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Dr. EDGAR MATOS BENAVIDESMEDICO INMUNOLOGO

PRESIDENTE DE SPI

DIAGNOSTICO DE IDPs POR CITOMETRIA DE FLUJO

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Inmunodeficiencias Primarias

Las inmunodeficiencias son desórdenes que afectan algún componente importante en la respuesta inmunológica, provocando una respuesta inadecuada a infecciones por diversos microorganismos y susceptibilidad al desarrollo de neoplasias

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Tres Niveles de Defensa

Lisozima en secreciones

Integridad de la piel

Clearance ciliar y mucus de las vías respiratorias

Presencia de comensales

Ph bajo estómago

Complemento

Neutrófilo

Células NK

Células T

Células B

DC

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INMUNIDAD INNATA INMUNIDAD ADAPTATIVA

COMPARTIMIENTOS DEL SISTEMA INMUNE

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SEÑALES DEE PELIGRO DE LAS INMUNODEFICENCIAS PRIMARIAS

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Clasificación de IDPs

≅200 defectos genéticos asociados a IDP

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PACIENTES REGISTRADOS POR PAIS MAYO 2015

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Que se necesita para establecer el diagnóstico de

una IDP

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Que se necesita para establecer el diagnóstico de una IDP

CITOMETRO DE FLUJO

SECUENCIADOR

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CITOMETRIA DE FLUJO

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CITOMETRIA DE FLUJOEs una poderosa tecnología para la caracterización y análisis de células. Mide y analiza simultáneamente Múltiples características físicas de las células, cuando estas se mueven en un flujo a través de un haz de luz.

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CASO CLINICO

• 14 Julio 2012• Niño, 10 años• Infecciones recurrentes

desde los 2 años de edad• 11 neumonías y 3 meningitis

bacterianas• 2 Episodios de Otitis con

tratamiento ATB

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• IgG ↓, IgA ↓, IgM ↓• Leucocito 9,800 cel /uL• Linfocitos 970 cel /uL

Citometría de flujo

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10 -1 10 0 10 1 10 2 10 310 -1

10 0

10 1

10 2

10 3

10 -1 10 0 10 1 10 2 10 310 -1

10 0

10 1

10 2

10 3

15.8% 0.39%

Control PacienteC

D3

CD20

Citometría de flujo

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• IgG ↓, IgA ↓, IgM ↓• Linfocitos B ↓

• ¿Diagnóstico?• Agammaglobulinemia

¿Ya tenemos el diagnóstic

o?

Citometría de flujo

CASO CLINICO

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Agammaglobulinemias

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¿Qué gen está fallando en

nuestro paciente?

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Diagnóstico:• Agammaglobulinemia por mutación en

BTK

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¿El camino que tomamos para hacer el diagnóstico fue el más adecuado?

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Detección de Btk por citometría de flujo• Diagnóstico de deficiencia de Btk

• Menos costo que secuenciamiento genético• Más rápido

• ¿En qué células se hace el estudio?• Monocitos

• ¿Qué actitud tomar si se detectan valores normales de Btk en monocitos?

• Secuenciamiento genético si hay alta sospecha• Puede haber proteína no funcionante

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CELULAS B

Son leucocitos de los cuales depende la inmunidad mediada por anticuerpos

Constituyen 5 al 20% de los linfocitos totales en sangre periférica

Dan origen a las células plasmáticas encargadas de secretar anticuerpos

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DESARROLLO DE LA CÉLULA B.

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SUBPOBLACIONES DE CELULAS B

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CD 19: 0 Cel./uL

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Y

Y Y

Y

Y

Ig/Ig

IgM

PLC2

Btk

Fyn

Blk

Lyn

Syk

BLNK

Vav

IP3

Citoesqueleto

JNK

NF-BPKC

DAG

Calcio

Y

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DETERMINACION DE BTK POR CITOMETRIA DE FLIJO

UAAI -INSN

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BTKBTKTESTIGO

CD14 CD14

GAM

MA

BTK

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Células B transicionales: Niveles altos se han sido reportados en infección por VIH , la deficiencia BAFFR (Receptor del Factor de supervivencia de la células B).            Plasmablastos: El aumento de números de plasmablastos se correlaciona con la actividad de la enfermedad en LES.

Células B vírgenes: El aumento en el número de estas células se ven en algunas patologías es debido a una disminución de las células B de memoria (HiperIgM y ICV).      Células B de memoria sin cambio de isotipo: La reducción se han descrito deficiencias tales como CD19, CD81 , LRBA, la enfermedad linfoproliferativa LX.

