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I
MEZCLA SINRGICA ENTRE POLIHIDROXIBUTIRATO (PHB) Y CAUCHO
NATURAL (LATEX) PARA OBTENER UN COPOLIMERO
ALEXANDER ENRIQUE ELLES MONTERO
CESAR AUGUSTO GARCA ECHEVERRY
Trabajo de grado para optar el ttulo
De ingeniero qumico
UNIVERSIDAD DE CARTAGENA
FACULTAD DE INGENIERAS
PROGRAMA DE INGENIERA QUMICA
CARTAGENA DE INDIAS D.T. Y C.
2012
II
MEZCLA SINRGICA ENTRE POLIHIDROXIBUTIRATO (PHB) Y CAUCHO
NATURAL (LATEX) PARA OBTENER UN COPOLIMERO
ALEXANDER ENRIQUE ELLES MONTERO
CESAR AUGUSTO GARCA ECHEVERRY
TRABAJO DE GRADO PARA OPTAR EL TTULO
DE INGENIERO QUMICO
DIRECTORA DE TESIS
ING. GESIRA DE AVILA MONTIEL
UNIVERSIDAD DE CARTAGENA
FACULTAD DE INGENIERAS
PROGRAMA DE INGENIERA QUMICA
CARTAGENA DE INDIAS D.T. Y C.
2012
III
NOTA DE ACEPTACIN
---------------------------------------------
Presidente del Jurado
----------------------------------------------
Jurado
----------------------------------------------
Jurado
IV
AGRADECIMIENTOS
Agradecemos inicialmente a Dios por darnos la fuerza, paciencia y sabidura para poder
elaborar este documento y alcanzar los logros propuestos.
A nuestra tutora Gesira De vila Montiel MSc., por su asesora, confianza y colaboracin
durante todo el proceso.
A nuestros padres por su apoyo a lo largo de la carrera y del desarrollo de este trabajo.
Agradecemos a la facultad de medicina, la colaboracin, disposicin y prstamo de las
instalaciones, de manera especial, al Sr. Gregorio, la seora Mara, docentes y jvenes
investigadores del rea de postgrado en la Facultad de Medicina.
Al Programa de Ingeniera de Alimentos por brindarnos un espacio de trabajo, asesora y
capacitaciones brindadas, especialmente a los Ingenieros: Germn, ngel y Santiago.
Finalmente al programa de Ingeniera Qumica y a las docentes Lesly Patricia Tejeda y
Mara Teresa Acevedo, por su apoyo incondicional, sus sugerencias y apreciaciones. As
mismo, al Dr. lvaro Realpe por permitirnos el espacio de trabajo en los laboratorios del
Programa.
V
CONTENIDO
Pg.
RESUMEN 4
ABSTRACT 5
INTRODUCCIN 6
1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 8
2. JUSTIFICACIN 10
3. OBJETIVOS 11
3.1 OBJETIVO GENERAL 11
3.2 OBJETIVOS ESPECFICOS 11
4. MARCO DE REFERENCIA 12
4.1 ESTADO DEL ARTE 12
4.2 ANTECEDENTES 17
4.3 MARCO TERICO 24
4.3.1 POLIHIDROXIALCANOATOS (PHA`S) ........................................................................ 24
4.3.2. POLIHIDROXIBUTIRATO (PHB) ................................................................................ 26
4.3.3 PRODUCCIN DE PHB CON MICROORGANISMOS ....................................................... 26
4.3.3.1 GENERALIDADES DEL GNERO AZOTOBACTER SP. ................................................. 27
4.3.3.2 AZOTOBACTER VINELANDII .................................................................................. 30
4.3.4 EL CAUCHO NATURAL (LTEX) ................................................................................ 31
4.3.5 MEZCLAS DE PHB-CAUCHO NATURAL...................................................................... 33
5. METODOLOGA 34
5.1 TIPO DE INVESTIGACION 34
5.2 TECNICAS DE RECOLECCION DE INFORMACION 34
5.2.1 FUENTES DE INFORMACIN PRIMARIA ...................................................................... 34
5.2.2 FUENTES DE INFORMACIN SECUNDARIA ................................................................. 34
5.3 POBLACIN .................................................................................................................. 35
5.4 MUESTRA .................................................................................................................... 35
5.5 HIPTESIS .................................................................................................................... 35
5.6 VARIABLES .................................................................................................................. 36
5.7 OPERACIONALIZACIN DE VARIABLES ....................................................................... 36
