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Tlamati Sabiduría, Volumen 7 Número Especial 2 (2016)
4° Encuentro de Jóvenes Investigadores – CONACYT 11° Coloquio de Jóvenes Talentos en la Investigación
Acapulco, Guerrero 21, 21 y 23 de septiembre 2016
Memorias
Análisis semicuantitativo de la adherencia de Streptococcus pneumoniae
durante la infección latente de Citomegalovirus Humano (HCMV)
Diego Armando Lechuga Mercado
Facultad de Ciencias Químico Biológicas
Universidad Autónoma de Guerrero
Programa Delfín
Área VII: Medicina y Ciencias de la Salud
wine_diego@hotmail.com
Dr. C José Arellano Galindo
Investigador del Laboratorio de Virología del
Hospital Infantil de México Federico Gómez
jose.arellano@salud.gob.mx
Resumen
A partir de la pandemia de influenza en 1918 (Española) y 1954 (Asiática) comenzaron a
realizar estudios sobre co-infecciones (virus-bacteria) en donde observaron que tras una
infección viral los pacientes en los que se lograba aislar S. pneumoniae tenían un mal
pronóstico en el curso de la enfermedad. Lo que sugiere que existe un vínculo entre la
infección viral y la colonización bacteriana.
Citomegalovirus Humano (HCMV) es un β-herpesvirus de la familia herpesviridae
perfectamente adaptado al organismo humano, la prevalencia a nivel mundial en países
desarrollado es del 60% y en países en vía de desarrollo es de 94%. Una de las principales
características de este virus es que pueden permanecer en latencia. Por tal motivo se ha decido
estudiar si una infección previa de Citomegalovirus Humano es capaz de modular la
adherencia de Streptococcus pneumoniae en células con infección latente.
Palabras Clave: Citomegalovirus Humano (HCMV), co-infección, Infección latente,
adherencia, Streptococcus pneumoniae.
Introducción
Streptococcus pneumoniae es una bacteria comensal de las vías respiratorias
superiores, con la colonización asintomática de la nasofaringe. Para sobrevivir S. pneumoniae
en la población humana ha colonizado las mucosas de las vías respiratorias altas, donde el
neumococo puede propagarse exitosamente a otro hospedero. El éxito del neumococo de
sobrevivir y persistir en la población humana es demostrado por aproximadamente de 1.9 a
5.9 billones de personas que son colonizadas con S. pneumoniae en un tiempo indefinido. A
pesar de la habilidad de neumococo para causar severas enfermedades invasivas a la mayoría
de individuos colonizados que no desarrollan sintomatología clínica (Short, 2015).
El neumococo es un coco grampositivo encapsulado, tiene aproximadamente un diámetro de
0,5 a 1,2 µm, con forma ovalada o de lanceta, y se disponen en parejas (diplococos) o en
cadenas cortas (Murray, 2009). La incidencia de la enfermedad neumocócica es
desproporcionadamente alto en neonatos, niños y ancianos (Krone, et al., 2015). En las
mayorías de las investigaciones sobre las enfermedades infecciosas se ha centrado en las
infecciones con patógenos individuales. Sin embargo, las infecciones con patógenos a
menudo se producen en el contexto de infecciones virales (Short, et al., 2012). Hay
evidencias epidemiológicas que las infecciones por el virus de la gripe y virus sincitial
respiratorio (RSV) aumentan la incidencia y la gravedad de las complicaciones bacterianas,
principalmente la neumonía, sugiriendo que existe un vínculo entre la infección viral y la
colonización bacteriana (Avadhanula, et al., 2006). Uno de los factores claves en la
colonización neumocócica en las vías respiratorias altas es la co-infección con virus
respiratorios (Short, 2015).
La infección primaria por Citomegalovirus humano (CMVH) inicia cuando existe contacto
directo con fluidos corporales (saliva, la orina y leche materna) de persona a persona, a través
de la sobrepoblación y la falta de higiene, favoreciendo así la transmisión de CMV, de tal
manera que el virus tiene la capacidad de evadir la inmunidad innata (Knipe & M. Howley,
2013). HCMV es responsable de aproximadamente el 8% de los casos de mononucleosis
infecciosa. (Steininger, 2007). Aunque la infección con este virus es asintomática en personas
sanas, puede causar graves enfermedades sobre todo en personas inmunodeprimidas
(Ioudinkova, et al., 2006).
