Solubilización de fósforo por parte de Lysinibacillus sphaericus en un fragmento de suelo en los Llanos orientales, Colombia.

Juanita von Rothkirch Gómez y Jenny Dussán.

Centro de Investigaciones Microbiológicas - CIMIC. Universidad de los Andes.

Resumen.

La biodisponibilidad de fósforo en suelos ácidos, en ausencia de uso de fertilizantes, aún es un reto. En las últimas décadas, sin embargo, diferentes cepas bacterianas han sido propuestas como la mejor alternativa ecológica para la solubilización de fósforo en los suelos y, consecuentemente, para fortalecer el crecimiento vegetal. En este estudio, evaluamos el potencial de solubilización de fósforo de cuatro cepas de Lysinibacillus sphaericus, un microorganismo usado en biorremediación de contaminantes provenientes del crudo, y lo comparamos con Bacillus cereus, Bacillus licheniformis y Serratia sp. La actividad solubilizante de fósforo de las cepas fue estimada inicialmente en un medio líquido, empleando fosfato dicálcico como la única fuente de fósforo. La actividad también fue medida en un ensayo de invernadero, empleando plantas de Canavalia ensiformis que fueron inoculadas con las mezclas bacterianas. Un ensayo colorimétrico realizado en el medio liquido mostró que solo Serratia sp. y B. cereus producen ácidos orgánicos que liberan fósforo biodisponible. Cuantificaciones espectrofotométricas de la solubilización de fósforo mostraron que los mecanismos de solubilización de fósforo de L. sphaericus no involucran producción de ácidos orgánicos pero pueden permanecer más tiempo en el suelo en comparación a Serratia sp. Ensayos de campo también demostraron que L. sphaericus promueve el crecimiento vegetal cuando es adicionado. Este estudio sugiere que L.sphaericus puede ser usado como una alternativa para la solubilización de fósforo en suelos ácidos y/o contaminados con hidrocarburos que a su vez sean deficientes en fósforo biodisponible.

Abstract.

Phosphate bioavailability in the absence of fertilizers remains a challenge in acid soils. In the last decades however, strains from different genera of bacteria have been proposed as the best eco- friendly alternative for phosphorus solubilization and thus growth enhancement. We evaluated the phosphate-solubilizing potential of four strains of Lysinibacillus sphaericus, a microorganism used in bioremediation of crude oil pollutants, and compared them to Bacillus cereus, Bacillus licheniformis and Serratia sp. The phosphate-solubilizing activity of the strains was first estimated in a liquid medium using dicalcium phosphate as a sole phosphorus source. The activity was also measured in a greenhouse and a field trial with plants of Canavalia ensiformis inoculated with bacteria mixes. A colorimetric assay made in the liquid medium showed that only Serratia sp. and B. cereus produce organic acids that release bioavailable phosphorus. Spectrophotometric

quantification of phosphate solubilization showed that L. sphaericus mechanisms of phosphorus solubilization are not related to organic acids release but may persist longer in acid soils compared to Serratia sp. Field trials also revealed that L. sphaericus enhances plant growth when it is added. This study suggests that L. sphaericus might be used as a phosphorus-solubilizing alternative in acid and/or hydrocarbon contaminated soils that are deficient in bioavailable phosphorus.

Palabras clave: Lysinibacillys sphaericus, bacterias solubilizadoras de fósforo, biorremediación de crudo, suelo tropical, Canavalia ensiformis.

Introducción.

La mayor acumulación de fósforo se encuentra en rocas sedimentarias de origen marítimo, cuyo desgaste gradual o meteorización, añade el elemento al suelo. La única forma de fósforo inorgánico de importancia biológica es el fosfato (PO4) que las plantas absorben, incorporan a sus moléculas biológicas y después transfieren al ser ingeridas por consumidores. El fosfato vuelve al suelo o al agua por medio de la excreción animal o la descomposición de biomasa (Campbell & Reece, 2007). La alta estabilidad del fósforo, que no se encuentra de manera importante en fase gaseosa, resulta en una baja solubilidad, puesto que cantidades importantes del mismo quedan inmovilizadas al formar derivados con hierro, aluminio, calcio y otros. Así, aunque el contenido de fósforo en el suelo es de aproximadamente 0,05%, en promedio solo 0,1% del fósforo total está disponible para ser usado por la vegetación (Illmer & Schinner, 1995. Kucey, 1983).

