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HPLC a UPLC ¿Como conseguir una buena transferencia de

métodos?

IV Reunión de Usuarios de Sistemas UPLC

24 Enero 2012, Madrid.

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¿Como conseguir una buena transferencia de métodos?

Escalado Geométrico

Escalado Químico

Herramientas disponibles para facilitar la transferencia – Columns Selectivity Chart

– Acquity Columns Calculator

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Parámetros a Modificar Dimensiones de columna Acquity UPLC™

Columna habitual HPLC 4,6 x 150 mm, 5 µm Longitud de columna (L) = 150 mm = 150000 µm Tamaño de partícula (dp)= 5 µm

Mantener capacidad de separación entre columna HPLC y columna UPLC

Capacidad de Separación: Relación entre Longitud y tamaño de partícula

Elegir columna UPLC con la misma relación L/dp que columna

HPLC

L = 150000 = 30000 dp 5

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Escalado de HPLC a UPLC™ - L/dp constante

HPLC

UPLC™

2,5 µm – 75 mm Inyección = 2,5 µL Caudal = 0,5 mL/min Rs (2,3) = 2,34

5 µm – 150 mm Inyección = 5,0 µL Caudal = 0,2 mL/min Rs (2,3) = 2,28

3,5 µm – 100 mm Inyección = 3,3 µL Caudal = 0,3 mL/min Rs (2,3) = 2,32

1,7 µm – 50 mm Inyección = 1,7 µL Caudal = 0,6 mL/min Rs (2,3) = 2,29

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Escalado Geométrico Método inicial

Temperatura: 30°C Caudal: 1.50 mL/min Analitos: Cafeina (100 µg/mL)

Hidroquinidina (33 µg/mL) 3-Aminobenzofenona (39 µg/mL)

Pesos moleculares: Menores de 500 Diluyente de muestra: DMSO Volumen de inyección: 10 µL Detección: 254 nm Fase móvil: A: 0.05% TFA en agua

B: 0.05% TFA en acetonitrilo

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Ejemplo Características de la Columna inicial

Fase estacionaria: XTerra® MS C18

Tamaño de partícula (dp):5 µm

Diámetro interno (id): 4,6 mm

Longitud (L): 150 mm

Cálculo: dp 150,000 µm

5 µm = = 30,000 L

Calculamos la relación L/dp como medida de resolución Con este dato, seleccionamos las dimensiones adecuadas de la columna de UPLC™

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Ejemplo Resultado Inicial

Abs

orba

nce

254

nm

Minutos

1

2 3

0 10 20 30

Columna: 4,6 x 150 mm, 5 µm L/dp = 30.000 Resolución (1,2) = 12 Resolución (2,3) = 28

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Ejemplo Gradiente inicial

Etapa Tiempo

(min)

Caudal

(mL/min)

%A %B Curva

Inicial 0 1,5 95 5 *

2 15 1,5 5 95 6

lineal

3 20 1,5 5 95 1

Regeneración

4 30 1,5 95 5 1

Re-equilibrado

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Ejemplo Características del Instrumento inicial

Waters Alliance® 2695 Solvent Manager – Una única bomba

– Gradiente con mezcla en baja presión

Waters Alliance® 2695 Sample Manager

Waters 2487 TUV a 254 nm

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Cálculo del volumen de inyección

Volumen de inyección inicial X Volumen de columna UPLC Volumen de columna HPLC

Escalamos el volumen de inyección de 10 µL en una columna de 4,6 x 150 mm a una columna de 2,1 x 50 mm

0,068 0,17 2,49

=

10 µL x 3,14 x (0,105 cm)2 x 5 cm 3,14 x (0,23 cm)2 x 15 cm

=

10 µL x 10 µL x

= 0,7 µL

Cálculo del volumen de inyección

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Escalado del volumen de inyección

4,6 x 150 mm

2,1 x 50 mm

20 µL inyección/2,49 mL = 0,8%

20 µL inyección/0,17 mL = 12%

2,49 mL

0,17 mL

El volumen de inyección debe ser menos del 5% del volumen de la columna. Intentar por debajo del 1% y determinar experimentalmente si se puede aumentar según condiciones cromatográficas.

