EVALUACIÓN DEL EFECTO ANTIMICROBIANO IN

VITRO DE EXTRACTOS ETANÓLICOS DE 5 PLANTAS

SOBRE Clavibacter michiganensis subsp.

michiganensis (Cmm).

Presenta: Armendáriz Barragán José Eduardo

Asesores:

Soto Peña Gerson Alonso

Rosales Colunga Luis Manuel

NOVIEMBRE 2018.

1

CONTENIDO

1. Introducción2. Pregunta de Investigación

3. Justificación4. Objetivo

Gral.

5. Objetivos Específicos

6. Hipótesis7. Metodología8. Resultados

9. Conclusión 10. Bibliografías

2

El cultivo de jitomate (Solanum lycopersicum

sculentum.) es un producto agrícola de alta importancia económica a nivel mundial.

En México la producción de jitomate está altamente concentrada en cinco entidades; se produjo el 56.3% del total nacional en 2016.

San Luis Potosí como segundo lugar en producción de tomate rojo, con una producción aproximada de 200 mil toneladas anuales.

JITOMATE

El 54.5% de la superficie

destinada al cultivo de jitomate en 2014 se concentró en 4 países: China (19.8%), India(18.8%), Nigeria (10.8%) y

Turquía (6.40).

-Sinaloa (27.6 %), -San Luis Potosí (9.2%)-Michoacán (7 %),

-Baja California (6.7%)-Zacatecas (5.7%)

(FIRA 2017)(SAGARPA, 2015)

(FAO, 2014)

3

México ocupa la décima posición mundial con el 1.9% de la superficie cosechada de esta hortaliza.

Dada la importancia económica del cultivo de jitomate, se hace más

patente el esfuerzo tecnológico en cuanto a identificación y tratamiento de

plagas y enfermedades.

PRINCIPALES PLAGAS QUE AFECTAN AL TOMATE

INSECTOS ACAROS NEMÁTODOS

CHUPADORES • Afilados/Pulgone

s

• Mosca blanca

• Paratrioza

• Acaro

blanco

• Araña roja

MASTICADORES • Orugas

• Gusanos

MINADORES • Minador de la

hoja

• Nemátodo

de la raíz 4

TABLA 1.

El manejo integrado de plagas

(MIP) permite al productor elacceso a mercados de

exportación que exigen la

calidad fitosanitaria. Dicho

manejo incluye distintas

estrategias de control biológico,

químico, cultural y mecánico.

TABLA 2. PRINCIPALES ENFERMEDADES QUE AFECTAN AL

TOMATE

BACTERIANAS FUNGOSAS

• Cáncer bacteriano (Cmm) • Antracnosis

• Mancha bacteriana • Cáncer del tallo/Alternariosis

• Mancha negra del tomate • Cenicilla

• Marchitez Bacteriana • Fusarium

• Tizón temprano

• Verticillum

5

Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis es la bacteriacausante de la enfermedad delcáncer del jitomate.

La enfermedad fue descubiertaen 1909 en Grand Rapids,Michigan, EUA.

Esta bacteria es un bacilo Grampositivo, no móvil, aérobico,temperatura óptima decrecimiento in vitro es de 25 a28°C. (Schaad et al., 2000; Jones et al., 2001.).

6https://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Clavibacter_michiganensis

Esta enfermedad puede causar

pérdidas hasta del 100% de la

producción. En México se encuentra

distribuido básicamente en todos los

Estados productores de jitomate.

Los principales hospederossusceptibles al ataque de la bacteria

son:

Jitomate rojo.

Tomate de cascara.

Chile.7

Marchitamiento de la planta iniciando con las hojas más viejas

Necrosamiento marginal e intervenal de hojas.

Decoloración de los tejidos vasculares de tallos, iniciando de color amarillo para luego tornarse café claro y finalmente café obscuro.

Se presenta como manchas pequeñas color café claro.

Se manifiestan cuándo la bacteria es depositada mediante salpicadura.

Disease Guide BCT Spanish (1).pdf8

Semilla infectada.