El fósforo es un nutriente esencial para el crecimiento de las plantas. Dado que hace parte del material genético y del enlace fosfodiéster, involucrado en las reacciones de transferencia de energía, este nutriente participa en la división y crecimiento celular, fotosíntesis, almacenamiento de energía y otros procesos celulares, afectando el desarrollo de los diferentes órganos de las plantas y en consecuencia la productividad y calidad de cultivos (White & Hammond, 2008; Khan et al, 2009; FIFA, 2006). Por su distribución generalizada en las células, las plantas pueden concentrar hasta 100 mg/L de fósforo en la savia y acumular cerca de 4000 mg/Kg en sus semillas (White & Hammond,

2008). Las plantas toman el fósforo en forma de los iones de ortofosfato H2PO4- y

HPO42-, cuya disponibilidad varía en gran medida de acuerdo al pH del suelo.

En suelos ácidos el fósforo forma compuestos insolubles con hierro, manganeso y aluminio y en suelos alcalinos forma compuestos con calcio y magnesio (FIFA, 2006). Dado que los fosfatos de hierro, manganeso y aluminio no son solubles en agua, estos compuestos no están disponibles para el uso por parte de los plantas, lo cual implica que así haya abundancia de fósforo en el suelo, éste no es liberado (Thomason, 2002).

Esta es una de las muchas razones por la que los suelos ácidos constituyen uno de los limitantes más importantes para la producción agrícola alrededor del mundo. Aproximadamente el 50% de las tierras potencialmente cultivables son ácidas, por lo cual la producción de granos y otras plantas para el consumo humano o animal se ve limitada (Kochian et al, 2006). Se estima que alrededor del 55% de la adquisición de fósforo de plantas en bosques es realizada a partir de este reciclaje a partir de residuos de plantas. Dado que muchas de las tierras ácidas potencialmente cultivables no tienen una buena cobertura de materia orgánica, el reciclaje de fósforo se ve limitado; especialmente en los trópicos donde hay menor disponibilidad de fósforo inorgánico y hay una mayor actividad biológica (White & Hammond, 2008).

Por ello, considerando que el ciclo biológico del fósforo normalmente es insuficiente para suplir el nutriente en los cultivos, generalmente se usan grandes cantidades de fertilizantes en búsqueda de superar el problema de inmovilización del fósforo. Dependiendo del suelo, los requerimientos pueden ser hasta de 300 Kg/ha en suelos volcánicos o tropicales, que además constituyen las zonas con mayores limitantes económicas del mundo (White & Hammond, 2008). La gran acumulación de fósforo inorgánico en el suelo y el lavado de nutrientes causa impactos ambientales sobre los recursos terrestres, marinos y dulceacuícolas (Tilman et al, 2009), como expansión en la distribución de algas, pérdida de fertilidad a largo plazo y daño de las comunidades bacterianas de los suelos (Sharma et al, 2013).

Sin embargo, dado que los microorganismos son un componente esencial del ciclo del fósforo, puesto que son capaces de transformarlo entre sus diferentes estados, constituyen una alternativa al uso extensivo de fertilizantes. Muchos hongos y bacterias solubilizadores de fosfato convierten fósforo inorgánico y orgánico a formas biodisponibles a partir de diferentes mecanismos de solubilización y mineralización. La proporción de bacterias que tienen mecanismos de solubilización puede llegar a ser hasta del 0,5% de la población bacteriana total del suelo (Kucey, 1983). Actinomycetes, Pseudomonas, Bacillus, Rhizobium, Rhodococcus, Arthrobacter, Serratia y Enterobacter junto con los hongos Penicillium y Aspergillus han sido reportados como solubilizadores importantes, muchos de los cuales se encuentran naturalmente en la rizósfera (Mohammadi, 2012; Whitelaw, 1999; Bobadilla & Rincón 2008).