Si se inyecta demasiado, puede generare una mala forma de pico debido a sobrecarga

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Escalado geométrico del flujo

d2 Col. UPLC d2

Col HPLC

Caudal = Caudal inicial x π x r2 col UPLC π x r2 col HPLC

Esta ecuación se reduce a:

Caudal = Caudal inicial x

1,5 mL/min X 2,12

4,62 = 0,31 mL/min

Escalamos el caudal de 1,5 mL/min en una columna de 4,6 x 150 mm a una columna de 2,1 x 50 mm

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Escalado del gradiente inicial

Etapa Tiempo

(minutos) Caudal %A

%B

Curva Duración

(min)

Duración del

gradiente (cv)

Inicial 0 1,5 95 5 * 0 0

2 15 1,5 5 95 6

Lineal 15

3 20 1,5 5 95 1

Regeneración 5

4 30 1,5 95 5 1

Re-equilibrado

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Duración del gradiente Expresado en función del volumen de columna

Etapa 2: Tiempo de gradiente de 15 min a 1,5 mL/min en una columna de 4,6 x 150 mm

Volumen de gradiente = Caudal x Tiempo = 1,5 mL/min x 15 min = 22.5 mL

Volumen de columna = π x r2 x L = 3,14 x 0,232 x 15 = 2,49 mL

Duración del gradiente (cv) = Volumen de gradiente Volumen de columna

Duración del gradiente = 22,5 mL 2,49 mL

= 9,03 cv

Nota: etapa 3 : 5 min = 3,01 cv y etapa 4 : 10 min = 6,02 cv

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Escalado del gradiente inicial

Etapa Tiempo

(min) Caudal %A %B Curva

Tiempo de gradiente

(min)

Duración del

gradiente (cv)

Inicial 0 1,5 95 5 * 0 0

2 15 1,5 5 95 6 15 9.03

3 20 1,5 5 95 1 5 3.01

4 30 1,5 95 5 1 10 6.02

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Escalado del gradiente inicial Manteniendo constante la duración del gradiente (cv)

Etapa 2 en HPLC: 15 min @ 1,5 mL/min con una duración en volúmenes de columna de 9.03 cv Cálculo de etapa 2 en UPLC: Se mantiene constante la duración del gradiente en volúmenes de columna 9.03 cv Volumen de columna UPLC = π x r2 x L = 3,14 x 0,1052 x 5,0 = 0,17 mL Volumen de gradiente UPLC = duración del gradiente (cv) x Volumen de columna = 9,03 cv x 0,17 mL = 1,54 mL Tiempo de gradiente (min) = Volumen de gradiente / Caudal = 1,54 mL / 0,31 mL/min = 5 min

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Escalado del gradiente inicial Columna de 2,1 x 50 mm

Etapa Tiempo

(min) Caudal*

%A

%B Curva Tiempo

gradiente (min)

Tiempo de gradiente

(cv)

Initial 0 0,31 95 5 * 0 0

2 5 0,31 5 95 6 5,0 9,03

3 6,67 0,31 5 95 1 1,67 3,01

4 10 0,31 95 5 1 3,33 6,02

Ajustamos el flujo para una columna de 2,1 x 50 mm manteniendo constante la velocidad lineal (*Escalado geometrico del flujo)

Ajustamos el tiempo manteniendo constante la duración del gradiente en volúmenes de columna

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Curvas de van Deemter (PM<500)

0

5

10

15

20

25

30

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Linear Velocity [mm/s]

HETP

(µ

m)

5 µm SunFire™ C18

3.5 µm SunFire™ C18

1.8 µm ACQUITY UPLC® HSS T3

1.7 µm ACQUITY UPLC® BEH C18

Diámetro Caudal de trabajo (mL/min)

4.6 mm 0.70 1.40 2.10 2.80 3.50 4.20 4.90 5.60 6.30 7.00 7.70 8.40

2.1 mm 0.15 0.30 0.45 0.60 0.75 0.90 1.05 1.20 1.35 1.50 1.65 1.80

1.0 mm 0.04 0.07 0.11 0.14 0.18 0.21 0.25 0.28 0.32 0.35 0.39 0.42

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Gradiente optimizado

Etapa Tiempo (min)

