Post on 14-Mar-2021
INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL
Centro de Desarrollo de Productos Bióticos
Efecto inhibidor de acetilcolinesterasa por extractos
de Bouvardia ternifolia cultivada en hidroponía
T E S I S
Que para obtener el grado de Maestría en Ciencias en Desarrollo de
Productos Bióticos
PRESENTA
Biol. Giovanni García Morales
Directores de tesis
Dra. Elsa Ventura Zapata, Dr. Jesús Enrique Jiménez Ferrer
Yautepec Morelos, Diciembre 2009
El presente trabajo se llevó a cabo en el Departamento de Biotecnología del
Centro de Desarrollo de Productos Bióticos del Instituto Politécnico Nacional bajo
la dirección de la Dra. Elsa Ventura Zapata y en el Laboratorio de farmacología
del Centro de Investigación Biomédica del Sur bajo la dirección del Dr. Jesús
Enrique Jiménez Ferrer. Para la realización de los estudios se obtuvo el apoyo
económico de la beca CONACYT (No. de registro 235254) y de la beca del
Programa Institucional de Formación de Investigadores (PIFI). La investigación
fue realizada con el financiamiento económico del proyecto de la Secretaría de
investigación y Posgrado SIP 20071059.
AGRADECIMIENTOS
Al Centro de Desarrollo de Productos Bióticos y al Centro de Investigación
Biomédica del Sur por las facilidades otorgadas para el desarrollo y
conclusión de este trabajo de tesis en el laboratorio de cultivo de células
vegetales y el laboratorio de Farmacología respectivamente, a la Dra. Elsa
Ventura Zapata y el Dr. Enrique Jiménez Ferrer por haberme dirigido,
supervisado y corregido de manera constante y exhaustiva en el desarrollo de
esta investigación, al comité tutorial conformado por la Dra. Elsa Ventura
Zapata, la Dra. Kalina Bermúdez Torres, la Dra. Martha Lucia Arenas
Ocampo y el Dr. Javier Solorza Feria por sus observaciones y aportaciones en
beneficio no solo del trabajo como tal sino también de mi desarrollo y formación
como Maestro en Ciencias en Desarrollo de Productos Bióticos. Agradezco
también la participación y aportaciones del Dr. Alejandro Zamilpa
Investigador del Centro de Investigación Biomédica del Sur en el desarrollo de
la investigación fitoquímica de los extractos.
DEDICATORIA
a culminación de este trabajo de investigación lo dedico a mi
hijo Cristian Giovanni García Noguerón quien aun a su corta
edad ya forma parte de los sacrificios que como familia
realizamos para que pudiera alcanzar mi sueño de ser un
profesionista con grado de maestro, a mi esposa Ma. Del Carmen
Noguerón Merino por su paciencia y apoyo incondicional no obstante
las adversidades. A mis padres Angélica Morales Terán y Walfré
García Arroyo que con su apoyo y su confianza una vez más han
acompañado mis pasos en éste difícil camino para ser alguien en la
vida. A mi hermano Otman García Morales quien ahora emprende su
camino hacia el éxito y forma parte del orgullo que siento de formar
parte de esta familia.
L
I
I N D I C E
Pagina
Índice de figuras III
Índice de cuadros V
Abreviaturas VI
Resumen VIII
Abstract IX
1. INTRODUCCIÓN 1
2. ANTECEDENTES 3
2.1 El neurotransmisor acetilcolina 3
2.2 La enzima acetilcolinesterasa (E.C. 3.1.1.7) 4
2.2.1 La catálisis enzimática 5
2.3 Alzheimer 8
2.3.1 Fisiopatología 9
2.3.2 Tratamiento 12
2.4. Plantas medicinales utilizadas para contrarrestar
padecimientos del Sistema Nervioso Central
13
2.4.1. Bouvardia ternifolia 15
2.5 Métodos de propagación vegetal 18
2.5.1. Hidroponía 21
3. JUSTIFICACIÓN 22
3.1.Hipótesis 23
4. OBJETIVOS 24
4.1. Objetivo general 24
4.2. Objetivos particulares 24
5. MATERIALES Y METODOS 25
5.1. Material biológico 25
5.1.1 Material vegetal 25
5.1.2 Animales utilizados para pruebas farmacológicas 25
5.2. Métodos 25
5.2.1. Micropropagación 25
5.3 Aclimatización 28
5.4 Cultivo Hidropónico 29
II
5.5 Extracto vegetal de Bouvardia ternifolia cultivada 30
5.6 Estudios fotoquímicos 31
5.7. Inhibición de la enzima acetilcolinesterasa in vitro 32
6. RESULTADOS Y DISCUSION 34
6.1 Micropropagación 34
6.2 Aclimatización 40
6.3 Cultivo hidropónico 41
6.4 Obtención de extractos 44
6.5 Estudio Fitoquímico del extracto de Bouvardia ternifolia 45
6.5 Inhibición enzimática 49
7 CONCLUSIONES 58
9 PERSPECTIVAS 60
10 LITERATURA CITADA 61
11 ANEXOS 68
III
ÍNDICE DE FIGURAS
Número Figura
Página
1 Ejemplar de Bouvardia ternifolia 15
2 Diagrama de flujo del trabajo experimental 26
3 Diagrama del protocolo para desinfestación de semillas 26
4 Maquina picadora 30
5 Evaporador rotatorio 31
6 Esquema general del estudio fitoquímico 31
7 Efecto de las concentraciones de cinetina 35
8 Efecto de las concentraciones de bencilaminopurina 36
9 Segmentos nodales con formación de brotes
Efecto de las auxinas en la formación de raíces
37
38 10
11 Raíces inducidas con ácido naftalenacético 39
12 Plántulas en proceso de aclimatización 39
13 Efecto de la solución nutritiva en el crecimiento de la planta 41
14 Efecto de la solución nutritiva en el número de nodos 43
15 Plantas provenientes de la micropropagación 44
16 Diagrama del fraccionamiento del extracto hidroalcohólico 45
17 Presencia de áido ursólico en fracción acetato de etilo 46
18 Confirmación de la presencia de ácido ursólico en la fracción
acetato de etilo
46
19 Flavonoides en extracto hidroalcohólico y Fr-acetato de etilo 47
20 Comparación del extracto hidroalcohólico de la planta cultivada
y la fracción de acetato de Etilo
48
21 Presencia de flavonoides en la planta cultivada 48
22 Cinética enzimática acetilcolinesterasa 50
23 Representación de la transformación Lineweaver-Burkde la
actividad enzimatica de la acetilcolinesterasa
51
24 Transformación Lineweaver-Burk / Inhibidor Fr-Acetato de etilo 53
25 Transformación Lineweaver-Burk / Inhibidor Fr- Metanólica 54
IV
26 Transformación Lineweaver-Burk / Inhibidor Precipitado 55
27 Transformación Lineweaver-Burk / Inhibidor planta cultivada 56
28 Transformación Lineweaver-Burk expresiones 18 y 19 67
29 Transformación Lineweaver-Burk / Inhibidor competitivo 69
30 Transformación Lineweaver-Burk / Inhibidor no competitivo 71
31 Transformación Lineweaver-Burk / Inhibición mixta 73
32 Transformación Lineweaver-Burk / Inhibición mixta sistema C2 74
33 Transformación Lineweaver-Burk / Inhibición mixta sistema C5 75
V
INDICE DE CUADROS
Número Cuadro
Página
1 Diseño experimental para la inducción de brotación
múltiple
27
2 Diseño experimental para inducir la formación de raíces 28
3 Rendimientos de extractos hidroalcoholicos de B.
ternifolia silvestre y cultivada
44
4 Efecto Inhibidor del extracto hidroalcohólico de la planta
silvestre
51
5 Efecto inhibidor de la Fr- Acetato de etilo 52
6 Efecto inhibidor de la Fr-Metanólica 54
7 Efecto inhibidor del Precipitado 3 55
VI
ABREVIATURAS
Factor modificador de la constante de equilibrio de la formación
del complejo enzima-sustrato.
Factor modificador de la velocidad de reacción de la formación
de producto en reacciones enzimáticas en inhibición mixta
a β-amiloide
g Microgramo
mol Micromol
Ac Ácido
Ach Acetilcolina
Achasa Acetilcolinesterasa
AcoEt Acetato de Etilo
AIA Ácido Indolacético
ANA Ácido Naftalenacético
AtchI Acetiltiocolina
atm Atmosfera
BAP Bencilaminopurina
Ca++ Ion calcio
Cm Centímetro
D. O. Densidad óptica
DLB Demencia con cuerpos de Lewi
DTNB Ditio-bis-nitro benzoato
E Enzima
EA Enfermedad de Alzheimer
EI Complejo enzima inhibidor
ES Complejo enzima sustrato
ESI Complejo enzima sustrato inhibidor
F-Aq Fracción acuosa
Fr-AcoEt Fracción acetato de etilo
Fr-MeOH Fracción metabólica
Gln Glutamina
VII
HA Hidroalcohólico
I Inhibidor
IC50 Concentración inhibitoria 50 porciento
IBA Ácido Indolbutírico
Ki Constante de inhibición
KIN Cinetina
KM Constante de Michaelis-Menten en reacciones enzimáticas
KMapp KM aparente en reacciones enzimáticas inhibidas
kp Constante de velocidad de la reacción de formación de producto
KS Constante de equilibrio de la formación del complejo ES
KSapp KS reacción aparente
L Litro
M Metro
MeOH Metanol
Mg Miligramo
min Minuto
ml Mililitro
mM Milimolar
mm Milímetro
mmHg Milímetros de mercurio
MS Medio Murashige y Skoog
Msnm Metros sobre el nivel del mar
Na+ Ion sodio
NaCl Cloruro de Sodio
Nm Nanómetro
P Producto
S Sustrato
Ser Serina
SNC Sistema Nervioso Central
U Unidades
Vmax Velocidad máxima
Vmaxi Velocidad máxima inhibida
vo Velocidad Inicial
VIII
RESUMEN
El Alzheimer es una enfermedad crónica degenerativa que se caracteriza principalmente por la pérdida progresiva de la memoria. Los tratamientos actuales se basan en retrasar el avance de la enfermedad, incrementando las concentraciones del neurotransmisor acetilcolina por medio de la inhibición de la enzima acetilcolinesterasa y utilizando antioxidantes para la evitar la muerte neuronal causada por los radicales libres generados por el proceso inflamatorio que se presenta, desafortunadamente estos tratamientos presentan varios efectos secundarios como vómitos diarreas etc., lo que hace que la calidad de vida de los pacientes se vea disminuida por estos otros padecimientos; por lo que el objetivo del presente trabajo fue encontrar en el extracto hidroalcohólico de Bouvardia ternifolia cultivada en hidroponía un efecto inhibidor de la enzima acetilcolinesterasa, como lo hace la planta silvestre para contrarrestar los efectos de esta enzima. Dentro de los objetivos particulares están, establecer el protocolo de micropropagación por cultivo de nodos, establecer las condiciones de crecimiento y desarrollo en hidroponía, y evaluar farmacológicamente la actividad antiacetilcolinesterasa de los extractos hidroalcohólicos de Bouvardia ternifolia cultivada. Para lograr esto se propuso un método de micropropagación que permitiera obtener material aséptico a partir de semillas las cuales fueron tratadas con 0.3% de hipoclorito de sodio por 5 minutos y una vez obtenida la planta se usaron secciones nodales para inducir brotación con KIN y BAP a concentraciones de 0.2, 0.5, 1.0 y 1.5 mg/L; para inducir enraizamiento los brotes fueron tratados con ANA, IBA y AIA a concentraciones de 0.1, 0.2, 0.5, 1.0 y 1.5 mg/L. Para evaluar su desarrollo en hidroponía éstas se cultivaron con solución nutritiva de Hoagland y Arnon a concentraciones de 25, 50, 75, 100 y 125%. Los extractos obtenidos fueron evaluados en el ensayo de inhibición enzimática a concentraciones de 0.0125, 0.025 y 0.05 mg/ml, con concentraciones de sustrato de 5,10, 25, 50 y 75 mM de Acetiltiocolina. Las semillas tratadas con 0.3% de hipoclorito durante 5 minutos tuvieron un porcentaje de desinfestación del 97%. Para inducir brotación el mejor resultado se obtuvo con la concentración de 1.5 mg/L de BAP y se dio la formación de callos en la misma concentración de KIN. En la formación de raíces IBA a 0.5 mg/L fue el que mayor número de brotes con raíces generó. Posteriormente en el cultivo hidropónico la concentración a la que mejor se desarrolló la planta fue de 100%. En el ensayo de inhibición enzimática se observó un comportamiento de inhibición de tipo mixta por parte del extracto hidroalcohólico obtenido de la planta cultivada similar al de la planta silvestre.
Palabras Clave: Bouvardia ternifolia, Alzheimer, micropropagación, hidroponía,
inhibición enzimática.
