Post on 23-Jan-2016
El estudio de la estructura, química, bioquímica y función biológica de los carbohidratos
complejos (glicanos).
Glicobiologia
• mas del 50% de todas las proteínas conocidas así como mas del 80% de las proteínas de membrana están glicosiladas.
• El contenido de carbohidrato de una glicoproteina varia entre el 1 y el 80% del peso de la misma.
•Los glicanos o glicoconjugados son el biopolímero mas abundante en la naturaleza.
•Mas del 1.5% de todo el genoma humano codifica enzimas involucradas en la biosíntesis y modificación de glicoconjugados, en ciertos protozoos este porcentaje se eleva a casi el 12%.
•La enzima Hidroxilasa del CMP-acido sialico es el único gene identificado que no se encuentra en humanos pero si en chimpance.
•La O-acetilglucosaminilacion es una modificación regulatoria mas abundante que la Fosforilación
GlicobiologíaGlicobiología
GlicobiologíaGlicobiología
Proteoglicanos
Glicoproteinas
Glicolipidos
Glicosilfosfatidil-inositol anclajes
MonosacaridoProteinaLipido
Etanolamina fosfatoInositol fosfato
GLICOCONJUGADOSGLICOCONJUGADOS
Glicobio(pato)logia
El estudio de la estructura, química, bioquímica y función biológica de los carbohidratos
complejos (glicanos) y su implicación causal en el desarrollo de patologías,
diagnosis y terapia.
Diferencias en la composición de isomeros
entre oligopeptidos y oligosacaridos
Hexasacarido HexapeptidoNº Isomeros > 1012 64 106
(librería 6 hexopiranosas) (20 aminoácidos)
Cantidad > 100 nmol < 100pmol
Síntesis 20 semanas 3 h (robot)
Esto implica que no hay método analítico que permita un análisis estructural completo (determinación de secuencia) en cantidades de 100 nmol como se puede hacer con 100 pmol de proteínas u oligonucleotidos.No hay método analítico que permita distinguir entre 1012 estructuras con la misma masa.
Composición de monosacáridos Al menos 7 monosacáridos distintos son comunes de todos los glicanos, aunque hay mas de 30 que pueden formar parte de glicanos en la naturaleza.
NeuAcGalGlcManFucGalNAcGlcNAc
Enlace glicosidico (secuencia)
Anomericidad
Ramificación: numero y posición
Entre el carbono aldehido/ceto y cualquier grupo hidroxilo del otro monosacarido
Configuracion o del carbono que contiene el grupo aldehido/ceto
Tamaño del anillo: furanosa o piranosa
Origen de la Diversidad Estructural y Regulación de Afinidad
“Cluster” con cadenas vecinas en la misma glicoproteina (mucinas) o en la superficie celular (“rafts”).
HOCH2 O
HONH
COH3C
OH
O
O
OH
OH
OH
CH2
3
6HOCH2 O
OHHO
HOO
1
HOCH2 O
OHHO
HO
O1
O
OH
OH
OH
CH2
3
OH
Complejidad del Glicoma
DNA RNA Proteína
Célula
Organismo
Enzimas
Carbohidratos
Glycoconjugados
GENOMA PROTEOMA
TRANSCRIPTOMA
GLICOMA
DinámicoVariaciones espaciales y temporales
Respuesta al ambiente
CáncerDesarrolloInflamaciónDiferenciaciónActivaciónRespuesta infecciones
Desarrollo secuencial y cambios de importancia
de las funciones de los glicanos
Procariotes Eucariotes
Unicelular Multicelular
Estructural
Plegamientode
proteínas
“Tagging”Extracelula
r
Modulación del
plegamiento
Funciones Biológicas de los Glicanos
Físicas/Estructurales
P
P = Patogeno
Reconocimiento Intrínseco= Propio
INTRINSIC RECEPTOR
SELF
Reconocimiento Extrínseco
= No Propio
EXTRINSIC RECEPTOR
OLIGOSACCHARIDE =
SELF
Mimetismo molecular
Los Glicanos actúan como señales vía Lectinas
ANIMAL AND PLANT GLYCOPROTEINS SHOW VARIOUS SUGAR CONTENTS
GLYCOPROTEIN Present in Mr % sugar content
ENZYMESAlkaline phosphatase Murin liver 130 000 18Carboxypeptidase Y Yeast 51 000 17
HORMONES AND CYTOKINESChorionic gonadotropin Hum. urine 38 000 31Erythropoietin Hum. Urine 34 000 29Interferon g Hum. WBC 26 000 20
LECTINSSoybean lectin 50 000 50Potato lectin 120 000 6
EXAMPLES OF GLYCOPROTEINS IN ANIMALS AND PLANTS
Cell-surface and viral coat glycoproteins
Serum glycoproteins
Structural glycoproteins
Oligosaccharides of the cell surface are attached to membrane embedded proteins and certain lipid
oligosaccharide
glycolipid hydrophobic helix
integral protein
phospholipid
cholesterol
integral protein
Molecular model, based on the crystal structures
of IgG Fab and IgG Fc.
