MANIPULACION Y ANALISIS

DE LAS MOLECULAS DEL DNA

Gabriela Vidal S.

Definición

Estudio de una secuencia específica de DNA que suele encontrarse

en un conjunto heterogéneo de secuencias.

Aislamiento, amplificación, secuenciación y expresión de un fragmento de DNA

específico

Enzimas de restricción

Cada enzima de restricción reconoce una secuencia

específica de nucleótidos y corta en ese punto cada

una de las cadenas de ADN.

Los extremos libres que quedan se llaman

“extremos pegajosos” (pueden unirse a otros

fragmentos de ADN que hayan sido cortados por la

misma enzima de restricción).

Los fragmentos obtenidos se pueden separar por

tamaños mediante la técnica de electroforesis.

En el proceso de la electroforesis se prepara una

mezcla de fragmentos de ADN y se ponen en

distintas soluciones.

Los fragmentos se desplazan en relación inversa

con su tamaño, los fragmentos más pequeños se

mueven rápidamente, mientras que los grandes lo

hacen muy lentamente.

HIBRIDIZACION

La hibridación de ácidos nucleicos (ADN ó ARN) es un proceso por el cual se combinan dos cadenas de ácidos nucleicos antiparalelas y con secuencias de bases complementarias en una única molécula de doble cadena, que toma la estructura de doble hélice.

Los nucleótidos se unirán con sus complementarios bajo condiciones normales: A=T; A=U; C≡G; G≡C; T=A ó U=A.

En biología molecular experimentalmente se llevan a cabo dos tipos diferentes de hibridación: Tipo Southern, para uniones ADN-ADN y tipo Northern blot, para uniones ADN-ARN

Procedimiento experimental

1.La hélice de doble cadena (ADN) es separada mediante un proceso físico (calor) o químico. Esto rompe los enlaces por puente de hidrógeno que mantienen unidas las dos hebras del ADN.

2.Las dos hebras complementarias se separan, el ADN se desnaturaliza.

3.Una muestra de cadenas simples (o desnaturalizadas) se mezcla con otra muestra de cadenas simples.

4.La muestra combinada se enfría lentamente, las moléculas sencillas se van emparejando por las zonas complementarias y se va formando una nueva molécula hibridada.

Ejemplo

FISH o hibridación fluorescente in situ

Técnica de marcaje de cromosomas mediante la

cual los cromosomas son hibridados con sondas que

emiten fluorescencia y que gracias a ello permiten

la visualización, distinción y estudio de los

cromosomas así como de las anomalías que puedan

presentar.

El primer paso consiste en la desnaturalización del DNA para separar la doble hélice.

A la muestra desnaturalizada se le añade la sonda de interés (fragmento de ADN marcado fluorescentemente).

Primero, las sondas hibridan a regiones específicas.

Después, se tiñen los núcleos con un color de contraste inespecífico (generalmente DAPI).

Las sondas de DNA pueden marcarse con moléculas fluorescentes (método directo) o no fluorescentes que se detectan con anticuerpos fluorescentes (método indirecto).

Translocación t(9;22) : Gen de fusión BCR / ABL

La translocación t(9;22)(q34;q11) que origina el

cromosoma Filadelfia está presente en casi todos los

casos de leucemia mieloide crónica (95%) y en algunos

casos de leucemia linfocítica aguda, siendo de

importancia diagnóstica la detección del gen de fusión

BCR / ABL, mediante Hibridación in situ con

Fluorescencia (FISH). Esta técnica es capaz de detectar

un mosaicismo bajo de alrededor de 2-3%.

Amplificación del gen ErbB2 ó HER2/NEU

El gen HER2/NEU se encuentra localizado en el

cromosoma 17q y su amplificación está presente en

un 25% a 30% de las neoplasias de mama, se

relaciona estrechamente con los estadios

avanzados, metastásicos, que implican mal

pronóstico. El método más importante para detectar

el estado HER2 / NEU es la técnica del FISH.

REACCION EN CADENA DE

POLIMERASA (PCR)

Técnica que permite duplicar un número ilimitado de veces un fragmento de ADN en un tubo de ensayo.

Mediante esta técnica pueden generarse millones de moléculas idénticas, a partir de una molécula de ADN.