IX
ABSTRACT
The Alzheimer Disease is a degenerative chronic illness that characterized mainly by the progressive loss of the memory. The current treatments are based on retarding the advance of the illness, increasing the concentrations of the neurotransmisor acetilcholine by means of the inhibition of the enzyme acetilcholinesterase and using antioxidant drugs. It for avoiding the death neuronal caused by the free radicals, generated by the inflammatory process, these treatments present several adverse side effects, that makes that the quality of the patients' life is diminished by these other sufferings. For that the objective of the present work was to find in the hidroalcoholic extract of Bouvardia ternifolia cultivated in hidroponia, an enzyme inhibitor effect of the acetilcholinesterase, as makes it the wild plant to counteract the effects of this enzyme. Inside the particular objectives they are, to establish the micropropagation protocol for growing the nodes, to establish the conditions of growth and development in hidroponia, and to evaluate the antiacetilcholinesterase activity of the hidroalcoholic extracts of Bouvardia ternifolia cultivated in hothouse pharmacologically. To achieve this, was meant a micropropagation method that allowed to obtain aseptic material starting from seeds to put in 0.3% of sodium hypochlorite for 5 minutes and once obtained the plant nodal sections were used to induce buds with KIN and BAP to concentrations of 0.2, 0.5, 1.0 and 1.5 mg/L. To induce take root the buds were treated with ANA, IBA and AIA, to concentrations of 0.1, 0.2, 0.5, 1.0 and 1.5 mg/L. To evaluate the growth in hidroponia these they were cultivated with Hoagland and Arnon solution, to concentrations of 25, 50, 75, 100 and 125%. The obtained extracts were evaluated to enzymatic inhibition assay in concentrations of 0.0125, 0.025 and 0.05 mg/ml, with substrate concentrations of 5, 10, 25, 50 and 75 mM of Acetyltiocholine. The seeds tried with 0.3 sodium hypochlorite during 5 minutes had a percentage of desinfestation of 97%. To induce buds the best average it was obtained with the concentration of 1.5 mg/L of BAP and the formation of tripes was given in the same concentration of KIN. In the formation of roots was obtained with 0.5 mg/L of IBA concentration. Later on in the cultivation hidroponic the concentration to the one that better the plant was developed it was of 25% of concentration of Hoagland and Arnon solution. In the assay of enzymatic inhibition a behavior of mixed type inhibition was observed on the part of the extract obtained hidroalcoholic from the plant similar cultivated to that of the wild plant. Key words: Bouvardia ternifolia, Alzheimer, micropropagation, hidroponic, enzymatic inhibition.
Introducción
1
1. INTRODUCCIÓN
l Alzheimer es una enfermedad neurodegenerativa que afecta a mas de 20
millones de personas en el mundo principalmente a las personas mayores
de 60 años, y es considerada como un problema importante de salud
pública debido a los estragos que causa no solo en las personas que la padecen,
sino también en los familiares que deben atenderlos o en su defecto pagar la
atención requerida por los pacientes, así como los medicamentos, afectando la
economía familiar.
El avance de la medicina moderna permiten que las personas tengan una
esperanza de vida mucho mayor, con lo que también incrementa el riesgo para
padecer la enfermedad de de Alzheimer (EA) debido a que la edad es el principal
factor de riesgo.
La EA se caracteriza principalmente por la pérdida progresiva de la memoria
debido a la muerte de las células del cerebro, principalmente neuronas
colinérgicas. Lo anterior asociado principalmente a la deposición de la proteína β-
amiloide (βA) extracelular (placas seniles), que genera una gran cantidad de
radicales libres que activan a su vez a las células de la microglia generando un
proceso inflamatorio que deriva en daño orgánico, deteriorando la estructura
cerebral. La principal consecuencia de ello es la reducción de la en las
concentraciones del neurotransmisor acetilcolina que está directamente
relacionado con el proceso cognitivo, también ocurre lo que repercute en la
calidad de vida de las personas.
Actualmente dentro de los tratamientos para la EA, uno de los mas empleados
es el que se orienta a incrementar la disponibilidad de acetilcolina en el espacio
sináptico por medio de inhibidores de la enzima acetilcolinesterasa, como son la
tacrina, donezepil y galantamina. Con ellos se trata de disminuir los síntomas
asociados a EA como pérdida de memoria y depresión. Sin embargo, se ha
observado que estos medicamentos tienen efectos secundarios adversos como
nauseas, vómitos, diarrea etc.
EE
Introducción
2
Desde tiempos muy antiguos las plantas han sido utilizadas para aliviar
muchos malestares y enfermedades del hombre, y una de las ventajas de
utilizarlas es que en su mayoría poseen una gran cantidad de metabolitos
secundarios capaces de contrarrestar no solo uno, sino varios síntomas de una
enfermedad al mismo tiempo. Por lo tanto la utilización de plantas medicinales
como una alternativa para tratar los síntomas de la enfermedad es una opción que
permite mejorar la calidad de vida de las personas que padecen la EA.
Debido a las propiedades químicas de la planta Bouvardia ternifolia como son
la presencia de ácido ursólico y oleanólico, farmacológicas como antiinflamatorias
e inhibidoras de la enzima acetilcolinesterasa y de uso tradicional como
antiinflamatorias y problemas del sistema nervioso, se propone ésta planta como
un modelo de estudio en la búsqueda de un tratamiento que mejore la calidad de
vida de las personas que padecen la EA ya que como se mencionó anteriormente
la actividad de la enzima acetilcolinesterasa juega un papel importante en esta
enfermedad. A pesar de que ésta planta no presenta diagnóstico de peligro de
extinción, la posibilidad de la producción de un fitofármaco para tratar los efectos
de la EA, hace que se requiera de gran cantidad de material vegetal con calidad
homogénea, por lo que hace necesario obtenerlo de un modo controlado para no
depender del material vegetal silvestre.
Con base en lo anterior, la micropropagación es una herramienta alternativa
para la obtención del material vegetal con dichas propiedades, permitiéndonos
obtener la cantidad y calidad deseada de material vegetal independientemente de
la estación del año o del lugar de procedencia. Ésta técnica permite obtener
plantas libres de bacterias, hongos y nemátodos, confiriéndole una mejor calidad
con respecto a una planta silvestre.
Antecedentes
3
2. ANTECEDENTES
2.1 El neurotransmisor Acetilcolina
a acetilcolina (ACh) es un neurotransmisor ampliamente distribuido
en el sistema nervioso central y en el sistema nervioso periférico. Su
función, al igual que la de otros neurotransmisores, es mediar la
actividad sináptica del sistema nervioso. La Ach es sintetizada en el citoplasma
neuronal a partir de la unión de colina con acetato proveniente de acetil-CoA y
posteriormente es almacenada en vesículas sinápticas que son pequeños
compartimientos de unos 40 nm de diámetro que se acumulan en la región
presináptica de la terminal del axón. Se estima que cada vesícula contiene
1,000 a 50,000 moléculas de ACh y una sola terminación nerviosa motora
contiene 300,000 o más vesículas. En dichas vesículas se transporta a las
terminaciones nerviosas donde es utilizada para la transmisión del impulso
nervioso en las sinapsis neurona-neurona y neurona-célula muscular a través
de los receptores colinérgicos (Kandel, 2001).
La ACh es liberada en la hendidura sináptica, por fusión de las
membranas de las vesículas con la membrana de la neurona. La llegada de un
potencial de acción a la terminal presináptica estimula la entrada del ion calcio
(Ca++) al interior de la célula. Éste aumento del Ca++ intracelular es el que
provoca la exocitosis de las vesículas. Una vez que las moléculas de ACh han
sido liberadas en la hendidura sináptica, alcanzan por difusión los receptores
postsinápticos donde interaccionan con ellos, ocasionando en el plazo de 0.1
mseg un aumento transitorio de la permeabilidad de la membrana al ión sodio
(Na+) (Mathews et al, 2002; Purves et al., 2004).
En el Sistema Nervioso Central (SNC), las neuronas colinérgicas forman
un gran sistema ascendente cuyo origen se halla en el tronco cerebral e inerva
amplias áreas de la corteza cerebral, además de mantener la consciencia
parecen intervenir en la transmisión de información visual, tanto en el colículo
superior como en la corteza occipital. La acetilcolina también interviene en la
percepción del dolor y la memoria (Guyton y Hall, 2001; Purves et al., 2004).
LL
Antecedentes
4
2.2 La Enzima Acetilcolinesterasa (E.C. 3.1.1.7)
La acetilcolinesterasa (Achasa) es una enzima situada en las hendiduras
sinápticas donde hidroliza a la ACh, después de que ésta ha realizado su
función mediante la unión a sus receptores transmitiendo los impulsos
nerviosos. De esta manera la Achasa, limita o termina el estímulo en la sinapsis
colinérgicas (Massoulié et al., 2009). La reacción catalizada es la hidrólisis de
la ACh hasta colina y acetato: La Achasa es una esterasa tipo B y tiene un
resto de serina (Ser) en el centro activo y cuenta con un mecanismo de acción
catalítica del tipo "catálisis covalente", con la generación de un intermediario
covalente. En el centro activo de la enzima se distinguen dos dominios,
denominados esteárico, donde reside el resto de Ser, y aniónico donde tiene
una glutamina (Gln) que le proporciona carga negativa, adecuada para la
aproximación y orientación del sustrato con su carga positiva (Silman et al.,
2008).
La acetilcolinesterasa genera la inactivación de la acetilcolina, y por los
tanto la disminuye la transmisión del impulso nervioso. La reacción química
producida en este proceso es:
En la 1ª etapa de la reacción, el resto de Ser del centro activo de la
acetilcolinesterasa reacciona con la acetilcolina, generándose un intermedio
acetil-enzima y la liberación de la colina.
Acetilcolina + enzima (Acetilcolinesterasa) Colina + Acetilcolinesterasa
acetilada
E1n la 2ª etapa de la reacción se produce la hidrólisis de la acetil-
enzima, regenerándose la acetilcolinesterasa y liberándose el acetato (Silman
et al, 2008)
Acetilcolinesterasa acetilada + H2O Acetilcolinesterasa + ácido acético
Este mecanismo de acción es característico de las Serin-proteasas,
similar al de la quimitripsina. La colina puede regresar a la membrana
presináptica y ser reutilizada en la síntesis de la acetilcolina. Las
Antecedentes
5
colinesterasas, es decir, las enzimas que producen la hidrólisis de la
acetilcolina pueden ser de dos tipos, a saber:
La colinesterasa verdadera, acetilcolinesterasa, colinesterasa
eritrocitaria, específica o de tipo e, se encuentra unida a las membranas de las
neuronas, en las sinapsis ganglionares de la estructura neuromuscular del
organismo y en los eritrocitos.
La pseudocolinesterasa o colinesterasa inespecífica, también
denominada butirilcolinesterasa, colinesterasa plasmática o de tipo s, está
presente generalmente en forma soluble en casi todos los tejidos
(principalmente hígado) y en el plasma, pero en poca concentración en el
sistema nervioso central y periférico (Massoulié et al., 2009).
La importancia de la señalización de ACh se ha determinado por la
localización y participación de la acetilcolina en el proceso de aprendizaje y
memoria, mediante la infusión de medicamentos que inhiben los receptores de
este neurotransmisor causando daños selectivos; por ejemplo, la infusión de
escopolamina en el hipocampo daña la memoria espacial, por reducir la
liberación del neurotransmisor en el hipocampo. Estudios de localización
anatómica permite unir los efectos conductuales con los efectos celulares
específicos de acetilcolina. Modelos computarizados demuestran como el
mecanismo celular de estos efectos incrementan el proceso de codificación que
genera la memoria (Mesulam, 2004).
2.2.1 La catálisis enzimática.
Es uno de los procesos biológicos fundamentales para el desarrollo del
fenómeno viviente. Lo hace a través de acelerar las reacciones químicas con
un factor por arriba de 1x106. La aceleración que producen se alcanza en
condiciones de baja concentración de reactantes, por debajo de 150 mM; baja
presión del sistema de reacción, 1 atm o 760 mmHg y temperatura baja (25 a
35°C). Además de que, las reacciones catalizadas enzimáticamente son
transformaciones químicas en condiciones “suaves”, estas representan uno de
los mecanismos principales de control homeostático de los procesos biológicos.
Antecedentes
6
Por lo que las enzimas son entonces tanto un biocatalizador y como un punto
de control. Los procesos de control biológico centrado en las enzimas son
aquellos que se sustenta en: a) Ubicación física de la enzima
(compartamentalización), b) Biodisponibilidad (tiempo de recambio y control de
la expresión genética), y c) Modulación de la actividad (inhibición y alosterismo)
(Nelson y Cox. 2004). Dentro este último aspecto, en este trabajo de
investigación aprovecharemos a la inhibición como sistema de control.
La inhibición enzimática existe de dos tipos, la irreversible y la reversible;
la segunda de ellas es la que exploraremos, en tanto es la que representa un
mecanismo operativamente adecuado para el control farmacológico de la
actividad enzimática. La inhibición enzimática sigue diferentes patrones de
comportamiento, de acuerdo a los equilibrios químicos que se establecen en
función de la interacción de la enzima (E), el sustrato (S) y el inhibidor (I).
Dentro de la inhibiciones del tipo simple está la inhibición competitiva (Anexo 2,
figura 29 ecuaciones 29, 30 y 31); en esta inhibición se establece una
competencia entre S y e I por el sitio activo de la enzima. Es un proceso
mutuamente excluyente, ya que solo una de las dos especies químicas o
reactantes puede ocupar el sitio activo. Como se observa en el desarrollo de la
ecuación de Michaelis-Menten (Anexo 2, ecuaciones 29 y 31) la KM, es
afectada por el factor (1+[I]/Ki), por lo que se define como KM aparente (KMapp).
Además, como se aprecia en la figura 29, el valor de 1/Vmax es el mismo para la
reacción inhibida como para la que no lo está. Lo que confirma el hecho de que
la competencia que se establece entre el sustrato y el inhibidor no altera la
disponibilidad de sitios activos disponibles en la mezcla de reacción.
La inhibición no competitiva es el segundo de los patrones de
comportamiento de inhibición enzimática simple; en esta forma de inhibición, I
no afecta la unión de S con E ni, ni lo contrario, es decir que, S no afecta la
unión de I con E. De esta forma I y S se unen a E de manera reversible,
estocásticamente e independientemente en distintos sitios de la enzima. Lo
anterior se muestra en el Anexo 2, ecuación 32, donde se establece que el
complejo ternario ESI no es productivo, es decir que genere la transformación
de S en P. Lo anterior es lo que define a este proceso de inhibición, donde si se
Antecedentes
7
modifica la disponibilidad de sitios activos y por tanto la Vmax, como se observa
en el Anexo 2 figura 30 y ecuación 35. En esta se define que 1/Vmaxi =
1/Vmax·(1+[I]/Ki), lo que indica que hay un efectiva disminución de Vmax.
Un tercer patrón de inhibición es el de inhibición acompetitiva, en el cual
I se une reversiblemente al complejo productivo ES generando un complejo
ternario ESI inactivo, por lo que I no se une a E libre. Este tipo de inhibición se
le llama también inhibición anticompetitiva o inhibición acoplante (Anexo 2
ecuaciones 36 y 37).
