Post on 25-Jan-2019
TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR PARA HPV E ITS EN ADOLESCENTES
Programa de Microbiología- ICBM
Facultad de Medicina-Universidad de
Chile
María A. Martínez Tagle MSc, Ph.D
Declaración de Conflictos de Interés
Declaro no tener conflicto de
interés.
Mayor sensibilidad
No requieren viabilidad de los microorganismos
Eficientes con muestras No invasivas
Requieren menos tiempo para entrega de resultados
De elección en el diagnóstico de N. gonorrhoeae y C. trachomatis de muestras urogenitales y No genitales en adolescentes y adultos
Mayor eficiencia que las técnicas convencionales para el diagnóstico de T. vaginalis, Virus Herpes simplex y HPV
Ventajas de las técnicas de Biología molecular
en la detección y diagnóstico de ITS
Pruebas que han superado las TAAN comerciales en su desarrollo
Ausencia de reacciones falsas negativas, por mutaciones en los blancos de amplificación
Ausencia de reactividad cruzada Estándar de referencia de validación Sensible y
Específico Elevado VPP Elevado VPN No existen TAAN perfectas No todos las TAAN son iguales
Distintas plataformas, blancos de amplificación, partidores distintos flujogramas y poblaciones empleadas en la validación
Limitaciones de las TAAN
Mayor costo que es difícil de asumir por los países en desarrollo
Buen “costo-beneficio” si pensamos en complicaciones y secuelas que se evitan
Exigencias para la acreditación
Diseño de laboratorios
Personal competente
Organismo acreditador
Acceso expedito de los Laboratorios a:
Insumos
Mantención de equipos
Recomendaciones de “Screening” de C. trachomatis y N. gonorrhoeae en EUA
MMWR 2014; 63:2
# US Preventive Services Task Force, 2013
ITS USPSTF # CDC AAFP ACOG
C. trachomatis < 25 años Con riesgo
< 25 años Con riesgo
< 25 años Con riesgo
< 25 años Con riesgo
N.gonorrhoeae < 25 años Con riesgo
No Con riesgo
< 25 años Con riesgo
Adolescentes Con riesgo
Diagnóstico de laboratorio de C. trachomatis y N. gonorrhoeae. CDC-Abril 2014
Las TAAN son las técnicas recomendadas para “screening” ó diagnóstico de C. trachomatis y N gonorrhoeae en muestras urogenitales
Indicaciones sobre las muestras urogenitales: Obtenidas por el paciente (Screening) ó por el personal médico si se requiere examen clínico Hombres: Orina de 1er chorro ó secreción uretral son equivalentes Mujeres: Muestras vaginales ó endocervicales ú orina de 1er chorro. La orina es 10% menos sensible que las muestras vaginales ó cervicales Indicaciones sobre las técnicas No se requiere confirmar los resultados positivos, porque tienen: Especificidades >99% y VPP>90%
MMWR 2014; 63:2
Comparación muestras clínicas para el diagnóstico de C. trachomatis
Muestras clínicas : -vaginales tomadas por la paciente - endocervicales tomadas posteriormente por el médico durante el examen clínico Población: 3.793 mujeres ≥16 años (Centro de Salud Sexual, UK) Laboratorio: TAAN Aptima AC2, confirmado
Prevalencia de infección 10,3%
BMJ 2012; 345:e8013
Las TAAN son las técnicas de elección para “screening” ó diagnóstico de C. trachomatis y N. gonorrhoeae en muestras rectales y orofaríngeas
La sensibilidad de las técnicas clásicas es muy baja en muestras extragenitales
Los TAAN comerciales aún no han sido aprobados para el estudio de muestras No urogenitales
En EUA los laboratorios deben seguir las indicaciones de “Clinical Laboratory Improvement Amendments (CLIA)” (Este Instituto es de la FDA y otorga certificación)
MMWR 2014; 63:2
Qué se recomienda para el análisis de muestras rectales y orofaríngeas?
