Post on 12-Apr-2020
MICOBACTERIAS
Bioq Nora I Costa
Sección Bacteriología TBC
Hospital de Infecciosas F.J.Muñiz
MICOBACTERIAS: CLASIFICACIÓN
Orden: ActinomycetalesFamilia: Mycobacteriaceae
Género: MycobacteriumIntegrado por más de 150 especies, que pueden dividirse en 3 grandes grupos:
Micobacterias patógenas estrictas: Complejo Mycobacterium tuberculosis:
M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. microti, M. canetti, M. capreae, M. pinnipedii
Enfermedad: Tuberculosis M. leprae (no cultivable) Enfermedad: Lepra
Micobacterias Ambientales Micobacterias no tuberculosas de crecimiento rápidoMicobacterias no tuberculosas de crecimiento lento
Enfermedad: Micobacteriosis
Micobacterias
M. Tuberculosis complejo
• Parásito estricto
• Reservorio: el hombre infectado.
• Son patógenos verdaderos.
• Se transmite persona a persona.
MNT
• Son muy abundantes en la naturaleza.
• Son habitantes de agua, tierra y alimentos.
• Variable distribución geográfica.
• Pueden contaminar muestras clínicas.
• Pueden ser patógenos oportunistas (micobacteriosis).
• No se transmiten persona a persona.
• Frecuentemente son resistentes a las drogas antituberculosas.
Micobacterias
Genero Mycobacterium
• Pared celular compleja y rica en lípidos.
1- Capacidad de ácidorresistencia.
2- Presencia de ácidos micólicos con 60 a 90 átomos de carbono.
3- Elevado contenido G+C : 61 a 71 % (guanosina+citosina), en su ADN.
Distribución enfermedades por Micobacterias
0,00%
20,00%
40,00%
60,00%
80,00%
100,00%
120,00%
Tuberculosis
Micobacteriosis
M.bovis
98.5%
1%0.5%
Datos de la epidemiología mundial
Países con mayor carga de TB
Tasas de incidencia de TB 2016
Tasas de TB por jurisdicción. Argentina 2019
Costo de los Tratamientos
OPS
S Tratamiento HRZE 918,32$
MR Tratamiento ZEKEthCsL 169021$
XDR Tratamiento LzErMoBe 1027502$
Resistencia a M tuberculosis…
• Aparece por mutación genética.
• Selección mediante esquemas terapéuticos erróneos, falta de supervisión terapéutica, falta de adherencia al tratamiento, mala calidad de los fármacos.
• Por haber recibido un mal esquema (irregularidad, abandono, mala prescripción)
RESISTENCIA ADQUIRIDA
• Por haberse contagiado con una cepa resistente (exposición a un foco con tuberculosis resistente)
RESISTENCIA INICIAL
DIagnósticoDIAGNÓSTICO
Los procedimientos diagnósticos en el laboratorio deben realizarse en condiciones de
bioseguridad adecuada
Baciloscopía: BSL 2Cultivo: BSL2, con prácticas de BSL3.
Métodos de Laboratorio para el diagnóstico de TB
• Baciloscopía • Cultivo
Baciloscopía: Coloración de Ziehl-Neelsen
1- Fijar extendido con calor.
2- Cubrir con Fucsina y flamear hasta desprender vapores blancos.
3- Lavar
4- Decolorar con Alcohol-HCl 3%
5- Lavar
6- Contracolorear con Azul de Metileno 2 o 3 minutos.
7- Lavar y dejar secar.
8- Mirar en 100X, e informar bacilos/100 campos
Ziehl Neelsen
• M. tuberculosis: se ven como pequeños bastones curvados (bacilos) de color rojo, en pares o grupos, sobre un fondo de tonos azulados
Cuantificación del frotis
Coloración de ZN: nro. de BAAR obs. a 1000x
Informe
Ninguno No se obs. BAAR
1 a 9 BAAR en 100 campos Nro. de bacilos observados.
10 a 99 BAAR en 100 campos (+)
1 a 10 BAAR/cpo. en al menos 50 cpos. obs.
(++)
> 10 BAAR/cpo. en al menos 20 cpos. osb
(+++)
Baciloscopia
• “La calidad del informe del laboratorio de microbiología depende inicialmente de la calidad de la muestra clínica remitida”
• En el diagnóstico de TB pulmonar, el Esputo es la mejor muestra del tracto respiratorio
Calidad de las muestras I
ESPUTOS
Muestra de elección: mucopurulenta o mucosa
Espontáneo o inducido.