Los anteriores sistemas de inhibición tienen como característica común,
que tanto el complejo EI como el ESI son complejos no productivos, ya que no
generan la transformación de S en P. Existen otros sistemas de inhibición
donde el esquema de equilibrio entre las especies químicas participantes en la
catálisis enzimática, tienen la posibilidad de que exista una salida productiva
del proceso. Esta salida del proceso, es una más además de la propuesta en el
esquema de enzimas que siguen el modelo de Michaelis-Menten y en los
procesos de inhibición simple (Anexo 2, ecuaciones 1, 20, 32 y 36). Este tipo
de modulación de la actividad enzimática se le denomina inhibición mixta. De la
inhibición del tipo mixto existen diferentes modalidades. En primer lugar está la
que denomina Sistema C1 (Siegel, 1975); este es el mas sistema de inhibición
mixta más simple (Anexo 2, ecuación 40), en el cual EI tiene una menor
afinidad (la disminución de la afinidad está determinada por ) por S que E y el
complejo ESI es no productivo. Cabe hacer notar que como el esquema de
equilibrio de la reacción es similar al que presenta la inhibición no competitiva
simple (Anexo 2, ecuación 32), también se le denomina “Intersección con
inhibición no competitiva lineal”. Del esquema de reacción y la gráfica de
transformación de Lineweaver-Burk asociada (Anexo 2 ecuación 40 figura 31),
se observa que, independientemente de [ I ] esté presente en el sistema
siempre una parte de E se encuentra como complejo ESI no productivo, aun
cuando se esté presente una alta concentración de [S] consecuentemente Vmaxi
< Vmax. Del igual manera, cualquier [ I ] produce un complejo EI de menor
afinidad por S, por lo que KSapp> KS. También como ESI es no productivo la vo
tiende a cero conforme se incrementa [ I ].
Antecedentes
8
Otro de los sistemas de inhibición es el que describe Siegel como C2
(Siegel, 1975) (Anexo 2 ecuación 42). Se observa que en este sistema E y EI
se unen a S aunque con diferentes afinidades. En cualquier [S], se reparte para
la formación de ES y ESI. Como ESI es productivo aunque en menor
proporción que ES entonces Vmaxi < Vmax. Además, KSapp > KS porque en
cualquier [ I ], una parte de E se utiliza para la formación de EI de menor
afinidad por S. En este sistema se proponen dos parámetros y ; el primero
de ellos como se planteó en C1, describe una menor afinidad de EI o I por S.
El parámetro , indica la disminución de la constante de velocidad que afecta la
transformación de ESI en P. Una diferencia entre los sistemas de inhibición
simple C1 y C2, que se observa en la comparación de las figuras 31 y 32 del
Anexo 2, es que cuando [ I ] es muy alta, una parte forma ESI que es productor
por lo que el valor de vo nunca es cero.
Otro sistema de inhibición mixta relevante en este trabajo de
investigación, es el que se denomina C5 (Anexo 2 ecuaciones 46 y 47 figura
33). En este sistema el inhibidor disminuye la constante de velocidad de
formación de producto (), pero a su vez incrementa la afinidad de la enzima
por el sustrato (). Y describe el comportamiento de los parámetros de la
siguiente manera yComo se nota en el esquema
propuesto, la kP tiende a disminuir pero KS disminuye mucho más.
2.3 Alzheimer
La enfermedad de Alzheimer (EA) es una forma común de demencia,
caracterizada por la degeneración de las neuronas colinérgicas que inervan la
corteza, amígdala y el hipocampo, con dificultad de mantener la atención, y con
un daño cognitivo profundo, como la pérdida de memoria y la habilidad de
aprendizaje. Estos déficits cognitivos causan deterioros significativos en la
ocupación y función social. (Fodale et al., 2006)
En la actualidad, la EA es la primera causa de demencia en el mundo
afectando a más de 20 millones de personas. Se espera esta cifra se
incremente debido principalmente a dos razones: el aumento de la población
Antecedentes
9
de edad avanzada y que el principal factor de riesgo de padecer esta
enfermedad es precisamente la edad. En Estados Unidos, en el año 2000, se
calculaba que 4.5 millones de personas sufrían la EA y se calcula que para el
año 2020 esta cifra se incrementará en un 27%, para el 2030 un 70% y casi un
300 % para el año 2050 es decir aproximadamente 13 millones de personas
padeciendo esta enfermedad (Grant, 2004; Hebert, 2003; García, S. et al.,
2009). México no es la excepción, las transiciones sociales, demográficas y
económicas que ha experimentado nuestro país en las últimas décadas han
propiciado que un mayor número de personas llegue a la tercera edad, debido
particularmente a los avances registrados por la medicina, lo que ha
incrementado sustancialmente la esperanza de vida y con ello el riesgo del
deterioro intelectual durante la senectud. Se estima que alrededor del 25 por
ciento de la población mexicana sufrirá en el curso de su vida algún trastorno
mental. Así mismo estos padecimientos constituyen una de las principales
causas de pérdida de años de vida saludable. Las autoridades de salud mental
en México informaron que de 600 mil personas de edad avanzada que padecen
algún tipo de demencia, se calcula que 60% de los casos corresponde a la EA
(Magally, 2002). La transformación de la pirámide poblacional en nuestro país
permite prever que durante los próximos años la demanda de servicios de
salud mental será mayor debido al envejecimiento de la población y, en
particular, es probable que los casos de EA muestren una mayor prevalencia
(www.salud.gob.mx).
2.3.1 Fisiopatología
Aunado al proceso de envejecimiento en los pacientes que sufren la EA
los cambios morfológicos como la contracción del cerebro y las modificaciones
en la vascularización del mismo hacen que el proceso de deterioro cognoscitivo
sea exacerbado (Robertson, 2002).
Todas las regiones de la corteza cerebral reciben intensas inervaciones
colinérgicas, en la EA hay actividad reducida de proyecciones colinérgicas al
hipocampo y corteza, mientras que las alucinaciones experimentadas por
Antecedentes
10
personas con demencia con cuerpos de Lewy (DLB) están asociadas con
reducciones en la actividad de la acetilcolina neocortical. Funciones cognitivas
superiores como la memoria y el aprendizaje están estrictamente relacionadas
a eventos moleculares que son consecuencia de la expresión temprana de
productos génicos. Esto incluye la activación de receptores colinérgicos,
potenciación a largo plazo y depresión a largo plazo, plasticidad sináptica y
mantenimiento y diferenciación de neuronas (Fodale et al., 2006).
La EA se caracteriza por el deterioro de las funciones cognoscitivas,
resultado de la pérdida irreversible de las células cerebrales, particularmente
en la corteza e hipocampo. Las características más importantes de esta
enfermedad son la perdida de la memoria, el juicio, alteraciones en la toma de
decisiones, orientación y lenguaje aunque pacientes que presentan esta
enfermedad presentan otros síntomas como agitación, psicosis, depresión y
cambios en la personalidad. Sin embargo el diagnóstico definitivo sólo se
puede hacer mediante la autopsia. (Raskind et al., 2002).
La hipótesis colinérgica de disfunción de la memoria fue propuesta por
Bartus en 1982, se basa en dos nociones principales: la primera es que el
sistema colinérgico sostiene una gran variedad de procesos cognitivos,
particularmente los involucrados en el aprendizaje y memoria, la segunda es
que el déficit cognitivo relacionado con la edad es en parte causado por un
declive en la integridad funcional de ese sistema colinérgico cerebral. Lo
anterior deja ver que la pérdida de neuronas colinérgicas corticales se
considera como marcador de la enfermedad. Esto estudios han estimado la
relación entre la EA y el sistema colinérgico central son consistentes con
deficiencias en la neurotransmisión colinérgica y daño en la función cognitiva
de pacientes con EA (Fodale et al., 2006).
La inflamación juega un papel muy importante en muchas enfermedades
asociadas a la edad. Es probable que la actividad inflamatoria derive en la
muerte neuronal en el paciente con EA. Este proceso inflamatorio que circunda,
rodea e infiltra las placas neuríticas se asocia con la liberación de sustancias
mediadoras de inflamación como: la alfa 1 antiquimotripsina, la alfa 2
Antecedentes
11
macroglobulina, la interleucina 1 y la interleucina 6, que son sobreexpresadas y
activan mas células gliales, lo que provoca la muerte neuronal en pacientes con
EA (Griffin, 2006).
En general, las alteraciones fisiopatológicas y anatómicas de la
enfermedad se dividen en estructurales y funcionales. Dentro de la primera, se
identifican: marañas neurofibrilares que están compuestas de filamentos
helicoidales apareados y ocasionalmente filamentos rectos simples. Contiene
principalmente una forma anormal de la proteína tau hiperfosforilada, asociada
a los microtúbulos. En las neuronas saludables la proteína tau une y estabiliza
los microtúbulos que constituyen el citoesqueleto de la célula mediado por un
proceso de fosforilación y desfosforilación enzimática reversible. La formación
de estas marañas neurofibrilares destruye a la proteína tau interrumpiendo el
transporte neuronal y la muerte de las neuronas afectadas (Satyabrata et al.,
2004). Otro elemento estructural de daño orgánico lo representa la aparición de
placas neuríticas de material amiloide tóxico. Estas placas constituidas por la
proteína -amiloide regulan negativamente la síntesis y liberación de
acetilcolina, inhibiendo la piruvato deshidrogenasa que genera Acetil-Coenzima
A de piruvato. Un incremento en la forma soluble de -amiloide es considerada
un predictor de degeneración sináptica y esta relacionada con el daño cognitivo
en pacientes con EA (Fodale et al., 2006). La principal alteración funcional de
EA es la disminución en la producción o funcionamiento de sustancias
neurotrasmisoras. Los cambios estructurales y funcionales son el resultado de
una cadena de conmutaciones del programa genético neuronal y cambios
ambientales que modifican la estructura y la neurotransmisión del cerebro
(García, S. et al., 2009). Las placas neuríticas se forman primero en la
neocorteza basal y luego se expanden hacia la formación hipocampal y áreas
corticales adyacentes (Rogers y Morrison, 1985; Pearson et al., 1985;
Duyckaerts et al., 1986; Ingelsson et al., 2004). El sistema límbico está
fuertemente involucrado en la EA, particularmente el área del hipocampo está
relacionada con la función cognoscitiva y de memoria. Además, la muerte de
subpoblaciones neuronales como las colinérgicas, generan un déficit específico
de neurotransmisores, principalmente ACh como parte del escenario que
engloba a la EA. La evidencia clínica de la degeneración de las neuronas
Antecedentes
12
colinérgicas y las observaciones experimentales en animales, apoyan la
hipótesis de que la actividad nerviosa colinérgica juega un papel clave en la
función cognoscitiva (Matsuoka et al., 1992). Una de las características más
destacadas en los estudio postmortem en personas que padecieron la EA es la
disminución de los niveles de ACh en el Sistema Nervioso Central (SNC)
(Hebert et al., 2003). Otra característica importante es la formación de
astrocitos reactivos y el daño oxidativo originado por la microglia durante el
desarrollo de la enfermedad (Selkoe, 2001; Reddy y Beal, 2005; Reddy y
McWeeney, 2005).
2.3.2 Tratamiento
Los tratamientos que actualmente se utilizan para tratar la EA están
dirigidos a retrazar el avance de la enfermedad y disminuir la sintomatología de
la misma; principalmente se utilizan inhibidores de la enzima Achasa que tiene
como función destruir la ACh una vez que es liberada al espacio sináptico para
ejercer su acción, de esta manera lo que se busca es que aumente la ACh
acetilcolina a nivel de sistema nervioso central y que permanezca más tiempo
ejerciendo su acción sobre los receptores de las células postsinápticas. Existen
cuatro fármacos inhibidores de la Achasa, la tacrina, donezepilo, galantamina y
la rivastigmina, el primero que salió al mercado fue la tacrina, sin embargo, no
fue utilizado por mucho tiempo debido a su hepatotoxicidad. El donezepilo es
un inhibidor reversible, mejora la memoria y es relativamente selectiva a la
acetilcolinesterasa del SNC. La galantamina también es un inhibidor reversible,
además de que es un modulador alostérico de las receptores nicotínicos
presinápticos que aumentan la liberación de acetilcolina, glutamato y de GABA.
La rivastigmina ejerce su efecto principalmente en la corteza cerebral y el
hipocampo no es hepatotóxico pero al igual que los dos fármacos anteriores
produce efectos secundarios como calambres e incontinencia y en general
nauseas, vómitos, diarreas e insomnio, la (Wilkinson et al., 1999; Farlow et al.,
2007).
Antecedentes
13
Los agentes antiinflamatorios y antioxidantes son utilizados para reducir
el riesgo EA, atenuando la neurodegeneración generada por la actividad de las
células de la glía. La inflamación es un proceso que genera radicales libres que
inicialmente provocan daño celular, y posteriormente la muerte celular, por lo
tanto sustancias con actividad antioxidante se vuelven elementos básicos en la
búsqueda de alternativas para el tratamiento de la EA (Heneka et al., 2007).
2.4 Plantas medicinales utilizadas para contrarrestar padecimientos del
SNC.
La medicina tradicional menciona el uso de plantas con propiedades
sobre el sistema nervioso, como Ginkgo biloba y Panax ginsen que han
confirmado su eficacia terapéutica en numerosas alteraciones de la función
cerebral de origen isquémico vascular, demencias seniles ligeras y severas
como el Alzheimer. En todos los casos se apreció mejoría de los signos y
síntomas de las funciones cognitivas, particularmente de aquellas relacionadas
con pérdida de memoria, atención, alerta, vigilancia y fluidez mental. El Ginkgo
biloba en la EA parece actuar sobre el control de su progresión. Se ha
comprobado igualmente un efecto neuroprotector específico en células del
hipocampo (Diamond, 2000).
