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Dra. Noemí GalindoIVI-AlicanteNoemi.Galindo@ivi.es

www.ivi.es

3r curso de actualización en habilidades médicas y de enfermería

TÉCNICAS REPRODUCTIVAS EN LAS ENFERMEDADES

HEREDITARIAS

Alcoi, 8 de Marzo 2012

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Introducción

ÓvuloÓvulo

23 cromX 23 cromX

EspermatozoideEspermatozoide

46 XX 46 XY

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Incidencia

Anomalías cromosómicas: 0,4-0,6 %

Alteraciones génicas : 1-2 %

Anomalías cromosómicas: 0,4-0,6 %

Alteraciones génicas : 1-2 %

Herencia recesiva25 %Herencia recesiva25 %

Herencia dominante 50 %Herencia dominante 50 %

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Diagnóstico prenatal – aborto terapéuticoDonación de gametos

Donación de embrionesAdopción

DIAGN ÓSTICO GENÉTICO PREIMPLANTACIONAL

Opciones

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Procedimientos1. Selección de pacientes

2. Estimulación-ICSI-cultivo

3. Biopsia y fijación

4. Análisis Genético

5. Transferencia

DIAGNÓSTICO PREIMPLANTACIONAL

1.1. SelecciSeleccióón de pacientesn de pacientes

2.2. EstimulaciEstimulacióónn--ICSIICSI--cultivocultivo

3.3. Biopsia y fijaciBiopsia y fijacióónn

4.4. AnAnáálisis Genlisis Genééticotico

5.5. TransferenciaTransferencia

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Ley 14/2006, 26 de mayo, sobre Técnicas de Reproducción Humana Asistida.

Artículo 12. Diagnóstico preimplantacional.

DGP: Selección de pacientes

Los centros debidamente autorizados podrán practicar DPI para:a) Detección de enfermedades hereditarias graves, de aparición precoz,

y no susceptibles de tratamiento curativo posnatal con arreglo a los conocimientos científicos actuales

b) La detección de otras alteraciones que puedan comprometer la viabilidad del preembrión.

Otra finalidad no comprendida o determinación de los Antígenos de histocompatibilidad con fines terapéuticos para terceros requerirán autorización expresa.

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• Alteraciones estructurales:

- Traslocaciones robertsonianas

- Traslocaciones recíprocas

- Inversiones

• Alteraciones numéricas:

- varón: 47, XYY; 47, XXY

- mosaicismos:45,X/46,XX/47,XXX

Enfermedades monogénicas

DIAGNÓSTICO GENÉTICO PREIMPLANTACIONAL

Cariotipos anormales (PGD)

DGP: Selección de pacientes

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DGP: Selección de pacientes

Enfermedades Autosómicas Recesivas

• Atrofia Muscular Espinal • Fibrosis Quística • β-Talasemia • Defecto de la Glicosilación (CDG1A) • Sordera congénita neurosensorial no sindrómica• Poliquistosis renal (ARPKD) • Leucodistrofia metacromática• Deficit 21-Hidroxilasa• Enfermedad Gaucher• Tirosinemia tipo 1 • Linfohistiocitosis familiar • Acidemia propiónica A • Acidemia propiónica B • Mucopolisacaridosis IIIA (SanFilippo A) • Displasia hidrótica ectodérmica, Síndrome de Clouston• Déficit L-CHAD • Osteopetrosis, • Inmunodeficiencia combinada severa, alinfocítica

Enfermedades Autosómicas Dominantes

• Distrofia Miotónica, Steinert• Huntington • Poliquistosis Renal, AD. Ligada a PKD1 • Neurofibromatosis tipo 1 • Charcot-Marie-Tooth 1A • Ataxia Espinocerebelar, SCA1, SCA3 • Esclerosis tuberosa tipo 1 • Exostosis múltiple hereditaria • Neoplasia Múltiple Endocrina 2A • Cáncer colon hereditario, no polipósico (S. Lynch) • Poliposis adenomatosa familiar • Esclerosis tuberosa tipo 2 • Síndrome Von Hippel Lindau• Paraparesia espástica familiar • Poliquistosis Renal, AD. Ligada a PKD2 • Retinosis Pigmentaria

Enfermedades con herencia ligada al cromosoma X

•Síndrome de X frágil •Hemofilia A •Distrofia Muscular Duchenne/Becker •S. Alport•Incontinencia Pigmenti•Déficit Ornitin Transcarbamilasa •Enfermedad de Norrie•Mucopolisacaridosis II •Mucopolisacaridosis IIIA

ENFERMEDADES MONOGÉNICAS

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SCREENING GENÉTICO PREIMPLANTACIONALde Aneuploidías (PGS)

Parejas mal pronóstico reproductivo

• Edad materna avanzada ( ≥≥≥≥ 41 a)

• Fallo de implantación

• Abortos recurrentes

• FISH espermatozoides anormal

DGP: Selección de pacientes

Selección de embriones

euploides:

-Mejorar la implantación

-Disminuir la tasa de aborto

-Reducir el riesgo de

cromosomopatías

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¿QUÉ CROMOSOMAS analizamos?????