Estos microorganismos emplean diferentes vías metabólicas para solubilizar el fósforo inorgánico. El mecanismo mejor conocido consiste en la excreción de ácidos orgánicos como los ácidos cítrico, oxálico, glucónico, succínico y otros, que disminuyen el pH de la rizosfera (Chen et al, 2006) y actúan como agentes quelantes de hierro y alumino (Whitelaw, 1999., He et al, 2002). La quelación consiste en la formación de enlaces entre un ligando (generalmente un grupo carboxilo o hidroxilo) y un ión metálico, formando un nuevo complejo y liberando el fósforo (Whitelaw, 1999). Desde hace dos décadas se ha probado que la oxidación de glucosa a ácido glucónico es un mecanismo importante en la solubilización de fosfato mineral por parte de bacterias Gram negativas, reacción que es llevada a cabo por la enzima glucosa deshidrogenasa (GDH) y el cofactor Pirroloquinolina quinona (PQQ) (Rodríguez et al, 2006). Sin embargo, otras formas de movilización y

solubilización del fósforo son realizadas por mecanismos diferentes a la liberación de ácidos.

Los mecanismos bacterianos involucrados en la solubilización de fósforo inorgánico son complejos y diversos: los genes mps de Erwinia herbicola y gabY de Pseudomonas cepacia, producen ácido glucónico empleando la GDH y la PQQ; el gen pKG3791 de Serratia marcensens, y el pK1M10 de Rahnella aquatilis, producen ácido glucónico por vías alternas; el gen pcc de Synechococcus, hace la solubilización por medio de la enzima fosfoenolpiruvato carboxilasa; por otro lado, el gen PKKY de Enterobacter agglomerans, solubiliza el fósforo inorgánico sin producir cambio de pH en el medio (Rodriguez et al, 2006). También se ha probado que muchos rizobios, de los nódulos de leguminosas, pueden movilizar fósforo de fuentes orgánicas e inorgánicas (Alikhani, 2007). El panorama es tan diverso que incluso en los casos donde hay secreción de ácidos, se duda que sea el único mecanismo involucrado, dado que no hay una correlación directa entre la cantidad de fósforo solubilizado y las concentraciones de ácidos orgánicos (Illmer & Schinner, 1995). Sin embargo, este hecho también podría ser causado por efectos calcáreos de la roca o la producción de otros metabolitos por parte de las bacterias (Kucey, 1983).

Además de tener un rol esencial en la liberación de fosfatos de fuentes inorgánicas, los microorganismos también liberan el compuesto a partir de fuentes orgánicas. Los fitatos son la forma más abundante de fósforo orgánico en el suelo y no pueden ser tomados directamente por las plantas, ya que forman complejos químicos con otros compuestos del suelo (Singh & Satyanarayana, 2011).

Por ello, los microorganismos secretan fosfatasas como fitasas, fosfatasas ácidas o alcalinas y liasas C-P. Las fosfatasas ácidas realizan la desfosforilación de enlaces fosfodiéster o fosfoanhidrido, liberando fosfatos inorgánicos de nucleótidos, algunos azúcares y ATP. Las fitasas, causan la liberación de fósforo a partir del ácido fítico o fitato, componente mayoritario de formas orgánicas de fósforo del suelo; y las fosfonatasas y liasas C- P, clivan enlaces C-P en organofosfatos (Fernández & Rodríguez, 2005). Varios genes que codifican para fosfatasas han sido aislados y caracterizados, como el gen acp A de Francisella tularensis, PhoC y NapA de Morganella morganii, napD y napE de Rhizobium meliloti, phy de Bacillus sp y appA y appA2 de E coli (Rodríguez et al, 2006).

