Post on 14-Apr-2017
CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES: CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES: FUNDAMENTOS Y APLICACIONES EN FUNDAMENTOS Y APLICACIONES EN
DIFERENTES ESPECIDIFERENTES ESPECIES
CURSO – TALLER DE BIOTECNOLOGIA VEGETAL
Dra. Miriam Isidrón PérezDra. Miriam Isidrón PérezDra. Miriam Isidrón PérezDra. Miriam Isidrón Pérez
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Las plantas Las plantas Las plantas Las plantas desdedesdedesdedesde el laboratorio hasta el campo.el laboratorio hasta el campo.el laboratorio hasta el campo.el laboratorio hasta el campo.
Introducción al cultivo in vitro de plantas.
Desdiferenciación / Rediferenciación.Morfogénesis de novo.
Tipo de respuestas en el cultivo in vitro de
Plática 2.
Tipo de respuestas en el cultivo in vitro de tejidos vegetales:
Organogénesis y Embriogénesis directa e indirecta.
• Existen tres conceptos básicos que fundamentan el cultivo in vitro de células y tejidos vegetales:
- Totipotencialidad celular.
- Balance de reguladores del crecimiento vegetal.
Principales conceptos fisiológicos aplicablesa los cultivosin vitro
•Desdiferenciación / Rediferenciación.
Desdiferenciación / Rediferenciación• En condiciones de laboratorio “in vitro”, se parte de
cualquier planta o de cualquier órgano de la planta(condición es que sean células vivas).
• Se puede obtener el cultivo demeristemos y ladiferenciaciónde brotesy raíces, siempreque se partadediferenciaciónde brotesy raíces, siempreque se partadeun pedazo de la planta (explante) que tenga células vivas,en condiciones y medios apropiados.
• Este es elfundamento fisiológicode la obtención de loscultivos de tejidos vegetales “in vitro”, tanto de plantasdicotiledóneas (tabaco, papa, tomate, etc.) como de plantasmonocotiledóneas ( arroz, maíz, caña de azúcar, etc.).
Desdiferención y Rediferenciación
TROZO DE TALLO CON
YEMA
Se siembra en un medio de cultivo
Explanto(asepsia)
Ambiente
• Sin respuesta
• Cultivo infectado
• Regeneración
indirecta
Respuesta
Posibles respuestas de los cultivos vegetales in vitro
(asepsia)
Cultivo
indirecta
• Regeneración
directa
Desdiferención y Rediferenciaciónproceso
MorfogénesisMorfogénesis de novo: es el resultado de unadivisión y diferenciación celular organizada conpatrones definidos, que depende básicamente dela actividad y expresión de ciertos genes.
Organogénesis Embriogénesis somática
MITOSIS UNIDIRECCIONAL MITOSIS BIDIRECCIONAL
• Posibles vías morfogenéticas:
- Organogénesis
- Embriogénesis
• Diferencias entre las dos posibles vías:
- La organogénesis es de origen pluricelular. Un grupo o cluster de células del explanto inicial se desdiferencia inicialmente para luego rediferenciarse dando lugar a un
Existen dos posibles vías morfogenéticas implicadas enla diferenciaciónde novo de brotes y/o plantas completas
inicialmente para luego rediferenciarse dando lugar a un órgano vegetal. No se obtienen por esta vía plantas completas. MITOSIS UNIDIRECCIONAL
- La embriogénesis se presupone de origen unicelular.Una célula del explanto se aísla y constituye el puntode partida para la obtención de un embrión somático.Se diferencian embriones o estructuras bipolaresque completan cada una de las etapas implicadasen la ontogenia de un embrión cigótico. El resultado es una planta completa. MITOSIS BIDIRECCIONAL
- Organogénesis :-Es de origen pluricelular.-Un grupo de células del explante inicial se desdiferenciainicialmente para luego rediferenciarse dando lugar a unbrote o a un órgano vegetal.- LA DIVISION MITOSICA ES UNIDIRECCIONAL.
