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Eduardo S. G. Mizubuti Departamento de Fitopatologia Universidade Federal de Viçosa Viçosa, Minas Gerais Brasil Epidemiolog Epidemiolog í í a a Molecular Molecular de los de los Tizones Tizones de Papa de Papa
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Eduardo S. G. Mizubuti
Departamento de FitopatologiaUniversidade Federal de ViçosaViçosa, Minas GeraisBrasil
EpidemiologEpidemiolog ííaa Molecular Molecular de los de los TizonesTizones de Papade Papa
Guión Epidemiología Molecular de los Tizones de Papa
Introducción
Tizón temprano y tardío
¿Que és epidemiología molecular?
Epidemiología molecular
Cuantificar mecanismos evolutivos
Inferencias respecto a procesos biológicos
Generar hipótesis
Conclusión
Contribución para el control de las enfermedades
Introducción Tizón Temprano y Tardío
Enfermedades destructivas en varias regiones
Tizón Temprano y Tardío Características
ControlVariedades resistentes
Disponibilidad
Fungicidas� Época de cultivo → 4 aplicaciones / semana !
Problemas
“Eco(nómico y -lógico)-sociales” (salud pública)
EstratégiaCorto plazo: optimizar el uso de fungicidas
Mediano/largo plazo: variedades resistentes
Epidemiología
Epidemiología x Control Manejo
Control de enfermedades
Biología de poblaciones Epidemiología
Epidemiología clásica Genética de poblaciones
�� EstudioEstudio de los de los aspectosaspectos ecolecol óógicosgicos y y gengen ééticosticos
EvoluciEvolucióónn
EcologEcologííaade de poblacionespoblaciones
GenGenééticatica de de poblacionespoblaciones
Milgroom, 2001
Introducción Concepto y Objetivos
Epidemiologia molecular:
El estudio, al nivel molecular, de los factores genéticos y sus interacciones con factores ambientales en la ocurrencia y distribución de enfermedades en poblaciones
� Objetivos de la epidemiología molecular (Levin, 1999)
• identificar los microorganismos causantes de enfermedades y determinar sus fuentes físicas (fuentes de inóculo);
• determinar las relaciones biológicas (filogenéticas) entre los organismos causantes de enfermedades;
• compreender la manera de transmisión y los genes (inclusoelementos accesorios) involucrados en la virulencia y resistenciaa drogas.
Evolución - Epidemiología
Mutación
Recombinación
Migración
Selección
Deriva genética
Perspectiva Aplicada Control de enfermedades
Variabilidad
Tipos de inóculo
Dinámica de inóculo
Especificidad
Supervivencia
Plan Epidemiología Molecular
Estratégia para el estudio de los tizones
Poblaciones
Papa
Tomate
Análisis genéticos
Variabilidad
Mecanismos evolutivos
Inferencias
Procesos biológicos
Nuevas hipótesis
Muestreo Aislados
Muestreo:
principales regionesproductoras
Papa y tomate
Referenciadas GPS
Amplitud:
10 metros
3.287 Km
Marcadores moleculares Epidemiología molecular
Isoenzimas
EE FF
11
33
DD
55
77
99
1010
1313
14141616
1919
20202121
22222323
2424
2525AA BB CC
RFLP - sonda RG57
PP1 1 PP221 2 3 4 65 87 9 1110 13 14 161512 17
PCR mtDNA
AFLP
Secuencias
Biología de Poblaciones Modo de reproducción
A2A1
Assexuada ���� clonal Sexuada ���� recombinante
Sin sexo Con sexo
Asexuada
Énfasis en el modo de reproducción
Sistema de reproducción Variabilidad
ReproducciReproduccióónn x x ManejoManejo
Esp/Conídias+ Oos/Ascosporas
Esporangioso conídias
Esporas para epidemias
Aplicabilidad de sist. de previsión
Posibilidad de resistencia a fungicidas
Durabilidad de la resistencia
BajaAlta
Alta?
CortaLarga
Con sexo(Recombinante)
Sin sexo(Clonal)
Tizón Tardío Phytophthora infestans
Reproducción Genética de poblaciones
IIaIbmtDNA
1,3,5,7,13,14,19, 20,21,22,24,25
1,3,5,7,9,10,13,14,16,,20,21,24, 25RFLP
100/10086/100Gpi
A2A1GC
BR-1Papa
US-1Tomate
Phytophthora infestans
Sin sexo !Linaje clonal
Epidemiología Ciclo de vida
ColonizaciColonizaci óónn
ReproducciReproducci óónn
SupervivenciaSupervivencia
InoculaciInoculaci óónn GerminaciGerminaci óónn
Epidemiología Componentes
EfectoEfecto de la de la temperaturatemperatura en en PP. . infestansinfestans
Papa Papa
Papa Papa
Período latente (h)
Ger
min
ació
nin
dire
cta
(%)
Ger
min
ació
ndi
rect
a(%
)
Tizón Temprano Alternaria solani
Tizón Temprano Genética de poblaciones
Alternaria spp. Árbol filogenético: Alt a 1, Gpd y EF-1α
Subdivisión en la población Test de Hudson
¿Hay subdivisión en la población?