HCMV es un β-herpesvirus de la familia herpesviridae perfectamente adaptado al organismo
humano. El virión está compuesto por el genoma de ADN bicatenario, 235 kb encerrado en
una cápside icosaedrica proteica, que a su vez está rodeado por una capa proteínica
denominada tegumento y, finalmente una envoltura lipídica. Una de las principales
características de este virus es que pueden permanecer en latencia y aun que no existe una
definición molecular de CMV latencia, se ha definido operacionalmente como la incapacidad
para detectar virus infeccioso mediante métodos convencionales conocidos (Hummel & M.
Abecassis, 2002). En ciertos tipos de células, los genes Inmediatamente tempranos (IE) son
silenciados por la infección de HCMV, dando como resultado una infección latente. Durante
la latencia, la expresión del gen viral se reduce al mínimo, presumiblemente para evitar la
detección inmune (Sinclair et. al. Sissons, 2006).
Materiales y Métodos
Material biológico: células THP-1 (ATCC TIB-202), Citomegalovirus humano
towne (ATCC VR-977) y Streptococcus pneumoniae (Klein) chester (ATCC 49619).
Cultivo celular: Las células THP-1 se cultivaron en medio RPMI 1640 enriquecido con 10%
de suero fetal bovino (SFB) en cajas de cultivo celular a 37°C con tensión de CO2 al 5%
manteniendo una confluencias no mayor a 1x106 células/mL.
Manejo de la cepa bacteriana: S. pneumoniae fue cultivado en gelosa sangre durante 18
horas mediante estría masiva, posteriormente fue resembrado en medio Todd Hewitt e
incubado por 13 horas, enseguida se recuperó el botón celular mediante centrifugación a 1000
xg por 10 minutos. La cuantificación se realizó con el Nefelómetro de Mac Farland a 0.5.
Las bacterias se marcaron con isotiocianato de fluoresceína (FITC) a una concentración final
de 10 µM, se incubó por 20 minutos a 37°C en oscuridad. Subsecuentemente la bacteria fue
lavada 3 veces con PBS estéril.
Cinética de adherencia bacteriana: Se infectaron 1.5 X 106 células con 50 genomas de
CMV towne a las 96, 72, 48, 24, 2 y 0 horas, tras la infección con CMV towne se infecta con
S. pneumoniae.
Citometría de flujo: Las muestras se fijaron con paraformaldehido 0.3 %, posteriormente se
analizaron en el citometro de flujo FACSCanto™ y se analizaron por medio de flowing software 2.5
Formato de Gráficas y Figuras:
Gráfica 1. A) Histograma de intensidad de fluorescencia a 660 nm, donde se observa a CMV
concentrado con una mayor población a diferencia de las demás, lo que indica que hay más
bacterias adheridas a las células. B) Infección de CMV 0 horas, representando la Media de
Intensidad de Fluorescencia (MIF) vs la población. Fuente: Elaboración propia
Counts
B
A
Gráfica 2. A) Histograma de intensidad de fluorescencia a 660 nm, donde se observa a CMV
concentrado con una mayor población a comparación de las demás, lo que indica que hay
más bacterias adheridas a las células. B) Infección de CMV 2 horas, representando la Media
de Intensidad de Fluorescencia (MIF) vs la población. Fuente: Elaboración propia
Counts
A
B
Gráfica 3. A) Histograma de intensidad de fluorescencia a 660 nm, donde se observa la
dilución CMV-1, CMV-2, CMV-3 con una mayor población de células a comparación de
CMV concentrado que aunque tienen una menor población de células, se observa una mayor
adherencia de las bacteria en las células. B) Infección de CMV 24 horas, representando la
Media de Intensidad de Fluorescencia (MIF) vs la población. Fuente: Elaboración propia
Counts
A
B
Gráfica 4. A) Histograma de intensidad de fluorescencia a 660 nm, donde se observa a CMV
-1, CMV-2, CMV-3 con una mayor población de células a comparación de CMV concentrado
y THP1- S.pneumoniae que aunque tienen una menor población de células, se observa una