Los extractos vegetales que sustentan los tratamientos con
fitomedicamentos se están constituidos principalmente por sustancias
derivadas el metabolismo secundario. Dentro de ellas son los flavonoides son
pigmentos que protegen al organismo del daño producido por agentes
oxidantes, como los rayos ultravioletas, la polución ambiental, sustancias
químicas presentes en los alimentos, etc. El organismo humano no puede
producir estas sustancias químicas protectoras, por lo que deben obtenerse
mediante la alimentación o en forma de suplementos. Los flavonoides
contienen en su estructura química un número variable de grupos hidroxilo
fenólicos que les confieren excelentes propiedades de quelación del hierro y
otros metales de transición. Por ello presentan una gran capacidad antioxidante
y desempeñan un papel esencial en la protección al daño orgánico provocado
por el estrés oxidativo. Siendo muy efectivos en la terapéutica de un elevado
Antecedentes
14
número de patologías como: cardiopatía isquémica, aterosclerosis, cáncer,
diabetes mellitus, infecciones víricas, úlcera estomacal y duodenal, y procesos
inflamatorios asociados. Su capacidad de secuestrador de radicales libres se
dirigen fundamentalmente hacia radicales hidroxilo y superóxido, especies
altamente reactivas implicadas en el inicio de la cadena de peroxidación lipídica
y se ha descrito su capacidad de modificar la síntesis de eicosanoides (con
respuestas anti-prostanoide y anti-inflamatoria), de prevenir la agregación
plaquetaria (efectos antitrombóticos) y de proteger a las lipoproteínas de baja
densidad de la oxidación (prevención de la placa de ateroma) (Martínez-Flores
et al. 2002). Se ha evaluado la actividad de los flavonoides en enfermedades
como el Alzheimer en la que como ya se ha mencionado existen niveles
reducidos del neurotransmisor acetilcolina, que es hidrolizado por la enzima
acetilcolinesterasa. A la par existe otra enzima llamada Butirilcolinesterasa que
funciona como un corregulador de la neurotransmisión colinérgica ya que
posee una similitud estructural con la acetilcolinesterasa, sin embargo, durante
el desarrollo de la EA su actividad se incrementa hasta un 90% dañando
también la comunicación entre zonas cerebrales como la corteza y el
hipocampo. Los flavonoides se han estudiado con el objetivo de buscar la
inhibición tanto de la acetilcolinesterasa como butirilcolineterasa debido a su
similitud estructural. Como se menciona anteriormente las flavonoides poseen
una gran variedad de propiedades, entre ellas la de inhibir enzimas como las
cinasas dependientes de tirosina y ciclina, de donde fue posible suponer en la
inhibición de acetilcolinesterasa y butirilcolinesterasa. En un estudio realizado
con 10 flavonoides respecto a la capacidad inhibitoria de acetil colinesterasa
fue posible establecer la siguiente secuencia: Miricetina=Quercetina
>Luteolina>Galangina=Kampherol>Fisetina>Apigenina y Rutina no presentó
efecto inhibitorio relevante (Katalinic et al., 2009).
Otro grupo de compuestos que se han descrito como inhibidores de la
acetil colinesterasa son los ácidos triterpénicos (Reuter et al., 2007),
específicamente el ácido ursólico, que mostró inhibición mixta competitiva – no
competitiva, con un valor de Ki = 6 pM e IC50 = 7.5 nM, comparado con tacrina
que tuvo Ki =0.4 nM e IC50 = 1.0 nM (Chung et al., 2001).
Antecedentes
15
Otros estudios realizados con el extracto hidroalcohólico de Bouvardia
ternifolia silvestre han demostrado su eficacia como antiinflamatorio y mejora
de la memoria en ratones e inhibidor de la enzima acetilcolinesterasa in vitro,
procesos relacionados directamente con la EA (García, 2008).
2.4.1 Bouvardia ternifolia
Figura 1. Ejemplar de Bouvarida ternifolia colectada en la localidad de Coajomulco Municipio de Huitzilac Morelos. (N 19° 01’ 37.38”, WO 99° 12’ 38.37”, 2572 msnm).
Taxonomía
Reino: Plantae
Subreino: Traqueobionta (plantas vasculares).
Superdivisión: Spermatophyta (plantas con semillas).
División: Magnoliophyta (plantas con flor).
Clase: Magnoliopsida (dicotiledóneas).
Subclase: Asteridae.
Orden: Rubiales.
Familia: Rubiaceae.
Género: Bouvardia
Especie: Bouvardia ternifolia
Antecedentes
16
Descripción botánica
Es una planta herbácea, que llega a alcanzar los 3 m de altura, en el
tallo y ramas hay presencia de pelos blancos y cortos, sus hojas pueden ser de
forma linear, lanceoladas o elípticas pero en la mayoría de los casos son de
forma elíptico-lanceoladas, llegan a medir de 1 a 10 cm de largo y 0.2 a 2.5 cm
de ancho, tienen un ápice agudo, base cuneiforme, nervación pinnada y
comúnmente verticiladas, en numero de 3 a 4 por nodo, los peciolos miden
entre 0.5 y 11 mm de largo, su inflorescencia se encuentra en la parte terminal
de las ramas en numero de 3 a 40, con pedicelos de 2 a 14 mm de largo. Las
flores tienen corola de forma tubular de color salmón, rojo o naranja, en raras
ocasiones de color blanco, el tubo mide de 5 a 30 mm de largo, con un anillo
velloso interno hacia la base, sus anteras miden de largo entre 2 y 4 mm, los
lóbulos del cáliz son de forma lanceolada o lineares con una longitud de 2 a 10
mm. El fruto es una capsula de 4.5 a 9 mm de largo y de 5 a 10 mm de ancho
sin pelos; sus semillas miden de 2 a 3.5 mm de ancho (Rzedowski et al., 2001).
Usos
Es utilizada para problemas del sistema circulatorio y digestivos,
infecciones, desórdenes mentales, nervios, inflamación, problemas en el
embarazo, parto, desórdenes del sistema respiratorio, envenenamientos y
dolor, así como para la disentería, rabia, cólicos y diarrea, sangrado, también
se usa como tónico cardiaco, sus hojas y flores se usan para la erisipela, en
forma de cataplasma o ingerida como infusión es usada contra piquetes de
insectos (planta completa o semilla). Hervida y tomada como té se usa contra
el prurito (Argueta, 1994; Aguilar-Contreras et al., 1998).
Distribución geográfica
Es originaria de Mesoamérica y de México. Se distribuye en zonas de
bosque de pino-encino, pastizales y matorral xerófilo, se le ha encontrado hasta
los 3000msnm. En los Estados Unidos de America se ha localizado en los
condados de Texas, Nuevo México y Arizona, en México en los estados de
Chihuahua, Coahuila, Distrito Federal, Durango, Guanajuato, Hidalgo, Estado
de México, Michoacán, Morelos, Nayarit, Nuevo León, Oaxaca, Puebla,
Antecedentes
17
Querétaro, San Luís Potosí, Sinaloa, Sonora, Tamaulipas, Tlaxcala, Veracruz
(Villaseñor et al., 1998). En México se le conoce como Donita, nucppuetel,
candelilla, doto, en el estado de Sinaloa se le conoce como hierba del indio,
hierba del pasmo, en Coahuila y Durango se le conoce como mirto, trompetilla,
hierba del burro, mirto de campo (Aguilar-Contreras et al., 1998; Martínez,
1979).
Estudios fitoquímicos
Se han aislado de las partes aéreas de esta planta componentes
peptídicos como el bouvardín que es un hexapéptido cíclico, formado por 2 L-
alaninas, una D-alanina y 3 N-metil-L-tirosinas modificadas, además posee un
anillo formado por el acoplamiento oxidativo del oxígeno fenólico de una
tirosina por el carbono orto del grupo hidroxil fenólico de una tirosina adyacente
(Jolad et al.1977) además de los derivados desoxi y metilados (Shivanand et
al., 1977). En la su raíz de existe una elevada concentración de los ácidos
ursólico y oleanólico (Pérez et al., 1998.), los cuales poseen actividades
antiinflamatorias, analgésicas, sedantes, hepatoprotectoras y sobretodo de
inhibición de la enzima acetil colinesterasa (Chung et al., 2001; Jiménez-Ferrer
et al., 2005.).
Estudios farmacológicos
Se comprobó que el extracto metabólico de las partes aéreas presenta
actividad antitumoral y citotóxica; mediante una evaluación en ratón
administrados por vía intraperitoneal. La actividad citotóxica fue observada en
células tumorales de carcinoma in vitro a una concentración de 20 g/ml
(Argueta, 1994). Los extractos hexánico y metanólico presentaron efecto
inhibitorio de la acción tóxica del veneno de Centruroides limpidus limpidus en
ratones (Jiménez-Ferrer et al., 2005). Se demostró en estudios preeliminares
que el Bouvardín tiene alta efectividad contra la leucemia P388 y es
ligeramente activo contra el melanoma B16. Como antitumoral inhibe de la
síntesis de proteínas (Johnson et al., 1978). Además tiene un elevado efecto
Antecedentes
18
contra el ciclo de división celular en el cultivo de células de Hámster Chino
(Tobey et al., 1978).
El extracto hidroalcohólico de presentó efecto inhibitorio de la enzima
acetilcolinesterasa, efecto antiinflamatorio en el pabellón auricular de ratones y
nootrópico en ratones expuestos al modelo de laberinto en forma de “T”
(García, 2008).
2.5 Métodos de propagación vegetal
Como todos los seres vivos las plantas llevan a cabo un ciclo de vida
que consiste en nacer, crecer, reproducirse y morir. Existen solo dos métodos
de reproducción vegetal para las plantas: la forma sexual y la asexual, en esta
última se producen nuevos organismos a partir de semillas, haciendo posible
obtener nuevas variedades de plantas, detectar aquellas que se han adaptado
a las condiciones de un medio concreto y mejorar la especie mediante la
selección de ejemplares con características de interés (Boutherin, 2005).
En la propagación asexual no se produce la recombinación genética; ya
que el genoma de la planta hija, es idéntico al de la madre, lo cual permite
obtener preservar las características de interés y crear lotes con plantas
homogéneas (Boutherin, 2005). En este tipo de propagación se producen
organismos a partir de algún otro órgano de la planta (tallo, hoja o raíz). Sin
embargo la propagación vegetal se basa en el potencial de propagación de
cada especie (Vázquez et al., 1997). Existen varias técnicas de propagación
asexual: desqueje, injertos, acodo, división de matas, división de retoños,
macolladura y la micropropagación que es la propagación asexual de plantas
utilizando técnicas de cultivo in vitro. La micropropagación es una de las
aplicaciones mas utilizadas debido a su gran productividad comparada con las
técnicas tradicionales de propagación. Esta técnica ofrece varas ventajas,
como son un sistema de propagación clonal, es decir que mantiene las
características genotípicas del material seleccionado inicialmente; es un
sistema independiente de las condiciones externas como las estaciones del
año, sequías, heladas, debido a que todo se realiza bajo condiciones
Antecedentes
19
controladas de laboratorio: el número de plantas que se puede obtener es
ilimitado; requiere de espacios pequeños el proceso es relativamente corto;
otra ventaja importante es que las plantas obtenidas se encuentran libres de
patógenos que pueden afectar la calidad de las plantas. La micropropagación
se puede llevar a cabo a partir de meristemos apicales, yemas axilares (nodos)
y ápices, siendo la propagación por nodos la más comúnmente utilizada, ya
que son zonas naturales de crecimiento capaces de formar nuevos brotes que
al cabo de varios ciclos de corte de nodos y siembra permite aumentar de
manera exponencial el número de plantas obtenidas, algunas ventajas
importantes de este tipo de propagación son que ofrecen una estabilidad
genética excelente, el sistema es muy similar en todas las especies y permite la
obtención rápida de plantas libres de patógenos. La micropropagación de
cualquier especie vegetal consta de cinco etapas básicas:
La etapa 0. Es la etapa en la que se seleccionan y acondicionan las
plantas madre que serán utilizadas para iniciar el cultivo in vitro.
La etapa 1. Establecimiento de los cultivos axénicos. En esta se
selecciona el explante y se lleva a cabo la esterilización del mismo.
Etapa 2. Multiplicación del tejido. En esta etapa se lleva a cabo la
verdadera micropropagación con la finalidad de obtener un gran número
de brotes nuevos a partir de las mínimas cantidades de tejido,
Etapa 3. Elongación y Enraizamiento. En esta etapa se hace uso del
material generado en la etapa 2 que son básicamente pequeños brotes,
la mayoría carentes de raíz y de los cuales se pretende que lleven a
cabo la formación de su sistema radical, al mismo tiempo de que su
elongación se vea incrementada para poder llevar a cabo una mejor
manipulación de las plántulas y hacer más probable su adaptación a las
condiciones ambientales externas.
Etapa 4. Adaptación al medio externo. Las plantas generadas in vitro
presentan grandes dificultades a la adaptación hacia el medio externo,
por lo que se hace necesario enfrentar a tal planta a cambios moderados
de humedad relativa, horas luz etc. (Pérez et al., 1999)
Antecedentes
20
Ventajas:
Permite controlar las condiciones ambientales, debido a su
independencia de los mismos (luz, temperatura, y humedad).
Permite estudiar diversos procesos Fisiológicos.
Evita el riesgo de contaminación con patógenos, ya que se realizan en
medios estériles.
Se puede obtener grandes cantidades de plántulas en espacios
reducidos
Permite tener plántulas con características homogéneas (Segretin, 2007)
El cultivo de plantas medicinales se ha vuelto de gran importancia
debido a varias razones, por ejemplo, los metabolitos secundarios de las
plantas son un recurso importante de las industrias farmacéuticas,
experimentando en el comercio medicinal un incremento a nivel mundial en los
últimos 20 años; en el mundo, 1.5 billones de personas pertenecientes a países
en desarrollo continúan utilizando plantas medicinales en la forma tradicional.
