El sistema de expresión Baculovirus-células de insecto

Oscar Taboga

Instituto de Biotecnología

INTA

1 – Introducción a los baculovirus

2 – Baculovirus para la expresión de proteínas

3 – Puesta en práctica

Preguntas y discusión

Parte 1 – Introducción a los baculovirus

¿Qué son los baculovirus?

• Su ciclo de vida y cómo podemos hacer

uso de él

Los baculovirus son un grupo de virus

encontrados mayormente en insectos

(Baculoviridae).

Tienen una estructura de varilla

(baculum=bastón), un diámetro de entre 40-50 nm

y una longitud de entre 200-400 nm.

Su información genética está almacenada en una

molécula de ADN doble cadena, circular, de

aproximadamente 80-200 Kpb.

Spodoptera

frugiperda

Trichoplusia ni

En cultivos celulares o cuando se multiplican dentro

de un insecto permisivo, los baculovirus forman dos

tipos de viriones: virus ocluidos y virus brotados.

peplómeros

envoltura

nucleocápside

Para una sobrevida a largo plazo se

forman los cuerpos de oclusión o

poliedros que ocluyen los virus

ocluidos.

cálix

nucleocápsides

matriz

envoltura

Infección primaria

Fusión

Virus derivados de cuerpos de oclusión

Liberación de viriones por lisis celular

Poliedros

Solubilización en el intestino de la larva

Virus brotados

Brotación

Liberación del

genoma

Endocitosis

Infección secundaria

Ciclo de replicación

¡Película!

Su ciclo de multiplicación

La proteína poliedrina se acumula hasta alcanzar el 50% del

total de proteínas celulares, pero no es indispensable: el virus

puede multiplicarese en cultivos celulares sin formar cuerpos

de oclusión (virus pol -).

¿Qué significa en términos de expresión de

proteínas?

=>Pueden expresarse genes heterólogos bajo el control del promotor de

poliedrina

=> La expresión ocurre en un estadío muy tardío de la infección

=> Los niveles de expresión serán probablemente muy altos

Parte 1 – Introducción a los baculovirus

Parte 2 – Baculovirus para la expresión de

proteínas

Modificaciones postraduccionales

Parte 3 – Puesta en práctica

Seguridad

Riesgo personal o de contaminación de células de

mamífero.

Estudios mostraron que pueden entrar en células de mamífero, pero no se

transcriben genes

Pueden considerarse entonces que no poseen riesgo de seguridad adicional

y son clasificados como Clase I

Contaminación de otras células de insecto

Aunque su rango de hospedador es bastante limitado, pueden penetrar

otras células de insecto pero no replican ni entran en estadíos tardíos

De todas maneras, cuidado de no contaminar otros trabajos y como todo

organismo recombinante, debe ser considerado potencialmente peligroso

Características generales del BVES

Producción de proteínas en un hospedador eucariota

Siendo un sistema eucariota el BVES es capaz de:

•Plegamiento apropiado

•Modificaciones postraduccionales

Estos requisitos son cruciales para proteínas con

actividad biológica

Características generales del BVES

Altos niveles de expresión

El BVES tiene el potencial de una muy fuerte expresión de

genes heterólogos: se han alcanzado niveles de hasta 25-

50%de las proteínas totales (1g/l).

Sin embargo, usualmente los niveles de expresión están en

orden de:

•1- 3 mg /l (proteínas intracelulares)

•3-15 mg /l (proteínas secretadas)

•Tan poco como 0.1 mg /l (algunas integrinas)

•Hasta 50 mg /l (algunas kinasas)

Características generales del BVES

Expresión de proteínas tóxicas o termosensibles

La mayor fase de producción de proteínas ocurre tardíamente

en la infección. Esto significa que:

•Pueden expresarse proteínas heterólogas tóxicas a pesar

de posibles efectos sobre funciones celulares esenciales

•Hay poca presión de selección contra el gen tóxico ya que

este no interfiere con la producción de virus brotado

La expresión ocurre a 27°C, lo que puede ser permisivo para

proteínas termosensibles

Características generales del BVES

• Construcciones largas o múltiples

Debido a que el genoma de los baculovirus puede acomodar

grandes porciones de ADN, el sistema permite la expresión de

largas construcciones o multiples genes simultáneos

• Simplicidad de la tecnología

Los vectores son accesibles para el clonado directo

La construcción de un baculovirus recombinante es

considerablemente más rápida que la de una línea celular

eucariota (CHO, por ejemplo)

Hay un rango muy amplio de vectores comerciales disponibles

y kits para la construcción de virus recombinantes.

Costos

Los costos son significativamente más altos que los

sistemas de expresión bacterianos y de levaduras,

tanto en materiales como en equipamiento.

Modificaciones postraduccionales

Las células de insecto son capaces de lidiar con

modificaciones postraduccionales como:

•Clivaje de péptido señal (incluidos los de mamífero)

•Fosforilación

•N y O glicosilaciones

•Miristilación

•Plegamiento, formación de puentes S-S, oligomerización

•Modificaciones lipídicas

Modificaciones postraduccionales

Limitaciones:

•Clase y grado de modificación puede no ser idéntico al

encontrado en la especie o tejido original

•El muy alto nivel de expresión puede disminuir la

capacidad de la célula de modificar correctamente el

producto

•Secreción, fosforilación y glicosilación pueden verse

particularmente afectadas

•Algunos de estos inconvenientes pueden resolverse usando

promotores más tempranos

Diferencias en las rutas de glicosilación

1 – Introducción a los baculovirus

2 – Baculovirus para la expresión de

proteínas

3 – Puesta en práctica

Preguntas y discusión

Sistemas de expresión

Vector

Hospedador

Metodología

Características

Ambiente eucariota para la producción de proteínas

Expresión excepcionalmente alta

Expresión durante la fase de oclusión

Expresión a 27ºC

Capacidad de grandes inserciones

Expresión eficiente de genes no “spliceados” (cDNAs)