Caudal %A

%B

Curva Tiempo de gradiente

(min)

Tiempo de gradiente

(cv)

Inicial 0 0,6 95 5 * 0 0

2 2,61 0,6 5 95 6 2,61 9,03

3 3,48 0,6 5 95 1 0,87 3,01

4 5,22 0,6 95 5 1 1,74 6,02

Seleccionamos el flujo en UPLC™ y ajustamos el tiempo manteniendo constante el número de volúmenes de columna

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Escalado Químico

¿Que condiciona la selectividad de una columna?

– Fase enlazada

– Partícula

– Unión de la fase enlazada

– Endcapping

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Fase Enlazada

Diferentes tipos: – C18 - C8 – CN – Amide –PFP....

Diferentes enlaces: – Trifuncional

– Monofuncional

– Embeeded Group

Diferentes densidades

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Evolución del tamaño de partícula

10 min

80’s hasta hoy Partículas esféricas micro-porosas de 3.5 – 5 µm 1500 – 4000 psi 50.000 – 80.000 platos/metro Columnas de 3,9 x 150 – 300 mm

70’s (finales) Partículas Irregulares micro-porosas de 10µm 1000 – 2500 psi 25.000 platos/metro Columnas de 3,9 x 300 mm

10 min

70’s (inicio) recubrimiento pelicular no-poroso de 40µm 100 – 500 psi 1.000 platos/metro Columnas de 1m

10 min

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Fases Híbridas

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Evolución de las partículas

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End Capping

Si

CH3

CH3

CH3

Si

CH3

CH3

CH3 Cl

Es un proceso que implica una segunda derivatización con trimetilclorosilano ( C1), que bloquea los grupos hidroxilo libres, haciéndolos inaccesibles a nuestros analitos Primera Derivatización C18 Quedan ~ 50% OH Segunda Derivatización C1 Quedan ~ 40% OH.

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Waters Selectivity Chart

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Rellenos columnas BEH UPLC® BEH C18

– Relleno C18 trifuncional – Primera elección en columna UPLC – Máxima eficacia y óptima simetría de

picos

BEH C8 – Relleno C8 trifuncional – Nuevo proceso de endcapping – El mayor rango de pH

BEH Shield RP18

– Relleno monofuncional – Grupo polar embebido – Selectividad alternativa

BEH Phenyl

– Relleno Fenilo trifuncional – Combinación única de partícula y

ligando – Amplio rango pH

BEH HILIC – Partícula BEH sin funcionalizar – Relleno para bases muy polares

BEH Amide

– Relleno trifuncional con grupo amida – Modo Hilic para ácidos muy polares y

azúcares

Tipo Ligando Densidad Ligando

Carga Carbono

Endcapping Rango pH

Trifuncional C18 3.1 µmol/m2 18% Proprietary 1-12

Trifuncional C8 3.2 µmol/m2 13% Proprietary 1-12

Monofuncional Grupo Polar Embebido

3.3 µmol/m2 17% TMS 2-11

Trifuncional C6 Fenil 3.0 µmol/m2 15% Proprietary 1-12

Sin ligando --- --- --- 1-8

Trifuncional Amide 7.5 µmol/m2 12% None 2-11

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Rellenos columnas HSS UPLC® HSS T3

– Tecnología T3 de enlazado y endcapping – Mayor retención para compuestos polares