Necesita cantidades de ADN muy pequeñas y sólo se precisa un tubo de ensayo, algunos reactivos, una fuente de calor y unas pequeñas cadena de nucleótidos que actúan como cebadores (primers).

La reacción es un proceso cíclico:

1. Desnaturalizacion: La molécula de ADN que va a copiarse se calienta para que se separen las dos hebras.

2. Apareamiento: De los primers o iniciadores con cada una de las hebras separadas del ADN molde.

3. Extension: La ADN polimerasa extiende los primers, sintetizando las secuencias complementarias de las hebras del ADN molde.

El resultado de la aplicación de numerosos ciclos "en cadena" da lugar a la amplificación geométrica del segmento de ADN delimitado por los primers.

Termociclador para PCR

http://www.youtube.com/watch?v=Kuy4PDb6bdU

Aplicaciones en medicina de PCR

Identificación de personas en medicina forense (DNA fingerprint).

Permite detectar agentes infecciosos como los virus de las hepatitis B y C o regiones del genoma del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV).

Diagnóstico de enfermedades tales como las hemofilias A y B, la distrofia muscular y la fibrosis quística.

Reconocer mutaciones de genes vinculadas con enfermedades oncológicas.

Evaluar el riesgo de padecer diabetes de tipo I y la enfermedad celíaca.

CLONACION

Proceso por el que se consiguen copias idénticas de un organismo ya desarrollado, de forma asexual.

Dos características:

Se parte de un animal ya desarrollado, porque la clonación responde a un interés por obtener copias de un determinado animal que nos interesa, y sólo cuando es adulto conocemos sus características.

Por otro lado, se trata de hacerlo de forma asexual. La reproducción sexual no nos permite obtener copias idénticas, ya que este tipo de reproducción por su misma naturaleza genera diversidad.

Clonación del DNA

Recombinación in vitro de un fragmento de DNA con

un DNA vector con capacidad de replicación

autónoma.

El fragmento de DNA se replicará junto con el DNA

vector en la célula hospedadora y así será posible

obtenerlo en un número elevado de copias.

1. OBTENCIÓN DEL DNA

El DNA podrá obtenerse mediante la extracción a partir de la célula, generalmente con la finalidad de construir una genoteca.

Consiste en una lisis celular y la purificación del DNA. La lisis puede conseguirse mediante métodos físicos y químicos.

La pared bacteriana se degrada mediante un lisozima y se lisa con EDTA y SDS. Posteriormente las proteínas y el RNA se degradan por tratamiento con proteasas (ej: Kinasa K) y con RNAasas. El DNA se podrá separar de los enzimas y los restos ya que precipitará con etanol.

Este DNA purificado, en el que está representado todo el genoma del individuo lo vamos a fragmentar con el objetivo de construir lo que denominamos genotecas.

Una genoteca (library en inglés) es una colección de

clones cada uno de los cuales contiene un vector al

que se le ha insertado un fragmento de ADN

derivado del ADN o el ARN totales de la célula o

tejido.

Entre los usos que se le pueden dar a una genoteca están:

El aislamiento de secuencias y genes: punto de partida

para el estudio molecular.

La conservación del genoma: la excepcionalidad de

una muestra biológica aconseja conservar su material

genético (restos arqueológicos, especies en extinción,

individuos con patologías únicas).

Estudio de la secuencia genómica: conocer la secuencia

completa de un genoma implica su clonación previa.

Endonucleasas de restricción

Las endonucleasas de restricción son enzimas que se encuentran en numerosas especies bacterianas y su función es la de reconocer y cortar el DNA foráneo.

Tipos:

Tipo I, cortan de forma inespecífica en un punto que dista de la secuencia de reconocimiento alrededor de 1000 pares de bases.

Tipo III, cortan en un punto más cercano de la secuencia que las del tipo I (25pb).

Tipo II, son las más utilizadas. No requieren ATP y cortan específicamente en la secuencia de reconocimiento.

Las tipo II cortan justo en los puntos que reconocen,

que son repeticiones invertidas o palíndromes

2. UNIÓN DE LOS FRAGMENTOS DE DNA AL

VECTOR

Vectores de clonación:

Un vector es una molécula de DNA con un origen de replicación autónomo y

que posee zonas donde pueden introducirse fragmentos de DNA exógeno.

Así, el DNA exógeno se replica como parte del vector en la célula

receptora y hospedadora.