Test de permutación de Hudson (Kst) – 1000 permutaciones
� Alt a 1: Kst = 0,34 (P=0,03)� *
� Gpd1: Kst = 0,26 (P=0,01) *
� ITS: Kst = 0,001 (P=0,98)�
¿Hay evidencia de migración?
� MDIV – migración x polimorfismos ancestrales compartidos(Nielsen & Wakeley, 2001)�
� Estimación bayesiana (2x106 pasos/500.000 “burnin“)�� Estimación de M, Theta y Tiempo de divergencia - T
Migración Máxima verosimilitud
Alt a 1
Gpd
ITS
Migración Coalescencia
� Estimar la magnitud y dirección de migración
� MIGRATE (Beerli & Felsenstein, 2001)
- Matriz de migración
- 10 ejecuciones: MCMC, 20 cadenas cortas y 3 largas
Selección Tests de neutralidad
Población Locus Tajima´s D
Total Alt a 1 0.158Gpd1 -0.570ITS -2.320 *
Papa Alt a 1 2.093 *Gpd1 0.555ITS -1.947 *
Tomate Alt a 1 -1.814 *Gpd1 -1.360ITS -2.208 *
Hongo asexuado?
Recombinación Coalescencia
Métodos
RDP2.0 – 6 tests para detectar
LDHat2.0
Tasa de recombinación
Máxima verosimilitud / coalescencia
Recombinación ρ = 2Ne.r
Alt a 1
Gpd1
ITS
Recombinación En ejecución
M = 1Kb
C1 = control 1
C2 = control 2
MAT1-2
MAT1-1
Genes de compatibilidad sexual (mating type)
Genealogía Coalescencia
Genealogía de los genes Alt a 1 y Gpd:
Mutación y subdivisión
Poblaciones de mismo tamaño
Para ITS: coalescencia sin subdivisión
GENETREE (Bahlo & Griffiths, 2000)�
GenealogGenealogííasas de Alt a 1, Gpd1 y ITS de Alt a 1, Gpd1 y ITS basadasbasadas en el en el procesoproceso coalescentecoalescente..
Alt a 1 Gpd1 ITS
Epidemiología Clásica Deriva Genética
Epidemiología clásica Deriva genética
¿Cuánto tiempo pueden los patógenos sobrevivir en campo?
P. infestans
15 dias 30 dias
Epidemiología clásica Deriva Genética
A. solaniInfectividad tras 90 dias
Fsup Fent
Con
ídio
s (x
104 /
mL)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Folíolo superfície Folíolo enterrado
Tempo (Dias)
0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330
Ger
min
ação
(%
)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
¿Cuánto tiempo pueden los patógenos sobrevivir en campo?
Epidemiología clásica Deriva Genética
Dinámica de inóculo
¿Cómo es la dinámica de inóculo a lo largo del año?
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40
Semana
Esp
orân
gios
P. infestans A. solani
Semana11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52
1 2 3 4
Coní
dios/
m3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
� Poblaciones clonales (conídias o esporangios)
� Adaptación al huésped
� Unidades epidemiológicas distintas
� Tizón tardio: manejo adecuado la época de cultivo
� Tizón temprano: investigaciones adicionales
� Protección constante
FinalEpidemiología y Manejo
Control
TomatePapa
Agradecimientos Final
Colaboradores� Prof. Luiz A. Maffia – DFP-UFV
� Dr. Ailton Reis – Embrapa CNPH
� Dr. Nelson D. Suassuna – Embrapa CNPA
� Dr. Diógenes da C. Batista – Embrapa Semi-árido
� Dr. Valdir Lourenço Júnior – Pós-Doctor UFV
� José Marcelo N. Maziero – Ministério da Agricultura
� Tatiana T. M. S. Rodrigues – Doutoranda UFV
� Christiana F. B. Silva – Doutoranda UFV
� Marcello Arrais Lima – Doutorando UnB
� Dr. Andrés Moya – Instituto Cavanilles – Valencia, España
� Dr. Fernando Gonzáles-Candelas – ICByBE – Valencia, España
� Dr. Ignazio Carbone – North Carolina State University, Estados Unidos
� Dra. Mary Berbee – University of British Columbia - Canadá
� Dr. Emmory G. Simmons – Estados Unidos
Agencias de financiación
FAPEMIG e CNPq
Epidemiologia Componentes
118244456001659Esporulação
0,020,120,090,05Expansão de lesão (cm2/h)
0,97,03,01,6Área lesionada (cm2)
105110115162Período de geração (h)
TomateBatataTomateBatata
BR-1(batata) US-1 (tomate) Isolados de:
Componente epidemiológico
PhytophthoraPhytophthora infestansinfestans
�� Alternaria Alternaria solanisolani: não houve diferenças
Reproducción Genética de poblaciones
Alternaria solani
Árvores filogenéticas: Alt a 1, Gpd e região ITS
Relação entre distância genética e distância geográfica
r = -0.079(P = 0.262)
Distância genética (Kimura 2-parameter)
Dis
tânc
ia g
eogr
áfic
a (K
m)