Los suelos del este de los Andes en Colombia, son normalmente ultisoles y oxisoles, es decir tierras normalmente lixiviadas y ácidas (Rivera, 2001). En gran parte de los Llanos orientales predominan las sabanas, ecosistemas con poca vegetación y suelos arcillosos y resecos que favorecen la generación de incendios y el lavado de nutrientes de los estratos superiores (Mora Camargo, s.f). Por otro lado, esta zona es el área más importante de extracción petrolera en Colombia, siendo el Meta, Casanare y Arauca los departamentos con mayor producción de crudo (Revista Dinero, 2012). Sin embargo, ha sido declarada como una de las zonas con mayor potencial para la agricultura, por lo que se espera que en el futuro aumenten los cultivos de alimentos. Por ello, aunque los suelos del lugar se caracterizan por tener una alta acidez y problemas de contaminación con

residuos petroleros, después de aplicar correctivos la tierra puede ser fuente de productos agropecuarios.

Los microorganismos, entonces, se presentan como de un mecanismo viable para eliminar contaminantes y mejorar suelos, puesto que son una alternativa sostenible y de bajo costo. Lysinibacillus sphaericus ha sido una bacteria ampliamente estudiada como una opción para eliminar contaminaciones por petróleo, puesto que tiene rutas de metabolismo de hidrocarburos aromáticos que permiten la degradación de crudos aceitosos (Manchola & Dussán, 2014). Por otro lado, se ha visto que numerosas cepas de L. sphaericus pueden ser utilizadas para la biorremediación de metales pesados (Lozano & Dussán, 2013. Peña-Montenegro & Dussán, 2013). Todo ello, con la ventaja de que L. sphaericus es un microorganismo esporulado, lo cual le confiere la habilidad de persistir en el ambiente por tiempos prolongados. De esta forma, los residuos de hidrocarburos pueden ser tratados por medio de procesos de biorremediación, con microorganismos, y fitorremediación, con plantas de rápido crecimiento como Canavalia ensiformis. Sin embargo ninguno de estos dos procesos ayuda a incorporar nutrientes como el fósforo a la tierra. Por lo tanto, el presente estudio desea explorar si L. sphaericus actúa como bacteria solubilizadora de fósforo y, por tanto, podría ser usada en un consorcio bacteriano tanto para degradar crudos aceitosos como para mejorar los suelos de una región de los Llanos Prientales. En consecuencia, este estudio explora la capacidad solubilizadora de fósforo inorgánico por parte de un consorcio de cepas de L. sphaericus, comparándolo con un consorcio de Bacillus cereus y Bacillus licheniformis y un tratamiento de Serratia sp (microorganismos ampliamente reportados como solubilizadores de fosafatos), como parte de un proceso de biorremediación, fitorremediación y mejoramiento de un suelo ácido contaminado con hidrocarburos y metales pesados.

Materiales y Métodos.

Microorganismos y condiciones de cultivo.

La capacidad de solubilización de fósforo mineral fue evaluada en los siguientes microorganismos: cuatro cepas de L. sphaericus OT4b.25, OT4b.31, III(3)7 y CBAM.5, B. cereus y B. licheniformis. Serratia sp. fue elegida como control positivo de todos los ensayos (Tabla 1). Cada uno de los microorganismos fue activado en medio de agar nutritivo durante 48 horas a 30ºC.

Tabla 1. Los microorganismos que fueron evaluados corresponden a cuatro cepas de L. sphaericus y dos Bacillus, los cuales provienen de diversas fuentes de origen.

Búsqueda de genes asociados al metabolismo del fósforo.

Se realizó una búsqueda de homologías en GenBank empleando el algoritmo de Blastx. De esta forma fueron alineados genes que han sido asociados al metabolismo del fósforo, tanto orgánico como inorgánico, con los genomas de las cepas mencionadas.

Determinación de producción de ácidos orgánicos en medio líquido.

Con el objetivo de observar si las cepas estaban produciendo ácidos, se realizó un medio con un indicador de pH. Para eso, se preparó un medio NBRIP (Nautiyal en 1999) modificado, con los siguientes ingredientes: 10g/L de glucosa, 5g/L de Ca3(PO4)2,

0,25g/L de 2O, 0,2g/L de MgSO4·7H2O, 0,1g/L de (NH4)2SO4 y 0,0125g/L de azul de bromofenol. Se determinó si las cepas estaban produciendo ácidos según el cambio de color de los medios.

En el segundo procedimiento, que consistió en la cuantificación del fosfato solubilizado, dado que el azul de bromofenol presentó interferencia con los métodos espectrofotométricos, fue excluido. De esta forma, se pudo realizar una cuantificación confiable de los fosfatos disueltos por cada una de las cepas. Se preparó el medio NBRIP sin el azul de bromofenol para cada una de las muestras. Cada una se centrifugó por 10 minutos, se filtró en un papel de poro de 0.22um y se procesó de acuerdo a las

instrucciones con el Phosphate Kit Set® de Merck (límite de detección de 1-100 mg/L). Se realizó la lectura de la concentración de iones por espectrofotometría en el Spectroquant

NOVA 60A®.

Microorganismo Origen ReferenciaLysinibacillus sphaericus OT4b.25 Larvas de coleóptero Lozano & Dussán (2013)Lysinibacillus sphaericus OT4b.31 Larvas de coleóptero

Peña-Montenegro & Dussán (2013)

Lysinibacillus sphaericus III(3)7

Suelo de un bosque de robles Lozano & Dussán (2013)

Lysinibacillus sphaericus CBAM5

Suelo contaminado con hidrocarburos Peña Montenegro (2015)

Bacillus cereus Crudo pesado Shaw & Dussán (2015)

Bacillus licheniformis

Muestras de suelo.

Dos tipos de suelos fueron tomados de un sector de una zona petrolera en el departamento de Casanare, Colombia (5°05.855N, 72°24.130W) (ver Figura1). El primero es suelo regular del área y el segundo es suelo proveniente de un proceso de biorremediación de lodos aceitosos. El suelo no contaminado presenta un pH de 4,46 y concentraciones elevadas de aluminio, moderadas de hierro, bajas en calcio y deficientes de fósforo (ver Figura 2). Para los montajes se mezclaron los dos suelos en una proporción 3:1 respectivamente, continuando con los parámetros estandarizados en campo para la transición de la fase de biorremediación a fitorremediación.

Figura 1. Sector de proveniencia de los suelos.

Figura 2. Suficiencia nutricional de la mezcla de suelos empleada en los montajes: el valor ideal de cada nutriente se encuentra a nivel de la línea horizontal media. Valores por debajo indican deficiencia y por arriba, exceso.

Microcosmos

Se estructuraron ocho microcosmos por triplicado con los siguientes contenidos: Serratia sp., Serratia sp. + NPK, Lysinibacillus, Lysinibacillus + NPK, Bacillus, Bacillus + NPK, NPK y mezcla de suelo sin adiciones. El NPK corresponde a un fertilizante que contiene nitrógeno, potasio y fósforo, el cual se encuentra en forma soluble de P2O5. Dado que el fertilizante se usa en campo a una concentración de 90 Kg/ha, esa fue la medida empleada para los microcosmos.

Absorción de fósforo solubilizado en C. ensiformis.

Dado que las diferencias en el crecimiento de las plantas pueden deberse a muchos factores, y la habilidad para solubilizar fósforo no está directamente asociada a la habilidad de promover crecimiento, este estudió realizó la evaluación de absorción de fósforo por parte de raíces y hojas de plantas. Para ello, se dispusieron 9 plántulas de C.

Nutrientes

Gra

do d

e su

ficie

ncia

0.1

110

NO3 P K Ca Mg S Cl Zn Na Mn Fe B Cu Al

MacronutrientesNutrientes secundariosMicronutrientes

ensiformis por tratamiento en el invernadero, en los mismos montajes de tierras descritos para los microcosmos. Este montaje fue repetido en campo, en el mismo terreno donde fue extraído el suelo para los experimentos de invernadero.

Cuantificación de fosfato en suelo, raíces y hojas.

La cuantificación del ión ortofosfato en el suelo de los microcosmos y raices de C. ensiformis se realizó de acuerdo al protocolo de Escobar & Dussan (2015). Para los microcosmos, se hizo una mezcla de 10g de suelo en 100 mL de agua destilada y se agitó en shaker durante 12 horas a 250 rpm. Se tomaron 100 uL de la solución y se adicionaron 10 mL de agua destilada y 0.5mL de HNO3 65%. A continuación, la solución

fue procesada 30 minutos a 111 °C con el Crack Kit Set® de Merck de acuerdo a las

instrucciones del fabricante. Se usó el Phosphate Kit Set® de Merck (límite de detección de 1-100 mg/L) y se realizó la lectura de la concentración de iones por espectrofotometría

en el Spectroquant NOVA 60A®.

Para la medición del ión ortofosto en C. ensiformis se tomó 1gr de raíz u hoja para los diferentes tratamientos y se adicionaron 3mL de HNO3 65%. La mezcla se procesó de la forma como se describió anteriormente.

Resultados.

Búsqueda de genes asociados al metabolismo del fósforo.

El Blastx corrido entre las cepas y los genes reportados, demostró 6 coincidencias. Esto, significa que únicamente no se encontraron alineamientos para una de las cepas (L. sphaericus III(3)7)), como se muestra en la Tabla 2.

Tabla 2. De los 6 microorganismos que presentan genes asociados al metabolismo del fósforo, sólo Serratia sp. está relacionado a la solubilización de fuentes inorgánicas.

Determinación de producción de ácidos orgánicos en medio líquido.

De las 8 cepas seleccionadas, se observó acidificación del medio en los cultivos de B. cereus y Serratia sp, demostrando que estas dos cepas son las únicas que realizan solubilización de fósforo inorgánico por medio de producción de ácidos orgánicos. Por tanto, se sugiere que las diferentes cepas de L.sphaericus y B. licheniformis realizan el proceso por medio de vías metabólicas que no implican la producción de ácidos.

La cuantificación del fosfato solubilizado en los medios líquidos se presenta en la Figura 3. Se observa que a los tres días la cepa que realiza una mayor solubilización es la OT4b.25. Sin embargo, a los 7 días la solubilización de OT4b.25 y Serratia sp. superan el límite de detección del método, es decir los 100 mg/L. A los 7 días también se observa que la solubilización de B. cereus, B. licheniformis y CBAM5 son comparables, con concentraciones de fosfato de alrededor de 50 mg/L. Por último, se observa que la cepa III(3)7 tiene niveles muy bajos de solubilización a lo largo del tiempo.

Microorganismo Gen asociadoLysinibacillus sphaericus OT4b.25 phoLysinibacillus sphaericus OT4b.31 phoALysinibacillus sphaericus III(3)7 -Lysinibacillus sphaericus CBAM5 phoP

Bacillus cereus phy

Bacillus licheniformis phyA

Serratia marcescens pKG3791

Figura 3. OT4b.25 y Serratia sp. realizan la mayor solubilización de fósforo después de 7 días. Las demás cepas obtienen niveles intermedios de solubilización, exceptuando a III(3)7, que tiene niveles bajos.

Microcosmos.

En los microcosmos, el consorcio formado por las cuatro cepas de L. sphaericus logran realizar una mayor solubilización del fósforo en comparación a Serratia sp. y el consorcio conformado por B. cereus y B. licheniformis. Aunque todos los microcosmos contienen la misma cantidad de fertilizante, se observa que algunos microorganismos consumen o transforman una cantidad importante del fosforo presente en el fertilizante. Por último se determinó que todos los microorganismos logran solubilizar una pequeña cantidad de fósforo del suelo en ausencia del fertilizante, especialmente los Bacillus y Serratia (Figura 4).

Figura 4. El tratamiento de L.sphaericus con fertilizante es el que demuestra un mejor desempeño en el microcosmos y, por tanto, una mayor concentración de fosfatos. En ausencia de fertilizante sobresale el tratamiento de Bacillus. (F: Fertilizante / LF: L. sphaericus + fertilizante / SF: Serratia sp. + fertilizante / BF: B. cereus y B. licheniformis + fertilizante / L: L. sphaericus / S: Serratia sp. / B: B. cereus y B. licheniformis).

Cuantificación de fosfato en hojas y raíces de C. ensiformis.