HSS C18 – Alta cobertura, relleno C18 trifuncional – Universal, relleno C18 de altas

prestaciones – Proceso de endcapping patentado para

picos óptimos

HSS C18 SB – SB: Selectividad para Bases – Sin encapping: selectividades silanólicas

alternativas – Diseñada para desarrollo de métodos

HSS PFP – Selectividad excepcional para isómeros

posicionales, compuestos halogenados y compuestos polares

HSS CN – Estable, compatible con RP & NP, química

CN reproducible

– Baja hidrofobicidad y selectividad única comparada con ligando C18

Tipo Ligando Densidad Ligando

Carga Carbono

Endcapping Rango pH

Trifuncional C18 1.6

µmol/m2 11% Proprietary 2-8

Trifuncional C18 3.2

µmol/m2 15% Proprietary 1-8

Trifuncional C18 1.6

µmol/m2 8% None 2-8

Trifuncional Propilfluorofenil

3.3 µmol/m2 7.5% None 2-8

Monofuncional Diisopropil Ciano

2.0 µmol/m2

5.5%

None

2-8

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Rellenos columnas CSH UPLC®

CSH C18 — Media/alta cobertura trifuncional C18

— Superior forma pico para productos básicos en fases móviles de baja fuerza iónica

— Menor retención para bases (vs. BEH C18)

CSH PFP Fluorofenil — Forma pico excepcional y baja retención para

bases con grandes diferencias en selectividad

— Elevada reproducbilidad

CSH Fenil Hexil — Excepcional forma de pico para compuestos

básicos

— Selectividad complementaria para compuestos aromáticos

Tipo Ligando Densidad Ligando

Carga Carbono

Endcapping Rango pH

Trifuncional C18 2.3 µmol/m2 15% Proprietary 1-11

Trifuncional Propilfluorofenil 2.3 µmol/m2 10% None 1-8

Trifuncional C6 Fenil 2.3 µmol/m2 14% Proprietary 1-11

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UPLC Columns calculator

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Condiciones Cromatográficas HPLC

Condiciones Cromatográficas HPLC : Columna: XTerra® MS C18 4,6 x 150 mm, 5 µm Fase Móvil A: 0,1% TFA en agua Fase Móvil B: 0,08% TFA en acetonitrilo Caudal: 1,0 mL/min Perfil Gradiente: Tiempo Perfil (min) %A %B curva 0,0 92 8 2,0 92 8 6 32,0 50 50 7 35,0 10 90 6 36,0 92 8 6 41,0 92 8 6 Vol. inyección: 10 µL Conc. muestra: 100 µg/mL Temperatura: 40 oC Detección: UV @ 330 nm Velocidad adquisición datos: 5 pts/sec Constante Tiempo: 1,0 Instrumento: Módulo Separación Alliance® 2695 con 2996 PDA

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AU

0.00

0.10

0.20

0.30

0.40

Minutos 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00

Método HPLC original: Derivados de ácido cafeico en Echinacea Purpurea

Pc = 94

1 2 3

4

5

Nombre Tiempo Retención Resolución USP 1. Acido caftárico 5,71 2. Acido clorogénico 7,07 4,20 3. Cinarina 13,96 21,19 4. Equinacosida 16,54 10,16 5. Acido cicoico 20,32 17,14

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AU

0.00

0.10

0.20

0.30

0.40

Minutes 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00

AU

0.00

0.10

0.20

0.30

0.40

Minutos 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00

Opción 1: Escalado geométrico del gradiente a la misma velocidad lineal de HPLC

HPLC

UPLC™

Pc = 94

Pc = 99

35.00

NameRetention Time

USP Resolution

caftaric acid 5.71chlorogenic acid 7.07 4.20cynarin 13.96 21.19echinacoside 16.54 10.16cichoic acid 20.32 17.14

NameRetention Time

USP Resolution

caftaric acid 1.99chlorogenic acid 2.38 3.97cynarin 4.85 25.00echinacoside 5.93 15.09cichoric acid 7.11 19.62

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AU

0.00

0.10

0.20

0.30

0.40

Minutos 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00

Opción 2: Escalado geométrico del gradiente a velocidad lineal de UPLC

NameRetention Time

USP Resolution

caftaric acid 5.71chlorogenic acid 7.07 4.20cynarin 13.96 21.19echinacoside 16.54 10.16cichoic acid 20.32 17.14

HPLC

NameRetention Time

USP Resolution

caftaric acid 0.71chlorogenic acid 0.87 3.96cynarin 1.72 22.12echinacoside 2.06 11.40cichoric acid 2.44 14.28

UPLC™

Pc = 94

Pc = 85

AU

0.00

0.10

0.20

0.30

0.40

Minutos 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00