Spot vs Overnight (53 % vs 85%)
Los esputos salivosos, no son buenas muestras, pero no deben descartarse, porque aun así pueden contener bacilos
Esputos¿Cuántas muestras procesamos?
Realizar estudio seriado para una mayor rentabilidad
La baciloscopía directa aporta:
~ 1ra. Muestra: 80% de positivos
~ 2da. Muestra: 95 % de positivos
marcado incremento de la positividad
~ 3ra. Muestra: 100% de positivos
Baciloscopia
• Conservación esputo (En heladera)
• No hay mucho problema si los conservamos hasta 1 semana, porque aunque los bacilos no sean viables, se colorean.
• No enviar extendidos!!!
En extendidos fijados hay entre 30 a 40% de bacilos viables.
En preparados coloreados, no hay bacilos viables
Baciloscopía
Rápida Fácil de realizar Bajo costo Detecta la mayoría de los casos infecciosos Especificidad: 96-99% Son necesarios entre 5.000 y 10.000 BAAR/ml. de
muestra para ser BK+, por eso la limitación másimportante es su baja sensibilidad
• RECORDAR!!! se necesitan < de 10 bacilos para transmitir la infección
S:70%E:99.8%
Baciloscopía
• Especificidad 96-99%• Falsos positivos:
Micobacterias ambientalesHongosNocardiaRayadurasSuciedad
• En un país de alta o mediana endemia, más del 99% de las BK+ son TB
DIAGNÓSTICO DE CERTEZA!!!!
La gran limitación de esta técnica (ZN) es su relativa baja sensibilidad
Influenciada por 3 factores:
1ro. Con lo avanzado de la enfermedad:
Sens. 80-90% con patrón cavitario en Rx de tórax
Sens. 50-80% si tiene infiltrados
Sens. < 50% en formas nodulares o masas
2do. Calidad de la muestra y de la coloración
3ro. Tiempo que dedica el operador en observar el frotis
BaciloscopíaPermite…
• Categorizar el grado de avance de la enfermedad en el momento del diagnóstico
• Interrumpir la cadena de transmisión tratamiento
aislamiento del paciente internado
• Monitorear la evolución del tratamiento
Control de tratamiento
• A todos los pacientes positivos en tratamiento se les realizarán controles baciloscópicos al 2º, 4º y 6º mes.
• Si la baciloscopía del 2º mes resultara positiva, se cultivará la muestra para identificación y sensibilidad.
• En el caso de pacientes internados se les realizará una baciloscopía semanal como control para poder externarlos.
CULTIVO
• La baciloscopía detecta el 70-80% de los casos • El cultivo el 20-30 % restante.
• Entre los casos de tuberculosis extrapulmonar el aporte del cultivo al diagnóstico es muy variable según la localización de la patología.
Si se considera el total
de casos con diagnóstico
de tuberculosis
pulmonar confirmado
bacteriológicamente…
Calidad de las muestras II
• BAL es importante centrifugar estas muestras previa realización de los
directos, para mejorar la calidad de las mismas.
Evaluar celularidad.
• CONTENIDO GÁSTRICO (solo en niños) BAAR no patógenos, baciloscopίa con reserva, debe haber abundantes bacilos.
• ORINAS centrifugar previa realización de los directos
seriado de 3 muestras
• Otros líquidos: pleural, LCR, articular, abscesos, etc
Calidad de las muestras III
• BIOPSIAS
En solución fisiológica o agua estéril, sin conservantes. Macerar el material antes de realizar el directo
• HEMOCULTIVO Y MÉDULA ÓSEA• 5 ml de sangre heparinizada
• Aspiración de médula ósea heparinizada
• Muestras que solo tienen valor en pacientes inmunocomprometidos
SEGÚN LAS NOTIFICACIONESLA BACILOSCOPIA CONFIRMA
EL 75% o más DE LOS CASOS PULMONARES….