Fab glycosylation sites are in the hyper-variable region and occupied approx. 40% of the
time. (Dweck, 1995)
X-ray structure of murine antibody against canine lymphoma
Textbook presentation 1998
New methods revolutionised the study of glycoconjugate structures
Many proteins bear a sugar attachment such as13.6 kDa T Lymphocyte Adhesion Domain of Human CD2
Successful fertilisation depends on binding of
spermal lectins to glycoproteins of egg
membrane
Specific glycoprotein - lectin recognition defines many physiological processes
• Fertilisation• Development and differentiation• Activity regulation of hormones• Immune response and inflammation• Memory consolidation
– and many more
Cel-cell recognition relies on the specific glycoprotein-lectin interaction capable to decode information
carried in the presented oligosaccharide motive.
Glycoproteins are found responsible for
• Xenografts rejection• Cancer progression and metastasis• Storage diseases• Immune response towards recombinant
therapeutics
- and many more
STUDYING GLYCOCONJUGATES
ST R U C T U R EProtein, G lycan
Glycotypes, G lycoform sConform ation
B IO SYN T H ESISLocation, Core,
Enzym es, Sorting,E laborations, Regulation
FU N C T IO NConform ational, Protective
Functional EffectsT argeting
E xperim eta l s tra tegiesSam ples, T echniques
Equipm entAnalysis
EVOLUTION DIAGNOSIS THERAPY
PHARMACEUTICAL INDUSTRY
ANALYTICAL TOOLS
ALDOSE: CH2(OH)(CHOH)n-2HCOKETOSE: CH2(OH)(CHOH)n-3COCH2OH
Cyclic hemiacetal forms
D-Glucose
Glycosidic link
Enzyme catalyzed reaction seals the anomeric configuration.
Sugar1-OH + Sugar2-OH Sugar1-O- Sugar2 + H2O
UDP GDP CMP
GalNAc Fucose Sialic a.
GlcNAc Mannose
Galactose
Glucose
Glucuronic a.
Xylose
16 kJ
ENZYME
Laine (1988)Pentasacarido lineal, monosacaridos no repetidos.
n! x 2na x 2nr x 4n-1 n=numero de monosacaridosa=anomericidadr=tamaño del anillo4n-1= enlaces
Con cinco monosacáridos distintos el total es: 31 457 280 estructuras posibles
Con seis monosacáridos distintos el total es: 819 200 000
Para Proteínas el total es 20n. Si n=5 3 200 000
Para oligonucleotidos el total es 4n . Si n=5 1024
Si incluimos posibles ramificaciones el total para un n=6 llega a: 2 633 600 000 = 2.6 x109
sin considerar las formas D o L.
El total de formas posible para un hexasacarido (el tamaño medio involucrado en reconocimiento) es de 1.05 x 1012.