TAANs comerciales aprobadas por FDA para diagnóstico de N. gonorrhoeae y C. trachomatis
Varias plataformas de TAAN aprobadas por la FDA
Desarrolladas por 5 firmas comerciales
La mayoría corresponden a técnicas de 2ª generación
Algunas son útiles para laboratorios pequeños y otras son plataformas robotizadas para uso en laboratorios de gran complejidad
Abbott RealTime m 2000 Reacción en cadena de la
polimerasa Roche , Amplicor y COBAS Reacción en cadena de la
polimerasa Hologic/ Gen-Probe , Aptima (Amplificación mediada por
transcripción (TMA) BD ProbeTec Amplificación por
desplazamiento de hebra (SDA) Cepheid, Xpert assay Amplificación isotérmica
BD Viper™ System
Totalmente automatizado
Incluye sistema de extracción de ADN
Eficiencia
Hasta 736 resultados por 8,5 h
Demora 20 min por corrida
Flexibilidad
Puede analizar hasta 5 ITS simultáneamente
Tecnología “Point of care”(POC)
Ventajas particulares
Para laboratorios de baja ó mediana complejidad
Equipamiento mínimo
Resultados en 60-90 min
Xpert® CT/NG, Cepheid 90 minute detection and
differentiation of Chlamydia trachomatis and Neisseria
gonorrhoeae
Sensibilidad analítica 10 genomas
Muy flexible
J Clin Microbiol 2013; 51: 1666-72
Estándar de comparación: APTIMA Combo 2 (AC2) y
ProbeTec ET
Eficiencia de Xpert para la detección de C. trachomatis
y N. gonorrhoeae en distintas muestras clínicas
Técnica Sens (%) P
Cultivo 81 <0.001
Vaginal 99
Endocervical 96
Sintomáticas
Cultivo 84 0.004
Vaginal 100
Endocervical 100
Asintomáticas
Cultivo 78 0.008
Vaginal 98
Endocervical 90
Diagnóstico de N. gonorrhoeae:
Comparación de técnicas y muestras clínicas
BMJ 2012; 345:e 8107
Cultivo: Médico: Muestra
uretral y endocervical
TAAN (Aptima AC2):
Paciente: vaginal Médico:
Endocervical
Población: 3859 mujeres ≥16
años (Clínica GU de UK)
Prevalencia gonorrea: 2.5%
Consideraciones adicionales para el diagnóstico de N. gonorrhoeae
Mantener el uso del cultivo para vigilancia epidemiológica y susceptibilidad antimicrobiana
Frente a sospecha de falla terapéutica debe efectuarse diagnóstico por cultivo y efectuar estudio de susceptibilidad
Los resultados positivos de las muestras faríngeas deben confirmarse con otro DNA blanco, por la posibilidad de reacción cruzada con Neisseria spp.
Las técnicas comerciales actuales suelen traer 2-3 blancos de amplificación distintos
Trichomonas vaginalis
Agente de transmisión sexual no viral de mayor prevalencia mundial (180 millones casos nuevos/ año) Diferencias por acceso a salud, raza, nivel socioeconómico
En Chile la literatura informa prevalencias en adolescentes sexualmente activas entre 2,2 y 5,7%
No es una ITS reportable en la mayoría de los países
Factor reconocido de riesgo de:
Transmisión de VIH y otras ITS
Parto prematuro
EIP
Parasitol.dia 1999; 23: 9-14
Rev Chil Obstet Ginecol 2003; 68:499-502
Comparación de técnicas para el diagnóstico de T. vaginalis
Clin Infect Dis 2002;35:576-80.
