Post on 29-Jul-2020
FACULTAD DE MEDICINA UNIVERSIDAD DE CANTABRIA
GRADO EN MEDICINA
TRABAJO FIN DE GRADO
ANÁLISIS DE MUTACIONES EN BRCA1 Y BRCA2 ASOCIADAS AL CÁNCER DE MAMA
ANALYSIS OF BREAST CANCER-RELATED BRCA1 AND BRCA2 MUTATIONS
Autor: D. Javier Álvarez Gama
Director/es: Dña. María Elena Cabezón Navarro
Santander, Junio 2016
TFG-Anexo III
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Índice
1. RESUMEN .............................................................................................................................. 2
2. INTRODUCCIÓN ..................................................................................................................... 3
2.1. EPIDEMIOLOGÍA DEL CÁNCER DE MAMA Y DE OVARIO Y LA INFLUENCIA DE LAS
MUTACIONES EN BRCA1 Y BRCA ............................................................................................... 4
2.2. LA INFLUENCIA DE LOS FACTORES MEDIOAMBIENTALES EN LA MODULACIÓN DEL
RIESGO DE CÁNCER DE MAMA Y OVARIO ................................................................................. 4
3. OBJETIVOS ............................................................................................................................. 5
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .................................................................................................... 5
4.1. LOS GENES BRCA1 Y BRCA2 Y LAS PROTEÍNAS QUE CODIFICAN ................................... 5
4.2. LA FUNCIÓN DE LAS PROTEÍNAS BRCA1 Y BRCA2 ......................................................... 9
4.3. LAS MUTACIONES EN BRCA1 Y BRCA2 Y SU RELACIÓN CON EL RIESGO DE CÁNCER . 11
4.4. MUTACIONES EN BRCA1 Y BRCA2 MÁS PREVALENTES EN ESPAÑA ........................... 15
4.5. MÉTODOS DIAGNÓSTICOS PARA LA DETECCIÓN DE MUTACIONES EN BRCA1 Y BRCA2
16
4.5.1. AMPLIFICACIÓN MEDIANTE PCR ......................................................................... 17
4.5.2. CONSTRUCCIÓN DE LA LIBRERÍA Y SECUENCIACIÓN ................................................ 18
4.5.3. ANÁLISIS DE LA SECUENCIA ....................................................................................... 19
4.5.4 RENDIMIENTO DEL MÉTODO .............................................................................. 19
4.6. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS .................................................. 20
4.7. IMPLICACIONES EN LA PRÁCTICA CLÍNICA .................................................................. 21
4.7.1. CRITERIOS PARA LA REALIZACIÓN DE LA PRUEBA GENÉTICA DE BRCA .................... 21
4.7.2. VIGILANCIA Y DIAGNÓSTICO PRECOZ DE CÁNCER EN PORTADORES DE MUTACIONES
EN BRCA1 Y BRCA2 .............................................................................................................. 21
4.7.3. CIRUGÍA PROFILÁCTICA ............................................................................................. 22
4.7.4. QUIMIOPREVENCIÓN ................................................................................................ 23
4.7.5. ESTRATEGIAS DE TRATAMIENTO DEL CÁNCER EN PORTADORAS DE MUTACIONES EN
BRCA .................................................................................................................................... 23
4.7.6. MANEJO DE MUJERES CON HISTORIA FAMILIAR DE CÁNCER DE MAMA CON
ANÁLISIS DE BRCA NO CONCLUYENTE ................................................................................ 24
5. CONCLUSIONES ................................................................................................................... 24
6. AGRADECIMIENTOS ............................................................................................................. 25
7. BIBLIOGRAFÍA ...................................................................................................................... 26
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1. RESUMEN
Los genes BRCA1 y BRCA2 son genes de herencia autosómica dominante y alta penetrancia, cuya función está relacionada con la reparación del daño al ADN. Sus mutaciones se asocian a un riesgo aumentado de cáncer hereditario, particularmente de mama y de ovario. Los genes BRCA1 y BRCA2 se dividen en regiones BCCR, donde las mutaciones aumentan preferentemente el riesgo de cáncer de mama, y regiones OCCR, donde las mutaciones aumentan preferentemente el riesgo de cáncer de ovario. Hoy en día, la detección de mutaciones se basa cada vez más en NGS, que está reemplazando a la secuenciación Sanger. Los pacientes con datos sugestivos de cáncer hereditario de mama u ovario deben someterse a detección de mutaciones en BRCA1 y BRCA2. Los resultados de la detección pueden tener un significado incierto, por lo que resulta esencial ofrecer al paciente un asesoramiento genético. Existen también otros genes asociados al cáncer hereditario de mama y ovario. La detección de mutaciones en éstos debe considerarse ante un negativo a BRCA1 y BRCA2 en un paciente de alto riesgo. Los portadores asintomáticos de mutaciones en BRCA1 y BRCA2 pueden beneficiarse de un programa de vigilancia intensificada y, eventualmente, de tratamientos profilácticos, como la mastectomía bilateral o la salpingo‐ooforectomía.
PALABRAS CLAVE: BRCA1, BRCA2, cáncer hereditario, test genético, detección de mutaciones
BRCA1 and BRCA2 are autosomic‐dominant high‐penetrance genes, whose function is related to DNA damage repair. Mutations on these genes are associated to an increased hereditary cancer risk, specially for breast and ovarian cancer. BRCA1 and BRCA2 genes contain two BCCR domains. Mutations on these domains increase predominantly the risk of breast cancer. On the contrary, mutations on OCCR domains are predominantly associated to an increase of ovarian cancer. Nowadays, mutation detection is generally performed by NGS (next generation sequencing), replacing Sanger sequencing methods. Patients with a clinical history that suggests hereditary breast or ovarian cancer should undergo BRCA1 and BRCA2 mutation detection. Detection results are sometimes inconclusive and genetic counseling must be recommended. There are also other breast and ovarian cancer related genes. Mutation detection in these genes must be considered in patients with high risk of hereditary cancer and BRCA1 and BRCA2 negative results. Asympthomatic BRCA1 and BRCA2 mutation carriers might benefit from an intensified surveillance approach, and eventually from prophylactic treatments, such as bilateral mastectomy or salpingo‐oophorectomy.