5.8 DISEO DE EXPERIMENTOS ......................................................................................... 37
VI
5.9 DETERMINACIN DEL CRECIMIENTO BACTERIANO ...................................................... 38
5.10 CARACTERIZACIN DEL POLMERO ............................................................................ 39
5.11 TEXTURMETRO (PRUEBA DE TRACCIN MECNICA)............................................... 39
5.12 PROCESAMIENTO DE LA INFORMACIN ..................................................................... 40
6. RESULTADOS 41
6.1 DIAGRAMA DE FLUJO DEL PROCESO 41
6.1.1 MATERIALES Y EQUIPOS ........................................................................................... 42
6.1.2 PREPARACIN DEL MEDIO DE CULTIVO ..................................................................... 43
6.1.3 CARACTERIZACIN BACTERIANA .............................................................................. 44
6.2 FERMENTACIN Y OBTENCIN DEL PHB ................................................................ 44
6.3 DETERMINACIN DEL CRECIMIENTO BACTERIANO ...................................................... 45
6.4 EXTRACCIN DE LA BIOMASA Y DEL POLMERO ..................................................... 48
6.5 CARACTERIZACIN DEL POLMERO ......................................................................... 49
6.6 RENDIMIENTO Y PRODUCTIVIDAD TOTAL DE BIOMASA Y PRODUCTO (PHB) ........... 51
6.7 PREPARACIN DE LAS MEZCLAS DE PHB-LTEX ................................................... 53
6.8 CARACTERIZACIN DE LAS MEZCLAS DE PHB-LTEX ........................................... 54
6.9 PROCESAMIENTO Y ANLISIS DE DATOS ............................................................... 54
7 ANLISIS Y DISCUSIN DE RESULTADOS 55
7.1 DETERMINACIN DE PROPIEDADES TRMICAS POR DSC ............................................. 55
7.2 TEXTURMETRO (PRUEBA DE TRACCIN MECNICA) ............................................. 69
8 CONCLUSIONES 75
9 RECOMENDACIONES 77
BIBLIOGRAFA 78
ANEXOS 84
1
NDICE DE TABLAS
Pg.
TABLA 1. BACTERIAS QUE ACUMULAN PHA. .......................................................... 27
TABLA 2. DEFINICIN DE VARIABLES PARA PROCESO DE FERMENTACIN. 36
TABLA 3. RELACIONES DE CONCENTRACIN DE LA MEZCLA ........................... 38
TABLA 4. PROPIEDADES A EVALUAR ........................................................................ 38
TABLA 5. CARACTERSTICAS DE LAS COLONIAS DE CULTIVO [39] .................. 44
TABLA 6. RESULTADOS D.O. PARA LA BIOMASA ................................................... 46
TABLA 7. COMPARATIVO CONCENTRACIN DE PHB. ........................................... 51
TABLA 8. CLCULO DE LA RELACIN DE LAS VARIABLES PARA EL PROCESO
DE FERMENTACIN. ....................................................................................................... 52
TABLA 9. PROPIEDADES TRMICAS OBTENIDAS POR DSC. ................................. 60
TABLA 10. COMPARATIVO MEZCLAS PHB-LTEX VS. MCL-PHA: CAUCHO
NATURAL ........................................................................................................................... 62
TABLA 11. INTERACCIONES MOLECULARES Y SUS RANGOS DE ABSORCIN.
.............................................................................................................................................. 64
TABLA 12. CUADRO COMPARATIVO ESPECTROS IR PARA MEZCLA PHB-
LATEZ Y PHB/P (HB-IPN-AAM) ..................................................................................... 68
TABLA 13. RESULTADOS PRUEBA DE TRACCIN PARA LTEX. ........................ 69
TABLA 14. RESULTADOS PRUEBA DE TRACCIN PARA LTEX-PHB (10:10 P/V)
.............................................................................................................................................. 70
TABLA 15. PROPIEDADES MECNICAS OBTENIDAS POR PRUEBA DE
TRACCIN. ........................................................................................................................ 74
2
NDICE DE FIGURAS
Pg.
