Ccm Taller Incertidumbre Micro

Capacitador: Lic. Sergio Gustavo Chesniuk

Email: sergio@chesniuk.com Teléfono: +54 351 4710602

Skype: sergio.chesniuk

Curso-Taller: Estimación de la Incertidumbre de la Medición en Métodos Microbiológicos

Objetivos Generales

Se pretende que al finalizar el curso el participante sea capaz de plantear y

desarrollar el calculo de la incertidumbre de los resultados analíticos microbiológicos siguiendo los lineamientos de la norma

ISO/IEC 17025:2005 o su equivalente nacional

REPASO DE ESTADISTICA

Las herramientas cualimétricas.

¿Por qué mediciones repetidas o replicadas?

Las herramientas cualimétricas. Media y Varianza.

Parámetros estadísticos usados en el tratamiento de datos analíticos

Estimador del valor central

Media aritmética

Estimador de la dispersión

Varianza

Las herramientas cualimétricas. Media y Varianza.

¿Qué mide y que nos indica la

varianza?

Las herramientas cualimétricas. Distribución Normal.

n Media aritmética

Desviación estándar

Población ∞ (n > 30) m s

Muestra (n < 30) sx

Resultados de 50 determinaciones de concentración de NO3- en

0.51 0.51 0.51 0.50 0.51 0.49 0.52 0.53 0.50 0.47

0.51 0.52 0.53 0.48 0.49 0.50 0.52 0.49 0.49 0.50

0.49 0.48 0.46 0.49 0.49 0.48 0.49 0.49 0.51 0.47

0.51 0.51 0.51 0.48 0.50 0.47 0.50 0.51 0.49 0.48

0.51 0.50 0.50 0.53 0.52 0.52 0.50 0.50 0.51 0.51

Tabla de frecuencias para medidas de concentración de ion nitrato

[NO3- / mg/mL] Frecuencia

0.46 1

0.47 3

0.48 5

0.49 10

0.50 10

0.51 13

0.52 5

0.53 3

Herramientas para graficar mediciones repetitivas Histogramas

Curva de distribución

normal

# clases = n

Área total = 1 (100%)

La ecuación de la curva normal

viene dada por la expresión

Los valores de x están distribuidos normalmente con promedio y una varianza 2

]2/)(exp[2

1)( 22

),( 2Nx

Función de densidad de probabilidad normal para distintos valores de m2 y s2.

La desviación estándar, , mide la distancia desde la media, , hasta el punto de inflexión de la curva.

Un 95% de los valores están comprendidos en el interyalo ± 1,9600.

Un 99% de los valores están comprendidos en el intervalo ± 2,576.

Un 99,7% de Ios valores están comprendidos en el intervalo ± 3,290.

Estandarización de variables

Planillas de cálculo, tablas

Intervalos de confianza

Para una distribución normal el 95 % de los datos cae dentro de los límites z=-1,96 a z=1,96 (± 1,96)

Los promedios de las muestras tambien se

distribuyen normalmente

Existe un 95 % de probabilidad de que (estimador de ) este

comprendido en ese rango X

Para muestras grandes (n>30), los límites de confianza de la media vienen dados por :

Donde z depende del nivel de confianza requerido

Para el 95%, z = 1.96Para el 99%, z = 2.58Para el 99.7%, z = 2.97

Las herramientas cualimétricas. Distribución t de Student.

Para muestras pequeñas (n<20), los límites de confianza de la media vienen dados por :

Donde t depende del nivel de confianza requerido y los grados de libertad.

Otras funciones de probabilidad.

Distribución de Poisson

• Es un caso especial de la distribución binomial• Asociada con eventos raros• Tiene a la normalidad cuando l es grande

Las herramientas cualimétricas. Probabilidad estadística

Funciones transformación Distribución normal

Las herramientas cualimétricas. Probabilidad estadística

CONCEPTOS GENERALES DE INCERTIDUMBRE DE UNA MEDICIÓN

La norma ISO/IEC 17025-2005(E). Requisitos técnicos. Descripción

5.4.6.1 Un laboratorio de calibración, o un laboratorio de ensayo que realiza sus propias calibraciones, debe tener y debe aplicar un procedimiento para estimar la incertidumbre de la medición para todas las calibraciones y todos los tipos de calibraciones