KEYWORDS: BRCA1, BRCA2, hereditary cancer, mutation detection, genetic test
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2. INTRODUCCIÓN
Los genes BRCA1 y BRCA2 (Breast cancer 1 and 2, DNA repair associated) son genes humanos que codifican proteínas supresoras de tumores. Las proteínas codificadas desempeñan un papel en la reparación del ADN dañado, y por tanto tienen una función importante en asegurar la estabilidad del material genético.
El gen BRCA1 fue descrito por primera vez en 1990 por MC King1, quien identificó que la región 17q21 del cromosoma 17 debía contener un gen causante de mayor susceptibilidad heredada al cáncer de mama de inicio precoz. Ese gen es el gen BRCA1.
Los genes BRCA1 y BRCA2 se heredan mediante un patrón autosómico dominante, pues están situados en los cromosomas 17 y 13, respectivamente, y es suficiente heredar un único alelo para tener un riesgo aumentado de cáncer. La penetrancia del rasgo “cáncer hereditario”, aunque incompleta, es elevada, pues un alto porcentaje de los portadores del gen mutado desarrollarán un cáncer de mama u ovario. Más adelante indicamos porcentajes concretos.
Cuando estos genes sufren mutaciones asociadas a pérdida de su función, el paciente portador de esas mutaciones presenta un riesgo muy aumentado de padecer cáncer. En el caso concreto de los genes BRCA1 y BRCA2 objeto del presente trabajo, se ha descrito en la mujer aumento del riesgo de cáncer de mama y de ovario, principalmente.
Además, en la mujer, las mutaciones en BRCA1 se han relacionado con un aumento de riesgo de cáncer de las trompas de Falopio y de cáncer primario del peritoneo.
En el varón, las mutaciones en BRCA2 y, en menor medida, en BRCA1, se han relacionado con un aumento de riesgo de cáncer de mama. Las mutaciones dañinas en BRCA1 y BRCA2 se han asociado también a un riesgo aumentado de cáncer de próstata.
En ambos sexos, las mutaciones en BRCA1 y BRCA2 se han revelado como causantes de un aumento en el riesgo de cáncer de páncreas. Las mutaciones en BRCA2 (conocidas como FANCD1), cuando se heredan de ambos padres, pueden provocar un subtipo de anemia de Fanconi, un síndrome que se asocia a tumores sólidos en los niños y a Leucemia Mieloide Aguda. Por su parte, las mutaciones en BRCA1 (también denominadas FANCS), cuando se heredan también de ambos padres, están relacionadas con otro subtipo de anemia de Fanconi.
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2.1. EPIDEMIOLOGÍA DEL CÁNCER DE MAMA Y DE OVARIO Y LA INFLUENCIA DE LAS MUTACIONES EN BRCA1 Y BRCA2
Cáncer de mama
En la población general, se estima que un 12% de las mujeres padecerán un cáncer de mama a lo largo de su vida. Las mutaciones en BRCA1 y BRCA2 se suponen causantes de cerca de un 16% de los cánceres de mama hereditarios3, que suponen a su vez entre un 5% y un 10% del total de cánceres de mama en la mujer4.
En cuanto a las portadoras de mutaciones en los genes objeto del presente trabajo, se estima que del 55% al 65% de las portadoras de mutaciones patológicas en BRCA1 y cerca del 45% de las portadoras de mutaciones dañinas en BRCA2 padecerán o habrán padecido cáncer de mama a la edad de 70 años.
Cáncer de ovario
En la población general, se estima que un 1,3% de las mujeres padecerán un cáncer de ovarios a lo largo de su vida. Las mutaciones en BRCA1 y BRCA2 se suponen causantes de alrededor de un 15% de los cánceres de ovario en general.
En cuanto a las portadoras de mutaciones en los genes BRCA1 y BRCA2, se estima que sobre un 39% de las portadoras de mutaciones patológicas en BRCA1 y entre el 11% y el 17% de las portadoras de mutaciones dañinas en BRCA2 padecerán o habrán padecido cáncer de ovario a la edad de 70 años56.
2.2. LA INFLUENCIA DE LOS FACTORES MEDIOAMBIENTALES EN LA MODULACIÓN DEL RIESGO DE CÁNCER DE MAMA Y OVARIO
Sin embargo, existen factores medioambientales que modulan el riesgo de cáncer de mama y ovario, más allá de la influencia de los genes. Velasquez‐Manoff 7opina que, a la vista de la evidencia disponible, la cual señala que las mujeres judías Ashkenazi portadoras de mutaciones en BRCA1 y BRCA2 nacidas antes de 1940 tenían un riesgo de cáncer mucho menor que las nacidas después de esa fecha, es notorio que la exposición crónica a estrógenos incrementa el riesgo de cáncer de mama.
Analizando las diferencias entre las mujeres nacidas antes y después de 1940, se observan dos diferencias. Las mujeres nacidas más tarde tenían una menarquía más precoz y su primer embarazo a una edad más avanzada. Ambos factores aumentan la exposición acumulada a estrógenos.
Otros estudios con mujeres originarias del Sudeste asiático, revelan que aquellas que se mudaron al Reino Unido antes de la pubertad presentan niveles de hormonas más altos que las que lo hicieron en la edad adulta. Esto se explica por la menor incidencia de enfermedades infecciosas en la infancia en Europa, en comparación con sus países
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de origen. Y ese nivel elevado de hormonas se asocia también a mayor riesgo de cáncer.
Además, se ha descrito que las mujeres más obesas y que realizan menos ejercicio tienen mayor riesgo de cáncer, pues son dos condiciones asociadas a niveles aumentados de hormonas sexuales y factores de crecimiento. Asimismo, se sugiere que la práctica de ejercicio aumenta la actividad de la copia normal de BRCA en las pacientes portadoras de mutaciones, reduciendo el riesgo de cáncer.
A pesar de que parece que lo indicado en los párrafos anteriores es evidente, cuando se compara a las mujeres nacidas antes de 1940 con las nacidas con posterioridad, se observa que, aun a igualdad de todos los demás factores, las nacidas antes de 1940 tienen un riesgo menor de cáncer. Algunas teorías apuntan a la dieta. Se sugiere que la comida basura es carcinogénica, a través de la alteración del microbioma, que produce un estado de inflamación crónica.
3. OBJETIVOS
El objetivo del presente trabajo es proporcionar una visión general de los genes BRCA1 y BRCA2, las proteínas que codifican y la función de las mismas. A partir de este marco de referencia, se estudiarán las mutaciones en estos genes, dando una visión global de la importancia de las mismas en el desarrollo de cáncer, en función del tipo de mutación y su localización en los genes respectivos, con especial atención a las mutaciones más prevalentes en España, en función de la región geográfica.
