BIOLOGÍA MOLECULAR EN GINECOLOGÍAGustavo A. Sandoval, MSc.gsandovalp@usmp.pe

Ginecología y Obstetricia2015-II

Flora Microbiana Humana

Microbiota Vaginal

Permite amplificar millones de veces

Emplea nucleótidos y cebadores

Catalizada por una polimerasa termoestable

Técnicas en Biología Molecular

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

• Componentes– Desoxinucleotidos (dNTPs) dATP, dTTP, dGTP, dCTP

– Enzima Taq (Thermus aquaticus)

– Iniciadores (Primers) Complementarios a la cadena de ADN

– ADN molde Concentracion de 20ng

Desoxinucleotidos (dNTPs)

Bases Nitrogenadas del ADN Union por puentes de hidrogeno

Adenina-TiminaGuanina-Citocina

ADN polimerasa

Actuar altas temperaturas

Thermus aquaticus

Thermococcus litoralis

Estable a altas temperaturas

Enzima de 95kd.

Actividad Exonucleasa: 5’—3’

5’ 3’

5’

5’

3’

3’

PRIMERS(Iniciadores, Cebadores)

Únicos: Asegura alta especificidad:

La secuencia del extremo 3’ es critica para el funcionamiento

Dos oligonucleótidos que son, cada uno, complementarios a una de las dos hebras del ADN.

CARACTERÍSTICAS IMPORTANTES

ÚnicosTamañoDimeros de primers

5’ 3’

3’ 5’

Denaturación94 oC 94 oC

Anillaje50-60oC

Extension72 oC

Tem

pera

tura

100

0

50

Tiempo

1. Denaturación: Apertura de la doble cadena2. Alineamiento: Anillaje de primers3. Extensión: Generación de la nueva cadena

Etapas de la PCR

30 ciclos Denaturación

El numero de copias del DNA delimitado por los primers se duplica en cada ciclo de PCR

0

1

3

8

2

4

1

2

4

16

5

32

6

64

Numero de ciclos

Numero de copias

Electroforesis de ADN

Agarosa y su preparación

Gel actúa como filtro molecular, controlando la migración en función del peso molecular

Agarosa

Mezclar agarosa con una solución tampón como el TBE (tris-ac.

Borico-EDTA)

Calentar

Electroforesis

Separación de moléculas en un campo eléctrico

Cámara de electroforesisElectrodo (+)

Electrodo (-)

Cubetas para preparación del gel de agarosa

Fuente de poder

Tinción con Bromuro de etidio

Agente intercalante Bromuro de Etidio Molécula fluorescente que se intercala entre las bases de la molécula de ADN

Absorción a 312 nm (UV)emisión en luz visible

Técnicas derivadas/basadas en PCR

PCR Nested :Amplificación de una secuencia dentro de otro previamente amplificada

PCR Multiplex :Varios targets diferentes en forma simultánea

PCR-RFLP :Polimorfismo genético

Reverse Transcriptase-PCR : Detección de mRNA

Real Time PCR :Cuantificación de copias iniciales – en tiempo real

SEGUNDA PCR

1 ReacciónPrimers externos para amplificación de una secuencia extensa

2 ReacciónPrimers internos para amplificación de una región especifica

PCR Nested (anidada)Dos rondas de amplificación con diferentes pares de primers

Genera mayor ESPECIFICIDAD

PCR Multiplex

• Amplificación de varias secuencias de forma simultanea

• Diferentes set de primers• Tamaño menor del amplicon

APLICACIONES

Ensayos de deleciones Amplifica exones

Ensayos forensesBiomarcadores polimórficos

Ensayos microbiológicosCepas y especies

PCR en tiempo real (RT-PCR)

La técnica RT-PCR combina la amplificación del DNA con la detección de los productos en un solo tubo.

“Tiempo Real”: Detección de productos de PCR en la medida que se van generandoMonitoreando la amplificación de una secuencia especifica en tiempo real

utilizando tecnologías fluorescentes

UTILIDADES - Genotipificación - Cuantificación de carga viral - Cuantificación del numero de copias de un gen - Expresión génica (RNA) Retrotranscripción

Componentes RT-PCR

Target Segmento de ADN que se ha seleccionado para amplificar. Es el molde (Muestra).

DNA Polimerasa Enzima capaz de copiar el ADN usado como molde una hebra simple de ADN (produce una hebra complementaria).

Primer Segmentos cortos de ADN de cadena simple específico para un segmento de DNA. Los primers son usados como punto inicial de la actividad de la DNA polimerasa.

Nucleótidos Pequeñas unidades de ADN; “letras“ del alfabeto biológico (A, T, C, G).

Solución Buffer Solución que reúne las condiciones necesarias para que la reacción de amplificación se de.

Sonda Segmento corto de ADN complementario al target (marcadores fluorescentes)

Termociclador Equipo que produce ciclos térmicos (Capacidad de detectar sondas)

PCR tradicional

PCR en Tiempo Real

Preparación de la Muestra Amplificación Detección

Preparación de la Muestra Amplificación y

Detección

PCR Convencional Vs. PCR en Tiempo Real

Patógenos bacterianos detectados

Avances Recientes

Número de niños afectados: de 400,000 a 200,000 en 4 años

Frecuencia Inicial durante gestación, parto o lactancia: de 15-45% a 1%