Métodos de determinación del virus del papiloma

humano (HPV) en cribado de cáncer de cérvix

Beatriz Bellosillo Servicio de Anatomía Patológica

Hospital del Mar, Barcelona

Virus del Papiloma Humano- HPV

– El virus del Papiloma pertenece a

un grupo diverso de virus DNA

– infectan a piel y a membranas

mucosas de humanos y una

variedad de animales

– cerca de 150 tipos de papilomavirus

afectan a humanos

– 40 de ellos se localizan en el tracto

ano-genital, y pueden ser:

• alto riesgo

• bajo riesgo

•El HPV se infecta por transmisión sexual, un 80% de las

mujeres podrían haber sido infectadas por al menos un

tipo de HPV antes de cumplir los 50 años

•A menudo no se observan síntomas, especialmente en el

caso de HPV de alto riesgo

•Mayoría de las infecciones de HPV son transitorias y

asintomáticas y se solucionan sin tratamiento. El 91/%

puede revertirse en dos años

•Otras permanecen en estado latente durante largos

periodos

•La mujeres con riesgo de cancer de cérvix son aquellas

en las que persiste la infección de un HPV de alto riesgo

(HR)

Virus del Papiloma Humano- HPV

Clasificación de ensayos para determinación de HPV

Hibridación de ácidos nucleicos

Hibridación + Amplificación de señal

Amplificación de ácidos nucleicos

Southern Blot Hibridación in situ Hibridación dot blot

PCR PCR-RFLP PCR en tiempo real Secuenciación Microarray COBAS®4800 Abbott real time PapilloCheck® CLART HPV 2® INNO-LiPA® Linear Array® MCHA® PreTect®Proofer APTIMA®HPV Assay FlowChip®

Ensayos aprobados por la FDA para determinación de HPV

Hybrid Capture®2 (hc2) Cervista®HPV

Clasificación de ensayos para determinación de HPV

Hibridación de ácidos nucleicos

Hibridación + Amplificación de señal

Amplificación de ácidos nucleicos

Southern Blot Hibridación in situ Hibridación dot blot

Hybrid Capture®2 (hc2) Cervista®HPV

PCR PCR-RFLP PCR en tiempo real Secuenciación Microarray COBAS®4800 Abbott real time PapilloCheck® CLART HPV 2® INNO-LiPA® Linear Array® MCHA® PreTect®Proofer APTIMA®HPV Assay FlowChip®

Ensayos aprobados por la FDA para determinación de HPV

Clasificación de ensayos para determinación de HPV

Hibridación de ácidos nucleicos

Hibridación + Amplificación de señal

Amplificación de ácidos nucleicos

Southern Blot Hibridación in situ Hibridación dot blot

PCR PCR-RFLP PCR en tiempo real Secuenciación Microarray COBAS®4800 Abbott real time PapilloCheck® CLART HPV 2® INNO-LiPA® Linear Array® MCHA® PreTect®Proofer APTIMA®HPV Assay FlowChip®

Ensayos aprobados por la FDA para determinación de HPV

Hybrid Capture®2 (hc2) Cervista®HPV

Hybrid Capture®2 (hc2)

Formación de hídridos DNA-RNA

DNA de HPV

Unión de sondas de RNA que hibridan con DNA de HPV

Unión de Ac que reconocen los híbridos DNA- RNA

Unión de Ac secundario

Emisión de luz

Test Cervista™ HPV HR

Resumen del Flujo de trabajo

Botón celular Extracción Agencourt

Incubación Leer & Analizar

Preparación de la Reacción

MAGNET

Alícuota 2ml de muestra desde el Vial

Cervista®HPV

Clasificación de ensayos para determinación de HPV

Hibridación de ácidos nucleicos

Amplificación de señal

Amplificación de ácidos nucleicos

Southern Blot Hibridación in situ Hibridación dot blot

Hybrid Capture®2 (hc2) Cervista®HPV

PCR PCR-RFLP PCR en tiempo real Secuenciación Microarray COBAS®4800 Abbott real time PapilloCheck® CLART HPV 2® INNO-LiPA® Linear Array® MCHA® PreTect®Proofer APTIMA®HPV Assay FlowChip®

La reacción en cadena de la polimerasa

• Amplificación de secuencias específicas de DNA

• Diseño de dos oligonucleótidos “primers”

complementarios a los extremos del fragmento

a amplificar y que actúan como cebadores de la

reacción

1- Desnaturalización

94ºC-96ºC

2- Hibridación

55ºC-70ºC

3- Extensión

72ºC

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Original DNA target region

Thermal cycle Thermal cycle Thermal cycle

En 32 ciclos, al 100% de eficiencia, se crean

1.07 billones de copias del ADN de interés

Detección de HPV mediante PCR

tubo

microarray

CLART® HPV2

FLOWCHIP®

cobas® 4800

cobas x 480

Equipo para la extracción de ácidos nucléicos

cobas z 480

PCR en tiempo real

Configuración

cobas® 4800

Kit multiplex cualitativo en un único tubo para la detección simultánea de14 genotipos de alto riesgo e identificación de los tipos 16 & 18 de HPV con ß-globina como control interno

4 canales de detección para medir los diferentes objetivos

– Canal 1 = panel AR HPV l (12 de 14 tipos de alto riesgo

– Canal 2 = HPV genotipo 16

– Canal 3 = HPV genotipo 18

– Canal 4 = beta-globin

Diferentes tipos de muestra

– PreservCyt

– cobas® PCR media

HR 16 18 Cont

Ch1 Ch2 Ch3 Ch4

HR

GT

18

HPV

GT

16

GT

18

High

Risk

Panel

31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68

APTIMA®HPV Assay

HPV assay

Targeted HPV

genotypes

Detection technology

DNA/RNA,

target HPV

gene

Controls Certificates

Hybrid Capture 2

13 HR Sandwich capture

molecular

DNA,

whole

genome

Batch control for

process

FDA, IVD, CE

Cervista 14 HR Signal amplification DNA,

whole

genome

Sample by sample

Reaction HIST2H2BE

for sample sufficiency

FDA, IVD, CE

CLART

13 HR + 22 LR Polymerase chain

reaction/

DNA, L1

Sample by sample

hCFTR microarray

gene for

sample sufficiency

IVD, CE

Flow CHIP 18 HR + 18 LR PCR + dot blot DNA Sample by sample

housekeeping gene

for sample sufficiency

IVD, CE

Cobas

14 HR Real-time polymerase

chain

DNA, L1

Sample by sample

reaction b-globin for

sample

sufficiency

FDA, IVD, CE

APTIMA

14 HR MMLV reverse

transcriptase and T7

RNA polymerase

mediated amplification

RNA,

E6/E7

Spiked control for

sample process

validity

FDA, IVD, CE

5064 muestras- 33.2% positivas con ≥ 1 técnica (41% positivas con los 4 ensayos). Menos concordancia en : Mujeres mayores (>30 años): 30% vs 49%

Muestras cribado primario (29%) vs muestras de seguimiento (38%) Citología normal (22%) vs mujeres con citología anormal (68%)

Rebolj et al, PLOS One, January 2014

Elección de los ensayos de detección de HPV – requisitos a considerar

- Sensibilidad clínica adecuada

- Controles internos (evitar falsos negativos)

- Procesamiento de elevado número de muestras

- Automatizable

- Tiempos de respuesta adecuados

- Genotipado – no es imprescindible en estos momentos

Servei de Patologia

Francesc Alameda Belén Lloveras

Mercè Muset Sergi Serrano