INGENIERIA DE PROTEINAS

Jaime Eyzaguirre

INGENIERÍA: Ciencia o arte que realiza aplicaciones prácticas a partir de los conocimientos que nos dan lasciencias básicas

EN EL AREA BIOLOGICA: Bioingeniería, ingeniería genética, ingeniería de proteínas.

OBJETIVOS DE LA INGENIERÍA DE PROTEINAS: Construir nuevas proteínas o modificar proteínas ya existentes con el fin de obtener productos con propiedadesnuevas o diferentes.

OBJETIVOS A NIVEL DE CIENCIAS BASICAS

-Ampliar nuestros conocimientos sobre la relaciónentre estructura y función de proteínas

OBJETIVOS A NIVEL DE CIENCIAS APLICADAS

- Producir proteínas más efectivas y más estables confines industriales o terapéuticos.

PROPIEDADES DE ENZIMAS QUE PUEDEN SER MODIFICADAS

- Propiedades cinéticas (KM y kcat)- Termoestabilidad y temperatura óptima- Estabilidad y actividad en solventes no acuosos- Especificidad de sustrato- Requerimiento de cofactores- pH óptimo- Resistencia a proteasas- Regulación alostérica- Tamaño y estructura de sub-unidades

METODOS PARA LLEVAR A CABO INGENIERIA DE PROTEINAS

Genéticos (los más utilizados): Síntesis total de genes nuevos Mutagénesis al azar Mutagénesis sitio-dirigida

(óptimo: combinación de los dos últimos)

Químicos: Modificación química de proteínas Síntesis total de péptidos (Merrifield) Semi-síntesis

MUTAGENESIS SITIO-DIRIGIDA(diseño racional)

- Modificaciones en la secuencia nucleotídica (reemplazo de una base por otra) (el más común)- Deleciones- Inserciones

Ventajas: se puede planificar el lugar y tipo de mutación que se desea realizar.

Desventajas: ¿dónde realizar la mutación? Se requiere conocimiento PREVIO de propiedadesde la proteína (estructura; mecanismo de acción).Purificación de la enzima mutada y determinaciónde sus propiedades.

MUTAGENESIS AL AZAR

- Química (nitrosoguanidina)- Por radiaciones (ultravioleta, rayos X)- Evolución dirigida (errores introducidos por Taq polimerasa)

Ventajas: - Permite seleccionar por aquella propiedad que se deseamejorar (por ej.: estabilidad térmica).- No requiere conocimiento previo de la estructura y mecanismo- Las mutantes se pueden mejorar en mutagénesis sucesivas

Desventajas: - Requiere el análisis de muchos clones. - Se necesita un método de selección sensible y eficiente.

Caso particular: “DNA shuffling” (DNA barajado)

BIODEGRADACION DE LA LIGNOCELULOSA

- Madera (blanda o dura)

- Plantas anuales (cultivos: gramíneas, etc.)

- Desechos agrícolas (paja, corontas de choclo, etc.)

¿POR QUE ES VALIOSA LA LIGNOCELULOSA?

¿DONDE HAY LIGNOCELULOSA

- Material renovable

- Producido por la fotosíntesis en las plantas verdes

¿DE QUE ESTA COMPUESTA LA LIGNOCELULOSA?

-Dos polisacáridos:celulosa (polímero de glucosa)hemicelulosas (polímeros de manosa o xilosa)

-Un polifenol:la lignina

¿COMO ESTA ESTRUCTURADA¿COMO ESTA ESTRUCTURADALA LIGNOCELULOSA (MADERA)?LA LIGNOCELULOSA (MADERA)?

¿QUE ES LA BIODEGRADACION (OSACARIFICACION) DE LA LIGNOCELULOSA?

- El tratamiento biológico de la lignocelulosa, preferentemente por enzimas, para obtener (por hidrólisis) sus componentes fundamentales (monosacáridos de azúcares)

¿QUE PUEDE HACERSE CON LOSPRODUCTOS DE HIDRÓLISIS?

- Materias primas para la síntesis química- Fermentación para producir alcohol (combustible)- Alimento de animales

¿DONDE SE OBTIENEN LAS ENZIMASPARA LA SACARIFICACION DE LA

LIGNOCELULOSA?

- Estas enzimas son producidas por numerosos bacterios

y hongos.

- Microorganismos del suelo (aerobios) y del rumen de losrumiantes (anaerobios)

- En su mayor parte son secretadas al medio(los componentes de la lignocelulosa son muypoco solubles o insolubles)

¿QUE NOS INTERESA A NOSOTROS?