Esto implica que no hay metodo analitico que permita un análisis estructural completo (determinacion de secuencia) en cantidades de 100 nmol como se puede hacer con 100 pmol de proteinas u oligonucleotidos.No hay metodo analitico que permita distinguir entre 1012 estructuras con la misma masa.
Oligomer Number of isomers composition Oligosaccharide Oligopeptide
Dimer AADimer AB
1120
12
Trimer AAATrimer ABCTetramer AAAATetramer ABCDPentamer AAAAAPentamer ABCDE
120720
14243456017872
2144640
161
241
120
R.R. Schmidt, Angew. Chem. 1986, 212-235
Comparable sequences of oligopeptide and oligosaccharide differ drammatically in isomeric
possibilities
Diversidad de enlaces sacárido-proteína en las glicoproteínas
Oligosaccharides are linked to proteins by O- or N-Oligosaccharides are linked to proteins by O- or N-glycosidic bondsglycosidic bonds
In N-linked oligosaccharides N-acetylglucosamine at the C1 position of reducing end of sugar binds to Asn within Asn-X-Ser/Thr sequence.
O-glycosidic bonds are formed between C1 position of reducing terminus of monosaccharide or oligosaccharide and hydroxyamino acid, Ser or Thr.(N-acetylgalactosamine is often at the non-reducing end.)
BIOSYNTHESIS OF GLYCOPROTEINS STARTS IN ER
In ER oligosaccharide is preassembled on a lipid carrier and transferred “en block” to the nascent protein.
Glycan processing and tagging occurs in Golgi.
Glycosylated product is packed and exported to final destination.
EndoH sensitive
EndoH resistant
Biosintesis compleja pero conservada evolutivamente
…en principio no diana terapeutica
Calnexin and calreticulin bind misfolded or unfolded monoglucosylated glycoproteins to prevent final deglucosylation by -glucosidase II, which signalises the export to ER, in case of impaired protein folding.
Lectin-like chaperons mediate and controlproper protein folding
Levaduras
Insectos Plantas
Vertebrados
Hongos
Evolucion de complejidad
Oligosaccharide transfer
Branching enzymes
Processing enzymes
Terminal transferases
GlycoformsTerminal transferases
Branching enzymes
Initialmonosaccharide
O-linked peptideSer/Thr
N-linked peptideA-X-S/T
Origin of Glycoheterogeneity
Glycosaminoglycans attached to proteoglycans are formed
from repeating disaccharide units
Secreted or extracellular
Cartilage proteoglycan *Mr 220 952Versican*Mr 264 048Decorin* Mr 38 000Intracellular granule
Serglycin*Mr 10 190Membrane intercalatedSyndecan* Mr 38 868
*Protein Mr
PROTEOGLYCAN STRUCTURES are predominantly glycosaminoglycans O-linked to Ser
O-linked saccharides extend functional protein domains above membrane surface
PROTEOGLYCAN STRUCTURE
OF BOVINE CARTILAGE
Hyaluronate (up to 4 m), coated with proteo-glycans, forms the backbone of a complex polyanionic structure (Mr>2x106) which is highly hydrated and enmeshed in a network of collagen fibers. Link protein assists the noncovalent attachment of proteoglycan core proteins.
EVOLVING FUNCTIONS OF OLIGOSACCHARIDESADVENTITIOUS
General propertiesand structural roleN-linked cores are added earlyin the life of glycoproteins.
INTERMEDIATESorting role
Transient glucose signals for sorting. Oligomeric proteins assemble before entering Golgi.
COLLATERAL and RECENTSubstitutional roles for amino acids
Extensions and O-linked sugars
Recognition markersPotential for adaptation Terminal elaborations
Supporting facts for the Hypothesis of sequential
evolution of glycosylation:
Two strategies : “En bloc” vs.., stepwise
ER-Golgi shuttling protein ERGIC-53, similar to L-type lectins, recognizes the same structures as calnexin/calreticulin
Core sugar bound to a proximal Asn in the vicinity of a hydrophobic region of trypanosomes coating protein makes redundant the protective -helix segment.