mayor adherencia de la bacteria en las células. B) Infección de CMV 48 horas, representando
la Media de Intensidad de Fluorescencia (MIF) vs la población. Fuente: Elaboración propia
Counts
A
B
Gráfica 5. A) Histograma de intensidad de fluorescencia a 660 nm, donde se observa a
CMV-4 con una mayor población de células que CMV concentrado, el cual tiene una menor
población, pero una mayor adherencia de la bacteria en las células. B) Infección de CMV 72
horas, representando la Media de Intensidad de Fluorescencia (MIF) vs la población. Fuente:
Elaboración propia
Counts
A
B
Gráfica 6. A) Histograma de intensidad de fluorescencia a 660 nm, donde no se observa
diferencia cualitativa, en cambio CMV concentrado muestra un mayor desplazamiento, lo
que indica que hay una mayor adherencia de la bacteria con las células. B) Infección de
CMV 96 horas, representando la Media de Intensidad de Fluorescencia (MIF) vs la
población. Fuente: Elaboración propia
Counts
A
B
Resultados
Gráfica 7. Porcentaje de población con bacterias adheridas. Fuente: Elaboración propia
Gráfica 8. Mediana de la intensidad de la fluorescencia. Fuente: Elaboración propia
Este estudio reporta la cinética de adherencia de S. pneumoniae en células THP-1 con post-infección
de CMV Towne a las 96, 72, 48, 24, 2 y 0 horas. Al tiempo 0 horas (Gráfica 1 A) observamos la
población celular con respecto al desplazamiento de la intensidad de la fluorescencia que indica la
cantidad de bacteria adherida a la superficie celular, de ahí se observa que existe un incremento en la
adherencia cuando hay una infección (virus- bacteria) al mismo tiempo. Por lo tanto no se puede
discriminar que población tiene más bacteria adherida, entonces se gráfica la Media de la Intensidad
de la Fluorescencia (MIF) vs la población (Gráfica 1 B) en donde el control negativo (células THP-
1) representan la autoflorescencia de la célula, posteriormente en las células con S. pneumoniae
representan nuestra adherencia normal, a partir de ello se observa un aumento lineal en la adherencia
en las diluciones CMV-4, CMV-3 y CMV-2. En cambio en la dilución CMV-1 se observa una caída
en la adherencia de S. pneumoniae, enseguida CMV concentrado aumenta la adherencia bacteriana.
Mientras tanto en el tiempo 2 horas (Gráfica 2 A) se representa la población celular con respecto a
un gran desplazamiento de la fluorescencia de CMV concentrado, indicando que existe una mayor
adherencia por parte de la bacteria en la célula. También en este caso no se debe discriminar que
población tiene más bacteria adherida, por lo tanto se realizó una gráfica MIF vs la población
(Gráfica 2 B) en donde el control negativo (células THP-1) representan la autoflorescencia de la
célula, posteriormente en las células con S. pneumoniae representan nuestra adherencia normal, donde
a partir de los controles se muestra un aumento en CMV atenuado (UV) y un descenso por parte de
la dilución CMV-4 y enseguida se observa un aumento lineal en la adherencia, mayormente en CMV
concentrado. Tanto en la Gráfica 3 A, 4 A, 5 A y 6 A se observa un aumento importante en la
adherencia de S. pneumoniae en la célula, una vez infectada por CMV concentrado sin dejar de tomar
en cuenta qué población tiene más bacterias adheridas, realizando así graficas de comparación MIF
vs la población Gráfica 3 B, 4 B, 5 B, 6 B. En base los resultados obtenidos se establecieron gráficas
donde se observa el porcentaje de población con bacterias adheridas (Gráfica 7) representando que
CMV concentrado mantiene una linealidad de población más alta que las demás muestras en 0, 2, 24,
48, 72, 96 horas con respecto a MIF (Gráfica 8) donde se observa que a las 2 horas CMV concentrado
alcanza su mayor intensidad, representando que existe una mayor adherencia por parte de S.
pneumoniae en la célula.
