Cinética enzimática

CONCEPTO DE ENZIMA

• Los enzimas son catalizadores muy potentes y

eficaces, químicamente son proteínas. Como

catalizadores, los enzimas actúan en pequeña cantidad

y se recuperan indefinidamente.

• No llevan a cabo reacciones que sean

termodinámicamente desfavorables (no varian el ∆Gr),

no modifican el sentido de los equilibrios químicos, sino

que aceleran su consecución.

aumenta la fracción de moléculas que tienen las energía

suficiente para alcanzar el estado de transición

Continuación…

• Las enzimas, a diferencia de los catalizadores inorgánicos catalizan reacciones específicas. Sin embargo hay distintos grados de especificidad.

• La enzima sacarasa es muy específico: rompe el enlace b-glucosídico de la sacarosa o de compuestos muy similares.

• Entre los enzimas poco específicos están las proteasas digestivas como la quimotripsina, que rompe los enlaces amida de proteínas y péptidos de muy diverso tipo.

NOMENCLATURA DE LOS ENZIMAS

– nombres particulares

– Nombre sistemático:

3 partes:

el sustrato preferente - el tipo de reacción realizado – terminación “asa“.

Ej: glucosa fosfato isomerasa que cataliza la isomerización de la glucosa-6-

fosfato en fructosa-6-fosfato. Si es hidrólisis, el segundo componente del

nombre se omite y por ejemplo, la lactosa hidrolasa se llama simplemente

lactasa.

– código de la comisión enzimática (enzyme comission): encabezado por las

letras EC (enzyme commission), seguidas de cuatro números separados

por puntos:

Clase . Subclase . grupos químicos específicos que intervienen en la reacción.

Clase 1: OXIDORREDUCTASAS

Clase 2: TRANSFERASAS

Clase 3: HIDROLASAS

Clase 4: LIASAS

Clase 5: ISOMERASAS

Clase 6: LIGASAS

Enzimas

Factores físicos y termodinámicos que desfavorecen

una Rx enzimática:

• Variación de entropía

• Capa de solvatación

• Distorsión de los sustratos

• Alineamiento inadecuado

de los grupos funcionales

Barreras superadas por

la ENERGÍA DE

FIJACIÓN

Energía procedente de

la interacción enzima-

sustrato

La enzima superóxido dismutasa (SOD) cataliza la dismutación de

superóxido en oxígeno y peróxido de hidrógeno.

Simulación de la droga PPI a la proteina Src

quinasa: topología y cargas complementarias (sitios de

reconocimiento en regiones de unión de elem. de estr. secundaria)

Simulación de la droga PPI a la proteina Src

quinasa: topología y cargas complementarias (sitios de

reconocimiento en regiones de unión de elem. de estr.

secundaria)

El sitio activo involucra aminoacidos separados

en la secuencia primaria (ejemplo: lizosima)

Metodos de catálisis enzimatica

• Provee una superficie de reacción (sitio activo)

• Provee un entorno adecuado (hidrofóbico)

• Permite el acercamiento de los reactivos

• Posiciona a los reactivos correctamente para la reacción

• Forma interacciones débiles con los reactivos

• Provee catálsis ácida/básica

• Provee nucleófilos

Estructura y función de enzimas

van der Waals

H-Bond

Ionic

H3C

C

C

O

O

O

• Ionicas

• Pte de H

• van der Waals

Fuerzas de enlace

Ejemplo: Unión de piruvico a LDH

O

H

H3N

H-Bond

Ionic

bond

Interacciones posibles vdw-interactions

H3C

C

C

O

O

O

Unión al sustrato

Mecanismos catalíticos

• Histidine

Catálisis ácido/base

Ataque nucleofílico

NNH

+H

-H NNH

H

No-ionizada

Actua como base

(sumidero de protones)

Ionizado

Actua como ácido

(fuente de protones)

H3N CO2

OH

H

L-Serine

H3N CO2

SH

H

L-Cysteine

Estabilizacion de

este complejo

Mecanismo de la ribonucleasa pancreatica

Hidroliza polirribonucleótidos en los enlaces Py-X, siendo Py un

nucleótido pirimidínico (C, U) y X cualquier otro nucleótido.

Definiciones

a A + b B c C + d D

va

d A

dt b

d B

dt c

d C

dt d

d D

dt

1 1 1 1[ ] [ ] [ ] [ ]

•Se define velocidad de reacción como:

•Se llama ley de velocidad a:

),( ncomposicióTfv

•Consideramos una reacción arbitraria

El quid de la cuestión es

hallar esta f.

Debe determinarse

experimentalmente

Orden de reacción y constante de

velocidad

En muchos casos: ...][][])[( FBATkv

k = constante de velocidad

de reacción.

= orden de reacción respecto

al componente A.

= orden de reacción respecto

al componente B.

+ +…+ = orden total de

reacción.