La concentración de fosfatos determinada en hojas y raíces en las plántulas cultivadas en invernadero y campo se presentan en la figuras 5 y 6 respectivamente. En el invernadero, se observa que todos los tratamientos contienen un mayor nivel de fosfatos en las hojas que en las raíces. Igualmente, en general se ve un mayor nivel de solubilización que en campo (Figura 6). Los tratamientos de Serratia sp. sobresalen también en este caso, dado que presentan niveles destacados del nutriente en las hojas

La concentración de fosfatos en hojas y raíces en campo presentan un nivel de alrededor de 15 mg/L. En todos los tratamientos hay una mayor concentración del nutriente en las raíces que en las hojas. El tratamiento de Serratia sp. sobresale, por presentar los niveles más altos de fosfato para las raíces. (Los tratamiento de Serratia + fertilizante y Serratia-hojas se encuentran ausentes dado que las plantas fueron destruidas por las hormigas presentes por el fenómeno de fuerte sequía).

Figura 5. El tratamiento con mejor desempeño de solubilización de fosfato para las raíces en campo es Serratia sp. Después de un mes, en todos los casos se ve una mayor concentración de fosfatos en las raíces que en las hojas. (F: Fertilizante / LF: L. sphaericus + fertilizante / BF: B. cereus y B. licheniformis + fertilizante / L: L. sphaericus / S: Serratia sp. / B: B. cereus y B. licheniformis).

Figura 6. El tratamiento con mejor desempeño de solubilización de fosfato para las raíces y hojas en invernadero es Serratia sp. Después de 3 meses, se observa una mayor concentración de fosfatos en hojas que en raíces para todas las plantas. (F: Fertilizante / LF: L. sphaericus + fertilizante / SF: Serratia sp. + fertilizante / BF: B. cereus y B. licheniformis + fertilizante / L: L. sphaericus / S: Serratia sp. / B: B. cereus y B. licheniformis).

Discusión Los resultados obtenidos sugieren que diferentes cepas de L. sphaericus efectivamente llevan a cabo la solubilización de fósforo a forma de ortofosfatos que pueden ser absorbidos por las plantas. Esto confirma lo encontrado por Seshadri et al (2007), Wahyudi et al (2011) y De Fleitas et al (1997), quienes indicaron la capacidad para solubilización de fósforo por parte de Bacillus sphaericus. De todas las cepas probadas, la III(3)7 no tiene la capacidad de solubilizar el fósforo, como lo demuestran el Blastx y las pruebas en medio líquido. Las cepas de L. sphaericus que realizan solubilización son OT4b.25, OT4b.31 y CBAM5, las cuales aparentemente emplean vías metabólicas alternas a la producción de ácidos orgánicos. Estos resultados contradicen algunos estudios anteriores. De Freitas et al (1997), por ejemplo, encontraron que la solubilización de fósforo en B. sphaericus estaba relacionada a la producción de ácidos. En medio líquido sobresale la cepa OT4b.25 por realizar una alta solubilización del fosfato dicálcico a los 3 días de haber sido inoculada. Esta capacidad se complementa con la presencia del regulón Pho, el cual se encuentra asociado a esta cepa. Este gen corresponde al regulón de fosfatos, es decir el mecanismo involucrado en el metabolismo de fósforo inorgánico. Normalmente, este gen activa enzimas capaces de obtener fósforo inorgánico a partir de fosfatos orgánicos, transportadores específicos de fósforo inorgánico y enzimas involucradas en el almacenamiento del nutriente (Santos-Beneit, 2015). Las cepas OT4b.31 y CBAM5 también demostraron la capacidad de solubilización de fósforo inorgánico en el medio NBRIP. La primera lo puede realizar gracias a que posee genes correspondientes a fosfatasas alcalinas. Las fosfatasas alcalinas (PhoA) son unas de las enzimas más comunes que son inducidas cuando la bacteria ha sufrido de inanición de fosfato inorgánico (Santos-Beneit, 2015). CBAM5, por otro lado, alberga el gen phoP, el cual hace parte del sistema regulatorio del regulón Pho como regulador de la respuesta citoplasmática transcripcional (Santos-Beneit, 2015). Por otra parte, B. cereus y B. licheniformis presentan genes phy, los cuales permiten metabolizar fuentes de fósforo orgánico. El gen phy, de B. cereus, es el gen que codifica para la enzima fitasa. La fitasa es la enzima que cataliza la hidrólisis del ácido fítico o fitato, una forma orgánica indigestible de fósforo, para liberar otras formas de inositol-fosfato y fosfato inorgánico. Con las fitasas, los microorganismos pueden suplir sus altos requerimientos de fósforo y de otros nutrientes minerales (Rao et al, 2008). El gen phyA, asociado a B. licheniformis, corresponde a un tipo de esta enzima, comúnmente encontrada en Aspergillus niger (Han et al, 1999). La capacidad que tienen los Bacillus para metabolizar fuentes de fósforo orgánico, podría ser la explicación a la diferencia de desempeño de estos microorganismos en el medio líquido y en tierra. En el medio líquido realizan una solubilización comparable a la de OT4b.31 y CBAM5, lo que indica que pueden metabolizar fosfato dicálcico. Sin embargo,

