Eduardo S. G. Mizubuti

Departamento de FitopatologiaUniversidade Federal de ViçosaViçosa, Minas GeraisBrasil

EpidemiologEpidemiolog ííaa Molecular Molecular de los de los TizonesTizones de Papade Papa

Guión Epidemiología Molecular de los Tizones de Papa

Introducción

Tizón temprano y tardío

¿Que és epidemiología molecular?

Epidemiología molecular

Cuantificar mecanismos evolutivos

Inferencias respecto a procesos biológicos

Generar hipótesis

Conclusión

Contribución para el control de las enfermedades

Introducción Tizón Temprano y Tardío

Enfermedades destructivas en varias regiones

Tizón Temprano y Tardío Características

ControlVariedades resistentes

Disponibilidad

Fungicidas� Época de cultivo → 4 aplicaciones / semana !

Problemas

“Eco(nómico y -lógico)-sociales” (salud pública)

EstratégiaCorto plazo: optimizar el uso de fungicidas

Mediano/largo plazo: variedades resistentes

Epidemiología

Epidemiología x Control Manejo

Control de enfermedades

Biología de poblaciones Epidemiología

Epidemiología clásica Genética de poblaciones

�� EstudioEstudio de los de los aspectosaspectos ecolecol óógicosgicos y y gengen ééticosticos

EvoluciEvolucióónn

EcologEcologííaade de poblacionespoblaciones

GenGenééticatica de de poblacionespoblaciones

Milgroom, 2001

Introducción Concepto y Objetivos

Epidemiologia molecular:

El estudio, al nivel molecular, de los factores genéticos y sus interacciones con factores ambientales en la ocurrencia y distribución de enfermedades en poblaciones

� Objetivos de la epidemiología molecular (Levin, 1999)

• identificar los microorganismos causantes de enfermedades y determinar sus fuentes físicas (fuentes de inóculo);

• determinar las relaciones biológicas (filogenéticas) entre los organismos causantes de enfermedades;

• compreender la manera de transmisión y los genes (inclusoelementos accesorios) involucrados en la virulencia y resistenciaa drogas.

Evolución - Epidemiología

Mutación

Recombinación

Migración

Selección

Deriva genética

Perspectiva Aplicada Control de enfermedades

Variabilidad

Tipos de inóculo

Dinámica de inóculo

Especificidad

Supervivencia

Plan Epidemiología Molecular

Estratégia para el estudio de los tizones

Poblaciones

Papa

Tomate

Análisis genéticos

Variabilidad

Mecanismos evolutivos

Inferencias

Procesos biológicos

Nuevas hipótesis

Muestreo Aislados

Muestreo:

principales regionesproductoras

Papa y tomate

Referenciadas GPS

Amplitud:

10 metros

3.287 Km

Marcadores moleculares Epidemiología molecular

Isoenzimas

EE FF

11

33

DD

55

77

99

1010

1313

14141616

1919

20202121

22222323

2424

2525AA BB CC

RFLP - sonda RG57

PP1 1 PP221 2 3 4 65 87 9 1110 13 14 161512 17

PCR mtDNA

AFLP

Secuencias

Biología de Poblaciones Modo de reproducción

A2A1

Assexuada ���� clonal Sexuada ���� recombinante

Sin sexo Con sexo

Asexuada

Énfasis en el modo de reproducción

Sistema de reproducción Variabilidad

ReproducciReproduccióónn x x ManejoManejo

Esp/Conídias+ Oos/Ascosporas

Esporangioso conídias

Esporas para epidemias

Aplicabilidad de sist. de previsión

Posibilidad de resistencia a fungicidas

Durabilidad de la resistencia

BajaAlta

Alta?

CortaLarga

Con sexo(Recombinante)

Sin sexo(Clonal)

Tizón Tardío Phytophthora infestans

Reproducción Genética de poblaciones

IIaIbmtDNA

1,3,5,7,13,14,19, 20,21,22,24,25

1,3,5,7,9,10,13,14,16,,20,21,24, 25RFLP

100/10086/100Gpi

A2A1GC

BR-1Papa

US-1Tomate

Phytophthora infestans

Sin sexo !Linaje clonal

Epidemiología Ciclo de vida

ColonizaciColonizaci óónn

ReproducciReproducci óónn

SupervivenciaSupervivencia

InoculaciInoculaci óónn GerminaciGerminaci óónn

Epidemiología Componentes

EfectoEfecto de la de la temperaturatemperatura en en PP. . infestansinfestans

Papa Papa

Papa Papa

Período latente (h)

Ger

min

ació

nin

dire

cta

(%)

Ger

min

ació

ndi

rect

a(%

)

Tizón Temprano Alternaria solani

Tizón Temprano Genética de poblaciones

Alternaria spp. Árbol filogenético: Alt a 1, Gpd y EF-1α

Subdivisión en la población Test de Hudson

¿Hay subdivisión en la población?

