Post on 03-Jul-2015
Tema 14. Principios de Genética Bacteriana. Variaciones Bacterianas. Mutaciones.
Tema 15. Recombinación.
Tema 16. Transferencia de material genético en bacterias: Transformación. Conjugación. Transducción.
Tema 17. Ingeniería genética. Técnicas y Aplicaciones.
BLOQUE III. MICROORGANISMOS PROCARIOTICOS
III.C. GENÉTICA BACTERIANA
1. CONCEPTO Y APROXIMACION HISTORICA-Experiencia de Lederberg y Tatum-Experiencia de Davis-Experiencia de Lederberg y Hayes
2. DESCRIPCION DEL PLASMIDO F Y DE SUS FUNCIONES BÁSICASEstructura físicaOrganización genética y funcionalProcesos de integración y escisión del plásmido F
3. FASES DE LA CONJUGACIÓN-Contactos entre las células-Transferencia del DNA
F+ x F- ----- F+, HfrHfr x F- ----- F-F' x F- ----- F', Hfr
-Estado del DNA donador en la célula receptora
4. APLICACIÓN DE LA CONJUGACIÓN EN EL LABORATORIO
Tema 16. Conjugación.
Conjugación: Transferencia de material genético entre dos bacterias vivas, donadora y aceptora, a través de un contacto físico
1. CONCEPTO Y APROXIMACIÓN HISTÓRICA
Transferencia de ADN plasmídico
Transferencia de ADN cromosómico
Donador
Receptor
•Aparición de colonias con frecuencia muy superior a la de doble reversión
- Escherichia coli K12
Prototrofos
RECOMBINACIÓN
A B
Medios mínimos sin metionina, biotina, treonina, leucina
Mutantes auxotrofos1.Experimento de Lederbergy Tatum (1946)
2. Experimento de Davis
Bio- met- thr+ leu+ Bio+ met+ thr- leu-A B
4 h
No crecimiento
E. coli K12
A B
2. Experimento de Davis
Bio- met- thr+ leu+ Bio+ met+ thr- leu-A B
4 h
Prototrofas
E. coli K12
A B
Sin filtro
Las células necesitan contactar físicamente
Bio+ met+ thr+ leu+
3. Experimento de Lederberg y Hages
Célula donadorafértil F+
Célula receptora no fértil F-
La conjugación es un FENÓMENO POLAR
Factor sexual F+
Plásmido F(genes para los pili)
OmpA
Receptores pili
3. Experimento de Lederberg y Hages
Célula donadorafértil F+
Célula receptora no fértil F-
La conjugación es un FENÓMENO POLAR
Factor sexual F+
OmpA
Receptores pili
3. Experimento de Lederberg y Hages
Célula donadorafértil F+
Célula receptora no fértil F-
La conjugación es un FENÓMENO POLAR
Factor sexual F+
F+ F- F+ F+
F+ ~ (100%)Frecuencia recombinación (10-5)
(la auxotrofía desaparecía rara vez)
Estructura física, organización genética y funcional del plásmido F
25 genes(33Kb)
Región tra
Plásmido F100 Kb
-biosíntesis y ensamblaje de pelos sexuales-estabilización de los agregados de conjugación-regulación genética de la transferencia-proteínas que tapan las porinas ompA
(fenómeno de exclusión de superficie)
Región de replicación:ori V y ori T
Región tra
Estructura física, organización genética y funcional del plásmido F
Plásmido F100 Kb
Región de integración del plásmido en el cromosoma y de su escisión.
Organización genética y funcional del plásmido F
Región de replicación:ori V y ori T
Región tra
Integración del plásmido F en el cromosoma
autónomo integradoF+ Hfr
F+ Hfr
Recombinación homóloga(RecA)
Recombinación homóloga(RecA)
Hfr
Gen cromosómico
Plásmido F
Escisión del Plásmido FHfr F’
Separación del plásmido F llevándose parte del cromosoma bacteriano
Posibles situaciones del plásmido F
autónomo integradoAutónomo (con un fragmento cromosoma)
Hfr F’
F+
Célula F+
Célula F-
1. Contactos entre células fértiles y células infértiles
1-10 pelos sexuales
OmpA
HfrF’
F+
3. Fases de la conjugación
1. Contactos entre células fértiles y células infértiles
OmpA
Cromosoma bacteriano Plásmido F
Pili
Puente conjugativo
Genes tra
Célula F+ Célula F-
oriT
El pelo se despolimeriza
El pili se retrae
2.Transferencia y procesamiento del DNA conjugativo
oriT
a) Transferencia entre células F+ y F-
TODA LA POBLACIÓN F+
Inicio síntesis de la cadena complementaria en célula receptora
Final transferencia DNASeparación células
Endonucleasahelicasa
Genes tra
a) Transferencia entre células F+ y F-
F+ F- F+ F+
oriT
b) Transferencia entre células Hfr y F-
Ori THfr F- Hfr F-
tiene un fragmento del DNA plasmídico y cromosómico con el cual puede recombinar o degradar
TODA LA POBLACIÓN F+
c) Transferencia entre células F’ y F-
F’ F- F’ F’
oriT
TODA LA POBLACIÓN F’
Cruces posibles
•F+ X F-→ F+
•Hfr X F-→ Hfr + F-
•F’ X F- → F’
Cruces no viables (exclusión superficial)
F+ X F+ F+ X Hfr F+ X F’
F’ X F’ F’ X Hfr
Hfr X Hfr
1.- Contactos entre las células2.- Transferencia del DNA
FASES DE LA CONJUGACIÓN
4. Aplicación de la conjugación en el laboratorio
Construcción de mapas cromosómicos(actualmente por secuenciación)
Ingeniería genética
1. Concepto y aproximación histórica
2. Tipos de bacteriófagos implicados en la transducción
3. Tipos de transducciónTransducción generalizada
-características-mecanismo
Transducción especializada-características-mecanismo
4. La transducción en la naturaleza y en el laboratorio
Tema 16. Transducción.
Transducción: Transferencia de material genético en la que el DNA exogenote es vehiculizado desde la célula donadora a la aceptora a través de un bacteriófago
1. Concepto y aproximación histórica
Células A ++ -- x Células B -- ++
Medio de cultivo deficiente enbio, met, tre, leu, etc.
En todos los casos hubo crecimiento de colonias recombinantes
Prototrofos
Norton Zinder y Joshua LederbergSalmonella typhimurium
Células A ++ -- x Filtrado del cultivo de las células B -- ++Células A ++ -- separadas por filtro Células B -- ++
+ DNAsas
Medio de cultivo deficiente enbio, met, tre, leu, etc.
+ DNAsas Prototrofos
1. No se requiere contacto célula-célula2. No se afecta por la DNAasa3. Agente de transferencia atraviesa el
material poroso (bacteriófago)4. La recombinación solo ocurre con
células receptoras que tengan sitios receptores para el virus
Transducción Proceso de transferencia genéticamediada por un virus
2. Tipos de bacteriófagos implicados en la transducción
Ciclo lítico Ciclo lisogénico
inducción
Adsorción
Penetración
Síntesis de ácidos nucleicos y proteínas
Ensamblaje
Lisis
2. Tipos de bacteriófagos implicados en la transducción
Fagos virulentos Fagos atemperados o moderados
1.Transducción generalizada
2.Transducción especializada
Fagos virulentos
Fagos atemperados o moderados
Empaquetamiento inespecífico
1.Transducción generalizadaFagos virulentos
Partículas transductantes
Partículas virales
Ciclo lítico
La transducción no siempre va seguida de recombinación del DNA exogenote en la
célula receptora
b)DNA transductante muy diferente(sistemas modificación-restricción)
DNA se recombina
DNA no se recombina
a)Transducción abortiva
Recombinación homóloga o generalizada
Supervivencia DNA donador
Degradación
Transferencia génica estable
Ciclo lisogénico
Adsorción
Penetración
Síntesis de ácidos nucleicos y proteínas
Ensamblaje
Lisis Integración del DNA fago
Profago Bacteria lisogénica
Recombinación específica de sitio
2.Transducción especializada
Fagos atemperados o moderados
Recombinación específica de sitio - Entre secuencias idénticas(sitios de fijación “att”)
- No interviene RecA
Escherichia coli
Fago lambda
Integrasa(int)
2.Transducción especializada
Fagos atemperados o moderados
ATAT
TATA
ATAT
TATA
integrasa
A TATTAT A
A TAT
TAT A
Recombinación específica de sitio
ATAT ATATTATA TATA
λ
E.coli
Recombinación específica de sitio
-proceso reversible el DNA del fago se escinde (escisionasa)
Ciclo lítico
Escisión normal Escisión defectuosa
Transducción generalizada(igual fagos virulentos)
Infección célula receptora
gal+
gal+
gal+
Fagos defectivos
Escisión defectuosa
Infección célula receptora
a) Entrecruzamiento para integrar genes bacterianosCromosoma bacteriano que contiene DNA del dador
b) Integración como profagoCromosoma bacteriano que contiene DNA viral y del dador
gal+
Bacteriofago + gal+
Fagos defectivos
No dan ciclos líticos
2. TRANSDUCCIÓN ESPECIALIZADA
a) Fagos con ciclo lisogénico(atemperados)
b) Se transfieren zonas concretasdel cromosoma
c) Se produce por escisión del profago y consiguiente entrada a fase lítica
d) El DNA genómico de la bacteria va unido al DNA del fago
TIPOS DE TRANSDUCCIÓN
1. TRANSDUCCIÓN GENERALIZADA
a) Fagos con ciclo lítico(virulentos)
b) Se transfiere con igual probabilidad cualquier región del cromosoma
c) La eficiencia de la transducción para cualquier marcador cromosómico es muy baja
d) El DNA transferido puede sufrir recombinación generalizada
Transducción en la naturaleza y en el laboratorioEn la Naturaleza: tiene importancia como mecanismo de intercambio genético
En el Laboratorio: clonaje de genes, construcción de mapas genéticos y librerías genómicas