“Structural effects arose adventitiously and were selected for. Direct effects of glycosylation on behavior of
glycoproteins evolved recently.”T. Drickhamer, 1998
Diversidad Evolutiva de las Lectinas
Oncogenic transformations are associated with numerous changes in glycosylation• different cancers are characterized by
different changes– appearance of novel carbohydrate structures– changes in the activity of glycosyltransferases– appearance of novel lectins
• novel carbohydrate structures and lectins are promising targets for cancer vaccines and drug targeting
NON-SPECIFIC ROLES OF GLYCANS BOUND TO PROTEIN
• Folding, assembling Hepatic lipase and secretion Erythropoietin Vascular endothelial growth f. immature GP aggregation
HBV glycoproteins• Conformational effects Yeast acid phospfatase
increased thermal stability t-Plasminogen activator decreased backbone mobility Cell-surface CD2
Mucins (terminal Sia)• Protective effects Fibronectin
proteolytic degradation Ribonuclease BLDL-receptor (ovary cells)
circulatory life time ceruloplasmin• Functional effects and antithrombin
binding Glycoprotein hormones kinetics Ribonuclesase A and B
Glicanos mas
comunes en células
animales
OSer
OSer/Thr
NAsn
Ser-O-
EXTERIOR
INTERIOR
NAsn
S S S
-O-SerS SSS S
EtnP
INOSITOL
P
NH
Ac
P
NS NS
Ac
S
2
P
GlicoproteinaGlicoproteina
ProteoglicanoProteoglicano
ANCLAJE ANCLAJE GLICOFOSFO-GLICOFOSFO-
LIPIDOLIPIDO
N- CHAINSN- CHAINS
O-LINKED O-LINKED CHAINCHAIN
HIALURONANOHIALURONANO
GLICOSAMINO-GLICOSAMINO-GLICANOSGLICANOS HEPARAN SULFATOHEPARAN SULFATO
CONDROITINCONDROITIN SULFATOSULFATO
Acido Acido SialicosSialicos
GLICOESFINGOLIPIDOGLICOESFINGOLIPIDO
O-GlcNAcO-GlcNAc
Eliminacion de los
glicanos mayoritarios permite la viabilidad celular in vitro
OSer
GLYCOPHOSPHO-GLYCOPHOSPHO-LIPIDLIPID
ANCHORANCHOR
OSer/Thr
NAsn
Ser-O-
N-LINKED CHAINSN-LINKED CHAINS
O-LINKED O-LINKED CHAINCHAIN
GLYCOSPHINGOLIPIDGLYCOSPHINGOLIPIDOUTSIDE
INSIDE
NAsn
S S S
-O-SerS SSS S
GLYCOSAMINO-GLYCOSAMINO-GLYCANSGLYCANS
EtnP
INOSITOL
P
NH
Ac
P
NS NS
O-LINKED GlcNAcO-LINKED GlcNAc
Ac
S
2
P
GlycoproteinGlycoprotein
ProteoglycanProteoglycan
HYALURONANHYALURONAN
HEPARAN SULFATEHEPARAN SULFATE
CHONDROITINCHONDROITIN SULFATESULFATE
Sialic AcidsSialic Acids
LETHAL
Eliminación de los
glicanos mayoritarios
causa letalidad
embrionaria
in vivo
OSer
GLYCOPHOSPHO-GLYCOPHOSPHO-LIPIDLIPID
ANCHORANCHOR
OSer/Thr
NAsn
Ser-O-
N-LINKED CHAINSN-LINKED CHAINS
O-LINKED O-LINKED CHAINCHAIN
GLYCOSPHINGOLIPIDGLYCOSPHINGOLIPIDOUTSIDE
INSIDE
NAsn
S S S
-O-SerS SSS S
GLYCOSAMINO-GLYCOSAMINO-GLYCANSGLYCANS
EtnP
INOSITOL
P
NH
Ac
P
NS NS
O-LINKED GlcNAcO-LINKED GlcNAc
Ac
S
2
P
GlycoproteinGlycoprotein
ProteoglycanProteoglycan
HYALURONANHYALURONAN
HEPARAN SULFATEHEPARAN SULFATE
CHONDROITINCHONDROITIN SULFATESULFATE
Sialic AcidsSialic Acids
Species 1 Species 2 Species 3 Species 4 Species 5
= in situ localization of a specific oligosaccharide structure
Glicomica Comparativa: nueva aproximación para el establecimiento de las funciones endógenas de
algunos oligosacaridos
Examples of Parasite Glycans
Examples of Parasite Glycans
Which class of Glycan recognition is more common?