Además, haremos un estudio de las técnicas analíticas empleadas en la práctica clínica para la identificación de las mutaciones, y daremos unas pautas básicas para el manejo clínico de los pacientes con una mutación identificada en BRCA1 o BRCA2, con especial énfasis en los tratamientos preventivos.
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1. LOS GENES BRCA1 Y BRCA2 Y LAS PROTEÍNAS QUE CODIFICAN8
BRCA19
El gen BRCA1 está situado en el brazo largo del cromosoma 17 (17q21.31), a lo largo de una secuencia de unos 79 kb de longitud, y consta de 24 exones (figura 1), destacando sobre el resto la longitud del exón 1110.
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La traducción de este gen consiste en un producto de 1863 aminoácidos de longitud yunos 220 kDa de masa (figura 2). En esta proteína destacan los siguientes dominios:
Un dominio con un dedo de zinc (RING). Este dominio es crucial en la unión con la proteína BARD1, que forma un heterodímero BRCA1/BARD1 que parece ser esencial en la actividad antitumoral de BRCA1. Por otro lado, este dominio desempeña un papel en la ubiquitinación de proteínas, es decir, el marcaje de las mismas para su destrucción, lo que a su vez es importante para la regulación del ciclo celular. En esta función intervienen también las proteínas BARD1 y BRCA2
Un dominio rico en serina (SCD, Serine Cluster Domain). Parte de este dominio corresponde a los exones 11 a 13, una zona de alta frecuencia de mutaciones. La fosforilación de estos residuos de serina por quinasas ATM/ATR, que a su vez son activadas por el daño al ADN, permite a la proteína BRCA1 y los polímeros de que forma parte situarse junto al ADN dañado y proceder a su reparación. Por ello, mutaciones en estos residuos de serina producen una disminución de la actividad antitumoral de la proteína.
Figura 1. Tomada de Pavlicek et al. (2004). Mapa de los exones del gen BRCA1. Las cajas rotuladascomo e1, etc. son los exones. Las flechas representan regiones Alu. Las flechas sombreadas sonregiones Alu implicadas en deleciones y duplicaciones de exones en humanos.
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Dos dominios carboxi‐terminales de BRCA1 (BRCT). El extremo carboxi‐terminal de la proteína BRCA1 contiene dos dominios BRCT, sujetos a diversas variaciones. Estos dominios son esenciales en la reparación del ADN, la regulación de la transcripción y la función de supresión tumoral. Mutaciones de cambio de sentido en estas regiones afectan de forma devastadora la función de la proteína, incrementando significativamente el riesgo de cáncer.
Por último, hay que reseñar que el gen BRCA1 da lugar a múltiples productos proteicos diferentes, mediante splicing alternativo.
Recientemente, en febrero de 2016, se ha descrito la estructura tridimensional del dominio BRCT de BRCA1, en su unión a la proteína abraxas, para formar un dímero estable. Esta unión está mediada por la fosforilación del residuo de serina S404 de abraxas, y tiene lugar en respuesta a la radiación ionizante. El resultado de la formación de este dímero es importante para la acumulación de BRCA1 junto al daño al ADN causado por la radiación ionizante, y por consiguiente para la reparación de dicho daño.
Las mutaciones en el residuo S404 de abraxas, así como dos mutaciones en BRCA1, producen pérdida de función de BRCA1, y por ello aumentan las probabilidades de
Figura 2. Tomada de Wikipedia. Esquema de los dominios funcionales de la proteínaBRCA1. Adviértase la posición de los dominios RING, SCD y BRCT (ver texto). Seindica con NLS la localización de las señales de localización nuclear, necesarias parael transporte de la proteína al núcleo celular. Las líneas negras horizontales indicanlos lugares de unión a otras proteínas. Los círculos indicados con P son residuos deserina sometidos a eventual fosforilación. Las flechas verticales indican sitios deunión a ciertas proteínas o moléculas.
Figura 2 bis. Dos proteínas BRCA1 se unen a dos proteínasAbraxas, gracias a la fosforilación mediada por ATM enrespuesta a radiación ionizante. El complejo así formado escapaz de unirse al ADN dañado y reclutar más BRCA1.
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Un dominio que contiene 8 repeticiones BRC (unas repeticiones de unos 35 aminoácidos), crítico para la unión a RAD51, que es una proteína cuya función está relacionada con la reparación del ADN de doble cadena12131415
Un dominio helicoidal (H), que se une al polipéptido DSS1, la deleción de cuyo gen está relacionado con un síndrome que se presenta con un conjunto de malformaciones congénitas
Un dominio OB1, con estructura de barril beta, relacionado también con la unión a DSS1, así como con la unión a ADN de cadena sencilla.
Un dominio OB3, también con estructura de barril beta y relacionado asimismo con la unión a ADN de cadena sencilla.
Un dominio Tower (T), relacionado con la unión a ADN de doble cadena, esencial en la función antitumoral de la proteína BRCA2.
Un extremo carboxi‐terminal que contiene una NLS (una señal de localización nuclear, esencial para el transporte de la proteína al núcleo celular, donde desempeña su función), y un sitio de fosforilación por la quinasa dependiente de ciclinas CDK2, que también es un lugar de unión a RAD51.16
4.2. LA FUNCIÓN DE LAS PROTEÍNAS BRCA1 Y BRCA2
BRCA 1
La proteína BRCA1 es una fosfoproteína de localización nuclear, que forma parte de un complejo, denominado complejo de vigilancia del genoma asociado a BRCA1 (BASC). Una causa de daño a ADN de doble cadena es la formación de uniones cruzadas (cross‐
Figura 4. Tomado de Roy et al. (2012). Esquema de los dominios funcionales de lasproteínas BRCA1 y BRCA2. En la parte superior de la proteína se denominan los dominiosfuncionales (RING, NLS, etc.). Los rectángulos indican el nombre de las proteínas con quese unen BRCA1 y 2 y el lugar de unión. Los óvalos señalan las quinasas que fosforilan lasproteínas y el lugar de fosforilación. Los números bajo las proteínas indican el número deorden de los nucleótidos. Para más detalles, léase el texto.
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links), en la reparación de las cuales juega un importante papel el BASC, y en cuya génesis intervienen compuestos ambientales como el formaldehido y el acetaldehído.