Los productos naturales han empezado a ser nuevas estrategias comerciales y
se han implementado en programas de salud alternativa en países
desarrollados sin excluir a los no desarrollados. Por lo que la demanda de
plantas medicinales ha crecido en Europa y todo el mundo; la comercialización
de plantas medicinales significa cada año un negocio de 20,000 millones de
dólares en todo el mundo. Siendo un área de gran importancia a nivel
internacional tanto para químicos, biólogos, antropólogos, sociólogos como
también para economistas, administradores y grandes empresarios (Secretaria
de Desarrollo Rural, 2005). Por lo que el establecimiento de técnicas para el de
cultivo de plantas medicinales se hace indispensable para el aprovechamiento
de este recurso. La biotecnología provee de las técnicas adecuadas de cultivo
que favorecen el mejoramiento de la calidad de los cultivos de plantas.
Antecedentes
21
2.5.1 Hidroponía
Existen varias formas de cultivo de plantas, la tradicional que se realiza
en suelo directamente el cultivo en sustrato y la hidroponía que forma parte de
los llamados “cultivos sin suelo”. En estos sistemas el medio de crecimiento o
soporte de las plantas puede estar constituido por sustancias de origen
orgánico o inorgánico e inertes, donde se garantiza que la nutrición de la planta
es exclusivamente externa. Por lo tanto la hidroponía es un sistema de
producción donde el agua es el medio donde las plantas encuentran los
nutrientes necesarios para su desarrollo sin la participación del suelo. Las
ventajas más sobresalientes de este sistema es que requieren un número
menor de horas de trabajo, las plantas no tienen competencia por los
nutrientes, las raíces tienen mejores condiciones de crecimiento, se logra una
perdida mínima de agua, no tiene problemas con las malezas, se reduce la
aplicación de agroquímicos, entre otros. Por lo tanto estas dos técnicas en
conjunto permiten la propagación, el crecimiento y desarrollo de plantas en
condiciones controladas (Gilsanz, 2007).
Si bien existen antecedentes en la micropropagación de la especie
Bouvardia ternifolia (Fernández y Sánchez de Jiménez, 1983), hasta el
momento no se han registrado diseños del desarrollo en hidroponía de la
planta. El protocolo de cultivo en hidroponía establecido en este trabajo de
tesis, será el pionero en esta área, para poder establecer el desarrollo
controlado de la planta y evaluar sus propiedades farmacológicas.
Justificación
22
3. JUSTIFICACION
a EA representa un grave problema de salud pública para México y
para el mundo, debido que se encuentra en franco crecimiento por el
incremento de los estratos poblacionales mayores de 60 años, al
aumentar la esperanza de vida. Estos son segmentos de la población son los
que presenta el mayor riesgo de padecer EA. Otro factor que agrava la
situación, es el aumento de la prevalencia de enfermedades crónico-
degenerativas asociadas al envejecimiento, donde el daño orgánico se
incrementa por la exposición al estrés oxidativo. La búsqueda de nuevas
terapias tiene en los fitomedicamentos un recurso de enorme potencial, en
tanto que consisten en extractos vegetales que se definen como una mezcla de
principios activos. Siendo la EA un proceso fitopatológico multifactorial, la
administración de mezclas complejas sustancias diversas actividades
farmacológicas, surge como un tratamiento lógico. Se tiene antecedentes
químico-farmacológico, de que el extracto de Bouvardia ternifolia presenta la
capacidad de contrarrestar las principales alteraciones de EA; por el efecto
nootrópico, antiinflamatorio y antioxidante, destacando la actividad como
inhibidor de la acetilcolinesterasa. Con ello se puede concebir a esta planta,
como una especie con la que se puede alcanzar el desarrollo de un
fitomedicamento anti Alzheimer. Sin embargo, una de las limitantes mas
importantes que presenta cualquier desarrollo tecnológico de un
fitomedicamento fundamentado en una planta silvestre y por ello no cultivada,
es asegurar el abasto de material vegetal de buena calidad, que contenga los
principios activos asociados a la actividad farmacológica deseada.
Es por ello que en este proyecto se pretende caracterizar el efecto
farmacológico como inhibidor de acetil colinesterasa del extracto de Bouvardia
ternifolia micropropagada y cultivada en hidroponía; estableciendo su perfil de
composición fitoquímica y una la comparación tanto química como
farmacológica con un extracto de B. ternifolia silvestre.
LL
Hipótesis
23
3.1 Hipótesis
l extracto hidroalcohólico de Bouvardia ternifolia cultivada en hidroponía
tiene el efecto inhibidor de la enzima acetilcolinesterasa igual que la
planta silvestre.
EE
Objetivos
24
4. OBJETIVOS
4.1 Objetivo general
valuar el efecto inhibidor de acetilcolinesterasa por extractos de
Bouvardia ternifolia cultivada.
4.2 Objetivos particulares
Establecer el protocolo para la micropropagación de Bouvardia ternifolia
por cultivo de nodos.
Establecer las condiciones de crecimiento y desarrollo en hidroponía.
Realizar la caracterización fitoquímica de los extractos de Bouvardia
ternifolia.
Evaluar el efecto de los extractos de Bouvardia ternifolia en la inhibición
de la enzima acetilcolinesterasa.
EE
Materiales y Métodos
25
5. MATERIALES Y MÉTODOS
5.1 Material biológico
5.1.1 Material vegetal
as partes aéreas y semillas de B. ternifolia se colectaron en la
localidad Coajomulco, Municipio de Huitzilac Morelos, un ejemplar de
herbario fue enviado para ser identificado en el Herbario de Centro
Médico Siglo XXI- IMSS por la M. en C. Abigail Aguilar Contreras quien la
registro con el número: HPMIMSS 13596.
5.1.2 Animales utilizados para las pruebas farmacológicas
Se utilizaron ratones hembra de la cepa ICR para obtener la enzima
acetilcolinesterasa mediante la extracción y maceración de cerebro, estos
animales fueron mantenidos y acondicionados en el laboratorio bajo
condiciones controladas, como son 12 hrs luz por 12 hrs oscuridad,
temperatura de 24 ºC y acceso libre al agua y alimento. Además se
manipularon bajo la ética de la Norma Oficial Mexicana NOM-062-ZOO-1999
(Especificaciones técnicas para la producción, cuidado y uso de los animales
de laboratorio).
5.2 Métodos
Los métodos utilizados para la realización de este trabajo se muestran
en el diagrama de flujo de la figura 2.
5.2.1 Micropropagación
Desinfestación de semillas. Se llevó a cabo de acuerdo al diagrama de
la figura 3 basado en lo reportado por Eugenio Martín Pérez y colaboradores
en 1999.
LL
Materiales y Métodos
26
Figura 2. Diagrama de flujo del trabajo experimental.
Figura 3. Diagrama del protocolo para la desinfestación de semillas.
Extran al 2% 5min
Etanol al 50% 10s.
Hipoclorito de sodio a 0.3 % 5min.
Siembra medio semisólido MS
Materiales y Métodos
27
La desinfestación de semillas comenzó con un lavado en extran al 2%
por 5 minutos (min), seguido de la inmersión en etanol al 50% por 10 segundos
(s) y después en condiciones asépticas se hizo la inmersión en hipoclorito de
sodio al 0.3% ( a partir de cloro comercial al 6%), al final se realizó la siembra
en medio MS. Un frasco tipo Gerber con cinco semillas se consideró como
unidad experimental, de las cuales se hicieron cinco repeticiones por cada
tratamiento. Se evaluó el porcentaje de desinfestación por unidad experimental
durante 8 días antes de la germinación y 10 días más después de la
germinación. Con las plántulas obtenidas se procedió a la micropropagación
por cultivo de nodos.
Cultivo de nodos.
Se evaluó el efecto de las citocininas Cinetina y Bencilaminopurina en la
brotación múltiple de los segmentos nodales provenientes de plantas asépticas
conforme al diseño experimental indicado en el cuadro 1. Los explantes fueron
colocados en medio MS al 100%. Se cuantificó el número de brotes por unidad
experimental. Se consideró unidad experimental un frasco tipo Gerber con
cuatro explantes. El tiempo de de valuación fue de 3 semanas. Con los datos
obtenidos se realizó una ANOVA para determinar si había diferencia entre los
tratamientos.
Cuadro 1. Diseño experimental para la inducción de brotación múltiple en segmentos nodales de B. ternifolia. Cada letra del abecedario es un tratamiento.
Concentración (mg/L)
CITOCININAS
Cinetina (KIN) Bencilamiopurina (BAP)
0.0 A E 0.2 B F 0.5 C G 1.0 D H 1.5 E I
Materiales y Métodos
28
Inducción de raíces.
Se emplearon las auxinas Acido Naftalenacético, Indolbutírico e
Indolacético para inducir la formación de raíz en los brotes desarrollados
después de 3 semanas en el medio de inducción de brotación múltiple, el
diseño aplicado para este fin se muestra en el cuadro 2.
Cuadro 2. Diseño experimental para inducir la formación de raíces de explantes provenientes de la brotación múltiple de B. ternifolia. Cada letra del abecedario es un tratamiento.
Concentración (mg/L)
AUXINAS
Ácido Naftalenacético
(ANA)
Ácido Indolbutírico
(IBA)
Ácido Indolacético
(AIA) 0.1 A E J 0.2 B F K 0.5 C G L 1.0 D H M 1.5 E I N
Los explantes fueron colocados en medio MS al 100%. Se cuantificó el
número de explantes con raíz por unidad experimental el cual nuevamente fue
un frasco tipo Gerber con cuatro explantes; de ésta cuantificación se obtuvo un
promedio por cada tratamiento y se determino si existía diferencia significativa
de los tratamientos mediante una ANOVA.
5.3 Aclimatización.
Se realizó aplicando el método reportado por Ventura y colaboradores
en el 2003 el cual consistió en la transferencia de las plántulas a sistemas
hidropónicos construidos con recipientes de plástico de 5 cm de alto por 6 cm
de diámetro en los que se vertió solución nutritiva de Hoaglan y Arnonn 1950.
Estos se cubrieron con una tapa de goma EVA (Ethylene Vinyl Acetate)
perforada en el centro para el sostener las plántulas, posteriormente se
cubrieron con bolsas de nylon de 10 x 20 cm previamente asperjadas con agua
destilada en su interior. Después de la primer semana se les hicieron
perforaciones de 6 mm de diámetro con una perforadora convencional cada
tercer día durante 2 semanas, con la finalidad de igualar las condiciones del
Materiales y Métodos
29
interior del sistema hidropónico con el ambiente externo, después de la tercer
semana se determino el porcentaje de supervivencia al contar el número de
plántulas aclimatizadas entre el número total de plántulas transferidas
inicialmente.
5.4 Cultivo Hidropónico
Efecto de la solución nutritiva de Hoagland en el desarrollo de plántulas
de B. ternifolia.
Se evaluó el efecto de diferentes concentraciones de la solución nutritiva
de Hoagland en el desarrollo de plántulas de B. ternifolia provenientes de la
germinación de semillas ex vitro. Los tratamientos fueron concentraciones de
solución nutritiva al 25, 50, 75, 100 y 125% con diez repeticiones por cada uno,
siendo la unidad experimental un recipiente de plástico del No. 8 con capacidad
de 250 ml con una plántula la cual se sostuvo con una tapa de papel aluminio,
los recipientes se cubrieron con papel aluminio para impedir el desarrollo de
organismos fotosintéticos y colocados en invernadero. Se hizo el registro de
longitud de brote (cm), de raíz (cm), y número de nodos cada siete días en un
periodo de 2 meses. Se aplicó una ANOVA para encontrar diferencias
significativas en el desarrollo de las plantas.
Cultivo hidropónico de plántulas provenientes de la micropropagación.
Plántulas provenientes del procesos de aclimatización se colocaron en
macetas de 7 cm de diámetro que contenían una mezcla de vermiculita y
agrolita en proporción de 3 a 1 respectivamente, las cuales se colocaron en
charolas de plástico de color negro de 40 cm de largo x 18 cm de ancho y 5.5
cm de profundidad en las que se vertió solución nutritiva de Hoagland y Arnon
al 100% ya que este tratamiento fue el que generó el mejor desarrollo de
plántulas de B. ternifolia. Permanecieron en condiciones de invernadero
durante un periodo de 10 semanas, al cabo del cual se cosecharon para su
secado y posterior evaluación fitoquímica y farmacológica.
Materiales y Métodos
30
5.5 Extracto vegetal de Bouvardia ternifolia cultivada
Secado y obtención de extractos.
Las plantas cosechadas se secaron en un cuarto obscuro a temperatura
ambiente hasta alcanzar un estado de quebradizo. Posteriormente se procedió
a moler en una picadora maraca Pulvex Plaxtic (Fig.4) el material molido se
maceró en una solución hidroalcohólica al 60% (60 etanol-40 agua), el líquido
recuperado mediante tres lavados consecutivos fue concentrado en un
evaporador rotatorio marca “Heidolph” modelo “Laborota 4000” (Fig.5) a 60°C
para la eliminación del disolvente, el material que se recuperó fue liofilizado y
almacenado para su posterior uso en las pruebas biológicas.
Figura 4. Maquina picadora marca PULVEX PLASTIC.
Materiales y Métodos
31
Figura 5. Evaporador rotatorio “Heidolph” modelo
“Laborota 4000”
5.6 Estudio fitoquímico
Fraccionamiento del extracto hidroalcohólico de la planta silvestre
Se tomaron 20 g del extracto hidroalcohólico de partes aéreas, se
disolvieron en 300 ml de agua y 300 ml de Acetato de Etilo (AcoEt) con la
finalidad de separa los compuestos de diferente polaridad, Figura No. 3.
Figura 6. Esquema general del estudio fitoquímico.