FIGURA 1. HISTORIA DE PHA`S. ................................................................................... 18
FIGURA 2. ESTRUCTURA QUMICA DEL POLIHIDROXIBUTIRATO (PHB) .......... 26
FIGURA 3. A) COLONIAS DE AZOTOBACTER SP. EN MEDIO LIBRE DE
NITRGENO. B) MORFOLOGA DE LAS CLULAS DE AZOTOBACTER SP. ......... 28
FIGURA 4. ESQUEMA DE LA SNTESIS DE PHB EN AZOTOBACTER SP. ............. 29
FIGURA 5. IZQUIERDA: GRNULOS DE PHB (COLOR CLARO) EN CEPA NO
MUTANTE DE LA BACTERIA AZOTOBACTER. DERECHA: CEPA MUTANTE DE
LA MISMA BACTERIA. .................................................................................................... 30
FIGURA 6. PIGMENTACIN VERDE-AMARILLO CARACTERSTICA DE
AZOTOBACTER VINELANDII. ....................................................................................... 31
FIGURA 7. ESTRUCTURA DEL LTEX (CIS- 1,4POLIISOPRENO) ........................... 32
FIGURA 8. DIAGRAMA DE FLUJO DEL PROCESO DE OBTENCIN DEL
COPOLMERO LTEX-PHB. ........................................................................................... 41
FIGURA 9. CURVA DE CRECIMIENTO PARA LA CINTICA CON AZOTOBACTER
VINELANDII. ..................................................................................................................... 46
FIGURA 10. CURVA AJUSTADA CINTICA DE CRECIMIENTO AZOTOBACTER V.
OD VS. TIEMPO. ................................................................................................................ 47
FIGURA 11. PRODUCCIN DE POLMERO Y BIOMASA A DISTINTAS
CONCENTRACIONES DE INOCULO.............................................................................. 49
FIGURA 12. CURVA PATRN DE CARACTERIZACIN DE PHB, MTODO LAW
AND SLEPECKY. ............................................................................................................... 50
FIGURA 13. PRUEBA DSC PARA MUESTRA DE LTEX. .......................................... 55
FIGURA 14. PRUEBA DSC PARA MUESTRA DE PHB- LTEX (5:10 P/V) ............... 57
FIGURA 15. PRUEBA DSC PARA MUESTRA DE PHB- LTEX (10:10 P/V) ............ 58
FIGURA 16. PRUEBAS DSC SUPERPUESTAS .............................................................. 59
FIGURA 17. TERMOGRAMA POR DSC PARA MUESTRAS DE PHA EN DISTINTAS
MEZCLAS DE CAUCHO: A. MCL-PHA EXTRADA DE C. TESTOSTERONI; B.
MEZCLA DE MCL-PHA: CAUCHO NATURAL (15:85 % P/P); C. MEZCLA DE MCL-
3
PHA: CAUCHO NITRILO (15:85% P/P); D. MEZCLA MCL-PHA: CAUCHO DE
BUTADIENO (15:85 %P/P) ................................................................................................ 61
FIGURA 18. ESPECTRO INFRARROJO DE LA MEZCLA PHB-LTEX (5:10 %P/V) 65
FIGURA 19. ESPECTRO INFRARROJO PARA MEZCLA PHB-LTEX (10:10 %P/V).
.............................................................................................................................................. 66
FIGURA 20. ESPECTRO IR DEL PHB Y P (HB-IPN-AAM)........................................... 67
FIGURA 21. PRUEBA DE TRACCIN. A) LTEX Y B) LTEX-PHB (10:10 P/V) .... 71
FIGURA 22. PRUEBA DE TRACCIN MECNICA MEZCLA PHB-MADERA ......... 72
FIGURA 23. PRUEBA DE TRACCIN MECNICA MEZCLA PHB-ALMIDN (TIPO
III). ....................................................................................................................................... 73
FIGURA 24. MORFOLOGA AZOTOBACTER VINELANDII. FOTOGRAFA EN
MICROSCOPIO. ................................................................................................................. 88
FIGURA 25. MORFOLOGA EN CRECIMIENTO DE AZOTOBACTER VINELANDII.