De suelos infestados a suelos libres, con la maquinaria o herramientas de trabajo.

Agua de riego.

Contaminación por insectos.

Contacto entre raíces infectadas y raíces sanas.

Utensilios de trabajo relacionados con las labores de manejo.

Manejo de las plantas infectadas por el hombre. 9

El cáncer bacteriano es difícil de controlar y para ello se han utilizado

bactericidas a base de cobre (Oyoque, 2008), sin embargo, los resultados

demostraron que incrementan el costo de producción y causan daño al

hombre, animales y al ambiente por lo que su empleo no es satisfactorio.

Cu(OH)2CuSO4 Cu2(OH)3Cl

Una alternativa que se plantea para el tratamiento de esta enfermedad

es el uso de plantas medicinales, que se a observado que pueden inhibir

el crecimiento de bacterias del género Gram Positivo. 10

EpazoteChenopodium ambrosioides

EstafiateArtemisa mexicana

GobernadoraLarrea tridentata.

HuizacheAcacia farnesiana

LechuguillaAgave lechuguilla torr 11

PLANTA P.A

Gobernadora Glucosidos, Flavonoides, Lignanos, Ácido

nordihidroguayarético.

Lechuguilla Esmilagenina.

Epazote Terpenos, Alcanos, Flavonoides, Ac. Butirico.

Huizache Esteroles, Flavonoides, Glucosidos,

Componentes fenílicos.

Estafiate Terpenos, Flavoboides y Cumarinas.12

Biblioteca de la Medicina Tradicional Mexicana

TABLA 3. PRINCIPIOS ACTIVOS PRESENTES EN LAS PLANTAS

¿Los extractos etanólicos de las plantas a evaluar

tienen efecto antimicrobiano sobre Clavibacter

michiganensis subsp. michiganensis?

13

El cáncer bacteriano es una enfermedad que causa severas perdidas en todo elmundo. La ocurrencia de esta enfermedad es esporádica, pero puede serdevastadora. En todos los tipo de cultivares de tomate están propensos a seriasperdidas (Monsiváis, 2006).

En México se ha detectado esta enfermedad en Sinaloa, Jalisco, San Luis Potosí,Baja California, Guanajuato y Sonora. En 2009, en Sinaloa, esta enfermedadafectó 200 ha de jitomate cultivado bajo invernadero, causando pérdidasaproximadamente de 40 millones de dólares. En San Luis Potosí se reportanpérdidas económicas que varían de 60 a 100 % en los municipios de Villa deArista y Moctezuma (Luzz & García, 2011).

El control natural es una alternativa natural propuesta para resolver problemascausados por bacterias del género gram positivo, el cual consiste en utilizarextractos de planta, para inhibir y eliminar la bacteria sin causar daños gracias asus principios activos.

15

Los extractos elaborados de las plantas a evaluar presentan efecto

antimicrobiano in vitro sobre Clavibacter michiganensis subsp.

michiganensis.

16

Evaluar el efecto antimicrobiano de los extractos

etanólicos de Chenopodium ambrosioides, Artemisa

mexicana, Larrea tridentata, Acacia farnesiana y Agave

lechuguilla torr en Clavibacter michiganensis subsp.

michiganensis.

17

18

1.

• Realizar la recolección de las plantas con las que se trabajaran.

2.

• Elaborar extractos de las plantas recolectadas mediante maceración y cuantificar su rendimientos.

3.•Realizar una cinética de crecimiento de Cmm.

4.

• Observar la inhibición producida por los extractos etanólicos en medio líquido.