Test de permutación de Hudson (Kst) – 1000 permutaciones

� Alt a 1: Kst = 0,34 (P=0,03)� *

� Gpd1: Kst = 0,26 (P=0,01) *

� ITS: Kst = 0,001 (P=0,98)�

¿Hay evidencia de migración?

� MDIV – migración x polimorfismos ancestrales compartidos(Nielsen & Wakeley, 2001)�

� Estimación bayesiana (2x106 pasos/500.000 “burnin“)�� Estimación de M, Theta y Tiempo de divergencia - T

Migración Máxima verosimilitud

Alt a 1

Gpd

ITS

Migración Coalescencia

� Estimar la magnitud y dirección de migración

� MIGRATE (Beerli & Felsenstein, 2001)

- Matriz de migración

- 10 ejecuciones: MCMC, 20 cadenas cortas y 3 largas

Selección Tests de neutralidad

Población Locus Tajima´s D

Total Alt a 1 0.158Gpd1 -0.570ITS -2.320 *

Papa Alt a 1 2.093 *Gpd1 0.555ITS -1.947 *

Tomate Alt a 1 -1.814 *Gpd1 -1.360ITS -2.208 *

Hongo asexuado?

Recombinación Coalescencia

Métodos

RDP2.0 – 6 tests para detectar

LDHat2.0

Tasa de recombinación

Máxima verosimilitud / coalescencia

Recombinación ρ = 2Ne.r

Alt a 1

Gpd1

ITS

Recombinación En ejecución

M = 1Kb

C1 = control 1

C2 = control 2

MAT1-2

MAT1-1

Genes de compatibilidad sexual (mating type)

Genealogía Coalescencia

Genealogía de los genes Alt a 1 y Gpd:

Mutación y subdivisión

Poblaciones de mismo tamaño

Para ITS: coalescencia sin subdivisión

GENETREE (Bahlo & Griffiths, 2000)�

GenealogGenealogííasas de Alt a 1, Gpd1 y ITS de Alt a 1, Gpd1 y ITS basadasbasadas en el en el procesoproceso coalescentecoalescente..

Alt a 1 Gpd1 ITS

Epidemiología Clásica Deriva Genética

Epidemiología clásica Deriva genética

¿Cuánto tiempo pueden los patógenos sobrevivir en campo?

P. infestans

15 dias 30 dias

Epidemiología clásica Deriva Genética

A. solaniInfectividad tras 90 dias

Fsup Fent

Con

ídio

s (x

104 /

mL)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

Folíolo superfície Folíolo enterrado

Tempo (Dias)

0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330

Ger

min

ação

(%

)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

¿Cuánto tiempo pueden los patógenos sobrevivir en campo?

Epidemiología clásica Deriva Genética

Dinámica de inóculo

¿Cómo es la dinámica de inóculo a lo largo del año?

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40

Semana

Esp

orân

gios

P. infestans A. solani

Semana11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52

1 2 3 4

Coní

dios/

m3

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

� Poblaciones clonales (conídias o esporangios)

� Adaptación al huésped

� Unidades epidemiológicas distintas

� Tizón tardio: manejo adecuado la época de cultivo

� Tizón temprano: investigaciones adicionales

� Protección constante

FinalEpidemiología y Manejo

Control

TomatePapa

Agradecimientos Final

Colaboradores� Prof. Luiz A. Maffia – DFP-UFV

� Dr. Ailton Reis – Embrapa CNPH

� Dr. Nelson D. Suassuna – Embrapa CNPA

� Dr. Diógenes da C. Batista – Embrapa Semi-árido

� Dr. Valdir Lourenço Júnior – Pós-Doctor UFV

� José Marcelo N. Maziero – Ministério da Agricultura

� Tatiana T. M. S. Rodrigues – Doutoranda UFV

� Christiana F. B. Silva – Doutoranda UFV

� Marcello Arrais Lima – Doutorando UnB

� Dr. Andrés Moya – Instituto Cavanilles – Valencia, España

� Dr. Fernando Gonzáles-Candelas – ICByBE – Valencia, España

� Dr. Ignazio Carbone – North Carolina State University, Estados Unidos

� Dra. Mary Berbee – University of British Columbia - Canadá

� Dr. Emmory G. Simmons – Estados Unidos

Agencias de financiación

FAPEMIG e CNPq

MuchasMuchas graciasgracias !!

mizubuti@ufv.br

OpenOffice for Linux

Epidemiologia Componentes

118244456001659Esporulação

0,020,120,090,05Expansão de lesão (cm2/h)

0,97,03,01,6Área lesionada (cm2)

105110115162Período de geração (h)

TomateBatataTomateBatata

BR-1(batata) US-1 (tomate) Isolados de:

Componente epidemiológico

PhytophthoraPhytophthora infestansinfestans

�� Alternaria Alternaria solanisolani: não houve diferenças

Reproducción Genética de poblaciones

Alternaria solani

Árvores filogenéticas: Alt a 1, Gpd e região ITS

Relação entre distância genética e distância geográfica

r = -0.079(P = 0.262)

Distância genética (Kimura 2-parameter)

Dis

tânc

ia g

eogr

áfic

a (K

m)