PORQUE BUSCAMOS LA HEPATITIS C?ESTE INDIVIDUO TIENE HCV?

ESTA PERSONA (POTENCIAL DONANTE DE SANGRE) PUEDE ESTAR EXPUESTO A HCV ?

QUE EFECTOS TIENE LA INFECCION POR HCV EN EL HIGADO?

CUAL ES LA PROBABILIDAD QUE EL TRATAMIENTO SEA EFECTIVO EN ESTE PACIENTE?

EXISTEN TRATAMIENTOS EFECTIVOS?

QUIENES SON LOS CANDIDATOS A ESTUDIAR EL HCV ?

1- AQUELLOS QUE TIENEN FACTORES DE RIESGO PARA LA INFECCION POR HCV

2- AQUELLOS CON RESULTADOS DE SU FUNCION HEPATICA ANORMAL

3- LOS DONANTES DE SANGRE

4- PACIENTES INFECTADOS CON TERAPIA ANTIVIRAL

IMPACTO DE LA INFECCION

HISTORIA NATURAL DE LA HEPATITIS C

GRAN COHORTE DE PACIENTESGRAN COHORTE DE PACIENTES

AMBOS SEXOS Y DE DIFERENTES ETNICIDAD

FECHA DE INFECCION: HEPATITIS C AGUDAFECHA DE INFECCION: HEPATITIS C AGUDA

SIN TRATAMIENTO

CONOCIMIENTO DE COFACTORES

ESTRATEGIAS PARA EL ESTUDIO DE LA HISTORIA NATURAL DE HCV

INFECCION INICIALFASE TEMPRANA

HEPATITIS CRONICA

FASE TARDIA HEPATITIS CRONICA

(CIRROSIS)

20 A 40 AÑOS

ESTUDIOS RETROSPECTIVOS

ESTUDIOS PROSPECTIVOS

ESTUDIOS RETROSPECTIVOS - PROSPECTIVOS

Leonard Seeff 2002; Hepatology

DINAMICA DE LA INFECCION TEMPRANA POR HCV

INFECCION POR HCV

CLEARANCE VIRAL

TRANSMISSION

PATOGENESIS

PERSISTENCIA VIRAL

Doubling Time Viral :10,8 a 17 horas

HCV RNA 4-7 log

SCREENING SEROLSCREENING SEROLÓÓGICOGICOC

on

cen

trac

ión

Rel

ativ

a

Infección

Anti-HCV 3ra

Anti-HCV 2da

Ag/Ac 4ª

Período de Ventana Serológica

Co

nce

ntr

ació

n R

elat

iva

Días

0 10 20 60 80 10030 40 50 70 90 110

Eclipse

Anti-HCV 2

Anti-HCV 1ra

EIA para Anti HCV

ALGORITMO ALGORITMO DIAGNÓSTICODIAGNÓSTICO

Relación S/CO

BajoAlto

-NEGATIVONEGATIVONEGATIVONEGATIVO

RIBA Anti RT-PCR

++++

-BajoS/CO

AltoS/CO

RIBA Anti HCV

RT-PCR HCV

-

NEGATIVONEGATIVONEGATIVONEGATIVO

-

Evaluación adicional

(PCR, ALT, etc)

IND

INDETERMINADOINDETERMINADOINDETERMINADOINDETERMINADO POSITIVOPOSITIVOPOSITIVOPOSITIVO

++++++++

POSITIVOPOSITIVOPOSITIVOPOSITIVO

Alter et al, Recommendations and Reports, CDC,2003

SCREENING SEROLSCREENING SEROLÓÓGICOGICO

CORE E1 E2 NS1 NS2 NS3 NS4 NS5ELISAELISA

c100-31º

S

80%c100-31º 80%

c200C22-32º 95%

c200 NS5C22-33º 97%

La Pregunta Inicial

¿Falso positivo?

Pruebas Suplementarias:

�Pacientes sanos�No antecedentes parenterales�ALT normal

AntiAnti--HCV (+)HCV (+)

¿Verdadero positivo?

Pruebas Suplementarias:� RIBA-LIA� HCV RNA

�Transfusiones o drogas IV� Incremento de ALT�Enfermedad hepática

Limitaciones del Anti-HCV

�No mide la presencia de virus circulante

�No distingue entre infección aguda, crónica o resuelta

�Es negativo en alrededor del 10% de los �Es negativo en alrededor del 10% de los pacientes con infección crónica C

�No es útil para el diagnóstico de infección aguda (seroconversión en semanas)

�En poblaciones de bajo riesgo la tasa de resultados falsos positivos es alta

EN LOS INMUNOENSAYOS

MUESTRAS QUE PERMANECEN POSITIVAS Y QUE SONNEGATIVAS POR UN TEST CONFIRMATORIO

INESPECIFICA O FALSA REACTIVIDAD

FALSOS POSITIVOS O BFR

2- LAS CAUSAS

INMUNOENSAYOS

La causa primaria de BFR es la reactividad de anticuerpos La causa primaria de BFR es la reactividad de anticuerpos No específicos ya sea contra epitopes virales o no viralescontaminantes

Vacunación contra FLU o RabiaInfecciones agudas recientes o AlergiasAgentes relacionados inmunologicamente