Plásmidos

Moléculas de DNA bihebra circular extracromosómico que se heredan de manera estable. Suelen conferir a la célula que hospedan alguna característica fenotípica como la resistencia a antibióticos.

Están clasificados en dos grupos:

1) estrictos, si su replicación está acoplada a la del DNA de la célula hospedadora

2) relajados, si se replican independientemente.

Para ser utilizados como vectores los plásmidos deben cumplir unas características:

pequeño tamaño (mejor manipulación y aislamiento);

replicación relajada (permite obtener el DNA clonado en grandes cantidades); y

presencia de puntos de corte únicos (permiten seleccionar las células que porten el plásmido recombinante).

Plásmido pBR322

3. INTRODUCCIÓN DEL DNA EN CÉLULA HUÉSPED:

TRANSFORMACIÓN

Cuando el DNA exógeno ha sido ligado en el

vector, debe entonces introducirse en la célula

hospedadora.

La más usada es E. coli pues, o bien la clonación se

realiza directamente en esta bacteria o bien se

utiliza para la amplificación del DNA recombinante.

4. Selección de colonias aisladas que porten moléculas

de DNA recombinante

Queda simplemente seleccionar aquellas colonias

bacterianas que expresen nuestro DNA

recombinante.

Lo podemos hacer detectando el gen o sus

productos (RNA o proteína) o detectarlo por

secuenciación del genoma de cada colonia.

PLANTAS TRANSGÉNICAS

Entre los principales caracteres que se han transferido a vegetales o se han ensayado en su transfección, merecen destacarse:

Resistencia a herbicidas, a insectos y a enfermedades microbianas.

Incremento del rendimiento fotosintético

Mejora en la calidad de los productos agrícolas

Síntesis de productos de interés comercial

Asimilación de nitrógeno atmosférico

ANIMALES TRANSGENICOS

Entre las aplicaciones de los animales transgénicos se pueden destacar:

La posibilidad de estudiar a nivel molecular el desarrollo embrionario y su regulación.

Manipular de forma específica la expresión génica in vivo.

Estudiar la función de genes específicos.

Poder utilizar a mamíferos como biorreactores para la producción de proteinas humanas.

La corrección de errores innatos de metabolismo mediante terapia génica.

APLICACIONES DE LA INGENERIA

GENETICA EN HUMANOS

1. OBTENCIÓN DE PROTEINAS DE MAMÍFEROS

Una serie de hormonas como la insulina, la hormona

del crecimiento, factores de coagulación, etc ...

2. OBTENCIÓN DE VACUNAS RECOMBINANTES

Por ejemplo, hepatitis B

3. DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES DE ORIGEN

GENÉTICO

4. OBTENCIÓN DE ANTICUERPOS MONOCLONALES

Terapia Génica

Consiste en la aportación de un gen funcionante a las células que carecen de esta función, con el fin de corregir una alteración genética o enfermedad adquirida.

La terapia génica se divide en dos categorías.

I. Alteración de células germinales (espermatozoides u óvulos), lo que origina un cambio permanente de todo el organismo y generaciones posteriores. Esta terapia no se utiliza en seres humanos por cuestiones éticas.

II. Terapia somática celular. Uno o más tejidos son sometidos a la adición de uno o más genes terapéuticos, mediante tratamiento directo o previa extirpación del tejido. Esta técnica se ha utilizado para el tratamiento de algunas enfermedades como la Distrofia muscular de Duchenne.

PROYECTO GENOMA HUMANO

El Proyecto Genoma Humano comenzó en 1990 en

los Estados Unidos con el objetivo de analizar

molecularmente la herencia genética humana.

Se trata de realizar mapas de cada uno de los

cromosomas humanos.

Implica dividir los cromosomas en pequeños

fragmentos que puedan ser caracterizados y

posteriormente ordenados en el cromosoma.

Los objetivos del Proyecto

•Identificar los aproximadamente 100.000 genes humanos en el ADN.

•Determinar la secuencia de 3 billones de bases químicas que conforman el ADN.

•Acumular la información en bases de datos.

•Desarrollar de modo rápido y eficiente tecnologías de secuenciación.

•Desarrollar herramientas para análisis de datos.

•Dirigir las cuestiones éticas, legales y sociales que se derivan del proyecto

Mapa genético

Mapa físico

GRACIAS