El sistema de expresión Baculovirus-células de insecto

Oscar Taboga

Instituto de Biotecnología

INTA

Baculovirus como sistema de expresión

Parte 1 – Introducción a los baculovirus

Parte 2 – Baculovirus para la expresión de proteínas

Parte 3 – Puesta en práctica

Preguntas y discusión

Baculovirus como sistema de expresión

Parte 1 – Introducción a los baculovirus

¿Qué son los baculovirus?

• Su ciclo de vida y cómo podemos hacer uso de él

Baculovirus como sistema de expresión

Baculovirus como sistema de expresión

Los baculovirus son un grupo de virus encontrados mayormente en insectos (Baculoviridae).

Tienen una estructura de varilla (baculum=bastón), un diámetro de entre 40-50 nm y una longitud de entre 200-400 nm.

Su información genética está almacenada en una molécula de ADN doble cadena, circular, de aproximadamente 80-200 Kpb.

Spodoptera

frugiperda

Baculovirus como sistema de expresión

Baculovirus como sistema de expresión

Trichoplusia ni

En cultivos celulares o cuando se multiplican dentro de un insecto permisivo, los baculovirus forman dos tipos de viriones: virus ocluidos y virus brotados.

peplómeros

envoltura

nucleocápside

Baculovirus como sistema de expresión

Para una sobrevida a largo plazo se forman los cuerpos de oclusión o poliedros que ocluyen los virus ocluidos.

cálix

nucleocápsides

matriz

envoltura

Baculovirus como sistema de expresión

Infección primaria

Fusión

Virus derivados de cuerpos de oclusión

Liberación de virionespor lisis celular

Poliedros

Solubilizaciónen el intestino de la larva

Virus brotados

Brotación

Liberación del

genoma

Endocitosis

Infección secundaria

Ciclo de replicación

¡Película!

Baculovirus como sistema de expresión

Su ciclo de multiplicaciónLa proteína poliedrina se acumula hasta alcanzar el 50% del total de proteínas celulares, pero el virus puede multiplicarese en cultivos celulares sin formar cuerpos de oclusión (virus pol -).

¿Qué significa en términos de expresión de proteínas?=>Pueden expresarse genes heterólogos bajo el control del promotor de poliedrina

=> La expresión ocurre en un estadío muy tardío de la infección

=> Los niveles de expresión serán probablemente muy altos

Parte 1 – Introducción a los baculovirus

Parte 2 – Baculovirus para la expresión de proteínas

Seguridad

Características generales del BVES

Alternativas

Modificaciones postraduccionales

Parte 3 – Puesta en práctica

Baculovirus como sistema de expresión

Seguridad

Riesgo personal o de contaminación de células de mamífero.Estudios mostraron que pueden entrar en células de mamífero, pero no alcanzan el núcleo ni transcriben genes

Pueden considerarse entonces que no poseen riesgo de seguridad adicionaly son clasificados como Clase I

Contaminación de otras células de insectoAunque su rango de hospedador es bastante limitado, pueden penetrar otras células de insecto pero no replican ni entran en estadíos tardíos

De todas maneras, cuidado de no contaminar otros trabajos y como todo organismo recombinante, debe ser considerado potencialmente peligroso

Baculovirus como sistema de expresión

Características generales del BVES

Producción de proteínas en un hospedador eucariota

Siendo un sistema eucariota el BVES es capaz de:

•Plegamiento apropiado

•Modificaciones postraduccionales

Estos requisitos son cruciales para proteínas con actividad biológica

Baculovirus como sistema de expresión

Características generales del BVES

Altos niveles de expresión

El BVES tiene el potencial de una muy fuerte expresión de genes heterólogos: se han alcanzado niveles de hasta 25-50%de las proteínas totales (1g/l).

Sin embargo, usualmente los niveles de expresión están en orden de:

•1- 3 mg /l (proteínas intracelulares)

•3-15 mg /l (proteínas secretadas)

•Tan poco como 0.1 mg /l (algunas integrinas)

•Hasta 50 mg /l (algunas kinasas)

Baculovirus como sistema de expresión

Características generales del BVES

Expresión de proteínas tóxicas o termosensibles

La mayor fase de producción de proteínas ocurre tardíamente en la infección. Esto significa que:

•Pueden expresarse proteínas heterólogas tóxicas a pesar de posibles efectos sobre funciones celulares esenciales

•Hay poca presión de selección contra el gen tóxico ya que este no interfiere con la producción de virus brotado

La expresión ocurre a 27°C, lo que puede ser permisivo para proteínas termosensibles

Baculovirus como sistema de expresión

Características generales del BVES

• Construcciones largas o múltiples

Debido a que el genoma de los baculovirus puede acomodar grandes porciones de ADN, el sistema permite la expresión de largas construcciones o multiples genes simultáneos

• Simplicidad de la tecnología

Los vectores son accesibles para el clonado directo

La construcción de un baculovirus recombinante es considerablemente más rápida que la de una línea celular eucariota (CHO, por ejemplo)

Hay un rango muy amplio de vectores comerciales disponibles y kits para la construcción de virus recombinantes.

