Técnicas de hibridación

Concepto, modalidades

y tipos de sondas

Aplicaciones principales

Federico Rojo

Fundación Jiménez Díaz

• Alteraciones estructurales del DNA y

cáncer

• Hibridación in situ: concepto y tipos de

sondas

• Aplicaciones: diagnóstico, pronóstico y

predicción

• Tres ejemplos de estudio de traslocaciones

y de alteraciones numéricas

Guión de la presentación

• Alteraciones estructurales del DNA y

cáncer

• Hibridación in situ: concepto y tipos de

sondas

• Aplicaciones: diagnóstico, pronóstico y

predicción

• Tres ejemplos de estudio de traslocaciones

y de alteraciones numéricas

Guión de la presentación

Chromosome

Proto-oncogene / Supressor gene

Cell extrinsic mechanisms:

• Radiation

• Topoisomerase inhibitors

• Oxidative stress

• Toxic agents

• Viruses

Cell intrinsic mechanisms:

• Aberrant DNA-repair mechanisms

• Non-canonical DNA

• Fragile sites

• Transcriptional stress

Alteraciones estructurales del DNA en cáncer

Chromosome

Proto-oncogene / Supressor gene

Point mutation Gene gain,

amplification

Local rearrangement

Deletion

Local rearrangement

Inversion

Chromosomal translocation

Balanced

translocation

Unbalanced

translocation

Isochromosome,

ring chromosome

Holland, AJ & Cleveland, DW. Nat Med 2012

Alteraciones estructurales del DNA en cáncer

• Alteraciones estructurales del DNA y

cáncer

• Hibridación in situ: concepto y tipos de

sondas

• Aplicaciones: diagnóstico, pronóstico y

predicción

• Tres ejemplos de estudio de traslocaciones

y de alteraciones numéricas

Guión de la presentación

Concepto de la hibridación in situ

Hibridación con sondas radiactivas (John, 1969)

Hibridación fluorescente (Pinkel, 1986) para marcado de cromosomas y de

cambios en genes

La base de las técnicas de

hibridación de DNA

Estrategias para el estudio de alteraciones

cromosómicas:

Hibridación in situ de DNA

1. Desnaturalización de las sondas de DNA

2. Desnaturalización del molde de DNA

(cromosoma)

3. Annealing (renaturalización, hibridación de

las pruebas)

4. Lavado de posthibridación, astringencia

(SCC, formamida)

5. Contratinción de los núcleos (DAPI, PI)

Hibridación in situ de fluorescencia

Sondas específicas de locus, centroméricas y

teloméricas

Normal

Abnormal

Centromeric probes Gene-specific probes

Telomeric probes

Sondas de fusión (fusion-probes) y de

separación (break-apart / split-probes)

Hoff, K et al. Anat Pathol 2010

Rhodamine

/ Texas red-

labeled

DNA probe

FITC-

labeled

DNA

probe

Anti-Texas

red

conjugated

with AP

Anti-FITC

conjugated

with HRP

Chromogenic

detection

Chromogenic

detection

Texas

red-

labeled

DNA

probe

FITC-

labeled

DNA

probe

DNP-

labeled

DNA

probe

DNP-

labeled

DNA

probe

Anti-DNP

conjugated

with HRP

Anti-DNP

conjugated

with AP

Silver

acetate

detection

Chromogenic

detection

FISH CISH SISH

Estrategias para el estudio de alteraciones

cromosómicas: Hibridación in situ

Estrategias para el estudio de alteraciones

cromosómicas: Hibridación in situ de DNA

Aplicaciones

• Detección de aneuploidia

• Análisis de centrómeros

• Estudio de cromosomas

• Análisis de genoma completo (pintado

cromosómico)

• Identificación de traslocaciones

• Detección de genes

• Estudio de microdeleciones

• Determinación de amplificación y

deleción génica

• Cromosomas en metafase

• Núcleos en interfase

• Tejidos fijados

• Células en cultivo

Estrategias para el estudio de alteraciones

cromosómicas:

Hibridación in situ de RNA (mRNA y miRNA)

Estrategias para el estudio de

alteraciones cromosómicas:

Cariotipo espectral, m-FISH

5

1

1

2

3

X

5

13

6 6

14

9

X

9

9

X

9

9

X

9

15

12

7

5

13

6

14

der(1)t(1;5)

B6-15 B6-1, B6-15

der(2)t(1;2) der(3)t(X;3)

HT29, C7-1, C7-15 HT29, C7-1, C7-15

der(5)t(5;13)

HT29, C7-1, C7-15

der(6)t(6;14)

B6-1, B6-15

der(6)t(X;6;9)

ins(X;9)

HT29 C7-15

der(9)t(X;6;9) der(12)t(7;12)

B6-15 HT29, C7-1

der(13)t(5;13)

HT29, C7-1, C7-15

der(14)t(6;14)

C7-1, C7-15

dup(19p)

- muestra cambios del número de copias de secuencias de DNA (pérdidas, ganancias y amplificaciones),

pero no detecta traslocaciones balanceadas.

- puede utilizarse tanto tejido fresco como fijado en formol y su sensibilidad es afectada por el porcentaje

de células tumorales de la muestra.

Estrategias para el estudio de

alteraciones cromosómicas:

Hibridación Genómica Comparada (CGH)

Estrategias para el estudio de

alteraciones cromosómicas:

Hibridación Genómica Comparada (CGH)

• Alteraciones estructurales del DNA y

cáncer

• Hibridación in situ: concepto y tipos de

sondas

• Aplicaciones: diagnóstico, pronóstico y

predicción

• Tres ejemplos de estudio de traslocaciones

y de alteraciones numéricas

Guión de la presentación

Traslocaciones en procesos linfoproliferativos

Jain, S et al. Int J Clin Exp Pathol 2010

Traslocaciones en sarcomas

Síndromes hereditarios asociados a sarcomas

en edad pediátrica

Slater, O & Shipley, J. J Clin Pathol 2007

• Alteraciones estructurales del DNA y

cáncer

• Hibridación in situ: concepto y tipos de

sondas

• Aplicaciones: diagnóstico, pronóstico y

predicción

• Tres ejemplos de estudio de traslocaciones

y de alteraciones numéricas

Guión de la presentación

Sarcoma sinovial:

Traslocación (X;18)(p11;q11)

Sarcoma sinovial:

Traslocación (X;18)(p11;q11)

Chromosome 18

Chromosome X

Before translocation After translocation

Jefferson T, D Mol Pathol, 2005

Sarcoma sinovial:

Traslocación (X;18)(p11;q11)

•Los productos de fusión SYT-SSXn

actúan como proteínas nucleares

reguladoras de la expresión génica

pero carecen de dominio de unión a

DNA

Sarcoma sinovial:

Traslocación (X;18)(p11;q11)

Amary, MFC et al. Mod Pathol 2007

Sarcoma sinovial:

Traslocación (X;18)(p11;q11)

Normal

Abnormal

SYT 3’

SYT 5’

Oxnard, GR et al. J Clin Oncol 2013

Targetable genes in NSCLC

Doebele RC et al. Clin Cancer Res 2012

Traslocación de ALK en cáncer de pulmón

Doebele RC et al. Clin Cancer Res 2012

Traslocación de ALK en cáncer de pulmón

Traslocación de ALK en cáncer de pulmón

Lindeman, NI et al. Arch Pathol Lab Med. 2013

- Evaluación de > 50 células

- Separación de señales: la distancia entre ambas equivale al diámetro de

una señal o se detecta únicamente la señal 3’

- > 15% de las células con alteración

ALK-3’

ALK-5’

Gerami, P et al. Am J Surg Pathol 2009

Bastian, BC et al. Am J Pathol 2003

Bastian, BC et al. Cancer Res 1998

Utilidad del FISH en el diagnóstico diferencial en lesiones melánicas cutáneas

North, JP et al. Am J Surg Pathol 2014

Utilidad del FISH en el diagnóstico diferencial en lesiones melánicas cutáneas

RREB1

CCND1

MYB

CEP6

Utilidad del FISH en el diagnóstico diferencial en lesiones melánicas cutáneas

Nú

me

ro d

e c

élu

las

Número de señales por núcleo

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 1 2 3 4 5

CEP6

MYB

REBB1

CCDN1

% núcleos con incremento del gen RREB1:

% núcleos con ganancia relativa del gen RREB1:

% núcleos con incremento del gen CCND1:

% núcleos con pérdida relativa del gen MYB:

57% (> 29%)

73% (> 55%)

6% (> 38%)

55% (> 40%)

Utilidad del FISH en el diagnóstico diferencial en lesiones melánicas cutáneas

Mensajes finales

Las técnicas de hibridación in situ permiten

determinar alteraciones estructurales del

DNA (y el estudio de RNA)

Utilidad diagnóstica, pronóstica y predictiva

de respuesta