N=337 mujeres
Las TAAN de 1ª generación no lograban superar esta sensibilidad
Diagnóstico molecular de T. vaginalis
Protocolo: Aptima T. vaginalis (TMA). SR: Ex al fresco y cultivo. Discordancias: Alt TMA
Diseño: Estudio prospectivo multicéntrico USA
Población: 933 mujeres ≥14 años con y sin síntomas urogenitales
Prevalencia de infección: 7%
Muestras clínicas Sens.(%) Esp.(%)
Vaginal 100 99
Endocervical 100 99,4
Thin Prep (PAP) 100 99,6
Orina 95,2 98,9 J Clin Microbiol; 2011; 49: 4106-11
Virus Herpes simplex
Técnicas de diagnóstico
Cultivo (Shell vial/tubo)
Técnica de referencia Tinción con AcMo tipo específicos 70-99% sensibilidad, 99% especificidad
Examen citológico Sensibilidad y especificidad <60%
PCR Distingue ambos tipos de virus Mayor sensibilidad
POC para diagnóstico de VHS IsoAmp® HSV assay
Aprobado por la FDA en 2011
Amplificación isotérmica
Sensibilidad analítica:
VHS-1: 5,5 genomas
VHS-2: 34,1 genomas
Tiempo: 60 min
Expert Rev Mol Diagn. 2012;12(5):437-443
Técnicas de diagnóstico de la infección por VPH
Citología (PAP)
Colposcopía
Moleculares
TAAN Hibridación
Técnicas moleculares para VPH aprobadas por FDA
Detección Genotipificación
• En base a PCR
• Son más sensibles y específicas
• Permiten la detección de infecciones latentes subclínicas y
activas
• Determinar los genotipos virales
AMPLICOR® HPV Test (ROCHE)
Aprobado para:
Screening primario de cáncer cervical
Resultados indeterminados del PAP (ASCUS)
Amplificación del DNA mediante PCR Desnaturalización
Hibridación de ácidos nucleicos para detectar: 13 hrVPH
Sensibilidad: 96,1%
Especificidad: 95,6%
VPN: 99,8%-100%
Ausencia de reactividad cruzada
Buena reproducibilidad
Genotipificación de VPH Linear Array VPH Genotyping Test
Etapas procedimiento
Amplificación del ADN
Hibridación de los amplicones con sondas biotiniladas
Detección mediante ELISA
Tipos de Virus que Detecta
• Sensibilidad: 96% •Especificidad: 99% •Sin reactividad cruzada
• Buena reproducibilidad
• Precisión: 95-100%
Detección de ARNm de E6/E7 de VPH
• La expresión de mARN de los oncogenes E6 y E7 de VPH indica actividad viral
• Se observa que le progresión de las lesiones aumentan en relación directa con los niveles de mRNA de E6 y E7
Importancia de una prueba
mRNA E6/E7 de HPV
Prueba negativa
No hay actividad oncogénica
Alto VPN
Prueba positiva
Hay multiplicación viral
El monitoreo de los niveles de mRNA permite seguir la progresión de la enfermedad con alto VPP
Alto nivel de expresión de E6/E7
Existe actividad celular anormal
Integración viral
Utilidad de las técnicas moleculares para la detección del VPH
La principal utilidad es la detección temprana de lesiones de alto riesgo NIC II/III y recurrencia post-tratamiento no identificadas por citología
Screening de cáncer cervical primario
Screening de cáncer cervical primario simultáneo con PAP
Especiar los intervalos del “screening” para las mujeres que no presenten infección por hrVPH
Seguimiento de mujeres con citologías ASCUS
Seguimiento post tratamiento de NIC II/III
Adolescentes con LSIL (lesión intraepitelial escamosa de bajo grado)
Las adolescentes presentan alta frecuencia de anormalidades citológicas de bajo grado (ASC-US/LSIL)
La prevalencia de VPH en <21 años con citología ASC-US varía entre el 70 -77%
Hay regresión espontánea en 91% de los casos a los 36 meses
Muy pocas desarrollan cáncer cervical
No está indicada la detección de VPH en adolescentes con ASC-US/LSIL para evitar colposcopias ó tratamientos innecesarios
http://www.cancer.gov/cancertopics/pdq/screening/cervical/HealthProfessional
Am J Obstet Gynecol 2007; 197: 346-55
J Natl Cancer Inst 2002; 94: 102-7
¡Gracias¡