Baculovirus como sistema de expresión

Costos

Los costos son significativamente más altos que los sistemas de expresión bacterianos y de levaduras, tanto en materiales como en equipamiento.

Baculovirus como sistema de expresión

Modificaciones postraduccionales

Las células de insecto son capaces de lidiar con modificaciones postraduccionales como

•Clivaje de péptido señal (incluidos los de mamífero•Fosforilación•N y O glicosilaciones•Miristilación•Plegamiento, formación de puentes S-S, oligomerización•Modificaciones lipídicas

Baculovirus como sistema de expresión

Modificaciones postraduccionales

Limitaciones:

•Clase y grado de modificación puede no ser idéntico al encontrado en la especie o tejido original

•El muy alto nivel de expresión puede disminuir la capacidad de la célula de modificar correctamente el producto

•Secreción, fosforilación y glicosilación pueden verse particularmente afectadas

•Algunos de estos inconvenientes pueden resolverse usando promotores más tempranos

Baculovirus como sistema de expresión

Parte 1 – Introducción a los baculovirus

Parte 2 – Baculovirus para la expresión de proteínas

Parte 3 – Puesta en práctica

Preguntas y discusión

Baculovirus como sistema de expresión

Sistemas de expresiSistemas de expresióónn

• Vector

• Hospedador

• Metodología

Baculovirus como sistema de expresión

Baculovirus como sistema de expresión

Baculovirus como sistema de expresión

CaracterCaracteríísticassticas

• Ambiente eucariota para la producción de proteínas

• Expresión excepcionalmente alta• Expresión durante la fase de oclusión• Expresión a 27ºC• Capacidad de grandes inserciones• Expresión eficiente de genes no “spliceados”(cDNAs)

• Simplicidad de la tecnología

Baculovirus como sistema de expresión

Crecer virus parental

Preparar ADN viral

Clonar gen en vector de transferencia

Preparar ADN plasmídico

Cotransfectar

Screening de recombinantes

Purificar recombinantes

Amplificar recombinantes

Confirmar identidad

Caracterizar expresión génica

Scaling-up

HistoriaHistoria

• Placas de lisis occ+ vspacas occ- (1:1000)

Baculovirus como sistema de expresión

• Gen reportero (igual frecuencia)

Baculovirus como sistema de expresión

• Linealización del genoma (eficiencia 30%)

Bsu361

Baculovirus como sistema de expresión

• Deleción en orf letal y linealización(eficiencia 100%)

Bsu361Bsu361

Baculovirus como sistema de expresión

VariacionesVariaciones

• Bácmidos como fuente de ADN viral

• Generación de recombinantes por transposición

Baculovirus como sistema de expresión

• Bácmido bAcGOZA

poliedrinaPp10

marker orf1629

Mini F

Baculovirus como sistema de expresión

Ppol

Generación de baculovirus recombinantes por el sistema Bac to Bac

ElecciEleccióón del virus y especie n del virus y especie hospedadorahospedadora

• 500 especies• AcNPV y BmNPV• 90% identidad• rango de hospedador y líneas susceptibles muy diferentes y con distintas propiedades

Baculovirus como sistema de expresión

AcNPVAcNPV vsvs BmNPVBmNPV

• Crecimiento y niveles de expresión de las líneas

• Rango de plásmidos de transferencia

• Expresión en larvas de insecto (tamaño, voumen de hemolinfa, canibalismo, bioseguridad, métodos de infección

Baculovirus como sistema de expresión

Cultivo de cCultivo de céélulas lulas vsvs larvaslarvas

CCéélulaslulas:

• Igual sistema al usado en la caracterización inicial

• Más “limpio” (medio libre de suero)

• Más homogéneas purificaciónespostraduccionales

• Caro

• Equipamiento

Baculovirus como sistema de expresión

Cultivo de cCultivo de céélulas lulas vsvs larvaslarvas

LarvasLarvas:

• Más alta eficiencia de modificaciones postraduccionales

• Bajo costo

• Se necesita mantener insectos

• Más difícil purificación

Baculovirus como sistema de expresión

ElecciEleccióón de cn de céélulaslulasPropiedadesPropiedades

• Tiempo de duplicación

• Capacidad de crecimiento en monocapa o suspensión

• Tamaño

• Susceptibilidad

• Modificaciones postraduccionales

Baculovirus como sistema de expresión

ElecciEleccióón del pln del pláásmido de smido de transferenciatransferencia

• Método de producción (transposición vs. recombinación)

• Proteína auténtica vs. fusión• Secretada vs citoplasmática• Complementación de la deleción letal en orf1629

• Bajo la regulación de qué promotor• Una o más proteínas• Fenotipo occ + vs occ-

Baculovirus como sistema de expresión

ProteProteíína autna autéénticantica

• Acortar región 5’ no traducida entre promotor y ATG (hasta 100 pb)

• Evaluar secuencias que rodean ATG

• Consenso: A YAUGAUG Y

Baculovirus como sistema de expresión

TAAG

consenso

100 pb

UAAATG

ProteProteíínas secretadasnas secretadas

• Señales propias

• Señales probadas (gp64, melitina, etc)

Baculovirus como sistema de expresión

PromotoresPromotores

• Immediate early no usados

• Early poco usados

• Late durante y luego de S! de ADN, 39K, proteína básica

• Very late P10, Pol

Baculovirus como sistema de expresión

MMáás de un gen s de un gen simultaneamentesimultaneamente

• Heterodímeros

• Necesidad de coexpresión de enzima modificante tejido o célula-específica

• 1 p10 + 1 pol en locus poliedrina

• 2 p10 + 1 pol en locus poliedrina

• 1 p10 + 1 pol en locus p10

Baculovirus como sistema de expresión

Fenotipo del virusFenotipo del virus

• Mantener una copia de poliedrina bajo su promotor o el de p10

Baculovirus como sistema de expresión

Conclusiones bConclusiones báásicassicas

• Usar genes sin intrones• Remover sec. heterólogas en región 5’ no codificante

• Buen contexto para el codón ATG (A a -3)• No son necesarias secuencias para poliA• Secuencias TAAG o CTTA dentro de la secuencia del gen de interés pueden ser perjudiciales

• El uso de codones parece tener poca influencia• Emplear secuencias de secreción comprobadas

Baculovirus como sistema de expresión

Baculovirus vs. otros sistemas de expresión de proteínas eucariotas

RapidezPlantas Baculovirus Levaduras BacteriasTrangénicos Células de

mamiferos

BacteriasGlicosidación

LevadurasPlantas

BaculovirusTrangénicos Células de

mamiferos

PlantasTrangénicos

BaculovirusBacterias Levaduras

Plegamiento Células de mamiferos

Bajo CostoTrangénicos Levaduras BacteriasCélulas de mamiferos

PlantasBaculovirus

Baculovirus como sistema de expresión

Baculovirus como sistema de expresión

Baculovirus

recombinantes

Sistemas de expresión

Display en cápside o superficie

Gene delivery

Control biológico de plagas

Expresión de proteínas a partir de células infectadascon el baculovirus Ac3AB1pol+:

clon 1 clon2 AcNPV MPM

47,5 Kda

32,5 kDa

25 kDa

Tinción con azul de Coomassie

poliedrina

3AB1

3AB1

clon 1 clon 2 AcNPV MPM

47,5 Kda

32,5 kDa

25 kDa

Western blot

SISTEMAS DE EXPRESIÓN HETERÓLOGOS PARA PROTEÍNAS

Reconocimiento de la proteína no estructural 3AB1 por sueros de

animales infectados con VFA

Sueros negativos VFA Sueros positivos

Sueros

vacunadosSueros bovinos negativos VFA

Sueros bovinos infectados VFA

Sueros bovinos vacunados contra VFA

A C O

Western blot de extractos

de células infectadas

SISTEMAS DE EXPRESIÓN HETERÓLOGOS PARA PROTEÍNAS

SISTEMAS DE EXPRESIÓN HETERÓLOGOS PARA PROTEÍNAS

Producción de VLPs en larvas de Rachiplusia ni

Display en superficie (GP64)

• Exposición en sup. de gp64-gD

• Inducción de Ac seroneutralizantes

• Competencia por el receptor celular:

plegamiento similar a la proteína nativa

Display de la glicoproteína gD de BHV-1 en la

superficie de baculovirusAcSup-gD

Microscopía electrónica

y marcación (específica

para gD) con oro

-X

Display en cápside (VP39)

Display de OVA

en cápside

vp39vp39-X

Se agrega una copia extra de

vp39 fusionada a la secuencia

del antígeno X.

Gene delivery (pCMV)

BHK (uv) A11 moi180