Primero se montó una columna de separación en donde se colocó la
solución de extracto con agua y AcoEt se agitó vigorosamente y se esperó a la
separación física de los solventes, se recuperó la fracción de AcoEt que es mas
densa que el agua y para ser concentrada en el evaporador rotatorio, el
Fracción- Acuosa
Fracción-Acetato de Etilo
Fraccionamiento del
extracto hidroalcohólico
Materiales y Métodos
32
extracto recuperado se fue almacenando para ser liofilizado posteriormente, el
solvente recuperado se agregó nuevamente a la columna y se realizo el mismo
procedimiento 3 veces, una vez terminados los tres lavados las dos fracciones
obtenidas se concentran nuevamente en el evaporador rotatorio y se liofilizan.
Identificación de compuestos en el extracto hidroalcohólico de la planta
silvestre.
Se pesó 10 mg de cada fracción que se obtuvo incluyendo el extracto
hidroalcohólico se disolvieron en 1 ml de metanol y 0.2 ml de agua. El análisis
de compuestos en cada una de las fracciones se realizó a través de una
cromatografía de placa en fase normal. Las fracciones que se obtuvieron
fueron probadas en el ensayo de inhibición enzimática.
La comparación fitoquímica del extracto hidroalcohólico de plantas
silvestres y cultivadas, se hizo mediante placas cromatográficas de fase normal
con un revelador para flavonoides y otra con revelador para terpenos.
5.7 Inhibición de la enzima Acetilcolinesterasa in vitro.
La evaluación de la actividad farmacológica como inhibidor de la
Acetilcolinesterasa se realizó de la siguiente manera (Rabanal y col., 2005):
Para un volumen final total de 360 l, en la celda de un
espectrofotómetro se adicionaron 300 l de buffer (100 mM de fosfatos
pH 8.0), 20 l de ATChI (Sigma Aldrich Química) (yoduro de
acetiltiocolina como sustrato en las concentraciones de 75, 50, 25, 10 y
5 mM), 20 l de DTNB (Sigma-Aldrich Química)(10 mM de dithio-bis-
nitro-benzoato, como marcador) incubado a 37°C.
Para iniciar la reacción enzimática se adicionaron 20 l de solución
enzimática (acetilcolinesterasa) (5 x 10-3 U) y se determino el incremento
de la D.O. a 412 nm, la actividad es reportada en unidades. El extracto
Materiales y Métodos
33
enzimático obtenido de la maceración de cerebro de ratón, se
estandarizó contra acetil colinesterasa purificada de anguila eléctrica
(Sigma Aldrich Química).
La unidad se define como 1 mmol de ATChI transformada por minuto,
para lo que se construyo una curva estándar de ATChI la cual reacciona
con DTNB formando un compuesto de color amarillo.
Para el ensayo de inhibición se utilizaron soluciones de: 0.00625,
0.0125, 0.025, 0.05 y 0.1 mg/ml del extracto vegetal de B. ternifolia
silvestre y cultivada, utilizando 280 l de buffer de fosfatos, 20 l de
ATChI, 20 l de DTNB, 20 l de extracto y 20 l de solución enzimática.
Resultados y Discusión
34
6 RESULTADOS Y DISCUSION
6.1 Micropropagación
e obtuvo un porcentaje de desinfestación de semillas de 96.92 con el
método propuesto de las cuales germinaron el 88.31%.
Flores-Escobar en el 2008 utilizó un método de desinfestación para
semillas muy similar al que se utilizo en este trabajo, las semillas empleadas en
este trabajo fueron de flores de orquídeas las cuales fueron tratadas con
hipoclorito de sodio al 5% con un tiempo de inmersión de 5 minutos obteniendo
con este método un porcentaje de desinfestación de 47.69%, Romero-Tirado en
el 2007 también menciona el uso de un método de desinfestacion muy similar con
etanol al 70% e hipoclorito de sodio al 0.5% para semillas de la orquídea Laelia
anceps. Lo cual nos permite determinar que el uso de concentraciones bajas de
hipoclorito de sodio son eficientes en la desinfestación semillas pequeñas (1 a 4
mm) sin dañar el embrión. En el caso de Bouvardia el uso de hipoclorito de sodio
a una concentración de de 0.3% a partir de cloro comercial (6%), influyó de
manera positiva en el de semillas desinfestadas y germinadas ya que el
tratamiento no fue tan agresivo para el embrión pero suficiente para eliminar los
agentes contaminantes de las semillas.
Cultivo de nodos
Los resultados de la inducción de brotación con los reguladores de
crecimiento cinetina (KIN) y bencilaminopurina (BAP) se muestran en la Figura 7
y 8 respectivamente, en donde se observa que con cinetina hubo una tendencia a
disminuir el número de brotes en la medida en que se incrementó la
concentración. Adicionalmente al desarrollo de brotes hubo formación de callo en
todos los tratamientos con éste regulador del crecimiento (datos no mostrados),
llegando a un valor máximo a partir de 0.5 mg/L. La formación de callo pudo influir
negativamente en la formación de brotes. En el caso de los tratamientos con BAP
ocurrió lo contrario respecto al desarrollo de brotes, ya que el número promedio
incrementó con el aumento de la concentración de la citocinina. El rendimiento
SS
Resultados y Discusión
35
más alto se obtuvo con 1.5 mg/L de BAP (7.2 brotes/explante), el cual es superior
al máximo valor obtenido con 0.2 mg/L de KIN (5.5 brotes/explante). Estos
resultados al ser analizados con el programa estadístico SPSS 14.0, con una
prueba de ANOVA y una postprueba de Tukey mostraron que el mejor tratamiento
fue el de BAP a 1.5mg/ml con una diferencia significativa p<0.05.
Los resultados de la obtención de callos con los diferentes tratamientos con
cinetina de este trabajo, concuerda con los resultados obtenidos por Ezequiel
Murillo en 1985 donde se indujo la formación de callos con cinetina a partir de
explantes foliares de Bouvardia ternifolia a una concentración de 0.005 mg/L. Esta
concentración fue menor a la que se utilizó para este proceso, este hecho hace
pensar que la cinetina en el caso de esta especie es una hormona que mas allá
de favorecer la formación de nuevos brotes, promueve la desdiferenciación
celular, lo cual permite que su aplicación sirva como modelo a seguir si se
quisiera establecer un cultivo celular a partir de esta planta.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
KIN 0 KIN 0.2 KIN 0.5 KIN 1 KIN 1.5
Tratamientos (mg/L)
Nú
me
ro d
e b
rote
s (
pro
me
dio
)
Figura 7. Efecto de diferentes concentraciones de cinetina en la brotación múltiple de B. ternifolia.
Resultados y Discusión
36
Los resultados obtenidos por Ponce en el 2006 en la propagación in vitro de
Lecanophora heterophylla donde utilizó a la bencilaminopurina como regulador
para inducir la brotación múltiple, muestra que la utilización de este regulador
favorece la formación de brotes en plantas herbáceas. La concentración con la
que logró obtener hasta 11 brotes por explante fue la de 1mg/L, que es una
concentración que también fue utilizada para este trabajo siendo uno de los
mejores con la cual se lograron un promedio de 6 brotes. Sin embargo, una
característica observada por Ponce fue que los tallos presentaban
engrosamientos y disminución en el tamaño de las hojas. Lo que no sucedió con
los explantes de B. ternifolia aunque no se alcanzó el mismo número de brotes,
probablemente a causa del reducido tamaño del tallo que solo mostraba en un
principio espacio para tres nodos, pero aun así las plántulas obtenidas fueron
suficientes para realizar los demás procesos.
La utilización de citocininas para inducir el desarrollo de brotes in vitro y ex
vitro a partir de las yemas axilares, es algo muy frecuente, ya que este es uno de
los papeles fisiológicos característicos de estos reguladores del crecimiento
vegetal. Taiz y Seiger (1998) refieren que las citocininas aumentan la capacidad
de los tejidos jóvenes de funcionar como demandas metabólicas creando
vertederos metabólicos, Claassens y Vreugdenhil (2000) mencionan que están
involucradas en el control de actividades enzimáticas que regulan el metabolismo
de carbohidratos. Esto explicaría el desarrollo de brotes vegetativos en papa
cuando se le aplican citocininas (Hemberg, 1970). García y col. en 2009 reportan
un incremento de sustancias con actividad citoquinínica antes y durante la
formación de brotes en el proceso de tuberización en tres variedades de papa,
que presentan periodos de dormancia diferentes. Por otro lado Bradford y
Trewavas en 1994 reportan que eventos como el desarrollo de yemas y
regeneración de brotes es una respuesta en la que están involucrados los
reguladores del crecimiento y que es dependiente de la concentración de los
mismos.
Resultados y Discusión
37
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
BAP 0 BAP 0.2 BAP 0.5 BAP 1 BAP1.5
Tratamientos (mg/L)
Nú
me
ro d
e b
rote
s (
pro
me
dio
)
Figura 8. Efecto de diferentes concentraciones de becilaminopurina en la brotación múltiple de B. ternifolia.
Figura 9. Segmentos nodales con formación de brotes.
*
Resultados y Discusión
38
Inducción de raíces
En la figura 10 se presenta el número promedio de explantes con raíz que
se generaron en cada tratamiento. Lo relevante de este gráfico fue que con una
concentración de 0.5 mg/L de IBA y de ANA se lograron los promedios más altos:
2.7 y 3.2 respectivamente, mientras que para AIA, se logró un máximo de 2.9 con
0.2 mg/L.
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
0.1mg/L 0.2mg/L 0.5mg/L 1.0mg/L 1.5mg/L
T ra ta mientos
Pro
m.d
e e
xp
lan
tes
co
n r
aíz
IBA
AIA
ANA
Figura 10. Efecto de diferentes auxinas en la formación de raíces.
De acuerdo con los resultados, el mejor tratamiento para obtener el mayor
número de explantes con raíz por unidad experimental fue el de 0.2 mg/L de ANA.
Sin embargo, al hacer el análisis estadístico con el programa SPSS 14.0 se
encontró que no existe diferencia significativa entre ninguno de los tratamientos.
Es decir, en todos los casos la formación de raíces se dio de manera exitosa,
determinando que el mejor tratamiento fue aquel que indujo la formación de las
raíces de mayor longitud, grosor y vigor, las cuales correspondieron al
tratamiento con IBA a la concentración de 0.5mg/L (figura 11).
Las auxinas cumplen un papel importante en el enraizamiento adventicio,
siendo su aplicación, un hecho común en la mayoría de los sistemas de
propagación. En este sentido, los ácidos naftalenacético (ANA), indolbutírico (IBA)
Resultados y Discusión
39
e indolacético (AIA) son las fitohormonas más utilizadas, por ejemplo en el estudio
de enraizamiento in vitro de Limonium sinuatum se utilizaron las mismas
concentraciones que las que se utilizaron para el enraizamiento de B. ternifolia.
Sin embargo, el AIA no tuvo efecto en la longitud de las raíces pero el IBA si tuvo
efecto sobre la longitud de las raíces sin embargo su efecto fue inversamente
proporcional a la concentración de auxina, es decir a menor concentración de
auxinas mayor era la longitud de las raíces (Hernán et al, 2007). Aunque con B.
ternifolia no se cuantificó la longitud de las raíces si se observó un efecto similar a
lo ocurrido en el trabajo con L. sinuatum, aunque en todos los tratamientos de
igual manera se formaron raíces. La longitud y grosos de las raíces implicó un
mejor desarrollo de las plantas por lo que se decidió utilizar IBA como el
tratamiento con mejor desarrollo de raíces.
Figura 11. Raíces inducidas con ANA.
b
Resultados y Discusión
40
6.2 Aclimatización
Durante el proceso de aclimatización (figura 12) se registraron valores
promedio de temperatura y de humedad relativa dentro de la cámara de
incubación de 25ºC y 40 % respectivamente. Los valores de estos parámetros
dentro del sistema hidropónico al inicio del experimento fueron de 29ºC y 89.25 %.
Al final de cuatro semanas después de la apertura total los parámetros fueron
27ºC y 48 % de humedad relativa, muy cercanos a las de la cámara de
incubación. Cuando las plántulas del sistema in vitro cuentan con un sistema
radicular abundante, no presentan problemas durante la adaptación a las
condiciones ambientales. Generalmente la aclimatización de plántulas
provenientes de propagación in vitro, por éste método ha sido exitosa, se ha
utilizado en alfalfa (Medicago sativa), camotillo (Curcuma longa) y “guaco”
(Aristolochia elegans) entre otras, con porcentajes de supervivencia del 100 %
(Ventura et al, 2003; Bazaldúa et al, 2008; Osuna et al, 2007).
Figura 12. Plántulas en proceso de aclimatización en sistema hidropónico.
Resultados y Discusión
41
6.3 Cultivo hidropónico
Efecto de la solución nutritiva de Hoagland y Arnon en el desarrollo de
plántulas de B. ternifolia.
La figura 13 muestra los resultados de la longitud de la planta y de raíz
obtenidos con las distintas concentraciones de la solución nutritiva de Hoagland.
Se observó que prácticamente no hubo diferencias significativas en el crecimiento
de brotes ni de raíz entre los diferentes tratamientos, pues para el caso de los
brotes alcanzaron una altura entre 16 y 18 cm en todos los tratamientos. El mismo
comportamiento ocurrió en la raíz, la longitud de esta en todos los tratamientos
fue de 12.5 y 13.3 cm (ANOVA, Post Prueba de Tukey p=0.05).
0
5
10
15
20
25
25% 50% 75% 100% 125%
Tratamientos
Pro
med
io d
e lo
ng
itu
d (
cm
)
Brote
Raíz
Figura 13. Efecto de las diferentes concentraciones de solución nutritiva de Hoagland y Arnon en el crecimiento de la planta.
En relación al número de nodos, a diferencia de los parámetros anteriores,
se observó una tendencia hacia la generación de mayor número de nodos con el
tratamiento de solución nutritiva. El tratamiento al 100% dio un promedio de 32.5
nodos por planta (figura 14). Este resultado tiene importancia para los fines de
propagación, ya que cada segmento nodal, potencialmente es una unidad para la
generación de nuevos individuos. En contraste, las plantas desarrolladas en el
tratamiento con solución nutritiva al 25 % desarrollaron entrenodos más largos y
Resultados y Discusión
42
por lo tanto un menor número de nodos. Cabe mencionar que los resultados aquí
mostrados corresponden a los datos obtenidos en la semana 8 de cultivo
hidropónico de plantas obtenidas de la germinación ex vitro de semillas en
condiciones de invernadero.