5.4.6.2 Los laboratorios de ensayo deben tener y deben aplicar procedimientos para estimar la incertidumbre de la medición. En algunos casos la naturaleza del método de ensayo puede excluir un cálculo riguroso, metrológicamente y estadísticamente válido, de la incertidumbre de medición. En estos casos el laboratorio debe, por lo menos, tratar de identificar todos los componentes de la incertidumbre y hacer una estimación razonable, y debe asegurarse de que la forma de informar el resultado no dé una impresión equivocada de la incertidumbre.Una estimación razonable se debe basar en un conocimiento del desempeño del método y en el alcance de la medición y debe hacer uso, por ejemplo, de la experiencia adquirida y de los datos de validación anteriores.

5.4.6.3 Cuando se estima la incertidumbre de la medición, se deben tener en cuenta todos los componentes de la incertidumbre que sean de importancia en la situación dada, utilizando métodos apropiados de análisis.

Aspectos generales. Factores que influyen en los ensayos.

Resultados Analíticos

Factores Humanos

Confort y Condiciones ambientales

Métodos de ensayosY calibración

Validación de Métodos

Equipamiento

Trazabilidad en las mediciones

Muestreo

Manipulación de los ítems de ensayo y

calibración

Definiciones de incertidumbre.

Parámetro no negativo que caracteriza la dispersión de los valores atribuidos a

un mensurando, a partir de la información que se utiliza

(VIM 2008)

La norma ISO 17025 recomienda que cada resultado vaya acompañado de dos parámetros de calidad

básicos

Trazabilidad

Incertidumbre

Trazabilidad e incertidumbre.

Valor 1 Valor 2

Trazabilidad

Estimación del valor verdadero

Incertidumbre

Incertidumbre y Calidad.

La incertidumbre es el primer índice de calidad de una medida, que es tanto

mayor cuanto menor es aquella

Errores analíticos.

Precisión

Incertidumbre específica

Exactitud

Bias o sesgo

Veracidad relativa

Cuando se refiere a un resultado

Cuando se refiere a un método (n < 30 det)

Cuando se refiere a un método (n > 30 det) | ´ - |

Xxi ˆ

Errores aleatorios o indeterminados

Fluctuantes

Distribución Normal de Gauss

Errores sistemáticos o determinados

Alteraciones operacionales bien definidas

Desviaciones de signo

determinado

Pueden depender o no de la [analito]

Errores crasos o espurios Características similares a los errores sistemáticos con excepción de la magnitud

Exactitud. Precisión y Veracidad.

Proximidad entre el resultado de una medición y el valor verdadero del mesurando. Es la combinación de la precisión y la veracidad (ISO 3534-2: 2006)

En caso de aplicarse a un conjunto de resultados, implica una combinación de componentes aleatorios y una componente de error sistemático común.

Exactitud: Veracidad (bias)

Proximidad entre el promedio de una serie grande de resultados y elvalor verdadero del mesurando (ISO 3534-2: 2006)

Exactitud: Precisión

Proximidad entre los resultados de mediciones independientes, obtenidos bajo condiciones estipuladas (ISO 3534-2: 2006)

Exactitud. Precisión y Veracidad

Precisión (errores aleatorios)

+Veracidad

(errores sistemáticos)

EXACTITUD

Exactitud vs

Precisión

Veracidad vs

Precisión

2) Corrección

Aseguramos la veracidad

Sesgo significativo

Sesgo no significativo

Mi valor individualValor verdaderoMi media

Errores Sistemáticos. Veracidad.

Trazabilidad. Definición de calibración.

Operación que bajo condiciones especificadas establece, en una primera etapa, una relaciónentre los valores y sus incertidumbres de medida asociadas obtenidas a partir de los patrones de medida, y las correspondientes indicaciones con sus incertidumbres asociadas y, en una segunda etapa, utiliza esta información para establecer una relación que permita obtener un resultado de medida a partir de una indicación

VIM 2008

Trazabilidad e incertidumbre. Unidades de masa.