- Biodegradación del xilano

- Enzimas participantes: purificación, caracterización¿Qué función desempeñan?

- Uso de un hongo como modelo

Xylp: -D-xilopiranosa, Araf: -L-arabinofuranosa, -D-Me-GluA: ac.4-O-metil--D-glucurónico, Ac: ácido acético, Ph: ácidos cinámicos

1 endoxilanasas, 2 -L-arabinofuranosidasas, 3 glucuronidasas, 4 acetil xilano

esterasas, 5 cinamoil esterasas

ESTRUCTURA Y BIODEGRADACION DEL XILANO

MODELO DE ESTUDIOMODELO DE ESTUDIO

Penicillium purpurogenumPenicillium purpurogenum: hongo de pudrición: hongo de pudriciónblanda aislado de suelo de bosques del sur de Chileblanda aislado de suelo de bosques del sur de Chile

Se han purificado y caracterizado:

- endoxilanasas A y B- acetil xilano esterasas I, II y III- arabinofuranosidasas 1, 2 y 3- -xilosidasa- feruloil cumaroil esterasa

LAS ACETIL XILANO ESTERASAS

32

- Hidrolizan enlaces éster entre grupos acetato y xilosa de la cadena principal

Conteo de esporas y posterior inoculación (2 x 107 por 500 ml)

Agar papa-dextrosa 28 ºC x 6 días

Filtración

NaCl al 9%

¿CÓMO SE CULTIVA EL HONGO?

Mandels-xilano acetilado 1%

28 ºC x 8 días a 200 rpm

Filtración

Sobrenadante de cultivo

Influencia de la fuente de carbono sobre la producción de acetil esterasas y acetil xilano

esterasas por Penicillium purpurogenum

Ultrafiltración

Precipitación con (NH4)2SO4

corte 40% y 90%

Unión a celulosa

Cromatografía de intercambio catiónico

(CMC50 Sephadex)

Cromatografía de interacción hidrofóbica(Fenil agarosa)

Cromatoenfoque rango pH 7-4

Cromatografía de filtración molecular (G 75 Sephadex)

¿CÓMO SE PUEDEN PURIFICAR LAS ENZIMAS?

Cromatografías

BOMBA PERISTALTIC

AA

COLECTOR

COLUMNA

Perfil de elución de CMC50 Sephadex

• Amortiguador citrato 10 mM pH 4,0.• Lecho de la columna 20 ml (8 x1,8 cm)

Lavado buffer: 7 Vol. de columna Lavado 0,1 M sal: 11 Vol. columna

Gradiente 0,1 - 0,3M sal: 10 Vol. de columna Lavado 0,3 M: 3 Vol. columna

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

2,2

1 11 21 31 41 51 61 71 81 91 101 111 121 131 141 151 161 171 181

Fracciones

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

Abs 230 nmAbs 280 nmAbs 405 nm

0,1 M NaCl

0,3 M NaClI

II

III

IV

A 2

30 y

280

nm

A 4

05 n

m

Zimograma de la actividad acetil esterásica

 

AXEII

AXEI

Días de cultivo 1 2 3 4 5 6 7

Zimograma de CMC50

II III IV

AXE I

AXE II

Determinación del punto isoeléctrico

pH 4,75

B

AXE I

AXE III

1 2 3 4

B: Zimograma, pista 1: AXE I, pista 2 y 3: AXE III, pista 4: Estándar preteñido IEF

pH

A

1 2 3 4

5,1

5,85

7,0

4,75

9,6

A: Gel de isoelectroenfoque, pista 1 y 4: Estándar IEF, pista 2: Anhidrasa carbónica, pista 3: AXE III.

Propiedades de las acetil xilano esterasas de P. purpurogenum.

AXE I AXE II AXE IIIPeso molecular 48 000 23 000 85 700 Punto isoelectrico 7,5 7,8 6,35 pH óptimo 5,3 6,0 5,3 Temperatura óptima 50º 60º 20°

Unión a celulosa si no no

Unión a xilano no no

Especificidad de sustrato de las AXE  Sustrato Actividad U/mg proteina

AXE I AXE II AXE III

α-Naftil acetato (C2) 24,2 7,72 3,09α-Naftil butirato (C4) 0,036 0,11 0,08α-Naftil caprato (C10) n.d. n.d. n.d.α-Naftil miristato (C14) n.d. n.d. n.d.Hemicelulosa de abedul 3,87 0,824 22,77Xilano acetilado de avena 2,85 0,67Xilosa tetraacetato 3,33 0,844Metil ferulato 0,0156 0,0059 n.d.: no detectado