Ejemplos sencillos

• Primer orden • Segundo orden

][][

][),(

Rkdt

Rdv

RkncomposicióTf

integrando

ktRR

eRR kt

0

0

][ln][ln

][][

2

2

][][

][),(

Rkdt

Rdv

RkncomposicióTf

ktRR

0][

1

][

1

integrando

Gráficos de primer orden

CH3NC CH3CN v= [CH3NC]

Gráficos de segundo orden

NO2 + CO NO + CO2 v= [NO2]2

Para una reacción química común, la velocidad en el tiempo cae debido a:

• Disminuye la concentración de reactivo

• La reacción inversa se hace importante al aumentar la [P]

• La reacción alcanza un equilibrio

P o S

tiempo

Para una enzima, la velocidad en el tiempo cae debido a:

Disminuye la concentración de reactivo (sustrato)

• La reacción inversa se hace importante al aumentar la [P]

• El producto puede inhibir a la enzima

• Cambios de PH o temperatura pueden modificar a la enzima en el curso de la reacción

• Al disminuir la [S] puede disminuir la saturación de la enzima

Unidades de actividad enzimática

Unidad internacional: cantidad de enzima que cataliza la formación

de 1 micromol de producto por minuto en condiciones óptimas

Katal: cantidad de enzima que cataliza la formación de 1 mol de

producto por segundo en condiciones óptimas.

La cantidad de una enzima entonces se expresa usando una

VELOCIDAD

La concentración de una enzima es la cantidad de enzima

(expresada en unidades) por unidad de volumen

La actividad específica de una enzima es la cantidad de enzima

(expresada en unidades) por miligramo de proteína

El mecanismo de Michaelis-Menten

1/v

1/[S])

La representación más utilizada, no es la más recomendable ya que da

impresiones extremadamente engañosas de los errores experimentales: así para

pequeños valores de v, pequeños errores en la medida de v, conducen a grandes

errores en 1/v, mientras que para valores grandes de v los mismo pequeños

errores en la medida de v conducen a errores apenas apreciables en 1/v.

Si multiplicamos ambos miembros de la ec. de dobles inversos, por [S], obtendremos,

La representación de [S]/v frente a [S], da una recta:

y = b + m x

- Esta representación se conoce como representación de Hanes, representación de

Woolf o de Hanes-Woolf.

2.2. Representación de Hanes

S

VV

Km

v

S

max

1

max

S

SV

Km

Vv

1

maxmax

11

maxmax V

S

V

Km

v

S

[S]/v

[S]

Km/Vmax

- Km

m = tg = 1/Vmax

Pendiente = 1/Vmax

corta en el eje [S]/v en un punto = Km/Vmax,

corta en el eje [S] en un punto = - Km

* En esta representación, como puede verse en la siguiente figura, los errores en [S]/v

son un reflejo mucho más fiel de los errores cometidos al medir el valor de v. Por este

motivo, la representación de Hanes es preferible a otras linealizaciones de la ecuación

de Michaelis-Menten.

[S]/v

[S]

¿Cómo afectarán los errores de medida de la velocidad de reacción en esta

representación?

Si multiplicamos ambos miembros de la ecuación de inversos por v * Vmax

obtenemos,

Vmax = v + (Km v)/[S]

y reordenando

y = b - m x

Esta representación se conoce como representación de Eadie-Hofstee

2.3.Representación de Eadie-Hofstee.

S

vKmVv max

max

1

maxmax

11vV

SV

Km

Vv

La representación de v frente a v/[S] nos da una recta de:

- pendiente = -Km

- corte en el eje v = Vmax

- corte en el eje v/[S] = Vmax/Km

v

v/[S]

Vmax

Vmax/Km

m = tg = -Km

Esta representación en general proporciona resultados

realmente buenos, ya que v aparece en ambas coordenadas

como factor multiplicativo, por lo que los errores cometidos en la

medida de v, harán que la curva se acerque o aleje del origen en

lugar de hacerlo paralelamente al eje de ordenadas.

v/[S]

v

Esta representación, contrariamente a la

de dobles inversos que hace aparecer

como buenos malos resultados, hace

aparecer como malos, buenos resultados,

dificultando grandemente el ocultamiento

de puntos que se desvíen de la recta.

Aspectos Positivos

Aspectos Negativos

Por lo que esta representación es la más adecuada para el

estudio de comportamientos que se desvíen del modelo de

Michaelis-Menten.

2

0

0

0

maxM

M

cat

S

maxcatS

vKSv

SK

EkvL

vEkvL

Mecanismo de Michaelis-Menten

[S]

0 10 20 30d[P]/dt

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

vmax

0,5 vmax

KM

Competicion de sustratos

KM y Vmax dependen del enzima y del sustrato

Supongamos 2 proteinas A y B hidrolizadas por el mismo enzima

Si las [A] y [B] son chicas ([A] <<KM,A y ([B] <<KM,B)

EFECTO DEL pH SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA