Post on 08-Jan-2016
description
7/17/2019 tema27
1/17
TRANSCRIPCION EN PROCARIOTAS
El dogma central de la biologa molecular y el flujo de la informacin gentica
Transcripcin Traduccin
DNA RNA PROTEINA
Funciones del RNA
a) Material gentico: puede replicarse y retrotranscribirse a DNA. Ejemplos, virus del mosaico
del tabaco y retrovirus.
b) Funcional: RNA ribosmico (rRNA), transferente (tRNA) y otros. No se traducen y
constituyen productos finales de la expresin gnica; regulatoria y catlisis.
c) Informativa: RNA mensajero (mRNA). Se traduce a protenas.
Molculas de RNA en E.coli
Tipo Cantidad relativa (%) Coeficiente de
sedimentacin (S)
Masa (kDa) Nmero de
nucletidos
RNA ribosmico
(rRNA)
80 23
16
5
1.2 x 103
0.55 x 103
3.6 x 101
3700
1700
120
RNA de
transferencia (tRNA)
15 4 2.5 x 101 75
RNA mensajero
(mRNA)
5 Heterogneo
COMPARACION ENTRE REPLICACION Y TRANSCRIPCION
SIMILITUDES
FENOMENO PROCESIVO
POLARIDAD 53
SE UTILIZA COMO MOLDE UNA CADENA DE DNA
COMPLEMENTARIDAD DE BASES
DIFERENCIAS
REPLICACION TRANSCRIPCION
ADN POLIMERASA ARN POLIMERASA
dATP, dGTP, dCTP y dTTP ATP, GTP, CTP y UTP
TODO EL CROMOSOMA UNO O POCOS GENES
UNA RONDA POR CICLO VARIOS ARN POR GEN EN CADA CICLO
DOS CADENAS UNA CADENA
CON CEBADOR SIN CEBADOR
ACTIVIDAD CORRECTORA SIN ACTIVIDAD CORRECTORA
7/17/2019 tema27
2/17
Reaccin catalizada por la RNA polimerasa
Los tres tipos de RNA celular en E.coli son sintetizados por la misma RNA
polimerasa segn las instrucciones dadas por un DNA molde.
REACCION GLOBAL
RNA polimerasa
(NMP)n+ NTP (NMP)n + 1+ PPi
RNA RNA alargado
La RNA polimerasa de E. coli requiere los siguientes componentes para la
sntesis de RNA:
1)
Un molde. Preferentemente es un DNA de doble cadena. Tambin
puede servir como molde un DNA monocatenario.
2) Precursores activados. Se requieren los cuatro nuclesidos trifosfato;
ATP, GTP, CTP y UTP.
3) Un in metlico divalente. Son eficaces el magnesio y el manganeso.
La RNA polimerasa cataliza la iniciacin y la elongacin paso a paso de
las cadenas de RNA.
Mecanismo de la reaccin catalizada por la RNA polimerasa
7/17/2019 tema27
3/17
Composicin de la RNA polimerasa
Es un enzima con un peso molecular de unos 500 kDa formado por cinco clases de
subunidades. La composicin subunitaria del enzima completo, llamado holoenzima, es
2
70
y .
Subunidades de la RNA polimerasa de E. coli
Diferentes Factores reconocen promotores con diferentes secuencias consenso
Funciones de la RNA polimerasa.
a) Localiza en el DNA los centros de iniciacin.
b) Desenrrolla un tramo corto del DNA helicoidal para producir un molde de DNA de
un solo filamento, del cul tomara instrucciones.
c) Selecciona un ribonuclesido trifosfato correcto y cataliza la formacin de un
enlace fosfodister.
d) Localiza las seales de terminacine) Interacciona con las protenas activadoras y represoras que modulan la velocidad
de transcripcin.