Copias oficialesCopias oficiales

Pesas certificadas

BalanzaBalanza

Futuras medidasFuturas medidas

Unidad base S.I.Kilogramo de

Sèvres

Máximo nivel

Nivel mínimo

(u21 + u2

2 )1/2

(u21 + u2

2 + u23)1/2

(u21 + u2

2 + u23 + u2

IncertidumbreNivel de trazabilidad

Elementos de la trazabilidad.

Cadena ininterrumpida de comparaciones

Incertidumbres determinadas

Documentación

Competencia

Referencia al S.I.

Recalibraciones

Veracidad. ¿Con que REFERENCIAS comparamos?

Métodos primarios o definitivos

Materiales de referencia certificadosMétodos de referencia

Ejercicios de intercomparación

Materiales de referencia de trabajo

Laboratorios de referencia

Instrumentos de referencia

Elaboración de materiales de referenciaMuestras

adicionadasTécnicas

alternativas

Máximo nivelde trazabilidad

Mínimo nivelde trazabilidad

Veracidad y Trazabilidad.

RESULTADO VERAZ

RESULTADO TRAZABLE

Trazabilidad: Medición de masas.

Trazabilidad al S.I.

Instrumento de

medida

Instrumento de

medida

Pesas certificad

Copiasoficiales

Unidad fundament

al S.I.:Kilogramo de Sèvres

Unidad fundament

al S.I.:Kilogramo de SèvresFuturas medidas

hechas con el instrumento de

medida

Futuras medidas hechas con el

instrumento de medida

Trazabilidad e incertidumbre. PMQs.

CRMs, Metodos Referencia, Ejercicios

interlaboratorios, etc.

CRMs, Metodos Referencia, Ejercicios

interlaboratorios, etc.

Método analíticos

Futuras medidasFuturas medidas

Sèvres

Máximo nivel

Nivel mínimo

Incertidumbre

(u21 + u2

2 )1/2

(u21 + u2

2 + u23)1/2

Nivel de trazabilidad

Trazabilidad e incertidumbre. Trazabilidad en el análisis químico.

Verificación de la trazabilidad.

Errores Aleatorios. Precisión. Dispersión de los resultados.

A lo sumo la dispersiónpuede minimizarse

El espectro de la Precisión

Dispersión de resultados de ensayos mutuamente independientes utilizando el mismo método aplicado a alícuotas de la misma muestra en diferentes condiciones: distintos operadores, diferente equipamiento o diferentes laboratorios. La reproducibilidad necesita una especificación de las diferentes condiciones experimentales, las mas frecuentes son: entre días, entre operadores y entre laboratorios.

Dispersión de resultados de ensayos mutuamente independientes, utilizando el mismo método aplicado a alícuotas de la misma muestra, en el mismo laboratorio, por el mismo operador, usando el mismo equipamiento en un intervalo corto de tiempo. Es una medida de la variabilidad (varianza) interna y un reflejo de la máxima precisión que el método pueda alcanzar.

Repetibilidad (ISO)

Reproducibliad (ISO)

El espectro de la Precisión

Repetibilidad

Reproducibilidad

Aumenta variabilidad

ReproducibilidadInterna (precision

intermedia)

Los diferentes parámetros de performance. Precisión

mxpss *0

La función precisión

Importancia de conocer la incertidumbre

Límite legal

Resultados sin incertidumbre

Límite legal

Resultados con incertidumbre

Resultados sin incertidumbre

Laboratorio 1 Laboratorio 2

Resultados con incertidumbre

Laboratorio 1 Laboratorio 2

Errores Aleatorios. Precisión. Dispersión de los resultados.

A lo sumo la dispersiónpuede minimizarse

Cuantificación de la dispersión

Desviación típica o estándar

30 Para1

30 Para

Desviación estándar relativa

30 Para

Varianza: su propiedad mas importante es la aditividad

Desviación estándar de la media.

Información obtenida en la validación del método analítico

ISO o “Bottom-up”

Información obtenida desde ejercicios inter-laboratorios

Simulación de Monte-Carlo

¿Cual es mas conveniente de utilizar?

Las mas empleadas

Incertidumbre. Métodos para valorar las fuentes de incertidumbre.

Distintas estrategias o aproximaciones para el cálculo de la incertidumbre.