Además de a los cánceres de mama y ovario, las mutaciones en BRCA1 se han asociado a la anemia de Fanconi, una enfermedad genética relacionada con la hipersensibilidad a los agentes que causan cross‐linking del ADN17.
La proteína BRCA1 participa en uno de los procesos de reparación del ADN, denominado recombinación homóloga, que consiste en utilizar la secuencia homóloga de una cromátida hermana, bien del mismo cromosoma, bien del cromosoma homólogo de la misma célula, dependiendo de la fase del ciclo celular en que nos encontremos, para reconstruir el fragmento de ADN perdido o alterado.
Este proceso de reparación tiene lugar en el núcleo celular, cuando muchas proteínas, entre las cuales está BRCA1, se sitúan junto al complejo ADN‐histonas.
En los procesos de reparación de roturas de la cadena doble de ADN, la proteína BRCA1 interacciona con la proteína RAD51, la cual también interacciona con la proteína BRCA2. Se trata de roturas ocasionadas por la radiación, durante la meiosis o por otros factores ambientales18.
En la reparación de daño al ADN por radiación ionizante, BRCA1 interacciona con proteínas como la ATPasa transicional del retículo endoplasmático (TER ATPase) o c‐Myc. Además, se une directamente al ADN, inhibiendo la actividad de ciertas nucleasas, promoviendo reparación del ADN de menor fidelidad mediante unión de finales no homólogos (NHEJ).192021
También se une a cierta histona en los focos de reparación del ADN de doble cadena, se cree que puede jugar cierto papel en el reclutamiento de factores de reparación.2223
Por último, se cree que, junto con BRCA2, juega un papel crítico en el desarrollo embrionario, en interacción con otras proteínas como supresores tumorales y reguladores del ciclo de división celular. Una prueba de esto es el hecho, clínicamente constatado, de que las mutaciones de BRCA1 son incompatibles con la vida cuando afectan a ambos alelos, en general.
BRCA2
Las estructuras de BRCA1 y BRCA2 son muy distintas, pero al menos algunas de sus funciones están relacionadas entre sí. Al igual que BRCA1, BRCA2 es esencial para la reparación del ADN dañado.
BRCA2 se une al ADN de cadena sencilla, estimulando la invasión de la hebra24, un paso esencial de la recombinación homóloga. La localización de RAD51 junto a la rotura de la hebra de doble cadena de ADN requiere la formación de un complejo BRCA1‐PALB2‐
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BRCA2. PALB2 (Partner and localizer of BRCA2, compañero y localizador de BRCA2)25, puede actuar en sinergia con una quimera de BRCA2 para promover la invasión de la hebra.
Todo ello sirve para reparar las roturas en el ADN de doble cadena debidas a radiación de uso médico y otros agentes ambientales, así como las ocurridas durante la meiosis en la espermatogénesis y la ovocitogénesis, además de las roturas producidas durante la reparación de cross‐links. Así, BRCA2 interviene en el mantenimiento de la estabilidad del genoma humano, previniendo reordenaciones peligrosas que pueden causar cánceres hematológicos y tumores sólidos.
Al igual que BRCA1, BRCA2 probablemente regula la actividad de otros genes y desempeña un papel crítico en el desarrollo embrionario.
4.3. LAS MUTACIONES EN BRCA1 Y BRCA2 Y SU RELACIÓN CON EL RIESGO DE CÁNCER26
Si bien está claramente establecido que las mutaciones en los genes BRCA1 y BRCA2 se asocian a un incremento en el riesgo de sufrir cáncer de mama y cáncer de ovario, desgraciadamente, la asociación entre el tipo de mutación y el riesgo concreto de cáncer asociado a esa mutación en particular, está mucho menos clara.
En principio, podemos suponer que ciertos tipos de mutaciones se van a asociar a riesgos de cáncer más elevados:
Las mutaciones que produzcan un codón de terminación prematuro, ya sea por una mutación sin sentido, ya sea por ocasionar un cambio del marco de lectura que da lugar a un codón de terminación prematuro más adelante.
Deleciones grandes que comprenden uno o más exones
Deleciones de regiones reguladoras de la transcripción, es decir, que afecten a la región promotora o bien al primer exón
Mutaciones de cambio de sentido que han sido informadas previamente como de alto riesgo
Sin embargo, Rebbeck et al., en un estudio observacional retrospectivo que abarcaba a cerca de 32.000 mujeres, realizó la identificación de mutaciones en BRCA1 y BRCA2 de alto riesgo de acuerdo con los criterios anteriormente indicados. Se clasificaron las mutacionespor regiones de los genes estudiados.
Algunas regiones se asocian, bien a un riesgo comparativamente mayor de cáncer de mama (a las que denominaron BCCR, breast cancer cluster regions), y otras se asocian a un riesgo comparativamente mayor de cáncer de ovario (a las que denominaron OCCR, ovarian cancer cluster regions), todo ello en comparación a una región de referencia, que correspondía al exón 11 en ambos genes.En concreto, se comparaba el riesgo de cáncer de mama y de ovario asociado a las mutaciones en cada región a
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estudio con el riesgo asociado a las mutaciones sin sentido en el exón 11 de cada gen, respectivamente.
Las mutaciones sin sentido del exón 11, se asocian tanto a un riesgo de cáncer de ovario superior al resto de conjuntos de mutaciones estudiadas, como a una edad al diagnóstico de cáncer, tanto de ovario como de mama en el caso del gen BRCA1, y de mama en el caso del gen BRCA2, inferior a la media asociada al resto de conjuntos de mutaciones.
El artículo citado clasifica en diferentes grupos las mutaciones en BRCA1 y BRCA2, calculando el riesgo relativo con respecto a un grupo de referencia, constituido, en ambos genes, por las mutaciones sin sentido en el exón 11.
Como conclusiones generales únicamente podemos extraer que todos los grupos de mutaciones analizados presentan un riesgo aumentado de cáncer de mama y un riesgo disminuido de cáncer de ovario con respecto al grupo de referencia, que es el de las mutaciones sin sentido en el exón 11 de ambos genes. El nivel de significación estadística es variable, así como la fuerza de asociación. No es posible extraer otras conclusiones fácilmente aplicables en la clínica, por lo que se remite al lector al artículo original para más detalles.