.............................................................................................................................................. 88
FIGURA 26. METODOLOGA DE EXTRACCIN DE PHB POR EL MTODO DE
DIGESTIN CLOROFORMO-HIPOCLORITO (70-30 V/V) RESPECTIVAMENTE. ... 89
FIGURA 27. MOLDE DE PHB-LTEX (10:10 %P/V) ..................................................... 90
FIGURA 28. MOLDE DE LTEX ..................................................................................... 90
FIGURA 29. PRUEBA DE TRACCIN MECNICA EN TEXTURMETRO A) INICIO
DE LA TRACCIN B) ESTIRAMIENTO C) FRACTURA DE LA MUESTRA. ............ 91
4
RESUMEN
En este trabajo de grado se presenta el proceso para la produccin de Polihidroxibutirato
(PHB) por fermentacin con Azotobacter vinelandii y posterior mezcla con caucho natural
(Ltex) para la obtencin de un copolmero; Para la fermentacin primero se activ la cepa
liofilizada, seguido de una etapa de incubacin para luego inocular con 10% del volumen
total del medio precrecido (20 ml) el cual contena 0.662 g/L de biomasa; al mismo tiempo
se prepar un medio Norris modificado e inocul con los 0.662 g/L de biomasa, dejando en
un proceso de fermentacin a condiciones de pH 7.5, Temperatura de 30C, 225 rpm por 48
horas. Concluido el proceso de fermentacin, se extrajo una biomasa total de 8.2 g/L y
procedi a separar la biomasa del PHB por el mtodo de digestin con cloroformo-
hipoclorito en relacin (70-30 %v/v) respectivamente; luego por los procesos de
centrifugacin, filtracin y evaporacin se obtuvo PHB. Se caracteriz el polmero por
espectrofotometra y el mtodo de Law and Slepecky y as se determin una concentracin
de PHB obtenida de 5,57 g/ml. Finalmente, se procedi a realizar mezclas sinrgicas con
Ltex por mtodo de dilucin en proporcin 5:10 y 10:10 P/V. Se evaluaron propiedades
fsicas y mecnicas a travs de Anlisis DSC y Traccin Mecnica. Los resultados del
anlisis trmico mostraron que a mayor dilucin con PHB, el ndice de cristalinidad
disminuy, producto de la diferencia aritmtica entre la temperatura de transicin vtrea y la
temperatura de cristalizacin. A su vez, el rango de estabilidad trmica se expandi entre
valores de 150-280C; En los ensayos de traccin mecnica, el modulo de Young
disminuy, mostrando una reduccin en la rigidez del copolmero, evidenciando mayor
elasticidad y maleabilidad, proyectando su uso en aplicaciones plsticas.
Palabras claves: PHB, Azotobacter vinelandii, Mezcla sinrgica, copolmero.
5
ABSTRACT
This grade paper shows the process for the production of polyhydroxybutyrate (PHB) by
fermentation with Azotobacter vinelandii and further mixed with natural rubber (latex) to obtain a
copolymer; At first for fermentation, lyophilized strain was activated, followed by an incubation
step and then inoculated with 10% of the total volume of the pregrown media (20 ml) which
contained 0.662 g / L of biomass; at the same time was prepared and inoculated Norris modified
media with 0.662 g / L of biomass, leaving in a fermentation process conditions of pH 7.5,
temperature 30 C, 225 rpm for 48 hours. Finishing that step, it was extracted a total biomass of 8.2
g / L and proceeded to separate the biomass of PHB by the method of digestion with hypochlorite in
relation chloroform (70-30% v / v) respectively, then by the processes centrifugation, filtration and
evaporation gave PHB. Polymer was characterized by spectrophotometry and the method of Law
and Slepecky, and thus determined a concentration of PHB obtained from 5.57 g / ml. Finally, it
proceeded to make Latex synergistic blendings by dilution in 5:10 and 10:10 ratio P / V. We
assessed physical and mechanical properties by DSC Analysis and Mechanical Traction. Thermal
analysis results showed that greater dilution with PHB, the crystallinity index decreased, resulting
from the arithmetic difference between the glass transition temperature and the crystallization
temperature. In turn, the thermal stability range was expanded between values of 150-280 C; In
the mechanical tensile tests, the Young's modulus decreased, showing a reduction in the stiffness of
the copolymer, showing greater elasticity and pliability, projecting its use in plastic applications.