Secuencia aminoacídica de AXE II

M H S K F F A A S L L G L G A A A I P L 20E G V M E K R S C P A I H V F G A R E T 40T A S P G Y G S S S T V V N G V L S A Y 60P G S T A E A I N Y P A C G G Q S S C G 80G A S Y S S S V A Q G I A A V A S A V N 100S F N S Q C P S T K I V L V G Y S Q G G 120E I M D V A L C G G G D P N Q G Y T N T 140A V Q L S S S A V N M V K A A I F M G D 160P M F R A G L S Y E V G T C A A G G F D 180Q R P A G F S C P S A A K I K S Y C D A 200S D P Y C C N G S N A A T H Q G Y G S E 220Y G S Q A L A F V K S K L G 234

  Péptido señal Triada catalítica

Alineamiento de AXE II con AXE de Trichoderma reesei

 

 

Espectro de difracción de AXE II

Derivado yodado de AXE

II

ESTRUCTURA DE LA AXE II DE P. purpurogenum

MUTAGENESIS SITIO-DIRIGIDA POR DELECION

Alteración de la especificidad de sustrato de la acetil xilanoesterasa II (AXE II) de Penicillium purpurogenum.La enzima hidroliza grupos acetilo unidos a la cadena principal del xilano.

ANTECEDENTES- La enzima muestra una gran especificidad por ésteres de ácidos grasosde cadena corta (acetato).- Se conoce la secuencia y estructura tridimensional de la enzima.- Interés biotecnológico por enzimas que sinteticen ésteres de ácidos grasos de cadena larga.- La cutinasa, una enzima que hidroliza ésteres de cadena larga, tiene una estructura tridimensional similar.

¿Cómo modificar la estructura de la AXE II para que utilice ésteres de acidos grasos de cadena larga?

M H S K F F A A S L L G L G A A A I P L1 AXEIIL P T S N P A Q E L E A R Q L G R T T R1 CUTINASA

E G V M E K R S - - C P A I H V F G A R21 AXEIID D L I N G N S A S C A D V I F I Y A R21 CUTINASA

E T T A S P G Y G S S S T V V N G V L S39 AXEIIG S T E T G N L G T L G P S I A S N L E41 CUTINASA

A Y P G S T A E A I N Y P A C G G Q S S59 AXEIIS - - A F G K D G V W I Q G V G G A Y R61 CUTINASA

C G G A S Y S S S V A Q G I A A V A S A79 AXEIIA T L G D N A L P R G T S S A A I R E M79 CUTINASA

V N S F - - - N S Q C P S T K I V L V G99 AXEIIL G L F Q Q A N T K C P D A T L I A G G99 CUTINASA

Y S Q G G E I M D V A L C G G G D P N Q116 AXEIIY S Q G A A L A A A S I - - - - - - - -119 CUTINASA

G Y T N T A V Q L S S S A V N M V K A A136 AXEII- - - - - - E D L D S A I R D K I A G T131 CUTINASA

I F M G D P M F R A G L S Y E V G T C A156 AXEIIV L F G - - - Y T K N L Q N R G - - - -145 CUTINASA

A G G F D Q R P A G F S C P S A A K I K176 AXEII- - - - - - R I P N Y P - - - A D R T K158 CUTINASA

S Y C D A S D P Y C C N G - S N A A T H196 AXEIIV F C N T G D L V C T G S L I V A A P H169 CUTINASA

Q G Y G S E Y G S Q A L A F V K S K L -215 AXEIIL A Y G P D A R G P A P E F L I E K V R189 CUTINASA

- - - - - G234 AXEIIA V R G S A209 CUTINASA

ALINEAMIENTO DE LA SECUENCIA DE AXE IICON LA CUTINASA DE Fusarium solani

La triada catalítica se indica en color azul

Cutinasa Acetil xilano esterasa IIFusarium solani Penicillium purpurogenum

NATIVAS MUTANTE DE DELECION (Δ 104-114)

CUTINASA AXE II

Especificidad de sustrato de AXE II nativa y mutante 

Sustrato AXE IIU/mg

AXE II 104-114

U/mg

-naftil acetato(C 2)

27,4 26,8

-naftil butirato(C 4)

12,4 3,3

-naftil caprato(C 10)

1,42 11,26

-naftil miristato( C 14)

0,67 11,97  

Ensayo realizado con enzimas expresadas en Aspergillus nidulans