La valoración de la relación entre el riesgo relativo de cáncer de mama y el riesgo relativo de cáncer de ovario, en comparación, para cada región del gen transcrito, con el resto de regiones, sí arroja algunas conclusiones significativas. Esto se valora calculando una razón de riesgos relativos: el riesgo relativo de cáncer de mama, dividido entre el riesgo relativo de cáncer de ovario.
El grupo de referencia está constituido en este caso por los pacientes pertenecientes al resto de regiones no estudiadas. Por ejemplo, si hay 30 grupos de mutaciones, la razón de riesgos relativos (RHR) de la región 1 se calcula de la forma siguiente:
1 . 2 301 . 2 30
Un RHR significativo y mayor de 1 representa que la región estudiada es un posible BCCR, y cuando es menor de 1 sugiere que estamos ante un OCCR.
En cuanto al gen BRCA1, se identifican 3 BCCR y una OCCR (definidas más arriba). Entre las primeras, la primera, denominada BCCR1, coincide con una parte del dominio RING de la proteína, y la tercera, denominada BCCR2’, corresponde a los dominios BRCT. En cuanto a la OCCR, corresponde a gran parte del exón 11, y coincide, aunque la excede, con una región OCCR descrita previamente (figura 5).
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Figura 5. Mutation bin es el número identificativo asignado a cada grupo de mutaciones. En la escala se representa el RHR, tal como se define en el texto. Cuando la barra de error (box and whiskers) no alcanza el valor 1, ello implica que hay una diferencia significativa entre los riesgos relativos de cáncer de mama y de ovario, y por tanto esa región es una BCCR o una OCCR. En el eje horizontal inferior se representan las OCCR y BCCR descritas
en la literatura y como resultado del trabajo correspondiente.
En cuanto al gen BRCA2, se describen tres regiones BCCR, las dos primeras, BCCR1 y BCCR1’, se encuentran al principio del gen, junto al extremo amino‐terminal. La tercera, BCCR2, corresponde con los dominios OB1 y Tower de la proteína (véase la descripción de su estructura, apartado 4.1 de este trabajo). Se describen asimismo dos dominios OCCR, el primero de los cuales, denominado OCCR1, se corresponde con la región de repeticiones BRC, contenida en el exón 11, así como con otros OCCR descritos con anterioridad. La región OCCR2 queda algo más adelante en el gen (figura 6).
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Figura 6. Mutation bin es el número identificativo asignado a cada grupo de mutaciones. En la escala se representa el RHR, tal como se define en el texto. Cuando la barra de error (box and whiskers) no alcanzael valor 1, ello implica que hay una diferencia significativa entre los riesgos relativos de cáncer de mama y de ovario, y por tanto esa región es una BCCR o una OCCR. En el eje horizontal inferior se representan las OCCR y BCCR descritas
en la literatura y como resultado del trabajo correspondiente.
Es evidente a la vista de los resultados que, pese a tratarse de proteínas diferentes con funciones diferentes, aunque relacionadas, existe un patrón similar entre los genes BRCA1 y BRCA2, con un exón central 11 de mucho mayor tamaño que el resto de exones, relacionado con una región OCCR, flanqueada por regiones BCCR en los extremos amino‐terminal y carboxi‐terminal. Parece existir cierta similitud estructural y funcional entre ambos genes, quizá fruto de un origen evolutivo común.
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4.4. MUTACIONES EN BRCA1 Y BRCA2 MÁS PREVALENTES EN ESPAÑA27
La descripción de las mutaciones más prevalentes en un territorio dado es útil porque permite ahorrar costes al focalizar la detección de mutaciones a dichas variantes, permitiendo un abaratamiento de costes en relación a la secuenciaciónde un gen completo.
En España se han descrito 5 mutaciones en BRCA1 y otras 4 en BRCA2 más prevalentes que el resto, lo que se atribuye a un efecto fundador. Estas mutaciones en BRCA1 son las siguientes, y en conjunto representan el 46,6 % de las detectadas en España:
c.68_69delAG. Representa el 30,4% de las mutaciones de BRCA1 detectadas en España, y es específica de las zonas mediterráneas. Tiene un origen común en los judíos sefardíes españoles y los judíos Ashkenazi.
c.211A>G (BIC: 330A>G). Produce splicing aberrante, y es originaria de Galicia, donde supone hasta el 50% de las mutaciones detectadas. Se ha hallado también en familias francesas y británicas de origen español.
c.5117G>A (BIC: 5236G>A)
c.5123C>A (BIC: 5242C>A)
c.470_471delCT(BIC: 589_590delCT)
En cuanto a las mutaciones en BRCA2, las 4 siguientes representan el 56,6% del total de las detectadas en España:
c.2808_2811del4 (BIC: 3036_3039del4). Predominante sólo en Castilla y León, se ha descrito en muchas poblaciones de todo el mundo, y es la segunda mutación patológica recurrente en el ranking de la base de datos BIC (Breast Cancer Information Core), lo que sugiere múltiples orígenes.
c.6629_6630delAA (BIC: c.6857delAA). Representa el 18,5% de las mutaciones de BRCA2 detectadas en España, y es específica de las zonas mediterráneas. c.9026_9030del5 (BIC: 9254‐9258del5)
c.9310_9311delAA (BIC: 9538delAA)
También se ha descrito que en el centro de España, las siguientes mutaciones son debidas al efecto fundador:
c.5153‐1G>A (BIC: 5272‐1G>A) en BRCA1. Supone el 18,4% de las mutaciones en el centro de España. Afecta al splicing de la proteína.
c.5146_5149del4 (BIC: 5374delTATG) en BRCA2. Supone el 13,6% de las mutaciones en el centro de España. Provoca un cambio del marco de lectura (frame‐shift).
Por el contrario, en la población vasca, sólo el 1,2% de las mujeres con cáncer de mama de inicio temprano sometidas a estudio genético resultaron portadoras de mutaciones patológicas, y no se identificó efecto fundador alguno.
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Todos estos resultados pueden utilizarse para la implantación de un programa de cribado inicial cubriendo únicamente la detección de las mutaciones más habituales en cada área geográfica, lo que reduce sustancialmente el coste del programa en su conjunto, haciéndolo más eficiente.