Estrategia basada en utilizar la información obtenida en la validación del método (VM)

Estrategia propuesta por la ISO o “Bottom-up”

Estrategia desde ejercicios interlaboratorios

Estrategia “Simulación de Montecarlo”

Naturaleza del método de ensayo y datos metrológicos disponibles (Tipos A y B)

Requisitos del cliente

Especificaciones

Recursos del laboratorio

¿Qué debe tenerse en cuenta al momento de elegir una metodología para estimar la incertidumbre analítica?

Distintas estrategias o aproximaciones para el cálculo de la incertidumbre.

Sistemática común de la estimación de la incertidumbre

EspecificaciónModelado del proceso de medición

IdentificaciónIdentificación de las fuentes de incertidumbre

Cuantificación, Reordenamiento de fuentesCálculo de la incertidumbre estándar

Combinación Cálculo de la incertidumbre estándar

combinadaIncertidumbre a informar

Cálculo de la incertidumbre expandida

Estimación de la incertidumbre ISO. Ventajas.

Metodología general, aplicable a todo tipo de mediciones

Metodología unificada, consistente y bien estructurada

Incorpora el conocimiento disponible sobre el ensayo

Da lugar a estimaciones cuantificables de significado no ambiguo

Mejora el conocimiento de los principios y técnicas analíticas

Estimación de la incertidumbre ISO. Limitaciones.

El analista debe efectuar estimaciones basadas en datos previos o experiencia (Estimaciones tipo B)

El costo en tiempo y esfuerzo es considerable

Debe desarrollarse una expresión matemática entre el mensurando (y) y los parámetros xi sobre los que y depende: y = f(x1, x1 ... xn)

Como alternativa el proceso de medida puede dividirse en bloques y puede calcularse la incertidumbre de cada bloque

La incertidumbre de cada paso se evalúa normalmente mediante análisis estadísticos de una serie de observaciones

Deben evaluarse las covarianzas asociadas a cualquier serie de parámetros que estén correlacionados

Presenta tendencia a subvalorar la incertidumbre

Estimación de la incertidumbre ISO. Combinación de la distintas fuentes de incertidumbre.

Aplicación de la ley de propagación de errores

Coeficiente de sensibilidad

Magnitudes de entradano correlacionadas

Magnitudes de entradacorrelacionadas

Obtención de la incertidumbre expandida

Se multiplica la incertidumbre estándar combinada por un factor de cobertura, k.

Está basado en distribuciones normales.

Garantiza que el intervalo valor medido U contiene el valor verdadero con una cierta probabilidad:

Obtención de la incertidumbre expandida

Determinación de GL para incertidumbres de tipo B

Determinación de GL efectivos (ecuación de Welch-Satterthwaite)

Estimación de la incertidumbre a partir de resultados de Ejercicios Interlaboratorios.

VentajasEngloba las fuentes y facilita enormemente la estimación de la incertidumbre.

Inconvenientes• No disponibilidad de los datos del ejercicio

interlaboratorio.

• La incertidumbre determinada puede no ser representativa del laboratorio

Los resultados obtenidos desde una participacion en un ejercicio entre

laboratorios pueden utilizarse a los fines de cuantificar la incertidumbre de los resultados generados (Condiciones de

reproducibilidad)

Repetibilidad

Reproducibilidad

Aumenta variabilidad

Información desde ejercicios inter-laboratorios

Cuantificación bajo máxima agrupación de las fuentes

de incertidumbre

Incluye factores individuales intrínsicamente desconocidos

Ventajas

Los errores sistemáticos y aleatorios que ocurren dentro de los laboratorios individuales se convierten en errores aleatorios entre laboratorios cuando se observan desde un nivel superior

Selección de los laboratorios

Limitaciones

Disponibilidad de información interlaboratorio

Las estimaciones de la reproducibilidad individual pueden no ser representativas Algunos de los componentes de la incertidumbre (muestreo, pretratamiento) pueden no estar incluidos Diferencias entre medidas pasadas y condiciones actuales del laboratorio

Estimación de la incertidumbre a partir de información de la Validación del Método.

VentajasImplica podo esfuerzo adicional pues siempre debe determinarse trazabilidad y precisión en condiciones de reproducibilidad interna.

Menos costosa que la aproximación ISO

InconvenientesNo disponibilidad de un adecuado material de referencia con elevada jerarquía metrológica.

Pueden existen factores que pueden no variar representativamente al momento de determinar la trazabilidad.

No permite cuantificar las fuentes de manera individual.

En ocasiones es dificultoso el diseño experimental para cuantificar alguna fuente de incertidumbre.

Sobrestimación de algunas fuentes de incertidumbre.

En el Proceso de Verificación de la Trazabilidad (PVT ) se genera información en condiciones intermedias de reproducibilidad

idadproducibilsesgo uuU Re22*2

Se deben incluir todas las fuentes de variación en el método analítico

Cómo informar la Incertidumbre cuando se tiene distribución normal.

Expresión de la incertidumbre

± Intervalo de confianza (U)

El último dígito significativo en el resultado y en la incertidumbre deberán coincidir

(1,23 ± 0,08) mg/L (1,2305 ± 0,08) mg/L (1,234 ± 0,083) mg/L

Estimación de la Incertidumbre de una

Medición Microbiológica

“Uncertainty of Quantitative Determination Derived by

cultivation of micro Organisms”Publication J3/2003

Centre for Metrology and Accreditation

Helsinki- Finland

(Seppo I. Niemelä)

Estimación de la incertidumbre en Métodos de Ensayos Microbiológicos.

Resultado del ensayo

Valores observados

Mediciones

Incertidumbre

Incertidumbre estándar relativaw

Incertidumbre estándar combinadauc , uy o wy

Incertidumbre expandidaU=kuc

k: F(distribución de probabilidad). Ej: Poisson o binomial negativa

Instrumentos cuantitativos

Suspensión de ensayo Suspensión final

Instrumentos

Sistema de tubos

Sistema de placas

“Resultado: x (unidades) con una incertidumbre estándar uc (unidades)”

± Intervalo de confianza (U)

El último dígito significativo en el resultado y en la incertidumbre deberán coincidir

“Resultado: x (unidades) con una incertidumbre estándar uc (unidades)”

y = x*10k

y = 1300000 g-1 con una incertidumbre del 25%

y = 1.30 * 106 g-1 con una incertidumbre estándar 0.33 * 106 g-1

Principios de estimación de la incertidumbre

Tipo A

Tipo BOtros

medios

Ley de Propagación de las incertidumbres

Hallazgo de las fuentes predominantes

Fuentes de información

Calibración

Análisis de varianza de mediciones ya realizadas

Suposición de distribuciones estadísticas (Poisson, binomial) o (rectangular y triangular)

Experiencia, fabricantes de equipos, especificaciones, literatura científica, experiencia de errores instrumentales, homogeneidad de materiales, reportes de

calibración y certificación, valores de incertidumbres citados en handbooks

Distribución rectangular

Distribución triangular simétrica

Distribución triangular asimétrica

Cálculo de la incertidumbre combinada

Ley de propagación de incertidumbres

Variables dependientes

Coeficiente de correlación

Transformación de escala

“El error relativo de una cantidad es aproximadamente igual al error absoluto de su logaritmo”. Myrberg (1952) base e

Características metrológicas de los métodos de cultivo microbiológicos

Detectores

Detector de recuentos de colonias (placas de Petri)

Detector presencia/ausencia(tubos)

Una placaNº de colonias

Volumen de la suspensión final

Múltiples placas

MPN a una dilución

MPN a dilución múltiple

Resultados de ensayos confirmados

Confirmación In Situ

Confirmación total

Confirmación parcial

Confirmación universal

Estimación de componentes de la incertidumbre

Incertidumbre de lectura

Incertidumbre de F

Incertidumbre de la lectura

Incertidumbre media por lectura en una placa

Recuentos repetidos

Incertidumbre combinada media por lectura en varias

placas

Incertidumbre de resultados MPN

Generalmente no disponible

Dispersión de Poisson

Recuento simple de colonias

Suma de recuentos de colonias

Incertidumbre del volumen de ensayo

Repetibilidad de l dispositivo de medición (llenado y vaciado)

Especificación del fabricante de glassware

Efectos de la temperatura (Tcalibración vs Tmedición)

Un volumen de ensayo

Suma de volúmenes de ensayo

Incertidumbre de recuentos confirmados

Confirmación general en instrumentos de placas múltiples

Confirmación dilución-específica en un instrumento de placas múltiples

Confirmación placa-específica en un instrumento de placas múltiples

No suele ser necesario suponer condiciones en cada placa del instrumento de placas múltiples

En caso de ser necesario debe trabajarse como en “Confirmación dilución-específica en un instrumento de placas múltiples”

El factor de dilución

a: Suspensión microbianab: Diluyente estéril

Incertidumbre del factor de dilución

K etapas similares

Si difieren en configuración de volúmenes

Modelos matemáticos de resultados de ensayos cuantitativos y sus incertidumbres

Correcciones sistemáticas para: • Factor de dilución• Coeficiente de confirmación

Variables para métodos de recuento cuantitativo de colonias

• Factor de dilución: F• Volumen para ensayo v• Número de colonias z• Coeficiente de confirmación p

Tiempo y temperatura de incubación• Se asume estricta adhesión a

los prescripto por las normas

Instrumento monoplaca

Wt: Incertidumbre relativa personal por lectura

Diseños multi-placas. General

p: Coeficiente de confirmación derivado de analizar un subconjunto de las colonias

Diseños multi-placas. Recuentos confirmados

Instrumento MPN. Dilución simple

Instrumento MPN. Dilución simple. Incertidumbre del volumen promedio de ensayo

Instrumento MPN. Dilución simple. Incertidumbre relativa de la estimación MPN

i) Al 95% de confianza

ii) Un “error estándar del log10MPN puede convertirse a incertidumbre relativa wMPN simplemente transformando a escala logarítmica natural (multiplicando por 2.303)

iii) Sin otras fuentes de información, la incertidumbre relativa estándar puede obtenerse suponiendo que el numero s de tubos estériles es una cantidad aleatoria que varia acorde a la distribución binomial. Por lo tanto su varianza es s(n-s)/n

Instrumento MPN. Dilución simple. Incertidumbre combinada del resultado

Instrumento MPN. Dilución múltiple.

Intervalos al 95% de confianza de distribuciones sesgadas

Las distribuciones estadísticas de los ensayos microbiológicos son mas o menos sesgados (asimétricos) prácticamente sin excepción

Una adición o sustracción aritmética simple de una incertidumbre expandida no siempre da una estimación satisfactoria del intervalo de confianza al 95% para

resultados de ensayos microbiológicos

Intervalos al 95% de confianza de distribuciones sesgadas. Estimación por el uso de distribuciones de probabilidad

El modelo de Poisson Aplicable cuando:

• Observado < 25• Dilución innecesaria• Hasta 100 por placa

Intervalos al 95% de confianza de distribuciones sesgadas. Estimación por el uso de distribuciones de probabilidad

El modelo binomial negativo

• Se aplica cuando la incertidumbre procedimental no es despreciable

• Debe excluirse la incertidumbre de la distribución • Debe incluir otras componentes pre-analíticas como

la variabilidad de muestreo• Hasta 100 por placa

Intervalos al 95% de confianza de distribuciones sesgadas. Aproximación general.

Intervalos al 95% de confianza de distribuciones sesgadas. Resultados basados en recuentos bajos

Condición de aceptabilidad

Intervalos al 95% de confianza de distribuciones sesgadas. Métodos MPN

Los intervalos son provistos por programas de computación (o tablas)

Un atajo al calculo de la incertidumbre para instrumentos multi-placa

Estadístico “ratio log-likelihood”

Confirmación

• Cada recuento presuntivo debe ser convertido a su correspondiente recuento confirmado.

• Si solo una parte de las colonias son confirmadas deben aplicarse los coeficientes respectivos.

Modelos completos para correcciones sistemáticas y sus incertidumbres

Naturaleza de las correcciones sistemáticas en microbiología

Errores espurios: • Contaminación, antibioticos, interacciones competitivas entre colonias• Temperatura

Errores sistemáticos: • Inhabilidad ocasional de una partícula viable para expresarse como colonia

reconocible• Solapamiento geométrico de colonias vecinas• Desvío sistemático del estilo de recuento• Disminución del rendimiento de un lote de medio

Ejemplo 1. Placa simple muestra no diluida

Se siembra una placa simple con un 1 ml (loop calibrado). Su incertidumbre relativa es de 12 % (wv = 0,12)z = 75

Mensurando: y = z/v

Dispersión de Poisson

Replicados de muestras o muestras control en condiciones de reproducibilidad (ISO TS 19036)

Elementos y suposiciones para calcular la incertidumbre

Muestras de control (no estándares)

Todas las etapas del método

Duplicado, en diferentes días, diferentes analistas, diferentes equipos,

Diferentes batchs de reactivos

Se asume que la matriz empleada es representativa de las muestras

American Association for Laboratory Accreditation

¿Cuáles son las etapas para calcular la incertidumbre?