Keywords: PHB, Azotobacter vinelandii, synergistic blending, copolymer.
6
INTRODUCCIN
La innovacin, ciencia y tecnologas del siglo XXI, se han encaminado a brindar un sin
nmero de soluciones a las principales limitaciones de la industria a temas ambientales,
tcnicos y de costos. La contaminacin producida por el uso excesivo de combustibles
fsiles y sus derivados y la mala disposicin y tratamiento de residuos industriales, han
contribuido a la bsqueda de nuevas alternativas, en especial el rea de la biotecnologa y
biomateriales para generar posibles soluciones.
El uso de materiales plsticos en la industria, ha generado un alto grado de desarrollo
petroqumico, debido a la gran variedad de propiedades y aplicaciones de estos materiales,
de all, su gran injerencia y uso general en las necesidades de la cotidianidad de la
sociedad. Pero, las propiedades que los hacen muy buenos materiales, son las mismas, que
les brindan gran resistencia a la degradacin biolgica, porque las cadenas de monmeros
principales son muy difciles de romper por distintos medios, ya sean fsicos o qumicos,
por tanto, estos materiales plsticos se acumulan en los distintos ecosistemas.
La biotecnologa presenta una posible solucin a esta problemtica, mediante el
procesamiento de biomateriales como la sntesis de Polihidroxialcanoatos (PHA`s) y
mezclas de los mismos con plsticos y cauchos naturales. Los PHA`s son polmeros
naturales producidos por bacterias, las cuales los utilizan como reservas de nutrientes.
Presentan gran variabilidad de propiedades fsicas y qumicas comparables a los plsticos
derivados del petrleo y propiedades biolgicas, llegando a ser biodegradables. Una de las
posibles soluciones presentada por el rea de la biotecnologa, est encaminada a la sntesis
de Polihidroxialcanoato (PHA) a partir de distintos microorganismos, donde cada uno usa
su propia ruta metablica de sntesis, diferencindose del hecho que cada bacteria puede ser
aislada de medios acuticos y/o terrestres, y cada especie bacteriana usa un sustrato
propio para la fermentacin del PHA, siendo el sustrato el factor econmico limitante del
proceso.
7
Una bacteria que emplea un sustrato econmico como bagazo de caa y glucosa, y es
aislada de un medio terrestre es la Azotobacter vinelandii, la cual puede sintetizar hasta el
90% en base seca de Polihidroxibutirato (PHB) en condiciones ptimas de crecimiento a
temperatura y pH adecuado. El proceso posterior a la sntesis es la bioseparacin donde se
retira el PHB intracelular, para lo cual se debe escoger la forma ms correcta de hacerlo sin
contaminar la muestra deseada.
Los PHA`s se caracterizan porque se pueden obtener mezclas de copolmeros de tipo
Polihidroxibutirato (PHB)/Polihidroxivalerato (PHV), las cuales, presentan mejores
propiedades plsticas; de igual forma, se pueden realizar mezclas de estos copolmeros
con plsticos o cauchos naturales, obteniendo nuevos materiales biodegradables, y con
propiedades mecnicas y plsticas mejoradas.
La propuesta de esta investigacin consiste en obtener PHB a partir de la Azotobacter
vinelandii para luego realizar la mezcla con caucho natural y de esta manera, obtener un
material con excelentes propiedades mecnicas y qumicas, de carcter biodegradable, es
decir, no bioacumulable, a condiciones de tratamiento bacteriano.
Adems, la propuesta incluye un diseo experimental para la sntesis y obtencin del
material biolgico polimrico a travs de la fermentacin con la bacteria Azotobacter
vinelandii, tomando en cuenta las condiciones y factores ambientales.