4.5. MÉTODOS DIAGNÓSTICOS PARA LA DETECCIÓN DE MUTACIONES EN BRCA1 Y BRCA2
Existen dos posibles enfoques al problema del diagnóstico de las mutaciones en BRCA1 y BRCA2, que cumplen cometidos bastante diferentes:
1. Secuenciar el gen completo, es decir, obtener la secuencia completa de todos los exones del gen, junto con una región de unos 25 a 50 pb a cada lado de cada exón. Se amplía la región estudiada a cierta parte de los intrones porque se ha demostrado que existen variaciones intrónicas con relevancia clínica, en la mayoría de los casos porque producen cambios en el splicing normal de la proteína (el ARN mensajero no se procesa adecuadamente, alterándose la eliminación de los segmentos intrónicos, y como consecuencia, obteniéndose como producto final una proteína alterada con una función deficiente). Es el enfoque habitual en un paciente en que se presume la existencia de una mutación porque cumple los criterios para considerar que en su familia existe cáncer de mama o de ovario de carácter hereditario.
2. Secuenciar tan sólo una parte del gen, en busca de una mutación previamente conocida. Es un enfoque de coste mucho más bajo que el anterior. Es el enfoque habitual cuando ya se ha identificado la mutación o mutaciones causantes de cáncer hereditario en la familia concreta del paciente. En este caso particular, los valores predictivos positivo y negativo de la prueba son muy altos.
El primer enfoque se materializaba hasta hace no mucho tiempo mediante secuenciación por el método Sanger (hibridación con dideoxinucleótidos y lectura de los fragmentos secuenciados separados mediante electroforesis capilar). Actualmente, ya son competitivos los métodos basados en NGS (next‐generation sequencing), también denominada MPS (massive parallel sequencing).
El segundo enfoque todavía suele realizarse mediante el método de secuenciación de Sanger.
A continuación se describen los pasos a seguir para la obtención de la secuencia completa de los genes BRCA1 y BRCA2 mediante un método basado en NGS28. Algunos de los datos son específicos del método concreto descrito en el artículo de referencia, si bien el procedimiento es similar en todos los protocolos de laboratorio:
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4.5.1. AMPLIFICACIÓN MEDIANTE PCR En primer lugar, es necesario definir las regiones genéticas que queremos secuenciar para su estudio. En nuestro caso en concreto, se deben cubrir todos los exones de los genes BRCA1 y BRCA2, junto con una región de unos 25 pb de longitud adyacente a cada límite de los exones, ya que se ha descrito que mutaciones en estas zonas pueden alterar el producto proteico final. En algún caso en particular, estas regiones se amplian hasta 50 pb para cubrir algún sitio cuya mutación tiene significación patológica, según lo descrito en la literatura.
A tal efecto, se usará un kit de primers o cebadores para la PCR (reacción en cadena de la polimerasa) adecuado al fin perseguido. Como en nuestro caso es necesario manejar exones de gran tamaño, mucho más grandes que los fragmentos que puede secuenciar nuestro aparato (en este caso, de la marca Illumina), se utilizan también primers que nos darán productos de ciertos fragmentos de cada exón, en vez de usar primers que nos darán en la PCR productos que se corresponden a la longitud completa del exón más las regiones intrónicas adyacentes correspondientes, como es lo habitual.
En el diseño de los cebadores, se debe tener especial cuidado en que sean complementarios de secuencias específicas de los extremos de la región a amplificar, en concreto, la zona a que deben unirse debe estar libre de SNPs (single nucleotide polymorphisms), pues su presencia haría que eventualmente el cebador no se uniera a esa región, no amplificándose la región de interés a estudiar.
Antes de la amplificación mediante PCR, se evalúa la integridad del ADN y se cuantifica el mismo. A continuación el ADN se fragmenta hasta un tamaño de aproximadamente 2 kb mediante un ultrasonicador, tras lo que se realiza la amplificación mediante PCR en un termociclador, según el procedimiento habitual.
Tras ello, los productos de la PCR se purifican en una columna y se cuantifican mediante un fluorómetro.
Los productos de la PCR (también denominados amplicones) son sometidos a un proceso de reparación de los extremos (end‐repair), fosforilados y ligados mediante enzimas específicas. Tras ello, se fragmentan en el ultrasonicador hasta un tamaño de entre 250 y 400 pb, ajustando el aparato a los parámetros apropiados.
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4.5.2. CONSTRUCCIÓN DE LA LIBRERÍA Y SECUENCIACIÓN
Los amplicones fragmentados se ordenan en los pocillos de una placa de microtiter. Se reparan sus extremos, se fosforilan y se les añade una cola‐A de adenosina, todo ello para prepararlos para la unión a los adaptadores de secuenciación, en una nueva
Figura 7. El ADN procedente de la primera PCR se somete a tres procesos enzimáticos: la reparación de los extremos desapareados, la fosforilación de dichos extremos y la adición de una cola de A (adenosina). Ello lo deja listo para la unión con los adaptadores de secuenciación, específicos del secuenciador utilizado y marcados con un barcode (en negro), identificativo de la muestra analizada. Tras ello, se seleccionan los fragmentos de un tamaño idóneo para la secuenciación (tamaño que también depende de las características del secuenciador). A continuación, se hace otra PCR, cuyos cebadores son los adaptadores de secuenciación, para aumentar la cantidad de ADN disponible. Por último, se efectúa la secuenciación propiamente dicha.
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amplificación mediante PCR utilizando dichos adaptadores como primers, que a su vez están marcados con una secuencia de nucleótidos o barcode, específica de cada muestra. Cada barcode se distingue del de otra muestra en, al menos, dos nucleótidos (figura 7).
Entre los pasos enzimáticos de construcción de la librería, se purifican las muestras mediante bolitas (beads) magnéticas, que están impregnadas de cebadores.
Una vez llevado a cabo el proceso, se procede a la secuenciación de las muestras siguiendo el protocolo del aparato utilizado.
4.5.3. ANÁLISIS DE LA SECUENCIA Obtenidas las lecturas del secuenciador, se procesan mediante un programa informático. En los aparatos Illumina cada lectura tiene una longitud de unos 100 pb. El análisis consta de 3 fases:
1. Manipulación prealineación de los datos y control de calidad 2. Alineación de las lecturas e identificación de variantes. Las lecturas obtenidas
se comparan con la secuencia homóloga de una base de datos de secuencias genómicas (en este ejemplo, el genoma humano de referencia, versión GRCh37/hg19). La base de datos con que se comparan es un dato importante, que ha de indicarse en los informes que sobre el resultado del análisis se entreguen al paciente y se archiven en la historia clínica, pues es imprescindible para la futura reinterpretación de la prueba, la aplicación de su resultado al futuro diagnóstico de otros familiares, etc.