1. Transformar en log10 los datos de CFU (columna 2 y 4)

2. Calcular la media global de los 40 resultados (columnas 2 y 4) . Su valor: 1.9219

3. Calcular la diferencia entre los replicados transformados (columna 5)

4. Elevar al cuadrado las diferencias entre los replicados transformados (columna 6)

5. Sumar las diferencias (columna 6) y dividirlas por 2n, donde n es el total de pares duplicados (en este caso n=20). El valor es: 0.00919

6. Tomar la raíz cuadrada del resultado obtenido en el paso anterior. Este valor , 0.0959, representa a la desviación estándar conjunta de reproducibilidad

7. Convertir esta desviación estándar en desviación estándar relativa dividiendo por el valor medio obtenido en la etapa 2. De acuerdo a esto RSD = 0.0499

8. Para expandir el rango de valores , aplicar el factor de cobertura k=2 (95% de confianza). La RSD obtenida es: 0,098 (valor en log10 )

9. Para calcular la incertidumbre del resultado de cualquier otra muestra que llegue al laboratorio, su resultado debe ser transformado a logaritmo decimal y multiplicado por 0,098. Esta incertidumbre expandida debe sumarse y sustraerse al logaritmo en base 10 obtenido.

10. Para estimar la incertidumbre de la muestra, convertir el valor logarítmico (volver) a UFC. Este valor debe ser acompañado por el antilogaritmo de los extremos del intervalo obtenido en el punto anterior. Convencionalmente, el resultado del extremo inferior debe redondearse hacia abajo y el extremo superior debe redondearse hacia arriba.

Replicados de recuperación para muestras o muestras de control (ISO TS 19036)

Elementos y suposiciones para calcular la incertidumbre

Suposición de que la recuperación es razonablemente constante para determinados organismos en determinadas matrices .

La variabilidad de la recuperación en el tiempo refleja a varias fuentes de incertidumbre

Una misma cantidad de inoculo es sembrada con y sin la matriz de interes.

Las diferencias entre cada conjunto es una medida de la recuperación del organismo expresada como un %

• Error aleatorio natural

• Equipamiento

• Condiciones ambientales

¿Cuáles son las etapas para calcular la incertidumbre?

1. Transformar los valores de CFU a log10 (columna 1 y 3)

2. Calcular el % de recuperación de los valores logarítmicos dividiendo la columna 4 por la columna 2 y multiplicando por 100.

3. Calcular la media y desviación estándar del % de recuperación de los valores logarítmicos (97.0% y 3.6% respectivamente). La desviación estándar es un estimado de la incertidumbre estándar combinada.

4. Transformar a incertidumbre expandida multiplicando el valor anterior de desviación estándar por k=2 (7.2 %)

Desde Ejercicios Inter-Laboratorio (EIL)

Proviene de: ISO TS 21748: Guidance for the use of repeatability, reproducibility and trueness estimates in measurement uncertainty estimation.

El EIL debe cumplir los requisitos de: ISO 5725-2: Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results – Part 2: Basic method for the determination of repeatability and reproducibility of a standard measurement method.

Se sobreestima la incertidumbre calculada

Se requiere demostrar que el laboratorio es competente.

Se incluyen todas las etapas del proceso de medicion

Protocolo sugerido para el calculo de la incertidumbre desde EIL

1. Asegurase de que se dispone de un diseño de estudio de validación y análisis de datos apropiado (que incluya remoción de outliers, cálculos estadísticos, análisis de efectos de concentración, etc.) y que las estimaciones de Repetibilidad ( Sr) y Reproducibilidad (SR) son apropiadas para el uso en el laboratorio.

2. Tomar la estimación de la Reproducibilidad como una estimación provisoria de la incertidumbre de la medición ( u´ ): .