- Embriogénesis :-Se presupone de origen unicelular.-Se presupone de origen unicelular.- Una célula del explante se aísla y constituye el punto departida para la obtención de un embrión somático.-Se diferencian embriones o estructuras bipolares quecompletan cada una de las etapas implicadas en laontogenia de un embrión cigótico.-LA DIVISION MITOSICA ES BIDIRECCIONAL.
Organogénesis (formación de órganos)
Formación de tallos, raíces, flores, etc.
¡¡Regeneración de una planta completa!!Explante
MITOSIS UNIDIRECCIONAL
Organogénesis
Formación de tallos Formación de raíces
Enraizamiento Tallos
Planta completa
MITOSIS UNIDIRECCIONAL
EJEMPLO DE ORGANOGENESIS DIRECTA
EJEMPLO DE ORGANOGENESIS DIRECTA
ORGANOGENESIS INDIRECTA (a partir de callo)
Embriogénesis Somática• Procedimiento para la regeneración vía
embriogénesis somática• 1. Iniciación: callos embriogénicos• 2. Proliferación: callos embriogénicos, masas
proembriogénicas (PEM)proembriogénicas (PEM)• 3. Desarrollo y maduración de embriones :
embriones• 4. Germinación de embriones (Regeneración)• Estadíos de desarrollo en dicotiledóneas:
– Masas proembriogénicas– Estadío globular– Torpedo– Embrión somático
Elección del explanto inicial
Semillas comerciales(zanahoria, tomate)
Escarificación
Esterilización
Semillas estériles
Germinación
Tritón X-100 3%, 10 minHipoclorito de Na 15%, 20 min
MS + 2,4-D
Germinación
% de germinación?
Disección bajo lupa
Esterilidad Medio de Hoagland
M. apicalHojaM. axilarTalloRaízM. radicular
Regeneración directa e indirecta MITOSIS UNIDERECCIONAL.
Organoogénesis
directa
Organogénesis
indirecta
Explanto (disco de hoja)
Explanto (células vegetales)
REGENERACIÓN
Callo
Propagación vegetativa por embriogénesis somática
Suspensión celular
Embriones somáticos
ENCAPSULACIÓN
GERMINACIÓN
GERMINACIÓN Semilla artificial
•• Caña de azúcar Caña de azúcar
•• PapayaPapaya
•• Bananos y Bananos y plátanosplátanos
•• GuayabaGuayaba•• GuayabaGuayaba
•• CaféCafé
•• CaobaCaoba
•• AnthuriumAnthurium
••Frijol Frijol
C) Formación de yemas con callo previoA) Yemas apicales y/o axilares, después raíces
Ejemplos de algunos sistemas de micropropagación
Organogénesis directa Organogénesis indirecta
B) Formación de yemas sobre explantes y después raíces
Embriogénesis somática indirecta
(ej.: tabaco, papa etc.)(ej.: piña,clavel, kiwi, manzano, etc.)
(ej.: begonia, violeta africana, etc.)
(ej.: trigo, maiz, apio, zanahoria, abeto, etc.)Organogénesis directa
D) Formación de embriones sobre callos
• La micropropagación vegetal, o propagación clonal masiva de plantas superiores, posibilita la obtenci óny cultivo de plantas a gran escala.
• Se realiza bajo estrictas condiciones de esterilid ad en un medio sintético nutritivo y con control de tempe ratura, luz y fotoperíodo.
La micropropagación constituye la principal aplicación comercial del cultivo de tejidos vegetales
Propagación vegetativa in vitroRegeneración directa e indirecta
Sistemas de propagación vegetativain vitro
Aplicaciones del Cultivo de tejidos a la conservación de GERMOPLASMA
Colecta e IntroducciColecta e IntroducciColecta e IntroducciColecta e Introduccióóóónnnn
ConservaciConservaciConservaciConservacióóóónnnn““““Ex situEx situEx situEx situ””””
En campoEn campoEn campoEn campo
““““In In In In vitrovitrovitrovitro””””
Banco de Banco de Banco de Banco de GermoplasmaGermoplasmaGermoplasmaGermoplasma
CaracterizaciCaracterizaciCaracterizaciCaracterizacióóóón n n n EvaluaciEvaluaciEvaluaciEvaluacióóóón preliminarn preliminarn preliminarn preliminar
ConservaciConservaciConservaciConservacióóóónnnn
““““In situIn situIn situIn situ””””
““““In In In In vitrovitrovitrovitro””””
DocumentaciDocumentaciDocumentaciDocumentacióóóón n n n
UsoUsoUsoUso
¿¿¿¿QUE SE CONSERVA?