La investigacin, de antemano, supone que la mezcla obtenida, constituir un material
estable no solo qumica sino tambin fsicamente, premisa, con la cual, se le otorgara las
propiedades ptimas y necesarias para entrar en competencia con los materiales
convencionales y bien posicionados de la industria petroqumica e industrial.
8
1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
El deterioro ambiental del planeta debido a la industrializacin y uso excesivo de recursos
de origen fsil y subproductos petroqumicos, es una problemtica que ha impulsado en
gran medida el estudio de fuentes energticas alternativas, para mantener un equilibrio
entre lo ambiental y lo econmico, por tal razn, la ciencia est en la bsqueda de nuevos
materiales como forma de desarrollo tecnolgico, industrial y ambiental, pues brindan la
oportunidad de ser materiales biodegradables a distintas aplicaciones.
Los plsticos y cauchos sintticos constituyen la base principal de la industria
petroqumica, debido a su gran variedad de propiedades fsicas y qumicas, permitindoles
ser aplicados a mltiples procesos; pero el uso intensivo de estos plsticos y cauchos
sintticos (obtenidos mediante procesos de polimerizacin de productos derivados del
petrleo); De hecho, constituyen entre el 60% y 80% de los desechos marinos de todo el
mundo [49], por su alta estabilidad tanto fsica como qumica, traducida en su gran
resistencia a la degradacin contribuyen al fortalecimiento de la problemtica ambiental,
por su alta estabilidad tanto fsica como qumica, traducida en su gran resistencia a la
degradacin.
Por otro lado, se encuentran los Polihidroxialcanoatos (PHAs), polisteres biolgicos
sintetizados por un gran nmero de microorganismos y especies vegetales, en especial
bacterias; adems, existen consorcios microbianos capaces de consumir las cadenas
carbonadas principales de estos polmeros, rompiendo sus estructuras fundamentales,
convirtindolas a dixido de carbono y agua, dndole as el carcter de materiales
biodegradables. Los PHA`s de ms inters para la ciencia son los PHB
(Polihidroxibutirato), PHV (polihidroxivalerato) y PHB/PHV; estos son polmeros de
mezclas entre los PHB y PHV. Estos han ganado gran importancia dentro de la nueva
generacin de materiales, ya que pueden obtener mezclas entre ellos y con otros materiales
dando como resultado un material con propiedades de biodegradabilidad y de gran
resistencia mecnica [2].
9
Dentro de los materiales de uso comn en la industria se destaca el caucho natural (cis-1,4-
polisopreno), un producto vegetal procesado obtenido de la savia de varios centenares de
especies de rboles, en especial de la familia Hevea Brasiliensis y plantas existentes en
distintas partes del mundo, por ejemplo en el frica ecuatorial, el sudeste asitico y
Sudamrica. La savia de aspecto lechoso o ltex extrada de estos rboles es usada de forma
intensiva en procesos industriales como la produccin de neumticos, suelas de zapato y
muchos componentes aislantes de uso industrial [7].
Existe una problemtica relacionada con el uso de materiales sintticos, con su
acumulacin en ambientes naturales y contaminacin de los mismos, en gran medida por
su naturaleza y sus buenas propiedades mecnicas y qumicas, como los cauchos (las llantas
son fabricadas en este material, y es uno de los residuos ms representativos por su gran
generacin, para todo tipo de vehculos); Por esta razn, estos materiales no son amigables
con el ambiente, incurriendo en costos de disposicin y tratamiento final de dichos
materiales. En la literatura hay muy poca informacin relacionada respecto al estudio
sinrgico de mezclas de PHA`s con cauchos naturales, lo cual dificulta la implementacin
de estos procesos a escala industrial.
10
2. JUSTIFICACIN
El inters despertado por la sntesis y obtencin de nuevos materiales, tipo biolgico
(biomateriales), ha contribuido a generar ideas en bioprocesos y biosntesis de productos
polimricos, los cuales, al ser mezclados con productos sintticos de uso en la industria,
como los cauchos, produzcan un nuevo material con una mejora en sus propiedades
mecnicas, reolgicas, fsicas, qumicas y biolgicas.