Discusión y conclusiones
Este estudio, se determinó la cinética de adherencia de S. pneumoniae en monocitos THP-1 infectadas
con CMV. Estudios previos reportan la adherencia de S. pneumoniae y H. influenzae no tipificable
en fibroblastos post-infección con Virus Sincitial Respiratorio (SRV) y Virus Parainfluenza tipo III
(HPIV-3). Se observó que dichos virus, modulan los receptores de la célula favoreciendo la
adherencia bacteriana. Además, aumentan la incidencia y la gravedad de las complicaciones
bacterianas, tales como neumonía y sepsis (Avadhanula, et al., 2006). En este estudio, se analizó la
adherencia de S. pneumoniae en una cinética de infección por CMV desde 0, 2, 24, 48, 72 y 96 hrs.
Se observó que a un título viral de 50 genomas, existe un incremento de la adherencia bacteriana;
estudios previos han demostrado que a las 2 horas de la infección existe la expresión de proteínas
Inmediatamente tempranas (IE), pudiendo ser las responsables de dicha modulación, debido a la
presencia de proteínas estructurales del tegumento propias del virus (Kalejta, 2008), lo que sugiere
que algunas de estas proteínas están involucradas directamente con la expresión de moléculas que
pueden fungir como receptores para la adherencia de S. pneumoniae. Teughels y col. (2007),
demostraron que la adherencia de Actinobacillus actinomycetemcomitans es directamente
proporcional al título de una infección activa de CMV in vitro, dependientes de un tiempo de 24 hrs.
post-infección viral, seguido de una ligera disminución. Por lo tanto, supone que la adherencia de
S. pneumoniae puede estar correlacionada con el tiempo post-infección, además del título viral; en
este experimento observamos que CMV concentrado alcanzó a mantener la mayor adherencia
bacteriana.
El modelo propuesto en este estudio, mostró un aumento importante de la adherencia con respecto al
control evidenciado, que se interpreta como un incremento de bacterias adheridas en las células, así
como un incremento de células con bacterias adheridas a un tiempo de 2 h post-infección viral.
Posteriormente, la adherencia disminuye próximo a la basal y nuevamente se observa un incremento
oscilatoriamente dependiente del tiempo de infección. Este efecto puede interpretarse como un intento
de compensación celular, una vez que las proteínas virales han secuestrado la maquinaria celular y
han contribuido al mecanismo de incremento de la adherencia bacteriana inducida por la infección
viral.
En este estudio observamos que la adherencia de S. pneumoniae es modulada por la infección de
CMV en un estado de latencia en células THP-1, en cambio al no existir una infección por CMV en
la célula, no logra modular la adherencia. Por lo que concluimos que la adherencia de S. pneumoniae
depende de una infección por CMV en células monociticas en estado de latencia (THP-1).
Existe la hipótesis que el gen UL111.5 que codifica para la interlucina-10 (IL-10) está relacionado
con la modulación de la adherencia bacteriana, proponemos investigar este efecto en S. pneumoniae.
Agradecimientos
Agradezco profundamente a mi Alma Mater la Universidad Autónoma de Guerrero
por permitirme una vez más realizar la estancia de verano, así como también al Dr. José
Arellano Galindo por el apoyo que me brindo durante la estancia, además permitirme formar
parte de un gran equipo de trabajo de investigación. Agradecer también la colaboración de
mis amigos Víctor Hugo Sánchez De Paz y Abel Tranquilino de Jesús presentes en el
Laboratorio de Virología para poder llevar a cabo y culminar este proyecto de investigación.
Referencias
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Respiratory Epithelium in a Viral Species- and Cell Type - Dependent Manner. Journal of virology
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Ioudinkova, E. y otros, 2006. Control of human cytomegalovirus gene expression by differential
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Kalejta, R. F., 2008. Tegument Proteins of Human Cytomegalovirus. microbiology and molecular
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Knipe, D. M. & M. Howley, P., 2013. FIELDS VIROLOGY. En: VIROLOGY. Philadelphia, USA:
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Krone, C. L. y otros, 2015. Carriage of Streptococcus pneumoniae in Aged Adults with Influenza-
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