19

Gobernadora

Cerritos de Zavala, S.L.P

Lechuguilla

Libramiento Poniente, S.L.P

Epazote

Comercialmente

Huizache

Fraccionamiento los Álamos S.L.P

EstafiateComercialmente

Secado del material vegetal

Maceración

(15 días) Filtración

Evaporación del solvente

(Rotavapor R-3)Cálculo de rendimientos

20

21

EXTRACTO GRAMOS

OBTENIDO

RENDIMIENTO DOSIS USADA

1

DOSIS USADA

2

LECHUGUILLA 6 g 6 % 0.0447 g/ml -

GOBERNADORA 6 g 6 % 0.0517 g/ml 0.150 g/ml

EPAZOTE 3 g 3 % 0.0162 g/ml 0.048 g/ml

ESTAFIATE 7 g 7 %- 0.0351 g/ml 0.105 g/ml

HUIZACHE 5 g 5 % 0.0173 g/ml 0.052 g/ml

TABLA 4. RENDIMIENTOS

22

Pre inóculo

40 ml LB + Cmm

Agitación 150 rpm

T= 28°C

D.O= 0.204Preparación de

medio con extractos

Toma de D.O

Se realizara un diseño completamente al azar, con 3

repeticiones por tratamiento.

Se realizara un análisis inferencial a través de las pruebas

no paramétricas de U de Mann Whitney y Kruskal Wallis.

23

24

0.000

0.031

-0.100

-0.050

0.000

0.050

0.100

0.150

0.200

0.250

0.300

0.350

0.400

0.450

0 12 18 24 36 42 48 60 66 72 84

UD

A

TIEMPO (h)

TESTIGOS

T1 T2 T3

25

0.148

0.235

0.283

-0.100

0.000

0.100

0.200

0.300

0.400

0.500

0.600

0.700

0 12 18 24 36 42 48 60 66 72 84

UD

A

TIEMPO (h)

GOBERNADORA

G1 G2 G3

26

0.148

0.235

0.283

-0.100

0.000

0.100

0.200

0.300

0.400

0.500

0.600

0 12 18 24 36 42 48 60 66 72 84

UD

A

TIEMPO (h)

EPAZOTE

E1 E2 E3

27

0.000

0.169

0.009

-0.100

-0.050

0.000

0.050

0.100

0.150

0.200

0.250

0.300

0.350

0.400

0 12 18 24 36 42 48 60 66 72 84

UD

A

TIEMPO (h)

ESTAFIATE

Es1 Es2 Es3

28

0.942

0.330

0.498

-0.400

-0.200

0.000

0.200

0.400

0.600

0.800

1.000

1.200

1.400

1.600

0 12 18 24 36 42 48 60 66 72 84

UD

A

TIEMPO (h)

HUIZACHE

H1 H2 H3

29

0.010

0.222

0.059

0.590

-0.200

-0.100

0.000

0.100

0.200

0.300

0.400

0.500

0.600

0.700

0.800

0.900

0 12 18 24 36 42 48 60 66 72 84

UD

A

TIEMPO (h)

CINÉTICA DE CRECIMIENTO DE Cmm

TESTIGOS GOBERNADORA EPAZOTE ESTAFIATE HUIZACHE

*p<0.05 Se presento diferencia estadísticamente significativa del T48 a T84

con respecto a los testigos.