3. Análisis postalineación
4.5.4 RENDIMIENTO DEL MÉTODO En el método descrito en nuestro artículo de referencia, se obtenían sensibilidades, especificidades y reproducibilidades en relación al método Sanger de secuenciación de prácticamente el 100%, siempre que se cumplieran dos condiciones:
1. Una profundidad de cobertura (coverage depth) de alta calidad de al menos 100 veces. Es decir, que cada base de la región de estudio haya sido leída en al menos 100 lecturas.
2. Que se hayan hecho para cada muestra de paciente, un mínimo de 100.000 alineaciones sobre la región de estudio, es decir, que se hayan hecho un mínimo de 100.000 lecturas sobre regiones pertenecientes a la zona a estudiar, es decir, los exones de los genes BRCA1 y BRCA2 del paciente.
Estos resultados permitirían emplear NGS como el único método diagnóstico, sin utilizar secuenciación Sanger como método de comparación, como se hizo en el estudio de referencia.
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Otros estudios han validado métodos de secuenciación mediante NGS, pero apoyándose en la secuenciación mediante Sanger de las mutaciones encontradas, etc.29
4.6. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS30 Obtenidos los resultados de la prueba de detección de mutaciones en BRCA1 y BRCA2, nos encontramos ante el problema, no siempre trivial, de interpretar los resultados obtenidos. Es un trabajo que debe hacer el clínico que atiende al paciente, y es muy aconsejable contar con la ayuda de un consejero genético experto.
El resultado de la prueba puede ser:
POSITIVO. El paciente ha heredado una mutación patogénica de los genes BRCA1 o BRCA2. Sin embargo, no es posible predecir si el paciente padecerá cáncer ni cuándo. Puede estar indicado un programa de detección precoz intensificado o la práctica de cirugía preventiva. Como las mutaciones en BRCA1 y BRCA2 son rasgos autosómicos dominantes y de elevada penetrancia, la probabilidad de que un hijo del paciente afectado sea también portador de la mutación es del 50%, así como la probabilidad de que un hermano sea portador de la misma mutación es también del 50%.
NEGATIVO. No se ha hallado ninguna mutación patogénica. La interpretación depende de los antecedentes familiares:
o Si hay miembros de la familia portadores de una mutación dañina conocida, el resultado negativo indica que el paciente no es portador de dicha mutación. En este caso, la interpretación es clara.
o Si no hay miembros de la familia portadores de una mutación conocida, el resultado negativo puede significar: Que el paciente no tiene ninguna mutación dañina Que el paciente tiene una mutación dañina que el análisis no ha
detectado, lo cual es poco probable. Puede ser un fallo del proceso analítico, o bien una mutación patogénica todavía no descrita.
Que el paciente tiene una mutación patogénica, pero en otro gen que no es BRCA1 ni BRCA2. Esta situación es tanto más probable cuantos más datos clínicos haya en la historia familiar, sugestivos de que el paciente padece o está en riesgo de padecer un cáncer hereditario.
AMBIGUO O INDETERMINADO. Se encuentra una variante de significado desconocido (VUS). Se ha encontrado una mutación en BRCA1 o BRCA2, que no ha sido descrita hasta la fecha como patogénica, o sea, como asociada a un riesgo aumentado de padecer cáncer. Se ha descrito que esto puede ocurrir en un 10% de las mujeres que se someten a un análisis de mutaciones de BRCA1 y BRCA2. Conforme avance la investigación sobre este tema, la mutación encontrada puede reclasificarse como dañina o como evidentemente no dañina.
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4.7. IMPLICACIONES EN LA PRÁCTICA CLÍNICA31 De acuerdo con la última Guía de práctica clínica de la SEOM (Sociedad Española de Oncología Médica), se hacen las siguientes recomendaciones en relación al cáncer de mama y de ovario hereditario:
4.7.1. CRITERIOS PARA LA REALIZACIÓN DE LA PRUEBA GENÉTICA DE BRCA Se recomienda ofrecer asesoramiento genético antes y después de la realización de la prueba genética, para informar sobre los beneficios y limitaciones del análisis genético, proporcionar estimaciones del riesgo de padecer cáncer, recomendaciones de diagnóstico precoz y medidas preventivas, información sobre opciones reproductivas y apoyo para el bienestar psicológico.
Los criterios de inclusión se basan en la historia clínica personal y familiar, para estimar una tasa de positivos de un mínimo de un 10%. Cuando esté disponible, se recomienda extender la prueba también a los genes TP53, PALB2, BRIP1, RAD51C y RAD51D:
Independientemente de la historia familiar: o Mujeres con cáncer de mama y cáncer de ovario, sincrónicos o
metacrónicos o Cáncer de mama en menores de 35 años (40 años si no hay al menos 2
mujeres que hayan vivido más allá de los 45 años en cada lado de la familia)
o Cáncer de mama bilateral (el primero antes de los 40) o Cáncer de mama triple negativo antes de los 50 años o Cáncer de ovario epitelial no mucinoso de alto grado (o de las trompas
de Falopio o cáncer primario peritoneal)
2 o más familiares de primer grado con cualquier combinación de las siguientes:
o Cáncer de mama bilateral junto con otro cáncer de mama antes de los 50 años
o Cáncer de mama en el varón o Cáncer de mama y cáncer de ovario o Dos casos de cáncer de mama diagnosticados antes de los 50 años
3 o más familiares directos, en la misma rama de la familia, con cáncer de mama y/u ovario
4.7.2. VIGILANCIA Y DIAGNÓSTICO PRECOZ DE CÁNCER EN PORTADORES DE MUTACIONES EN BRCA1 Y BRCA2 Las recomendaciones se resumen en la siguiente tabla:
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3. CIRUGÍA PPINGO‐OOF
o el elevadoxectomía tas de edad, c
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de las pacide mama, p
22
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entes por lo
23
que tras la cirugía se debe considerar prescribir hormonoterapia durante un período limitado y a bajas dosis, siempre que la mujer no tenga una historia personal de cáncer de mama.
MASTECTOMÍA PROFILÁCTICA
Es una opción, que se ha demostrado que reduce el riesgo de cáncer de mama, así como la supervivencia en mujeres que han sufrido un cáncer en la otra mama. Así pues, es una opción, tanto la mastectomía bilateral para las mujeres sanas portadoras de mutaciones patogénicas, como la mastectomía contralateral en las mujeres que han sufrido ya un cáncer de mama.