La cantidad de nutrimentos que requieren las plantas depende de la
especie, la variedad, la etapa fenológica y las condiciones ambientales. Cada
especie vegetal que se cultiva requiere de una solución nutritiva con
características específicas (Lara, 2000). En el caso de B. ternifolia la
concentración que le permitió el mejor desarrollo fue el tratamiento con solución
de Hoagland y Arnon al 100%, que aportaron a las plantas los nutrientes
adecuados y en cantidades suficientes.
Por otro lado, el crecimiento de los tejidos, órganos y plantas en parte está
dado por la cantidad de agua que absorben y almacenan. En el continum: suelo
(solución nutritiva en este caso)-raíz-tallo-hojas-atmósfera, la absorción y
transporte de agua depende del potencial osmótico generado por la concentración
de sales; cuando esta es mayor en la solución del suelo y menor en el interior de
los tejidos de la planta experimentará dificultad para absorberla, sufriendo estrés
por déficit hídrico, pueden presentar un bajo crecimiento causados por la
disminución de la expansión celular. En casos extremos, además de los efectos
hídricos hay efectos tóxicos provocados por los propios iones (Salisbury y Ross,
1994). Existe una clasificación de plantas con base en su respuesta a la elevada
concentración de sales:
1. Plantas sensibles, muy sensibles ó algo tolerantes: glucófitas
a. Muy sensibles detiene el crecimiento
b. Moderadamente sensibles disminuyen el crecimiento
c. Glucófitas tolerantes, ligera disminución del crecimiento.
2. Plantas poco sensibles: halófitas
a. Facultativas
b. Obligadas: 70mM de NaCl ó 4dS/m.
Resultados y Discusión
43
La solución nutritiva de Hoagland y Arnon es ampliamente utilizada para el
desarrollo de diversas especies, debido a que la concentración de los elementos
que la componen, se encuentra dentro de los intervalos para el desarrollo
adecuado de las plantas. Sin embargo, algunas pueden ser sensibles a esta
formulación y más aún cuando se incrementa la concentración de sus nutrientes
como en el caso del tratamiento al 125 %. Los datos de crecimiento mostrados en
la figura 13 aparentemente indicaron que el crecimiento de B. ternifolia no es
afectado por el amplio intervalo de concentraciones de nutrientes, sin embargo, la
información de la figura 14 sugiere que las concentraciones mayores (100 y 125
%), tienden a acortar la longitud de los internodos y el número de nodos. Sería
interesante continuar investigando la relación entre concentración de sales y el
crecimiento y desarrollo de esta planta, ya que probablemente pudiera tener
efecto en la biosíntesis de metabolitos con la actividad biológica buscada.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
25% 50% 75% 100% 125%
Tratamientos
Nú
me
ro d
e n
od
os
(p
rom
ed
io)
Figura 14. Efecto de las diferentes concentraciones de solución nutritiva de Hoagland y Arnon en
el número de nodos por planta desarrollada en cada tratamiento.
Resultados y Discusión
44
Cultivo hidropónico de plántulas provenientes de la micropropagación.
Con los datos obtenidos se determinó que el mejor tratamiento para el
desarrollo de las plantas fue a la concentración de 100% con el cual se trataron
las plantas provenientes de la micropropagación y se desarrollaron en
condiciones de invernadero. Con este tratamiento se logró obtener un número de
plantas suficiente con una altura promedio de 45 cm para la obtención del extracto
hidroalcohólico (figura15).
Figura 15. Plantas provenientes de la micropropagación cultivadas con solución de Hoagland y Arnon al 100%.
6.4 Obtención de extractos
Cuadro 3. Rendimientos de extracto hidroalcohólico de B. ternifolia silvestre y cultivada.
Planta Rendimiento de extracto hidroalcohólico (%)
Referencia
Silvestre 9.4 García, 2008
Silvestre 12.99 En la presente investigación
Cultivada 21.27 En la presente investigación
Resultados y Discusión
45
En el cuadro número 3 se presentan los rendimientos del extracto
hidroalcohólico obtenidos de planta silvestre y cultivada. La diferencia entre los
valores de la planta silvestre, pudo deberse a diferentes factores, como el lugar de
colecta, la época, la edad y el estado fisiológico de la planta, así como al tiempo
de maceración. En el caso del rendimiento obtenido con la planta cultivada, la
diferencia es del 63.74 % más que la silvestre. Se desconoce el o los factores que
pudieron haber influido mayoritariamente en la síntesis de metabolitos en ambos
tipos de plantas, sin embargo, lo que si puede decirse es que en la planta
cultivada, la utilización de una formulación nutricional balanceada influyó en el
rendimiento, ya que en condiciones naturales es imposible encontrar la
concentración y proporción de nutrientes óptimas para el desarrollo vegetal
adecuado (Lara, 2000).
6.5 Estudio Fitoquímico del extracto de Bouvardia ternifolia
Las fracciones obtenidas a partir de la bipartición del extracto
hidroalcohólico de la planta silvestre se resume en la figura 16 donde entre
paréntesis se muestran los solventes utilizados para hacer el fraccionamiento:
Figura 16. Diagrama de flujo de fraccionamiento del extracto hidroalcohólico de B. ternifolia. Esquema de las fracciones obtenidas.
Las fracciones obtenidas se analizaron por cromatografía en placa fina de
fase normal, en sistemas con diferentes polaridades para separar e identificar los
compuestos de en cada una de las fracciones lo que se observó fue lo siguiente:
Extracto H.A. Partes Aéreas
F-Aq F-AcoEt
AcoEt/H2O
Precipitado 3 F-MetOH
MetOH
Resultados y Discusión
46
En un sistema de elusión 7:3 (hexano/acetato de etilo) se reveló la placa
con sulfato sérico (para revelar terpenos). Las muestras utilizadas fueron el
extracto hidroalcohólico de las partes aéreas, la fracción acetato de etilo y
precipitado 3 del extracto de la planta silvestre (figura 17).
Figura 17. Presencia de un terpeno aparentemente Ac. Ursólico en la fracción de Acetato de etilo.
En otro sistema de elusión 90:10 (cloroformo:metanol) se corrieron dos
placas de fase normal una usando como control el Ac. oleanólico y otra
usando quercetina, pero no se encontró ninguno de estos compuestos en
la muestra de extracto Hidroalcohólico de partes aéreas.
Con el sistema de elusión cromatográfica 95:5 (cloroformo metanol) y Ac.
Ursólico como control, se comprobó la presencia de Ac. ursólico en el la
fracción de acetato de etilo de la planta silvestre (figura 18).
Resultados y Discusión
47
Figura 18. Confirmación de la presencia de ácido ursólico en la fracción de acetato de etilo de usando como control un estándar del ácido triterpénico.
También se comprobó la presencia de flavonoides (figura 19) en el extracto
hidroalcohólico de la planta silvestre en una placa corrida en un sistema 7:3
(hexano/ acetato de etilo).
Figura 19. En la que se observa la presencia de flavonoides en (a) el extracto hidroalcohólico y (b) la fracción de acetato de etilo de la planta silvestre. La placa fue revelada con 2-Aminoetildifenilborinato.
Se corrió una placa en el sistema de elusión 8:2 (cloroformo/metanol) para
analizar los compuestos del extracto de la planta silvestre (a) y planta
cultivada (b). La secuencia de carriles en ambas placas correspondieron a.
extracto hidroalcohólico, extracto de acetato de etilo y precipitado que se
a b
Resultados y Discusión
48
obtuvo en la fracción acuosa de la bipartición AcOEt:Agua (figura 21). La
diferencia mas importantes se observa en el extracto hidroalcohólico, ya
que la mancha que eluye en primer termino cambia de coloración en UV.
Por lo demás presenta una alta homología, es decir que la expresión de
sus compuestos es de manera constitutiva sin importar las condiciones de
crecimiento y desarrollo en las que fue cultivada.
Figura 20. Comparación del extracto HA de la planta cultivada y la fracción de AcoEt en la que se observa la presencia de acido ursólico.
b
Figura 21. Presencia de flavonoides en el extracto hidroalcohólico de (a) la planta silvestre, comparado con los flavonoides de (b) la planta cultivada.
b a
B.t
cultivada
AcoEt
silvestre
Resultados y Discusión
49
Con estos resultados se procedió a probar las diferentes fracciones
obtenidas del extracto de planta silvestre y el extracto hidroalcohólico de la planta
cultivada en el ensayo de inhibición enzimática para evaluar en que fracción
existía mayor actividad inhibitoria de la acetilcolinesterasa.
La presencia del acido ursólico (figura 20) en las partes aéreas de la planta
cultivada, es un dato que amplía la información que se tenia de la planta, pues
como se menciona en la literatura solo se había reportado la presencia del acido
triterpénico en las raíces (Argueta, 1994, Pérez GRM et al. 1998). De esta manera
se fortaleció la idea de una supuesta actividad inhibitoria de la enzima
acetilcolinesterasa. Ya que como se mencionó anteriormente se sabe que este
compuesto tiene esa actividad (Chung et al., 2001; Reuter et al. 2007) y el hecho
de que este ácido presente en la planta cultivada permite pensar que el extracto
obtenido de esta planta tendrá un efecto similar al que presenta el extracto
obtenido de la planta silvestre.
6.6 Inhibición enzimática
La evaluación farmacológica del extracto de B. ternifolia, dirigida a
contrarrestar los efectos discapacitantes de la Enfermedad de Alzheimer se centra
en la actividad biológica que presenten los extractos y/o los compuestos aislados
para inhibir a la enzima acetilcolinesterasa. Para ese fin se determinó el
comportamiento cinético de esta enzima en la condiciones de laboratorio. Como
se puede observar en la figura 22 se trata de una enzima que sigue el
comportamiento establecido por el modelo de Michaelis – Menten. Las constantes
cinéticas determinadas fueron: el valor de la constate de Michaelis – Menten fue
8.7 mM y la Velocidad máxima fue de 0.00385 D.O.412nm/min (ver Anexo 2
ecuaciones 15, 18, 19 y figura 28). Para transformar las unidades de absorbancia
obtenidas de los ensayos, se aplicó el coeficiente de extinción molar de tiocolina,
el cual es el producto de la reacción de hidrólisis de la acetil tiocolina (A = 1.36 x
104 cm2/ mol) con lo que el valor de Vmax resultó en: 2.83 x 10-7 mol/min .
Resultados y Discusión
50
0
0.0005
0.001
0.0015
0.002
0.0025
0.003
0.0035
0.004
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Acetiltiocolina (mM)
vo (
DO
412 n
m/m
in)
Figura 22. Cinética enzimática de acetil colinesterasa. Las constantes cinéticas medidas fueron: KM = 8.720 mM y la Vmax = 0.00385 D.O.412nm/min, aplicando el coeficiente de extinción molar de
tiocolina A = 1.36 x 104 cm
2/ mol, por lo tanto Vmax = 2.83 x 10
-7 mol/min.
Al comparar el valor de KM de obtenido en este trabajo con lo se reporta en
la literatura, encontramos una diferencia substancial de dos ordenes de magnitud
(Di Giovanni S, et al. 2008). Sin embargo, existen factores que pueden modificar
la capacidad de reconocimiento de E por S que no hayan sido considerados en el
proceso obtención del extracto enzimático (Di Giovanni S, et al. 2008) o la
concentración de Na+, en la mezcla de reacción también puede ser determinante
(Smissaert HR, 1981).
Al determinar la actividad enzimática de la acetil colinesterasa en presencia
de concentraciones crecientes del extracto hidroalcohólico de B. ternifolia
silvestre, fue evidente que hubo modificaciones en los valores de la constantes
cinéticas, como se muestra en la figura 23. Se pudo comprobar que hubo un
incremento en el valor de la KMapp respecto a la reacción sin inhibidor y el valor de
la Vmax no tuvo variaciones de gran magnitud Cuadro 4. Por el comportamiento
cinético se puede pensar en una inhibición de tipo mixta, debido a que la familia
de curvas no intercepta a la recta que representa a la enzima sin inhibidor en la
ordenada al origen. Debido a que se observa que el punto de intersección de la
Resultados y Discusión
51
familia de rectas se encuentra antes del eje “y”, el tipo de inhibición mixta tiene
correspondencia con una del tipo Mixta Lineal, Sistema C5. En este tipo de
inhibición disminuye la constate de velocidad de formación de producto, pero
incrementa la afinidad de la enzima por el sustrato, bajo los siguientes parámetros
< 1, < 1 y > (Anexo 2, ecuación 46, 47 y figura 33). Sin embargo, al
calcular dichos parámetros para cada una de las concentraciones del extracto
hidroalcohólico (0.05, 0.025 y 0.0125 mg/ml), se obtuvo para = 1.31, 1.21 y
1.63. Para = 1.047, 1.044 y 1.052 respectivamente para ambos parámetros. Con
esto no se cumple con < 1, < 1 y > Por lo tanto se puede considerar como
un comportamiento como inhibidor competitivo (ver Anexo 2 ecuación 31 y figura
29).
200
300
400
500
600
700
800
900
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25
1/{S}
1/v
o
Figura 23. Representación de la transformación de Lineweaver-Burk, de la actividad enzimática de Acetilcolinesterasa en presencia de concentraciones crecientes (mg/ml) del inhibidor, extracto hidroalcohólico de las partes aéreas de B. ternifolia silvestre. Sin inhibidor (------), inhibidor 0.0125 mg/ml (), inhibidor 0.025 mg/ml () e inhibidor 0.05 mg/ml (▲).
