturas
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8. ABREVIATURAS.
ADN: Ácido desoxirribonucleico.
CDIS: Carcinoma ductal in situ.
CK: Citoqueratinas.
EGFR: Receptor del factor de crecimiento epidérmico.
FISH: Hibridación in situ.
IC: Intervalo de confianza.
IGF: Insulin Growth Factor.
IHQ: Inmunohistoquímica.
IMC: Índice de masa corporal.
MFQ: Mastopatía Fibroquística.
Mv: Mega-electrón voltios.
NIH: National Institutes of Health.
Pb: Pares de base.
PCR: Reacción de polimerasa en cadena.
Seg: Segundos.
SG: Supervivencia global.
SLE: Supervivencia libre de enfermedad.
RE: Receptores de estrógenos.
RH: Receptores hormonales.
RM: Resonancia Magnética.
RNA m: Ácido Ribonucleico mensajero.
RNA mi: Micro RNA.
RP: Receptores de progesterona.
RR: Riesgo relativo.
TSH: Terapia hormonal sustitutiva.
UTDL: Unidad terminal ducto-lobulillar.
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