en los microcosmos sin fertilizante, el desempeño de los Bacillus es mejor en comparación al consorcio de L. sphaericus. Esto, podría explicarse por la capacidad de tomar fuentes adicionales del nutriente, es decir fuentes de origen orgánico. Tanto los microcosmos como los ensayos en invernadero y campo con C. ensiformis muestran diferencias con los resultados en medio líquido. En ese sentido, el complejo metabolismo de los microorganismos plantea la necesidad de estudiar las diferentes formas de asimilación del fósforo por parte de los microorganismos. Esto, quiere decir que es necesario estudiar los mecanismos de obtención de fosfatos a partir de fuentes orgánicas (mineralización) y a partir de fuentes inorgánicas (solubilización). También es necesario estudiar las formas en que los microorganismos convierten el fósforo disponible a fósforo orgánico (inmovilización) o a fósforo inorgánico (adsorción) para entender la variación en los tratamientos que contienen fertilizante respecto a los que no contienen nutrientes adicionados. Por último, sería interesante hacer un estudio más detallado de la relación entre el pH del suelo y la inmovilización del nutriente por parte de iones como el Aluminio. Para tener resultados confiables se deben repetir los ensayos de campo e invernadero, realizando las mediciones de la concentración de ortofosfatos por un tiempo más prolongado. Adicionalmente, sería ideal estudiar la habilidad de L. sphaericus para promover el crecimiento vegetal, por un lado, y la toma de fósforo por parte de las plantas, por otro. Algunos estudios indican que los microorganismos solubilizadores de fósforo favorecen el crecimiento de las plantas pero no la toma de fósforo (De Fleitas et al, 1997). Sin embargo los ensayos realizados con los microorganismos muestran que la concentración de fósforo inicialmente es mayor en las raíces (plántulas de campo) y después aumenta en las hojas (plantas de invernadero), indicio de que las bacterias pueden estar ayudando a la translocación de los fosfatos. Conclusiones Este estudio demuestra que diferentes cepas de L. sphaericus pueden contribuir al mejoramiento nutritivo de suelos áridos en proceso de biorremediación. Esto, quiere decir que en suelos ácidos contaminados con crudo, como los de los Llanos orientales, el uso de estos microorganismos puede ser un complemento o eventualmente un sustituto de fertilizantes. Especialmente la cepa OT4b.25 de L. sphaericus demostró un alto potencial para solubilizar el fosfato dicálcico en medio líquido, por lo que debería ser estudiada con mayor profundidad en campo. A futuro, es necesario estudiar el efecto que tienen los microorganismos en el crecimiento de las plántulas, dado que se observó que podrían contribuir al proceso de translocación de fósforo de las raíces a las hojas.

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Campbell, N., & Reece, J. (2007) Biology (7ma Ed.) Madrid, España: Médica

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De Freitas, J. R., Banerjee, M. R., & Germida, J. J. (1997). Phosphate-solubilizing

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