13,15,16,17,18, 21,22,X,Y13,15,16,17,18, 21,22,X,Y

Monosomía X 8,6Trisomía autosómicas 26,1Trisomía 13 1,1Trisomía 15 1,7Trisomía 16 7,5Trisomía 18 1,1Trisomía 21 2,3Trisomía 22 2,7Trisomías sexuales 0,3Poliploidía 9,8Anomalías estructurales 2,0

Datos de Hassold et al, 1996 (n=4088)

DGP: Selección de pacientes

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Criterios de inclusiCriterios de inclusiCriterios de inclusiCriterios de inclusióóóón:n:n:n: ananananáááálisis retrospectivo para seleccionar rango edad lisis retrospectivo para seleccionar rango edad lisis retrospectivo para seleccionar rango edad lisis retrospectivo para seleccionar rango edad

41- 44 años

Estudio Estudio randomizadorandomizado IVI: EDAD MATERNA AVANZADAIVI: EDAD MATERNA AVANZADA

Edad

ONGOING

DGP: Selección de pacientes

SGP: Selección de pacientes

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≥≥≥≥ 3 fallos FIV/ICSI, <40 años, ≥≥≥≥6 MII

Fallo repetido de implantaciFallo repetido de implantacióónn

Estudio previo de infertilidad:

• Ecografia vaginal (histeroscopia si es

necesario)

• Cariotipos de la pareja

• Estudio de trombofilias: anticuerposanticardiolipina y lupus anticoagulante;

Antitrombina III; APCR (si positiva, mutación

del factor V de Leiden); niveles de proteina C y

S; Homocisteina sérica y screening de

mutaciones MTHFR y factor II.

SGP: Selección de pacientes

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ABORTO DE REPETICIABORTO DE REPETICIABORTO DE REPETICIABORTO DE REPETICIABORTO DE REPETICIABORTO DE REPETICIABORTO DE REPETICIABORTO DE REPETICIÓÓÓÓÓÓÓÓN N N N N N N N Aborto de repeticiAborto de repeticiAborto de repeticiAborto de repeticiAborto de repeticiAborto de repeticiAborto de repeticiAborto de repeticióóóóóóóón: estudio retrospectivon: estudio retrospectivon: estudio retrospectivon: estudio retrospectivon: estudio retrospectivon: estudio retrospectivon: estudio retrospectivon: estudio retrospectivo

Improved results in RM patients:

- < 5 abortos previos

- Gestación previa anormal

- Aumento de anomalías cromosómicas masculinas

Resultados en AR < 38 años:

- 57% embriones anormales

- 53,1% gestación evolutiva/transfer

- 13,0% aborto

- 44,1 gestación evolutiva/ciclo

Gestación/transfer

Tasa de implantaciónTasa de aborto

2 abortosn=105

3 abortosn=76

4 abortosn=56

> 5 abortosn=16

SGP: Selección de pacientes

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PARPARPARPARÁMETROS SEMINALES ALTERADOSMETROS SEMINALES ALTERADOSMETROS SEMINALES ALTERADOSMETROS SEMINALES ALTERADOS

Oligozoospermia severa< 5 mill espermatozoides/ml

Teratozoospermia severa

Oligozoospermia severa< 5 mill espermatozoides/ml

Teratozoospermia severa

� disomía para cromosomas sexuales

� disomía 21

� diploidía y poliploidía

� disomía para cromosomas sexuales

� disomía 21

� diploidía y poliploidía

(Moosani, 1995; In’t Veld, 1997; Rubio, 2001; Bernardini, 1998; Pang, 1999; Pfeffer, 1999; Bernardini, 2000; Vegetti, 2000; Ushijima, 2000; Nishikawa, 2000; Calogero, 2001; Devillard, 2002 ; Martin, 2003; Mateu, 2006)

SGP: Selección de pacientes

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FACTOR MASCULINOFACTOR MASCULINO

•Azoospermia no obstructiva

•Teratozoospermia severa

•Oligozoospermia severa (<5 mill/ML)

0

10

20

30

40

50

60

≤4 >4-<10 ≤10-<20 ≥20

% FISH anormal

Rodrigo et al., 2009

SGP: Selección de pacientes

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Conlleva un tratamiento de Fecundación “in vitro”,

en el que se obtienen varios embriones para su análisis.

Ventaja:

se trata de parejas infértilesse trata de parejas infértiles

Diagnóstico preimplantatorio

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2.- Estimulación ovárica-ICSI-cultivo3.- Micromanipulación embrionaria4.- Análisis genético5.- Transferencia embrionaria

Consejo genético

Cronología

PÁG.18

Protocolos con análogos de la GnRH

Estimulación ovárica

PÁG.19

Obtención de ovocitos: punción

Laboratorio de FIV

Quirófano

Punción folicular transvaginal

PÁG.20

D5: Transferencia embriones sanosD3: Diagnóstico genético

Tasa fecundaciónICSI

Ovocitos MIIOvocitos punción

Estimulación ovárica

+/- vitrificación de ovocitos

PÁG.21

Es la fecundación del ovocito mediante laintroducción de un espermatozoide con la

ayuda de una micropipeta”

