SEPARACIÓN DE BIOMOLÉCULASAISLAMIENTO

PURIFICACIÓNCARACTERIZACIÓN

PRIMER PASO:SOLUBILIZACIÓN o EXTRACCIÓN DE LA

MOLÉCULA DE INTERÉS

RUPTURA MECÁNICA*trituración

*homogeneizador *uso de Prensa French

*Sonicador

Estrategia general de purificación

Solubilidad SALTING IN SALTING OUT

Carga Iónica Cromatografía de Intercambio Iónico

ElectroforesisIsoelectroenfoque

Polaridad Cromatografía de adsorciónCromatografía en papelCromatografía de interacción

hidrofóbica

Tamaño Molecular Diálisis Electroforesis en gelCromatografía de filtración por

gelesUltracentrifugación

Especificidad de unión Cromatografía de afinidad

La solubilidad de las proteínas depende de la concentración de sales disueltas, la polaridad del solvente,

el pH y la temperatura

SEPARACIONES CROMATOGRÁFICAS

chroma color graphein escribir

La mezcla de sustancias a fraccionar se disuelven en un fluído líquido o gaseoso denominado FASE

MÓVIL.

La solución resultante se filtra a través de una matriz sólida porosa denominada FASE ESTACIONARIA

Cromatografía de intercambio iónico

Los iones unidos en forma electrostática a una matríz insoluble y químicamente inerte se reemplazan de manera reversible por los iones de la solución

R+A- + B- R+B- + A-

Cromatografía de exclusión molecular

Polaridad Cromatografía de adsorciónCromatografía en papel

Cromatografía de afinidad

ELECTROFORESIS

Migración de iones en un campo eléctrico

La migración es proporcional a su densidad de carga, tamaño y forma

MATRICES USADAS

AGAROSAPOLIACRILAMIDA

PROTEÍNA AISLADA

•ENSAYO ESPECÌFICO Enzima: medición de la velocidad de

formación de un producto es proporcional a la cantidad de enzima presente

REACCIONES COLOREADAS, FLUORESCENTES O REACCIONES ACOPLADAS

Proteínas (no enzimas): procedimientos inmunoquímicos (RIA, ELISA, WESTERN BLOT)

ULTRACENTRIFUGACIÓN EN GRADIENTE

Fsedimentación= m2r-Vp2r

m masa velocidad angularr distancia de un puntoVp volumen de la partícula

Densidad de la solución

Cuando

Fsedimentación= Ffricción

S= v = M (1- Vp )

2r Nfdonde s es el coeficiente de sedimentación

Por lo tanto, la masa de una partícula puede determinarse a partir de su coeficiente de sedimentación

m= M/N