Pirosekuentziazioa

Xabier Arratibel, Bingen Gutierrez, Ines Martin eta Garazi Serna

Oinarriak

Pirosekuentziazioa luziferasa entzimak ATP gastatuz igorriko duen argi ikusgarriaren neurketan onarritzen da.

Argi kantitatea sekuentziako nukleotido kopuruarekiko proportzionala da.

DNA erauzi PCR-a burutu

◦ Mix-a Hasle biotinizatua

(Bisulfitoarekin tratatu metilazioak aztertzen bagaude) Desnaturalizatu

◦ NaOH Biotinadun harizpiak harrapatu

◦ Hutsezko ponpa◦ Estreptabidinari batu

Prozedura

Pirosekuentziadorea◦ 9 putzu daude dispentsadorean

Entzimen mixa, substratuen mixa, A, C, G eta T

◦ Nukleotido desberdinak ordenean sartzen dira plakan

(guk sartzen diogu sekuentzia, gure kasuan)

◦ Harizpiarekin elkartzean PPi askatu

◦ ATP sulfurilasa PPi-ak ATP bihurtzeko (Adenosina 5’ fosfosulfatoaren laguntzaz)

◦ Luziferasa ATP erabiliz, luminiszentzia eragin Luziferina sustratu Oxiluziferina

◦ Apirasa Erabili ez diren nukleotidoak degradatu

◦ Argi izpiak neurtu eta informazioa batu

http://www.labtube.tv/channel.aspx?v=137486&u=QIAGEN

http://www.qiagen.com/knowledge-and-support/videos-and-virtual-demos/videos/pyrosequencing%20cascade%20reaction/

Bisulfitoaren bidezko pirosekuentziazioa

Prozedura:

•DNA erauzi.

•Bisulfitoarekin tratatu

•Demagun hau dela gure sekuentzia 5´GCATCG…….CG………..CG……CG3’o Metilatua badago 5’ GTATCC…....CG……….CG…….CG3’o Ez badago metilatua 5’ GTATTG….….TG……….TG..….TG3’

•Metilazioa kuantifikatzeko teknika.

•PCR burutu.

•Lagina desnaturalizatzen da.

•Hasleak guztiz biotinilizatuak.

•DNA sekuentziak hibridatu hasle espezifikoarekin. Harizpi osagarria aipatutako entzimen presentzian eratuko da.

•Harizpi bakarreko anplikoiak harrapatu egiten dira estreptabidina bidez.

•Sekuentziazioa (3.pausua)

•25-30bp bitarteko sekuentziak

•Pirograma Kontrolak:

•Kontrol negatiboa

Emaitzen interpretazioa SNP

Osasuntsua den batekiko alderatuz nukleotido aldaerak ikusi

Emaitzen interpretazioa metilazioa ikusteko

Bisulfitoaren eraginez CG ak T bihurtu metilatuta ez badaude.

Portzentaiak metilazio maila adierazten du.