Células B de memoria con cambio de isotipo: Se han descrito en el síndrome de Wiskott-Aldrich , el síndrome linfoproliferativo LX, AID, UNG, CD40L, TACI así como algunos pacientes con ICV.

Las células B dobles negativas: El aumento se han observado en LES, enfermedad infecciosa crónica (VIH, malaria) y en algunos pacientes con ICV. 

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• Niño, 3 años• Lesiones granulomatosas en

piel desde los 7 meses de edad

• Serratia, Proteus• 3 neumonías• BK Negativo

Caso Clínico

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• IgG, IgA, IgM: normales• Poblaciones linfocitarias: normales

• ¿Diagnóstico clínico?• Enfermedad granulomatosa crónica

¿Cómo confirmar el diagnóstico?

Caso Clínico

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Oxigeno Molecular O2

Radical superóxido O2-H2O2

HOClOH-

Destrucción de Bacterias y hongos fagocitado

¿Qué gen está

fallando en nuestro

paciente?

ematben@hotmail.comDHR PACIENTESECUENCIAMIENTO

PACIENTE DHR MADRE PORTADORA

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¿El camino que tomamos para hacer el diagnóstico fue el más adecuado?

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RESULTADOS:PMN (Eventos contados) MFI

Muestra basal: 5000 225 Muestra con 1,2,3 DHR: 5000 29 955Muestra con estimulo PMA: 5000 993 441

NOI (Indice Oxidativo de los Neutrofilos): 33

Muestra Normal

Epling, C. L., D. P. Stites, T. M. McHugh, H. O. Chong, L. L. Blackwood, and D. W. Wara. 1992. Neutrophil function screening in patients with chronic granulomatous disease by a flow cytometric method. Cytometry13:615–620.

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PMN (Eventos contados) MFIMuestra Basal: 5000 1 151Muestra con 1,2,3 DHR: 5000 8 214Muestra con estimulo PMA: 5000 11 827NOI (Indice Oxidativo de los Neutrofilos): 1.4

Muestra de Paciente con EGC

Epling, C. L., D. P. Stites, T. M. McHugh, H. O. Chong, L. L. Blackwood, and D. W. Wara. 1992. Neutrophil function screening in patients with chronic granulomatous disease by a flow cytometric method. Cytometry13:615–620.

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VALORES NORMALES• NOI > 30 De acuerdo con un estado normal, no consistente con el

diagnostico de CGD.

• NOI < 5 Consistente con el diagnostico de CGD.

• NOI > 30 y NOI < 5 De acuerdo con un estado de portador de la ligada al cromosoma X forma de CGD en una mujer si hay 2 poblaciones claramente separadas de los granulocitos.

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• En la actualidad hay más de 300 mutaciones descritas en el gen CYBB y se han registrado en la XCG Dbase

(http://bioinf.uta.fi/CYBBbase). 2012

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DETERMINACION DE PERFORINAS POR CITOMETRIA DE FLUJO

UAAI -INSN

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1er uso de citometría en IDP…

• Determinación de poblaciones linfocitarias• Linfocitos B: CD19, CD20

• Naive• “Switched” memory• “Unswitched” memory• Transicionales, etc.

• Linfocitos T: CD3, CD4, CD8• Naive• Memory, etc

• Linfocitos NK: CD16, CD56

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1er uso de citometría en IDP…

• Determinación de poblaciones linfocitarias• Linfocitos B:

• Agammaglobulinemia• Inmunodeficiencia común variable

• Linfocitos T:• Inmunodeficiencias combinadas:

• T-B-NK-• T-B-NK+• T-B+NK-• T-

• Linfocitos NK:• Deficiencias NK

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• Detección de expresión proteica (membrana, intracelular)

• BTK: agammaglobulinemia ligada al X• WASP: síndrome de Wiskott-Aldrich• γC: X-SCID• SAP: síndrome linfoproliferativo ligado al X tipo 1• CD40L: síndrome hiper-IgM• FOXP3: IPEX• IL12Rβ1: MSMD• CD18: LAD 1• …

2do uso de citometría en IDP…

PROBLEMA: disponibilidad

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• Pruebas funcionales:• Estallido respiratorio: CGD• Fosforilación de proteínas intracelulares para evaluar

señalización de receptores• Proliferación de linfocitos T en respuesta a mitógenos

3er uso de citometría en IDP…

PROBLEMA: disponibilidad

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GRACIAS

El Equipo de

TrabajoUAAI-INSN

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