• RESULTADOS BACTERIOLÓGICOS EN MUESTRAS DE PACIENTES CON TUBERCULOSIS PULMONAR. ARGENTINA. 2º CUATRIMESTRE 2000
MUESTRA NÚMERO BACILOSCOPÍA +Nº %
SÓLO CULTIVO +Nº %
ESPUTO 1649 1339 81.2 310 18.8
L. BRONQUIAL Y BAL 110 53 48.1 57 51.9
LAVADO GÁSTRICO 37 18 48.6 19 51.4
TOTAL 1796 1410 78.6 386 21.4
RESULTADOS BACTERIOLÓGICOS EN MUESTRAS DE PACIENTES CON TUBERCULOSIS EXTRAPULMONAR
ARGENTINA. 2º CUATRIMESTRE 2000
MUESTRA BACILOSCOPÍA +Nº %
SÓLO CULTIVO +Nº %
TOTAL Nº %
GANGLIO 24 52.2 22 47.8 46 23.7
LÍQUIDO PLEURAL 5 13.9 31 86.1 36 18.5
ORINA 18 54.5 15 45.5 33 17.0
BIOPSIA PLEURAL 8 44.4 10 55.6 18 9.3
LCR 3 23.1 10 76.9 13 6.7
SANGRE Y M. ÓSEA 2 16.2 10 83.8 12 6.2
LÍQUIDO ASCÍTICO 3 33.3 6 66.7 9 4.6
OTRAS BIOPSIAS 1 12.5 7 87.5 8 4.2
OTRAS MUESTRAS 13 68.4 6 31.6 19 9.8
TOTAL 77 39.7 117 60.3 194 100.0
Cultivo
Muy importante!!!Conservar los materiales en la heladera, y procesarlos dentro de los 3 días, ya que los bacilos pierden viabilidad.
Tiempo 0 días 3 días 5 días 7 días
% viables 93% 83% 71 % 63%
Cultivo
• Permite dar seguridad al resultado de la baciloscopía positiva de algunas muestras.
• Permite aislar los BAAR presentes en una muestra en cantidad suficiente como para identificarlos por métodos bioquímicos.
• Permite realizar la prueba de sensibilidad en los casos que sea necesaria.
Normas para solicitud de cultivo
• Muestras de esputo con baciloscopías reiteradamente negativas y con clínica, radiología y/o epidemiología compatible con tuberculosis.
• Todas las muestras extrapulmonares.
• Todas las muestras pediátricas.
• Pacientes con asociaciones morbosas.
• Pacientes inmunocomprometidos.
• Pacientes comunidades cerradas.
Cultivo
• Decontaminación y concentración de la muestra por el Método de Petroff.
• El pellet obtenido de la concentración, es el que se siembra en el medio de LöwensteinJensen (LJ) y en un medio Stonebrink para
ver el desarrollo de M.bovis.
Detección de Micobacterias I
Método convencional:
Cultivo en medio sólido, a base de huevo entero, sales, glicerol, harina de papa y verde de malaquita.
Lowenstein-Jensen y Stonebrink (con glutamato)
Más de 20 días para obtener desarrollo microbiano
Cultivo en medio sólido
Las muestras se incuban a 37C durante 8 semanas, con observaciones diarias las primeras 48 hs. y luego observaciones semanales.
Registrar tubos contaminados, no debe ser mayor al 4-5% del total de muestras sembradas.
Los cultivos positivos se informan en cruces: Entre 1 a 19 colonias se informa el número exacto De 20 a 100 colonias: una cruz Más de 100 colonias: ++ o +++
CultivoVentajas:
Mayor sensibilidad que BK
Desvantajas:
Menos accesibles
Más caro
Lento crecimiento 3-8 semanas
10 a 100 bacilos en toda la
muestra
Utilidad del cultivo
Detectar bacilos escasos en distintas muestra
• De lesiones pulmonares poco avanzadas
• Extrapulmonares
• Pediatricas
Aislar e identificar BAAR en muestras que pueden contener micobacterias ambientales
• Orina, lavado gástrico
Utilidad del cultivo
Aislar y realizar la prueba de sensibilidad de BAAR de muestras de pacientes que pueden tener tuberculosis resistente a los antibióticos de primera línea con
Mala respuesta al tratamiento
Historia de tratamiento previo
Inmunosuprimidos
Vigilancia epidemiológica
A QUIENES PEDIR LA PRUEBA DE SENSIBILIDAD?
• Pacientes con abandono de tratamiento, recaídas, re-internaciones.
• Todas las muestras de pacientes inmunocomprometidos(HIV +, oncológicos, en tratamiento con corticoides, diabéticos).
• Pacientes en contacto con multirresistentes.
• Pacientes que al segundo mes de tratamiento cumplido sigan con baciloscopías positivas.
• Pacientes de países con alta tasa de resistencia (Perú).
Prueba de sensibilidad
• Método de las proporciones:
• Medio de Löwenstein-Jensen, con antibióticos:
H,R,S,E,PAS + tubo control sin antibiótico. Se siembran dos diluciones.
• Hay Resistencia con un desarrollo mayor al 1%
|
BK + y ++: siembra SD y -2
BK +++: siembra -1 y -3
• Microscopia de Fluorescencia LED
Mejora de Microscopía
• Uso de Medio Líquido
• Nitratasa, MODS
Mejora de cultivo y DST
ID rápida
Biología molecular
Inmunocromatografia lateral
Diag de Mtc y mutaciones que determinen R (R y/o H).X pert,
Nuevas Herramientas
AURAMINA- RODAMINA
Tan eficaz como la coloración de ZN
Se basa en el mismo principio de la ácido-alcohol-resistencia
M. tuberculosis: se ven como pequeños filamentos amarillos fluorescentes sobre fondo verde
SISTEMAS DESARROLLADOS PARA LA DETECCIÓN PRECOZ DEL DESARROLLO DE MICOBACTERIAS
Métodos que detectan consumo de O2:
• MGIT 960
Fluorométrico
(Becton Dickinson)
MGIT 960
• Método automatizado de monitoreo continuo que detecta el consumo de oxígeno por parte de las micobacterias que desarrollan en la muestra. Así se activan los sensores de fluorescencia y se detectan en el equipo las muestras positivas.
MGIT 960
• Lectura automatizada de cultivos• Monitorean automáticamente
tubos indicando crecimiento • Aumenta la sensibilidad• Reduce a la mitad el tiempo de
detección de desarrollo del bacilo• No Identifica Complejo M
tuberculosis• Permite conocer el perfil de
resistencia a drogas antituberculosas
• Botella con tapa, mejora bioseguridad pero aporta mayor contaminación
MGIT 960
• Los tubos donde se inoculan las muestras son plásticos y a rosca por lo que no hace falta jeringa y aguja para inocular las muestras reduciendo riesgos en el personal que las manipula, aunque son observadas mayores tasas de contaminación.
• Código de barras.
• Link a sistemas de gestión de laboratorio
Ventajas de los medios líquidos
• Mayor sensibilidad que los medios sólidos.
• Mayor rapidez de detección que los medios
sólidos.
ZN +++ ZN ++
L-Jensen 17 días 20 días
MGIT 5 días 10 días
Inconvenientes o desventajas
• Mayores tasas de contaminación (se calcula una tasa de contaminación aceptable de 4%, aunque es algo superior en el caso de MGIT 8%).
• Aporte eléctrico continuo
• Dificultad para reconocer cultivos mixtos
(Incapacidad de observar morfología de las colonias)
• Incapacidad de realizar recuento de colonias
• Muy caros
• Bioseguridad???
IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA DE MICOBACTERIAS
Marcha mínima
• MICROSCOPIA
( presencia de cuerda)
• TBc ID (inmunocromatografía).
detección de antigeno PT64.
• Tiempo de positividad del cultivo
• Características de las colonias
TBc ID (MGIT BD)
PRUEBAS DE SENSIBILIDAD EN MEDIO LIQUIDO (MGIT)
• A drogas de primera linea:
H (0.1) y R
• A drogas de segunda linea:
H (1), Ak, K, Levo, Ca
PRUEBA DE SENSIBILIDAD-MGIT
MGIT 7ml- curva de crecimiento
MGIT- R a INH y RIF
Se han desarrollado métodos rápidos y económicos para hacer un screening que acelere la detección de Resistencia a R (e H )
Para laboratorios habituados a la prueba de sensibilidad en Lowenstein–Jensen.
Para laboratorios con entrenamiento en microbiología
general y bioseguridad adecuada.
NITRATASA
FAGOS
Nuevos métodos fenotípicos rápidos para detección de MR o resistencia a R
Técnicas basadas en la detección de viabilidad bacilar
Método de la Nitratasa
• No dependen de equipamiento sofisticado ni reactivos costosos.• El procedimiento es similar al del método convencional y emplea el
mismo medio sólido.• Capacidad que tienen los bacilos para reducir el nitrato a nitrito
mientras están viables• Su incorporación a la rutina no altera sustancialmente la carga de
trabajo en los laboratorios que realizan pruebas de sensibilidad.• Se ha comprobado su utilidad en la detección de resistencia a
isoniacida, rifampicina.• En un estudio realizado en nuestro país, el método de la nitratasa
también resultó adecuado para la detección de resistencia a drogas cuando fue aplicado directamente a muestras de esputo con BK +++
MODS
Métodos colorimétricos
• Se basan en la capacidad que tienen los bacilos viables, luego de la exposición a una droga, para reducir indicadores de color añadidos al medio de cultivo.