Resultados y Discusión
52
Cuadro 4. Constantes cinéticas del efecto inhibidor del extracto hidroalcohólico de las partes aéreas de B. ternifolia silvestre
Inhibidor (mg/ml)
KMapp
(mM) Vmaxi
( mol/min) x10-7
0.0000 8.72 2.83 0.0500 11.38 2.92 0.0250 10.51 2.92 0.0125 10.15 2.95
En la determinación de la capacidad inhibitoria de la fracción de acetato de
etilo (figura 24 y Cuadro 5), se puede establecer la capacidad inhibitoria de dicho
extracto. En todas las concentraciones de esta fracción que se probaron que
incrementaron el valor de la KM. De igual manera se aprecia una disminución de
los valores del Vmax, por lo que la familia de rectas presentan valores crecientes
para el punto de intersección con el eje de “y”. El tipo de inhibición nuevamente es
mixta, entre un inhibidor de tipo competitivo.
Existen dos sistemas que puede explicar este comportamiento de inhibición
mixta. El primero de ellos se denomina Sistema C1 donde > 1 y = 0 y
corresponde a uno en el que el complejo EI tiene una afinidad mas baja ( KS) por
S en comparación con E (KS) y el complejo ternario ESI es un complejo no
productivo (Anexo 2 ecuación 40, 41 y figura 31). El segundo es denominado C2 y
en este sistema la enzima libre E y el complejo EI se unen a S, pero con
diferentes afinidades (KS y KS respectivamente). Ambos complejos ES y ESI
forman producto, pero con diferentes velocidades de reacción (kP y kP
respectivamente), bajo las siguientes parámetros 1< <∞ y 0< <1. Los sistemas
de inhibición mixta C1 y C2 pueden ser considerado como mezcla de una
inhibición competitiva (Anexo 2 ecuaciones 20, 31 y figura 29) y una inhibición no
competitivo (Anexo 2 ecuaciones 32, 35 y figura 30). Para definir qué tipo de
sistema de inhibición mixta esta rigiendo en el ensayo con el extracto de B.
ternifolia, será necesario identificar cada uno de los compuestos activos presentes
en los extractos y determinar cuál es el resultado de la interacción de los
diferentes tipos de inhibición. Para determinar si se trata de una inhibición C1 ó
C2 es necesario determinar cual es el comportamiento de la inhibición a alta
concentración del extracto. Ya que como se observa solo altas concentraciones
Resultados y Discusión
53
se puede definir que a tipo de sistema de inhibición mixta obedece la acetil
colinesterasa en presencia de este extracto. Independientemente a que tipo de
sistema obedece, es posible calcular a partir del punto de intersección de la
familia de rectas. El valor de calculado ponderado fue 18.6.
Cuadro 5. Constantes cinéticas del efecto inhibidor de la fracción de acetato de etilo de las partes aéreas de B. ternifolia silvestre.
Inhibidor (mg/ml)
KMapp
(mM) Vmaxi
( mol/min) x10-7
0.0000 8.72 2.83 0.0500 9.45 2.17 0.0250 10.33 2.55 0.0125 9.23 2.63
0
200
400
600
800
1000
1200
-0.15 -0.1 -0.05 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25
1/{S }
1/v
o
Figura 24. Representación de la transformación de Lineweaver-Burk, de la actividad enzimática de Acetilcolinesterasa en presencia de concentraciones crecientes (mg/ml) del inhibidor, fracción de acetato de etilo de las partes aéreas de Bouvardia ternifolia silvestre. Sin inhibidor (-----), inhibidor 0.0125 mg/ml (), inhibidor 0.025 mg/ml () e inhibidor 0.05 mg/ml (▲).
Resultados y Discusión
54
Con la fracción metanólica de las partes aéreas de B. ternifolia silvestre se
pudo establecer que se generó una inhibición de tipo mixta (figura 25), aunque de
características distintas a la inhibición mixta obtenida con el extracto de acetato
de etilo. La principal diferencia estriba en que este extracto presenta una
capacidad inhibitoria proporcional al aumento de la concentración (cuadro 6), lo
que es contrario a lo que sucede con el extracto de acetato de etilo. Y de la
misma manera que lo que se observó con el extracto hidroalcohólico se observó
que el punto de intersección de la familia de rectas se encuentra antes del eje “y”,
el tipo de inhibición mixta tiene correspondencia con una del tipo Mixta Lineal,
Sistema C5. (Anexo 2, ecuación 46, 47 y figura 33). Calculando los valores para
los para los parámetros y , se obtuvieron las siguientes cifras para las
concentraciones de extracto metanólico (0.05, 0.025 y 0.0125 mg/ml), fueron para
0.274, 0.525 y 0.740 respectivamente. Para el parámetro los valores fueron
0.736, 0.816 y 0.894 en el mismo orden. Cumpliendo con < 1, < 1 y > .
0
100
200
300
400
500
600
700
800
-0.15 -0.1 -0.05 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25
1/{S }
1/v
o
Figura 25. Representación de la transformación de Lineweaver-Burk, de la actividad enzimática de Acetilcolinesterasa en presencia de concentraciones crecientes (mg/ml) del inhibidor, fracción metanólica de las partes aéreas de B. ternifolia silvestre. Sin inhibidor (---), inhibidor 0.0125 mg/ml (), inhibidor 0.025 mg/ml () e inhibidor 0.05 mg/ml (▲).
Resultados y Discusión
55
Cuadro 6. Constantes cinéticas del efecto inhibidor de la fracción metanólica de las partes aéreas de B. ternifolia silvestre.
Inhibidor (mg/ml)
KMapp
(mM) Vmaxi
( mol/min) x10-7
0.0000 8.72 2.83 0.0500 2.39 2.06 0.0250 4.56 2.33 0.0125 6.41 2.52
En la figura 26 se representa la gráfica de la transformación de Lineweaver
Burk del efecto inhibitorio del precipitado obtenido en la fracción metanólica de B.
ternifolia. Se aprecia como el comportamiento inhibitorio más definido y
corresponde a una inhibición de tipo no competitiva (Anexo 2 ecuaciones 32, 35 y
figura 30). Este efecto inhibitorio, de mayor definición pudiera ser explicado por la
menor complejidad en la composición, puesto que se trata de un precipitado
obtenido en el proceso de fraccionamiento. De esta manera se considera que el
compuesto mayoritario en la muestra presenta actividad de inhibición no
competitiva.
0
200
400
600
800
1000
1200
-0.15 -0.1 -0.05 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25
1/{S}
1/v
o
Figura 26. Representación de la transformación de Lineweaver-Burk, de la actividad enzimática de Acetilcolinesterasa en presencia de concentraciones crecientes (mg/ml) del inhibidor, precipitado de las partes aéreas de B. ternifolia silvestre. Sin inhibidor (-------), inhibidor 0.0125 mg/ml (), inhibidor 0.025 mg/ml () e inhibidor 0.05 mg/ml (▲).
Resultados y Discusión
56
Cuadro 7. Constantes cinéticas del efecto inhibidor del precipitado del extracto hidroalcoholico de las partes aéreas de B. ternifolia silvestre.
Inhibidor (mg/ml)
KMapp
(mM) Vmaxi
( mol/min) x10-7
0.0000 8.72 2.83 0.0500 8.21 1.88 0.0250 9.11 2.19 0.0125 8.46 2.39
La figura 27 muestra el efecto inhibitorio del extracto hidroalcohólico de la
partes aéreas de la planta cultivada. Nuevamente se presenta una inhibición de
tipo mixta, la cual contrasta con lo que se obtuvo con el extracto hidroalacoholico
de las partes aéreas de la B. ternifolia silvestre. Ya que el extracto tiene un
comportamiento similar al observado por el extracto metanólico de la planta
silvestre.
200
300
400
500
600
700
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25
1/{S}
1/v
o
Figura 27. Representación de la transformación de Lineweaver-Burk, de la actividad enzimática de Acetilcolinesterasa en presencia de concentraciones crecientes (mg/ml) del inhibidor, extracto hidroalcohólico de las partes aéreas de B. ternifolia cultivada. Sin inhibidor (, -------), inhibidor 0.0125 mg/ml (), inhibidor 0.025 mg/ml () e inhibidor 0.05 mg/ml (▲).
Resultados y Discusión
57
Es decir que se ajusta a un sistema de inhibición mixta C5, por lo que fue posible
calcular los valores de los parámetros y para las concentraciones ensayadas
(0.05, 0.025 y 0.0125 mg/ml). Los valores calculados para fueron: 0.594, 0.683
y 0.740 respectivamente. Y para fueron: 0.763, 0.815 y 0.842 en el mismo
orden. El comportamiento de dichos valores corresponde al criterio que define a
este sistema de inhibición mixta, es decir que cumple con < 1, < 1 y > .
Conclusiones
58
7. CONCLUSIONES
e acuerdo a los objetivos particulares planteados en el inicio del
presente trabajo podemos concluir que:
En cuanto al establecimiento de para la micropropagación de Bouvardia
ternifolia
Se estableció el protocolo para la desinfestación de semillas.
El regulador de crecimiento Bencilaminopurina indujo el mayor número de
brotes por explante a la concentración de 1.5mg/L.
El tratamiento con Ácido indolbutírico a 0.5mg/L fue el que generó la
respuesta más alta de enraizamiento.
En lo referente al establecimiento de las condiciones de crecimiento y desarrollo
en hidroponía de Bouvardia ternifolia
Se determinó que las plantas cultivadas en hidroponía presentaron el
mayor número de nodos con la solución Hoagland al 100%.
El proceso de cultivo por hidroponía es un procedimiento factible para la
obtención de material vegetal de buena calidad
Por lo que respecta a la caracterización fitoquímica de los extractos de Bouvardia
ternifolia.
Se obtuvo un mayor rendimiento de extracción en el material vegetal
cultivado respecto al silvestre, en una proporción que se aproxima a una
relación de 1:2.
Las plantas cultivadas en hidroponía tienen los mismos compuestos que
las plantas silvestres, desatacando la presencia de acido ursólico y de una
gran variedad de flavonoides
En tanto a la evaluación el efecto de los extractos de Bouvardia ternifolia en la
inhibición de la enzima acetilcolinesterasa
Se estableció una capacidad inhibitoria de magnitud similar en el material
vegetal cultivado como en el silvestre.
El tipo de inhibición enzimática presentado por el extracto hidroalcohólico
de la planta cultivada obedece a un sistema de inhibición mixta tipo C5,
mientras que el mismo extracto de la planta silvestre presentó un tipo de
inhibición que se ajusta mas a un sistema de inhibición simple del tipo
DD
Conclusiones
59
competitivo, por lo que a pesar de tener un perfil cromatográfico similar,
tienen diferente comportamiento cinético, por lo que puede presentar
sutiles diferencias en la proporción de los compuestos activos.
Perspectivas
60
9. PERSPECTIVAS
os resultados obtenidos en este trabajo han respondido a las preguntas
planteadas al inicio pero a su vez ha generado otras que podrán ser
resueltas con otros estudios a partir de este trabajo como:
El cultivo de la planta en invernadero a escala industrial mediante las
técnicas establecidas en este trabajo.
Determinar el o los compuestos con actividad farmacológica de la planta
cultivada.
Realizar estudios toxicológicos de los extractos de la planta.
Obtención de los metabolitos secundarios activos mediante otras técnicas
como el cultivo de células en suspensión.
Evaluación del efecto de la administración de los extractos obtenidos de la
planta cultivada en modelos conductuales y de memoria.
Evaluación del efecto atioxidante de los extractos.
Sentar las bases para la producción de un fitofármaco.
LL
Literatura citada
61
8. LITERATURA CITADA
.
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diciembre de 2009]
Anexos
68
9. ANEXOS
Anexo 1. Composición química de la solución nutritiva de Hoagland y Arnon
1950.
Sustancia Concentración Molar de la solución patrón
Alícuota (ml) para un litro de solución al 100%
NH4H2PO4 0.2 5 Ca(NO3)2.4H2O 1.15 5
CaCl2 0.26 5
MgSO4.7H2O 0.40 5 KNO3 1.2 5
Oligoelementos H3BO3 CuCl2 H2O ZnCl2 MnCl2.4H2O NaMoO4.H2O
1.2x10-2 1.2x10-4 2.3x10-3 4.4x10-4 6.0x10-6
2
Fe-EDTA 2
Anexo 2. Deducción de la ecuación de Henri-Michaelis-Menten. (Siegel 1975).
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Figura 28. Representación gráfica de la transformación de Lineweaver Burk (expresiones 18 y 19) de la ecuación de Michaelis-Menten.
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Figura 29. Representación gráfica de la transformación de Lineweaver Burk de una cinética enzimática en presencia de un inhibidor competitivo. Las concetraciones crecientes, incrementa el valo de la pendiente en un factor de (1+ [I]/Ki). Es notable que no cambia el valor de Vmax, que corresponde al inverso de la ordenada al origen b = 1/Vmax.
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Figura 30. Representación gráfica de la transformación de Lineweaver Burk de una cinética enzimática en presencia de un inhibidor no competitivo. Las concetraciones crecientes, incrementa tanto el valor de la pendiente en un factor de (1+ [I]/Ki), como el valor de Vmax, que corresponde al inverso de la ordenada al origen b = 1/Vmax, en un factor de (1+ [I]/Ki).
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Figura 31. Representación gráfica de la transformación de Lineweaver Burk de una cinética
enzimática bajo una inhibición mixta bajo el sistema C1. Este se caracteriza por < 1 y = 0. Es
notable que debido a = 0, la vo tiende a cero conforme [I] tiende a ∞.
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Figura 32. Representación gráfica de la transformación de Lineweaver Burk de una cinética
enzimática bajo una inhibición mixta bajo el sistema C2. Donde 1 < < ∞, 0 < < 1, por lo que ESI es catalíticamente activo por lo que cuando [ I ] = ∞, la pendiente de la recta es finta y positiva.
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Figura 33. Representación gráfica de la transformación de Lineweaver Burk de una cinética
enzimática bajo una inhibición mixta bajo el sistema C5. Este se caracteriza por < 1, < 1 y >
ejemplo representando = 0.2 y =0.5). Es notable que la intersección con el eje “x” de la reacción inhibida presenta una disminución del valor de KS (similar a KM).