CARACTERISTICAS DE LOS BFR

2- CAMBIOS DE LA TASA DE BFR CON LOS LOTES

1- RELACIONADOS AL ENSAYO

3- VARIACIONES DE BFR DEBIDO A LAS MODIFICACIONES DEL ENSAYO

4- RESULTADOS DE BFR TRANSITORIO

5- LA SEÑAL S/CO

CARACTERISTICAS DE LOS BFR

5- LA SEÑAL S/CO

ENSAYOS DE MICROPLACAS

HCV

ENSAYOS EN TUBOS

HCVBFR S/CO : 1.524

ANTI HCV (+)/ RNA (-) S/CO: 4.546ANTI HCV (+) RNA(+) S/CO: 6.467

MÉTODOS SUPLEMENTARIOSMÉTODOS SUPLEMENTARIOS

RIBA O LIARIBA O LIA

Mayor Especificidad y menor Sensibilidad que EIA de 3º Generación

LUDWIG VAN BEETHOVEN – 1770-1827

El término música clásica es un amplio, a veces impreciso, término que se refiere a la música producida

o arraigada en la tradición

INTERPRETACION

La Biología Molecular es una ciencia cuyo objetivo fundamental es la comprensión de todos aquellos

procesos celulares, que contribuyen a que la informacióngenética se transmita eficientemente de unos seres a

otros, y se exprese en los nuevos individuos.

INTERPRETACION MUSICA CLASICA

ORQUESTA

LA BIOLOGIA MOLECULAR

ENSAYOS

VIOLINES, VIOLAS, FLAUTAS, HIBRIDACION, CLONACION

OBRA MUSICAL(SINFONIA)

HEPATITIS C

VIOLINES, VIOLAS, FLAUTAS, VIOLONCELOS CONTRABAJO, OBOE, FAGOT, CLARINETE

HIBRIDACION, CLONACIONPLASMIDOS, TRANSFECCIONAMPLIFICACION DE ACIDOS NUCLEICOS, SATELITISMO

1º Allegro

2º Adagio o Andante

3º Minuetto o Scherzo

4º Allegro Finale o Rondó

SINFONIA HEPATITIS C

Replicación y Persistencia

Interacción con el SI

Mutaciones

Carga Viral4º Allegro Finale o Rondó Carga Viral

CARGA VIRAL HCV

EL MOVIMIENTO DE ESTA SINFONIA : NAT

LOS INSTRUMENTOS : PCR CUANTITATIVATMA REAL TIME PCRbDNA

ARMONIA : LOS ACORDES

LIMITE DE DETECCION Y CUANTIFICACION

Utilidad Clínica del HCV RNA

�Marcador directo de replicación viral

�Diagnóstico de infección aguda

�Diagnóstico de infección oculta

�Transmisión vertical

�Transmisión por órganos sólidos

�Recurrencia de HCV post-trasplante

�Confiabilidad de los productos sanguíneos

�Accidentes de trabajo

�Monitoreo del tratamiento antiviral

¿Para qué sirve la carga viral de HCV?

�Para estimar la respuesta al tratamiento antiviral

�Para evaluar la respuesta virológica precoz (12 semanas de tratamiento):� HCV RNA negativo o ↓↓↓↓ >2 log� HCV RNA negativo o ↓↓↓↓ >2 log

¿Qué valor tienen la carga viral para evaluar la severidad o el pronóstico

de una hepatitis crónica C?

Ninguno fehacientemente comprobadoNinguno fehacientemente comprobado

Taqman

Syber Green

Tecnología Real time

Syber Green

Easy Q (Molecular Beacon)

A. Martinez-Lab Virología-CEMIC

REAL TIME PCR

Molecular

beacons

Sondas de hibridización

HCV RNA

Syber Green

Tecnología Taqman

Journal of Molecular Endocrinology (2000) 25,169-193

HEPATITIS VIRALES-CARGA VIRAL

REAL TIME PCR :

AUMENTO DEL RANGO DINAMICO : LOG DE 8 O 9

BAJO LIMITE DE DETECCION

BAJA CONTAMINACION

REPRODUCIBILIDAD – HIT RATE 95%

RESULTADOS EN UI/mL

“Workflow” 48 muestras

PCR Extracción, automatizada Amplificación Detección

9:00 10:00 11:00 12:00 13:00 14:00 15:00 16:00 9:00 10:00 11:00 12:00 13:00 14:00 15:00 16:00

DIA 1 DIA 2

RT AmplificaciónDetecciónExtracción, automatizada

SCOTT JD, GRETCH DR. JAMA 2007; 21:724-732

ENSAYOS MOLECULARES PARA HCV

•NASBA HCV QT (BIOMERIEUX) 278 UI/mL

•Procleix HIV 1/ HCV (Gene Probe ) 5 UI/mL

•AmpliScreen HCV (Roche) 50 UI/mL

HCV RNA CUANTITATIVO MONITOREO TRATAMIENTO

SCOTT JD, GRETCH DR. JAMA 2007; 21:724-732

* LOS ENSAYOS MOLECULARES DEBEN ESTAR VALIDADOS

* LOS ENSAYOS MOLECULARES: ESTANDARIZADOS

* LOS ENSAYOS MOLECULARES: CONTROLES DE CALIDAD

PERO CUIDADO!!

* ENSAYOS MOLECULARES COMERCIALES : TRAZABILIDAD

SOBREESTIMACION

DE LA CARGA VIRAL

CAP/ CTM

PAWLOTSKY JM, 2007 Hepatology ;46: 22-31

SUBESTIMACION DE LA CARGA VIRALGENOTIPO 2 (15%)GENOTIPO 4 (30%)

LOS ENSAYOS DE BIOLOGIA MOLECULAR CONSTITUYEN EL NUEVO PARADIGMA EN LAS HEPATITIS VIRALES

NUEVAS TECNOLOGÍAS : ARRAY LÍQUIDO (LUMINEX)

NUEVOS MARCADORES : cccDNA (HBV)

INTERPRETACION