Subunidad Gen Nmero Masa (kDa) Funcin
Rpo A 2 37 Iniciacin de la cadena, interaccin con las protenas
reguladoras y elementos promotores corriente arriba
Rpo B 1 151 Iniciacin y elongacin de la cadena, forma enlaces
fosfodister
Rpo C 1 155 Unin al DNA
70 Rpo D 1 70 Reconoce al promotor e inicia la sntesis
1 11 Desconocida
Gen Masa (kDa) Uso Secuencia - 35 Separacin Secuencia - 10
rpoD 70 General TTGACAT 16-18 pb TATAAT
rpoH 32 Choque trmico CCCTTGAA 13-15 pb CCCGATNTrpoN 54 Nitrgeno CTGGNA 6 pb TTGCA
fliA 28 Flagelar CTAAA 15 pb GCCGATAA
7/17/2019 tema27
4/17
Tecnica de huellas dactilares con DNasa I como herramienta para identificar los
lugares del DNA que unen protenas especficas.
7/17/2019 tema27
5/17
Estudios del promotor
Promotor A3 de T7
Promotor A3 de T7
- resistentes a la metilacin
- ms vulnerables a la metilacin
- * purinas metiladas que interfieren con la unin
- contactos de fosfatosLas dos regiones conservadas estn
separadas por dos vueltas de hlice
Identificacin de los residuos G que contactancon la RNA polimerasa en el promotor deltriptfano de E. coli
La RNApolimerasa de E.coli unida al DNA. Por
conveccin, el sitio de iniciacin de la transcripcin sueleanotarse +1. Los pares de bases que se extienden en ladireccin de avance de la transcripcin se dice que estncorriente abajo del sitio de inicio; los que se extienden
en la direccin opuesta estn corriente arriba. Lasubunidad
70 se une a secuencias especficas cerca de las
posiciones -10 y -35 en el promotor. Las subunidades se
ubican cerca del DNA en direccin corriente arriba. Lassubunidades y se asocian con el sitio de inicio.
7/17/2019 tema27
6/17
Visin general del proceso de transcripcin
La Sntesis de RNA comienza en los promotores y los acontecimientos ms importantes son:
Fase de Iniciacin:
a)
Unin a los sitios de iniciacin en el DNAb) Comienzo de la transcripcin
c) Desalojo del promotor
1 Unin de la RNA polimerasa al DNA y migracin hacia un lugar de iniciacin.
2 - Formacin de complejo promotor cerrado
- Complejo dbil Ka = 107108M-1
- Vida media de unos 10 seg- Unin de tipo electrosttico
(dependiente de la fuerza inica)
3 - Formacin de un complejo promotor abierto
-Se desenrolla el DNA desde 10 a + 1
-Complejo estable Ka = 1012M-1
-Estable al aumento de la fuerza inica
-Depende de la temperatura
-Isomerizacin dependiente de Mg
2+
,( aumenta la abertura desde 12 a + 2)
4 - 2 centros para la fijacin de NTP
- Iniciacin: especfico para nucletidos purnicos
semisaturacin 100 M
- Elongacin: semisaturacin 10 M
5 - Comienza la sntesis de RNA con una purina
- Direccin 53
- La mayor parte de las iniciaciones son abortivas
(complejos inestables?)
- Despus de la transcripcin de unos 10 nucletidos
se elimina la subunidad . Queda un complejo
estable y comienza la fase de elongacin.
7/17/2019 tema27
7/17
Fase de elongacin
BURBUJA DE TRANSCRIPCION
La fase de elongacin de la transcripcin comienza despus de la
formacin de unos pocos (9-10) enlaces fosfodister y la eliminacin de la
subunidad .
Modelo de una burbuja de transcripcin durante la elongacin del
transcripto de RNA. El DNA dplex se desenrolla en el extremo anterior dela RNA polimerasa y se rebobina en su extremo posterior. La hlice hbrida
RNA-DNA gira sincrnicamente.
Se han calculado las longitudes del DNA desenrollado y del hbrido
DNA-RNA a partir de las reactividades de los complejos de transcripcin
con reactivos como el KMnO4, que oxida las bases en los cidos nucleicos
de cadena simple. Mediante la tcnica de la huella se determina la longitud
del DNA en contacto con el enzima. Seis o siete nucletidos del RNA
detrs del DNA hbrido estn protegidos del ataque de la ribonucleasa
mediante su unin al enzima.