TIEMPO TESTIGOS GOBERNADORA EPAZOTE ESTAFIATE HUIZACHE

T0 0.000 ± 0.000 0.000 ± 0.000 0.009 ± 0.007 0.000 ± 0.000 0.000 ± 0.000

T12 0.000 ± 0.000 0.012 ± 0.012 0.045 ± 0.011* 0.000 ± 0.000 0.000 ± 0.000

T18 0.005 ± 0.006 0.024 ± 0.007 0.080 ± 0.008 0.062 ± 0.107 0.091 ± 0.079

T24 0.059 ± 0.072 0.035 ± 0.004 0.104 ± 0.014 0.096 ± 0.166 0.439 ± 0.159*

T36 0.244 ± 0.043 0.240 ± 0.012 0.240 ± 0.012 0.105 ± 0.181 0.657 ± 0.039*

T42 0.298 ± 0.051 0.338± 0.040 0.338 ± 0.040 0.111 ± 0.191 0.657 ± 0.318

T48 0.283 ± 0.054 0.411 ± 0.050* 0.397 ± 0.046* 0.106 ± 0.183 0.703 ± 0.303*

T60 0.200 ± 0.045 0.386 ± 0.121* 0.337± 0.048* 0.092 ± 0.159 0.747 ± 0.333*

T66 0.132 ± 0.040 0.324 ± 0.103* 0.287 ± 0.060* 0.080 ± 0.139 0.758 ± 0.437*

T72 0.094 ± 0.008 0.278 ± 0.076* 0.244 ± 0.058* 0.077 ± 0.119 0.685 ± 0.396*

T84 0.010 ± 0.017 0.222 ± 0.068* 0222 ± 0.068* 0.059 ± 0.095 0.590 ± 0.316*30

TABLA 5. PROMEDIOS Y DESVIACIÓN ESTÁNDAR (DOSIS 2)

31

0.601

0.686

0.694

0.566

0.489

0.652

0.000

0.100

0.200

0.300

0.400

0.500

0.600

0.700

0.800

0.900

1.000

0 12 24 36 48 60

UD

A

TIEMPO (h)

CINÉTICA DE CRECIMIENTO DE Cmm

TESTIGOS GOBERNADORA LECHUGUILLA EPAZOTE ESTAFIATE HUIZACHE

TIEMPOS TESTIGOS GOBERNADORA EPAZOTE LECHUGUILLA HUIZACHE ESTAFIATE

T 0 0.187±0.208 0.004±0.0040 0.187±0.105 0.114±0.0839 0.163±0.1092 0.115±0.0228

T12 0.367±0.0262 0.198±0.0298* 0.305±0.00089* 0.028±0.0008* 0.110±0.0019* 0.035±0.0011*

T24 0.304±0.0253 0.420±0.1100 0.289±0.0379 0.285±0.5928 0.431±0.0392* 0.014±0.0248*

T36 0.633±0.0113 0.535±0.0212* 0.512±0.0537* 0.476±0.0944* 0.611±0.1230 0.157±0.0923*

T48 0.606±0.1417 0.526±0.0470 0.434±0.0853 0.490±0.0285 0.698±0.2241 0.369±0.0112

T60 0.734±0.0175 0.593±0.0213* 0.504±0.0477* 0.602±0.0265* 0.575±0.0922* 0.438±0.0119*

T72 0.601±0.1240 0.686±0.0192 0.566±0.0100 0.694±0.0001 0.652±0.00015 0.489±0.0581

*p<0.05De las 12 a 36 horas, en todos los extractos hubo diferencias significativas con respecto de los

testigos, de igual manera a las 60 horas

TABLA 6. PROMEDIOS Y DESVIACIÓN ESTÁNDAR (DOSIS 1)

En los tratamientos de estafiate se logró observar que obtuvo mayor inhibición

del crecimiento de la bacteria Cmm en comparación con los testigo,

teniéndose en la mayoría del tiempo(T48 a T84) evaluado control sobre la

bacteria eso en la dosis usada 2, en cambio en la dosis 1(T12 a T36).

En la dosis 1 el epazote obtuvo mayor inhibición con respecto a la dosis 2,

aunque el tratamiento de estafiate es el que tuvo más inhibición con respecto a

los testigos.

En la dosis 2 no se utilizo tratamiento de lechuguilla debido a que presentabasaponificación lo que impedía la toma de lecturas.

33

Los extractos etanólicos de Estafiate y gobernadora demostraron

un control al desarrollo del microorganismo a ciertos tiempos,

dichos extractos representan una alternativa como medio de

control natural, que tienen la posibilidad de sustituir a los

tratamientos químicos, ya que sus compuestos biológicamente

activos podrían producir resistencia a la planta, lo que produce

una reducción del desarrollo de la bacteria.

34

Se seguirá trabajando con otras dosis y otros métodos para evaluar la inhibición

del Cmm.

Se evaluara con otra metodología con la lechuguilla debido a que en estás

pruebas presentaba saponificación e impedía la lectura.

Se buscara probar in vivo en plantas infectadas para ver si estas platas

evaluadas ayudan a controlar el cáncer bacteriano.

Se pretende realizar un estudio de dosificación repetida para ver si la inhibición

presente una mejor inhibición sobre Cmm.

35

36

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37