IntrinsicRecognition
Structural
ExtrinsicRecognition Intrinsic
Recognition
Structural
ExtrinsicRecognition
The two classes of Glycan recognition are under
different types and rates of evolutionary selection
pressures
OR
Glycans have probably been involved in an Ongoing Arms Race during Evolution
OLIGOSACCHARIDE =
M
INTRINSIC RECEPTOR
SELF
EXTRINSIC RECEPTOR
M = Micro-organism Pathogen Toxin Symbiont
How to Evade Microbial Recognition without
loosing Endogenous Function?
Como evadir el reconocimiento microbiano
sin perder la función endógenaCambiar enlace
Anadir modificación
Enmascarar
Añadir ramificación
Sustitución
MSELF
MSELF
MSELF
AcAc
MSELF
MSELF
Glicomica Comparativa
Glycan Arrays
Potencial de uso:1.- Perfil inmunologico anti-glicanos para la identificacion del “target” en distintas condiciones patologicas (infecciones, cancer, autoinmunidad, xenotransplantes, etc).2.- Identificacion de anticuerpos neutralizantes.3.- Identificacion de nuevas familias de proteinas de union a carbohidratos tanto en el hospedador como en el agente infeccioso.
Esto permitira identificar candidatos terapeuticos (Vacunas) y/o diagnosticos, asi como tambien ser critico para el entrendimiento de la relacion hospedador-agente infeccioso y la patogenesis d4e la inefccion.Tambien es posible establecer la firma glicano de los agentes ineecciosos.Es de destacar la capacidad de identificar (en combinacion con MALDI-TOF) antigenos no detctados por medios convencionales como WB.
Glycan Arrays
Glycan Arrays
Chagas Serum
Altamente reproducible en la identificacion de anticuerpos anti-glicanos en sueros
Concluding
• A great majority of proteins and many of membrane lipids are glycosylated. Many of their structures are to be revealed and their distinct function understood.
• Oligosaccharides serve various general and specific purposes, and may have regulatory properties.
• Information embedded in oligosaccharide structures, decoded by specific receptors, mediates many vital biological processes.
• Patterns of glycosylation depend on acting glycozymes. More information are needed about glycozymes.
• Diversity of glycotypes depends on tissue specific glycosylation machinery, yet various glycoforms are a challenging issue of biology.
• The role of glycosylation has been changing during evolution.
Concluding
• Impaired glycosylation may cause diseases and be disease specific.
• Surface oligosaccharides show antigenic properties and are receptor specific.
• Sugar structures change during development and aging, as well as in response to environmental factors.
• Understanding glycobiology will help understanding and treating diseases
• May the lectures on the challenging issues of glycobiology mediate your transformation into genuine glyco fan.
Quo vadis?
Glicobiologia es un área en la que se requiere estudios sistemáticos descriptivos no mecanisticos (al menos por ahora).
Esta claro que la exploración de la diversificación en estructuras de glicanos en patógenos y sus hospedadores puede educarnos acerca de su función.
Beneficios: mejor conocimiento acerca de las susceptibilidades a infecciones y a un mejor diseño terapéutico, identificando glicanos con funciones criticas durante el desarrollo y diversas condiciones patológicas