Inyección intracitoplasmática de espermatozoides

PÁG.22 FISH de espermatozoides

Desarrollo embrionario NO selecciona anomalías cromosómicas

Magli MC et al (2000), Sandalinas M et al (2001), Ziebe S et al (2003),Munné S (2004), Rubio C (2007)

DGP: implicación clínica

PÁG.23

Información genética de la célula embrionaria

DayDay--00 DayDay--11

Polar BodyPolar Bodybiopsybiopsy

DayDay--33

CleavageCleavage stagestagebiopsybiopsy

DayDay--55

BlastocystBlastocystbiopsybiopsy

Información genética

PÁG.24

DGP: biopsia de blastómera y fijación

Rotura de la zona pelúcida

Aspiración de las blastómeras

Fijación de las blastómeras

PÁG.25

FISH: hibridación “in situ” fluorescente: 9 cromosomas.

PCR: reacción en cadena de la polimerasa

DGP: análisis genético

jcmr2

Diapositiva 25

jcmr2 Independientemente de las muestras con las que estemos trabajando, ¿qué nivel de análisis abarcamos?Julio Martín ; 05/05/2002

PÁG.26

PCR: Mutaciones génicasFibrosis quFibrosis quíísticasticaDistrofia muscular de Distrofia muscular de DuchenneDuchenneSSííndrome de ndrome de MarfanMarfanDistrofia Distrofia miotmiotóónicanicaRetinitis Retinitis pigmentosapigmentosaSSííndrome del Xndrome del X--frfráágilgilCorea de HuntingtonCorea de Huntingtonßß -- TalasemiaTalasemia

......

DGP: análisis genético: PCR

Test informatividad previo:• mutaciones•marcadores genéticos

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+secuencia de ADN

a amplificar

Primers

TERMOCICLADOR

94ºC- 1’40-60º C

Descondensación y adhesión de primersSíntesis de ADN

Elongación de cadenas

(72ºC-1’)PCR FLUORESCENTE

ELECTROFORESIS

Lisis celular de membrana plasmática y nuclear� liberación ADN�amplificación por PCR y detección por fluorescencia

DGP: análisis genético: PCR

PÁG.28

SSííndrome de ndrome de DownDown, , KlinefelterKlinefelter XXYXXYssííndrome XYY, sndrome XYY, sííndrome de ndrome de Turner (XO), edad avanzada,Turner (XO), edad avanzada,

aborto de repeticiaborto de repeticióónn

DGP: análisis genético: FISH

FISH: hibridación “in situ” por fluorescencia

Alteraciones cromosómicas-Estructurales: translocacionestranslocaciones

-- Sondas especSondas especííficasficas

-Numéricas.- 9 cromosomas

PÁG.29

Sondas marcadas con fluorescencia con afinidad por los cromosomas que queramos estudiar

¿Qué CROMOSOMAS?

13,15,16,17,18, 21,22,X,Y

13,15,16,17,18, 21,22,X,Y

DGP: análisis genético: FISH

Jobanputra et al, 2002: el FISH para los cromosomas 13, 15, 16,

18, 21, 22, X, Y permitiría detectar el 83% de anomalías

citogenéticas en abortos

PÁG.30

FISH. Hibridación “in situ” confluorescencia

DGP: análisis genético: FISH

sonda ADN

secuencia cromosómica

DescondensaciónDesnaturalización

Renaturalización

sonda ADN

secuencia cromosómica

DescondensaciónDesnaturalización

Renaturalización

sonda ADN

secuencia cromosómica

DescondensaciónDesnaturalización

Renaturalización

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XXXXXY XXY

DGP: análisis genético: FISH

PÁG.32

Arrays de CGH(Hibridación Gen ómica Comparada)

DGP: análisis genético: Arrays

AnomalAnomalíías numas numééricas de ricas de todostodos los cromosomaslos cromosomas

Normal (XY)

24 cromosomas

¡¡Aumento nivel de detección!!

Aumento tasa de embarazo e implantación

15 % en >40 años>20-25% en AR y FI

En ≤40 años, si existe factor masculino severo adicional a FI o AR:44,4% embriones NO detectables con FISH

PÁG.33

Amplificación genómicacompleta

Marcaje

Purificación y combinación

Hibridación sobre el array

Lectura e interpretación de resultados: software

ADN controlADN controlMuestraMuestra

BlueGnome Ltd., Cambridge, UK

Cy3 Cy5

24 cromosomas

CGH arrays

Cy3 + Cy5

DGP: análisis genético: Arrays

Hibridación sobre plataformas con

secuencias de ADN específicas de

regiones concretas de cr. humanos

PÁG.34

DGP: análisis genético: Arrays

Aneuploide: -19, -21 (XY)

Normal (XY)

PÁG.35

EmbriEmbri óón can ca óóticotico

DGP: análisis genético: Arrays

PÁG.36

¿1 ó 2? ���� SET• Selección embriones:

– Genética

– Viabilidad

• Vitrificación sobrantes

ASPECTOS MÉDICOS DE LA ESTERILIDAD FEMENINA

FIV/ICSI: Transferencia embrionaria

PÁG.37

Gracias por su atención

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