Simplicidad de la tecnología

Crecer virus parental

Preparar ADN viral

Clonar gen en vector de transferencia

Preparar ADN plasmídico

Cotransfectar

Screening de recombinantes

Purificar recombinantes

Amplificar recombinantes

Confirmar identidad

Caracterizar expresión génica

Scaling-up

Historia

Placas de lisis occ+ vs pacas occ- (1:1000)

Gen reportero (igual frecuencia)

Linealización del genoma (eficiencia 30%)

Bsu361

Deleción en orf letal y linealización

(eficiencia 100%)

Bsu361Bsu361

Variaciones

Bácmidos como fuente de ADN viral

Generación de recombinantes por transposición

Bácmido bAcGOZA

poliedrinaPp10

marker Dorf1629

Mini F

Ppol

Generación de baculovirus recombinantes por el sistema Bac to Bac

Elección del virus y especie hospedadora

500 especies AcNPV y BmNPV 90% identidad rango de hospedador y líneas

susceptibles muy diferentes y con distintas propiedades

AcNPV vs BmNPV

Crecimiento y niveles de expresión de las líneas

Rango de plásmidos de transferencia

Expresión en larvas de insecto (tamaño, voumen de hemolinfa, canibalismo, bioseguridad, métodos de infección

Cultivo de células vs larvas

Células:

Igual sistema al usado en la caracterización inicial

Más “limpio” (medio libre de suero)

Más homogéneas purificaciónes postraduccionales

Caro

Equipamiento

Cultivo de células vs larvas

Larvas:

Más alta eficiencia de modificaciones postraduccionales

Bajo costo

Se necesita mantener insectos

Más difícil purificación

Elección de células

Propiedades

Tiempo de duplicación

Capacidad de crecimiento en monocapa o suspensión

Tamaño

Susceptibilidad

Modificaciones postraduccionales

Elección del plásmido de transferencia

Método de producción (transposición vs. recombinación)

Proteína auténtica vs. fusión

Secretada vs citoplasmática

Complementación de la deleción letal en orf 1629

Bajo la regulación de qué promotor

Una o más proteínas

Fenotipo occ + vs occ-

Proteína auténtica

Acortar región 5’ no traducida entre promotor y ATG (hasta 100 pb)

Evaluar secuencias que rodean ATG

Consenso: A YAUG Y

TAAG

consenso

100 pb

UAAATG

Proteínas secretadas

Señales propias

Señales probadas (gp64, melitina, etc)

Promotores

Immediate early no usados (usados en líneas celulares)

Early poco usados

Late durante y luego de S! de ADN, 39K, proteína básica

Very late P10, Pol

Más de un gen simultaneamente

Heterodímeros

Necesidad de coexpresión de enzima modificante tejido o célula-específica

1 p10 + 1 pol en locus poliedrina

2 p10 + 1 pol en locus poliedrina

1 p10 + 1 pol en locus p10

Fenotipo del virus

Mantener una copia de poliedrina bajo su promotor o el de p10

Conclusiones básicas

Usar genes sin intrones

Remover secuencias heterólogas en región 5’ no codificante

Buen contexto para el codón ATG (A a -3)

No son necesarias secuencias para poliA

Secuencias TAAG o CTTA dentro de la secuencia del gen de interés pueden ser perjudiciales

El uso de codones parece tener poca influencia

Emplear secuencias de secreción comprobadas

Baculovirus vs. otros sistemas de expresión de proteínas

eucariotas

RapidezPlantas Baculovirus Levaduras BacteriasTrangénicos Células de

mamiferos

BacteriasGlicosidación

LevadurasPlantas

BaculovirusTrangénicos Células de

mamiferos

PlantasTrangénicos

BaculovirusBacterias Levaduras

Plegamiento Células de mamiferos

Bajo CostoTrangénicos Levaduras BacteriasCélulas de mamiferos

PlantasBaculovirus

Baculovirus

recombinantes

Sistemas de expresión

Display en cápside o superficie

Gene delivery

Control biológico de plagas

Antiviral/Inmunomodulador

Expresión de proteínas a partir de células infectadascon el baculovirus Ac3AB1pol+:

clon 1 clon2 AcNPV MPM

47,5 Kda

32,5 kDa

25 kDa

Tinción con azul de Coomassie

poliedrina

3AB1

3AB1

clon 1 clon 2 AcNPV MPM

47,5 Kda

32,5 kDa

25 kDa

Western blot

Reconocimiento de la proteína no estructural 3AB1 por sueros de animales infectados con VFA

Sueros negativos VFA Sueros positivos

Sueros

vacunadosSueros bovinos

negativos VFA

Sueros bovinos

infectados VFA

Sueros bovinos

vacunados

contra VFA

A C O

Western blot de extractos de células infectadas

ELISA para diferenciar animales vacunados de infectados con FMDV

Producción de VLPs de rotavirus (coexpresión de VP2 y VP6) en larvas y células

• Exposición en sup. de gp64-gD

• Inducción de Ac seroneutralizantes

• Competencia por el receptor celular:

plegamiento similar a la proteína nativa

Display de la glicoproteína gD de BHV-1 en

la superficie de baculovirus

AcSup-gD

Microscopía electrónica

y marcación (específica

para gD) con oro

gD

Display de OVA en cápside

vp39vp39-

OVA

Se agrega una copia extra de

vp39 fusionada a la secuencia

del antígeno OVA.

BHK (uv) A11 moi180

Transducción de células de mamífero

Efecto antiviral