4.7.4. QUIMIOPREVENCIÓN Se ha demostrado en muchos estudios que el uso de tamoxifeno adyuvante reduce el riesgo de un segundo cáncer de mama contralateral en mujeres portadoras de mutaciones en BRCA.
Por el contrario, no hay evidencia de que el tamoxifeno aporte beneficio alguno en la quimioprevención primaria del cáncer de mama en portadoras de mutaciones en BRCA1 y BRCA2.
En cuanto a los anticonceptivos orales, se ha demostrado que su uso reduce el riesgo de cáncer de ovario tanto en portadoras de mutaciones en BRCA1 como en portadoras de mutaciones en BRCA2. Sin embargo, también hay evidencia de que su uso en menores de 25 años aumenta el riesgo de cáncer de mama en mujeres con mutaciones en BRCA1, por lo que se ha de aconsejar a estas mujeres que eviten su consumo.
4.7.5. ESTRATEGIAS DE TRATAMIENTO DEL CÁNCER EN PORTADORAS DE MUTACIONES EN BRCA En los cánceres de mama en estadios iniciales, se ha demostrado que las mutaciones en BRCA aumentan el riesgo tanto de recidivas ipsilaterales como de segundos tumores contralaterales. Por ello, se recomienda el análisis genético en estos casos, ya que el resultado puede condicionar cambios en el tratamiento quirúrgico.
La quimioterapia con sales de platino ha de ser considerada en los pacientes con mutaciones en BRCA, tanto como quimioterapia neoadyuvante (previa a la cirugía), como en los pacientes con metástasis, pues se ha demostrado que la respuesta al tratamiento con ellas es notable.
Se ha demostrado mejor pronóstico, mayores tasas de respuesta e intervalos más largos sin tratamiento entre recaídas en las pacientes con cáncer de ovario asociado a mutaciones en BRCA1 y BRCA2 tratadas con regímenes que contenían platino, que en las que padecían cánceres de ovario esporádicos, no hereditarios. Estos tumores también son muy sensibles a antraciclinas. Se recomienda el tratamiento con agentes alquilantes y agentes que dañan el ADN.
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También son tumores sensibles a inhibidores de la Poli(ADP‐Ribosa) polimerasa (PARP), como el olaparib, primer PARPi aprobado como terapia de mantenimiento en pacientes con cáncer seroso de ovario recidivante de alto grado, sensible a platino.
4.7.6. MANEJO DE MUJERES CON HISTORIA FAMILIAR DE CÁNCER DE MAMA CON ANÁLISIS DE BRCA NO CONCLUYENTE Las mujeres con una historia familiar sugestiva de un alto riesgo de cáncer de mama hereditario, pero cuyo análisis de mutaciones en BRCA1 y BRCA2 no arroja resultados concluyentes, tienen un riesgo mayor de lo normal de padecer cáncer de mama, pero su riego de cáncer de ovario no es mayor que el de las mujeres de la población general.
En este caso, están indicadas las medidas de vigilancia indicadas en esta tabla:
5. CONCLUSIONES
1. Los genes BRCA1 y BRCA2 son dos genes que codifican proteínas que desempeñan un papel en la reparación del daño al ADN, y las mutaciones en los mismos se asocian a un riesgo aumentado de padecer cáncer, especialmente de mama y de ovario.
2. El riesgo de cáncer de mama y de ovario aumenta en los portadores de mutaciones en BRCA1 y BRCA2, la magnitud de ese incremento depende del tipo de mutación de que se trata, así como, especialmente, de la posición de la mutación en el gen correspondiente. Se distinguen regiones de los genes asociadas a un incremento en el riesgo de cáncer de mama relativamente mayor que el incremento en el riesgo de cáncer de ovario, denominadas BCCR por sus siglas en inglés, y viceversa, regiones que se denominan OCCR.
3. Se han descrito ciertas mutaciones en BRCA1 y BRCA2 que son las más prevalentes
entre la población española, lo que puede orientar las estrategias de detección de mutaciones en BRCA en nuestro sistema de salud.
4. En los últimos años, el método de secuenciación Sanger está siendo sustituido por las nuevas técnicas de secuenciación de nueva generación, NGS, que aporta mayor
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capacidad de análisis y un coste más reducido, lo que es crucial en un contexto de incremento en la demanda de estas pruebas genéticas.
5. Los pacientes con datos clínicos sugestivos de cáncer hereditario de mama u ovario en sus antecedentes personales y familiares deben someterse a análisis para detección de mutaciones en BRCA1 y BRCA2.
6. Los resultados de los análisis de BRCA1 y BRCA2 no son siempre concluyentes,
especialmente en el caso de los resultados negativos o los hallazgos de variantes de significado incierto (VUS), por lo que es crucial para el paciente contar con un asesoramiento genético que le ayude a interpretar los resultados y tomar las decisiones terapéuticas más acertadas.
7. Las mutaciones en los genes BRCA1 y BRCA2 sólo suponen cerca del 16% de los casos de cáncer de mama y ovario de carácter hereditario. Actualmente se han identificado varios genes adicionales (TP53, PALB2, BRIP1, RAD51C y RAD51D) que parecen tener también un papel fundamental en este tipo de cáncer, por lo que resulta crucial ampliar el estudio siempre que el estudio de esos genes adicionales esté disponible.
8. Los pacientes portadores de mutaciones en BRCA1 y BRCA2 deben, si están sanos, someterse a un régimen intensificado de diagnóstico precoz de cáncer de mama y de ovario, así como de próstata en el varón, y también de cáncer de páncreas, melanoma y colorrectal, en estos últimos casos valorando de forma individualizada los antecedentes personales y familiares de cada paciente en particular.
9. Por último, los pacientes con mutaciones en BRCA deben valorar, conjuntamente con sus médicos y el asesor genético, en su caso, la posibilidad de someterse a tratamientos preventivos de cáncer de mama y ovario. Estos tratamientos pueden incluir la cirugía profiláctica, tal como la doble anexectomía y la mastectomía.
6. AGRADECIMIENTOS
A la Profesora Elena Cabezón, Directora de este trabajo, por su orientación y colaboración en la elaboración del mismo.
A la Dra. Carmen Hinojo, del Servicio de Oncología Médica del Hospital Universitario “Marqués de Valdecilla”, de Santander, por su orientación y la visión clínica que aportó a este trabajo.
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