foráneas
primitivas
VARIEDADES
mejoradas
Donaciones, prospecciones,
intercambio internacional
La mejora genética nacional
locales especies silvestres
Accesiones con cualidades Accesiones con cualidades
puntualizadas, cultivadas, silvestres, puntualizadas, cultivadas, silvestres,
géneros y especies afinesgéneros y especies afines
• Bancos de semillas en frigoríficos o en campo (camote, fresa)
• Colecciones in vitro a
Existendiferentes métodos parala conservaciónde germoplasma
• Colecciones in vitro a mediano plazo
• Crioconservación (largo plazo)
Conservación de Germoplasma ex situ• Conservar colecciones a partir de
colectas nacionales e introducción de material foráneo.
Conservación de semillas Botánicas
Colecciones de campo
Técnicas de almacenamiento apoyadas por BIOTECNOLOGÍA:• Colecciones in vitro.
- A corto y mediano plazo (medio mínimo, poca luz, no hormonas - Crioconservación (- 196ºC)
Botánicas
El cultivo in vitro permite sanear plantas infectadas sistémicamente por diferentes tipos de patógenos, como bacterias, hongos, virus y viroides.
Sanear antes de conservar o multiplicar
• El material vegetal infectado por virus, bacterias, hongos y/o micoplasmas puede ser tratado con diferentes técnicas:
-Termoterapia: 44 ºC ---25ºC----4horas/cu-Quimioterapia: Rivavirin 10mg/L (retroviral)- Electroterapia: 10-30Volt/5-30 minutos
- Cultivo de meristemos
Posibles metodologías utilizadas parael tratamientode plantas
•Estos tratamientos pueden usarse por separado, pero incrementan notablemente su efectividad cuando se los combina, ya sea in vivo o in vitro.
• La conservación de germoplasma se basa en limitarel crecimiento del material vegetal controlandolas condiciones del cultivo de tejidos.
• La restricción del crecimiento puede implementars epor distintas vías:
- Medios de cultivo de composición subóptima.
Colecciones in vitro o bancos de germoplasma in vitro
- Baja intensidad lumínica (< 500 lux)
- Temperaturas inferiores a las adecuadaspara el metabolismo normal de las célulasy tejidos vegetales bajo cultivo (15-20 ºC)
- Alta concentración de compuestos osmóticamente activos (sacarosa, manitol, etc.)
Crioconservación
Crioconservación en nitrógeno líquido a –196°C de temperatura de cultivos celulares de banano y plátano
Protocolo para la crioconservación y cultivode meristemas de soja
BANANOS Y PLÁTANOS (MUSA BANANOS Y PLÁTANOS (MUSA sppspp.) .) producidos por cultivo producidos por cultivo in vitroin vitro..
‘Somaclon Plátano Saba’
(ABB)
Somaclon bananao‘SH-3362’
(AA)
• La teoría de la totipotencialidad celular , enunciadapor Haberlandt a principios del siglo veinte, postula quetoda célula vegetal individual es capaz de regenerar una
planta entera a partir de un cultivo in vitro sin importar elgrado de diferenciación alcanzado. Para ello se requierencondiciones específicas referidas al medio del cultivo,relaciones hormonales, temperatura, fotoperíodo, etc.
• Todo proceso de diferenciación está regulado por elbalance entre diferentes tipos de reguladores del
crecimiento , fundamentalmente de auxinas y citocininas .
Resumen: Los fundamentos teóricosy prácticosdel cultivode tejidos vegetales
crecimiento , fundamentalmente de auxinas y citocininas .
•La desdiferenciación consiste en la transformación y pérdidade las características de especialización de un tipo celula rpara dar lugar a células de tipo meristemático. El siguientepaso involucrado en la regeneración de una planta es laredifereciación de las células previamente desdiferenciadas.