3. Utilizar la estimación de la Reproducibilidad y Repetibilidad para calcular la SD entre laboratorios (S L) de la siguiente manera:

4. Estimar el sesgo del laboratorio (BL) desde mediciones replicadas de materiales de referencia comparando con laboratorios de referencia o desde interlaboratorios de aptitud: BL = (Media del Laboratorio – Valor de Referencia)

5. Estimar la repetibilidad del laboratorio (S i) desde un estudio interno, el cual puede haber sido realizado previamente. Debe estar basado en al menos 10 replicados. Nota 1: Si la estimación del sesgo del laboratorio (BL) es menor que SL puede saltearse el paso 6. Si la repetibilidad Si es menor que Sr puede saltearse el paso 7 (pero considerar paso 7c)

6. Calcular el criterio de aceptabilidad para el sesgo del laboratorio de la siguiente manera: Sesgo limite = 2xSL. Si |BL| < Limite de sesgo el sesgo del laboratorio es aceptable para el uso de este procedimiento. En caso de superar el limite verificar las razones y corregir si es posible.

7. Calcular el criterio de aceptabilidad para la repetibilidad: Limite de precisión = 1,5xSr

a) Si Si < limite de precisión la precisión es aceptable para este procedimiento

b) Si Si > limite de precisión el procedimiento puede aun emplearse, pero la incertidumbre provisoria debe ser expandida de la siguiente manera:

c) Si Si es mucho menor que Sr el laboratorio podrá querer disminuir la estimación provisoria de la incertidumbre usando e mismo calculo que en el paso 7.b.

Protocolo sugerido para el calculo de la incertidumbre desde EIL

Nota 2: ISO TS 21748 requiere una prueba F, basada en el número de resultados en el estudio de validación y el número de resultados utilizados por el laboratorio para estimar la repetibilidad. Para el número mínimo de resultados en un estudio aceptable, y al menos 10 replicaciones en el estudio de repetibilidad, el límite de precisión en este paso es el criterio más apretado que se obtendría.

8. Agregar componentes de variabilidad (Sa1, Sa2, etc.) que no hayan sido incluidos en el experimento de validación, tales como submuestreo o preparación de la muestra. Pueden haber mas de una componente adicional. Agregar la componente(s) adicional a la estimación provisoria (u´) para generar la estimación final de la incertidumbre combinada estándar:

9. Calcular la incertidumbre expandida con el 95% de cobertura y k = 2 de la siguiente manera: U = 2xu

Nota 3: Si la estimación de la incertidumbre es un %, la incertidumbre actual deberá ser calculara para cada muestra a su nivel respectivo.

Nota 4: Los extremos del intervalo de incertidumbre deberán ser calculados con calores log10 y luego vueltos a transformar a UFC.

Ejemplo: AOAC método 990.12. Recuento en placa. Aeróbicos

Parámetros del Ejercicio Inter-Laboratorio

• 8 laboratorios• 6 alimentos con distintos niveles de contaminación• 2 muestras por alimento• 2 replicados por muestra• E conjunto de datos es cconsistente con ISO 5725-2• El EIL incluye todas las etapas del procedimiento analítico excepto el submuestreo

Para estimar el sesgo (paso 4) el laboratorio realiza un estudio de comparación con un laboratorio de referencia y los resultados para vegetales y camarones estuvieron siempre dentro de del 10% (BL < 10.0%) . La comparación con muestras de harina mostraron resultados por debajo de 5% (BL < 5.0%). Se declara al sesgo como aceptable.

Para estimar la repetibilidad (paso 5) el laboratorio generó una estimación con una serie de 10 replicados, y la repetibilidad para todos los alimentos fue del 5% o menos (S i < 5.0%). Se decide entonces que la repetibilidad es aceptable, así las estimaciones (bajas) de la incertidumbre provisoria pueden ser calculadas como se describe en el paso 7c (empleando la formula de 7b)

En consideración a componentes adicionales (paso 8), asumimos que al preparacion de la muestra (sub-muestreo, pesada) es estimada en un 3,0% de incertidumbre adicional.

Este componente fue agregado como se describe en el paso 8, y la incertidumbre final fue expandida de acuerdo a (9).

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