• La presencia de bacilos resistentes se detecta por un cambio de color del indicador.
• Dos indicadores, resazurina y MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide), han sido ampliamente evaluados en un micrométodo.
• Con ambos indicadores se detecta resistencia a isoniacida, rifampicina y etambutol en 10 días con una eficiencia mayor a 98%.
• La implementación de estos métodos requiere buenas condiciones y prácticas rigurosas de bioseguridad, por lo que en nuestro medio su implementación sería posible a nivel de laboratorio de referencia.
Nuevas herramientas diagnosticas en las redes de laboratorios de tuberculosis en Latinoamérica. Barrera L, Montoro E. OPS 2006 1(1)
OPS ha recomendado la prueba de nitratasapara detectar rápidamente resistencia a rifampicina e isoniacida en Latinoamerica
OPS /OMS producen recomendaciones
en base al análisis de publicaciones
y revisión sistemática de resultados de validación
en los escenarios donde tienen que ser empleados
a cargo de expertos independientes de la industria
Prueba de sensibilidad de fármacos de segunda línea• Métodos aceptados por la OMS
Métodos de las proporciones en medio Lowestein- Jensen
MGIT para aminoglucósidos y levofloxacina.
• El ensayo e interpretación de resultados de las pruebas presentan alto grado de dificultad
Orientación para evaluar la resistencia a drogas de segunda línea
OMS, Ginebra , julio 2007
Se recomienda seguir el siguiente algoritmo
R e H(incorporar algún método rápido en lo posible)
E y S
Z
fluoroquinolonas (OFX)
kanamicina (o amicacina) y
capreomicina
En laboratorios muy
experimentados
bajo un programa de
control de calidad
externo conducido por un
laboratorio supranacional
Conclusiones• En general, las pruebas de sensibilidad a distintas drogas
difieren en confiabilidad y reproducibilidad. • Las pruebas de sensibilidad a R son las más reproducibles
seguidas por las de sensibilidad a H. • los resultados de las pruebas de sensibilidad a E y S son
mucho menos confiables, aún los obtenidos con los métodos patrones.
• A nivel internacional se proponen valores de eficiencia de 97% y 99% para las pruebas de sensibilidad a H y R y de 92% para S y E.
• Eficiencias inferiores a estas exigen un programa de mejoramiento de la calidad.
• El método de la nitratasa, los colorimétricos y el basado en la replicación de bacteriófagos cumplen con los niveles de eficiencia aceptados para H, R y E, pero no para S.
Métodos Moleculares
• Amplificación de ácidos nucleicos
Métodos Moleculares
Métodos moleculares
Métodos moleculares
Medios líquidos para cultivo y PS
en escenarios con bajos y medios recursos
OMS ha recomendado el empleo de
Pruebas moleculares (LIPAs) para screening rápido
de pacientes con riesgo de multirresistencia
http://www.who.int/tb/dots/laboratory/en/index.html
Comenzando la implementación en
laboratorios de referencia nacional
que cumplan ciertos requisitos
CONCLUSIONES…..Recordar siempre!!!!
Cuanto menor el número de bacilos, menor la probabilidad de que resulte positiva una baciloscopía, un cultivo o una PCR
El resultado negativo de un método microbiológico no puede ser utilizado para descartar el diagnóstico de TBC.
EL DIAGNOSTICO EN TB ES
Clínico: síndrome de impregnación.Radiológico: poco específicoBacteriológico (el de mayor especificidad), obtención de muestras de esputo, punciones, abscesos, LCR, PAMO y hemocultivos en HIV+.
CASO DE TB: paciente diagnosticado como tal por el médico tratante.
La baciloscopía y cultivo continúan siendo los métodos básicos y certeros para confirmar el diagnóstico de
tuberculosis, por lo tanto deben ser ofrecidos a todos los sintomáticos
• Los métodos de reciente generación no son de aplicación universal, son costosos y tienen
distinta utilidad y precisión.
• La selección e interpretación de sus resultados requiere interacción estrecha entre neumonólogo/infectólogo y el
microbiólogo de manera que , racionalmente, estos métodos aporten orientación útil para las decisiones clínicas.
Equipo multidisciplinario
de salud!!!!
GRACIAS POR SU ATENCIÓN!