7/17/2019 tema27
8/17
Retroceso de un complejo de elongacin
Actividad RNasa intrnseca a la RNA pol. Protenas GreA y GreB
7/17/2019 tema27
9/17
7/17/2019 tema27
10/17
Seales antiterminacin
N Protena codificada por el fago que impide la terminacin de la transcripcin
NUT(N-utilization) secuencia especfica entre el promotor y el sitio de terminacin
a) Un tallo asa (horquilla) llamado caja Bque interacta con N
b) Una secuencia lineal de unos 12 nucletidos llamada caja A, que interacta con
Nus B y S 10NUS(N-utilization substances) protenas celulares para la utilizacin de N
a) NUS Afactor de elongacin
b) NUS B ?
c) NUS E(S 10)protena de la subunidad pequea del ribosoma
d) NUS G?
Antiterminacin por la protena N del fago y protenas celulares de E. coli. Despus de
que se reconoce la caja del sitio Nut y se une a ella, la protena N interacta con el complejo
Nus A-polimerasa. La posterior fijacin rpida de Nus B, Nus G y S 10 produce un complejode antiterminacin estabilizado por mltiples contactos protena-protena. Mientras la
polimerasa se desplaza alo largo del molde de DNA alejndose del sitio Nut, de manera que
se forma un asa de RNA de tamao cada vez mayor. El complejo impide la terminacin, y la
transcripcin prosige. Se muestra la inhibicin de la accin de terminacin del factor
hexamrico; la antiterminacin tambin se produce en sitios independientes.
7/17/2019 tema27
11/17
INHIBIDORES DE LA TRANSCRIPCION
Rifampicina. Antibitico que inhibe la RNA polimerasa in vitro y bloquea la sntesis de
RNAr, RNAt y RNAm in vivo
-amanitina. Toxina contenida en la seta venenosa Amanita. Inhibe las RNApolimerasas eucariotas II y III, pero predominantemente la RNA polimerasa II
Cordicepina. Terminador de cadena de la transcripcin, el nucletido de la cordicepina
se incorpora a la cadena en crecimiento y esta se para, ya que carece del grupo 3 OH a
partir del cul continuar
Actinomicina D. Se une al DNA intercalandose entre los pares de bases G-C
adyacentes y los brazos del polipptido cclico llenan el surco estrecho prximo.
7/17/2019 tema27
12/17
Modificaciones post-transcrpcionales de los RNA ribosmicos y transferentes.
Procesamiento de transcritos de pre-rRNA en bacterias
-Siete copias en el genoma de E. coli. Difieren en nmero, localizacin e identidadde los tRNA incluidos en el transcrito primario.
Bases
1 RNasa III2 RNasa P
3 RNasa E
Nucleasas especficas
Promotores
Opern
7/17/2019 tema27
13/17
Modificaciones postranscripcionales de los tRNA en bacterias
Escisin y modificacin qumica
- Precursores mayores; transcriptos que poseen de uno a siete tRNA -
1- Endonucleasacorta por el lado 3.
2- RNasa D, exonucleasa, hasta dos nucletidos de la secuencia CCA- 3
3- RNasa P, genera el extremo 5
4- RNasa D, elimina los dos nucletidos del extremo 3, genera la secuencia CCA- 3
4a- Nucleotidil transferasaaade el trinucletido CCA al extremo 3, si ste est ausente
5- Modificacin enzimtica de las bases: pseudouridinas, 2 isopenteniladenosina,
o2-metil guanosina, 4-tiouridina, etc.
Maduracin del tRNAtyr
de E. coli
7/17/2019 tema27
14/17
Mtodo de extensin del cebador para localizar el extremo 5 de un transcrito
7/17/2019 tema27
15/17
Mtodo de cartografiado con nucleasa S1 para identificar el extremo 5 de un RNA
7/17/2019 tema27
16/17
MAXAM GILBERT
7/17/2019 tema27
17/17
SANGER