En vista de la importancia y necesidad del uso de biomateriales econmicos y viables para
la industria, como los PHA`s y sus mezclas tales como las de poli [(R)-hidroxibutirato-co-
(R)-hidroxivalerato)] con cis-1,4-polisopreno (caucho natural) entre otros, se hace
necesario una investigacin orientada al desarrollo y sntesis de Polihidroxibutirato (PHB) a
partir de microorganismos con el fin de realizar una mezcla con caucho natural a distintas
concentraciones de PHB y, poder analizar mediante caracterizacin y pruebas de resistencia
de materiales el comportamiento de la mezcla; as mismo, se busca comparar como variar
el rendimiento del PHB en el caucho natural, es decir, en qu relacin de concentraciones
se obtendrn mejores resultados de propiedades mecnicas en la mezcla.
Este tipo de investigacin brinda la oportunidad de suministrar informacin til respecto al
rendimiento de la mezcla de PHB con caucho natural; pues, aun no ha sido desarrollada
plenamente y en particular se conocen ciertas tendencias del comportamiento final de la
mezcla, aunque, se espera como resultado una mezcla con alto rendimiento mecnico, con
bajo ndice de cristalinidad, y alta resistencia fsica y qumica, y como resultado un
material til en los distintos procesos y aplicaciones del caucho.
Esta investigacin busca incentivar al desarrollo biotecnolgico con miras a la proteccin y
cuidado ambiental, de modo que el material resultante de la mezcla sea un material
biodegradable en presencia de ciertos microorganismos selectos.
11
3. OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GENERAL
Obtener un copolimero a partir de una mezcla sinrgica entre Polihidroxibutirato
(PHB) y caucho natural (ltex) determinando sus propiedades mecnicas y
reolgicas.
3.2 OBJETIVOS ESPECFICOS
Sintetizar PHB por fermentacin con Azotobacter vinelandii.
Aplicar un procedimiento adecuado de bioseparacin para la obtencin del PHB.
Preparar Mezclas sinrgicas de Polihidroxibutirato/Ltex.
Evaluar las concentraciones de los componentes de la mezcla PHB-Caucho natural
mediante caracterizacin de las propiedades mecnicas.
12
4. MARCO DE REFERENCIA
4.1 ESTADO DEL ARTE
Muchas investigaciones han surgido desde el final del siglo XX hasta la primera dcada del
siglo XXI en torno a biomateriales, en especial, PHA`s. Entre los factores motivadores para
la comunidad cientfica, est el deterioro ambiental, el aumento de las demandas de
materias primas y la bsqueda de energas alternativas.
Los biomateriales, tiene su origen debido a la necesidad principal de fabricar productos con
alta competitividad en materia de propiedades mecnicas frente a los derivados de la
industria petroqumica, con ciertas caractersticas: no txicos, sin problemas de desecho y
permitan una disposicin final adecuada de estos residuos. El estudio y sntesis de nuevos
plsticos es la necesidad prioritaria referente a los biomateriales. Criterios como la
biocompatibilidad y biodegradabilidad los definen con ms propiedad [3].
Los estudios de los PHA ms recientes, han buscado mejorar los biomateriales ya
obtenidos, realizando combinaciones y mezclas entre distintos Polihidroxialcanoatos e
incluso sustancias petroqumicas, y de origen natural como el ltex, y aqu se mencionan
los ms destacados:
Las mezclas de diferentes tipos de polisteres han cautivado la atencin de la comunidad
cientfica y se han obtenido buenos resultados. Ejemplo de ello, es la caracterizacin
realizada a la mezcla de policarbonato de propileno (PPC) con copolmero de poli (-
hidroxibutirato-co- -hidroxivalerato) en diferentes proporciones. Caractersticas trmicas y
anlisis estructurales fueron estudiados a travs de tcnicas de DSC (escaneo de
calorimetra diferencial) y TGA (termogravimetra); HNMR (espectroscopia de resonancia
nuclear magntica) y SEM (microscopia de escaneo electrn). Esto permiti un
mejoramiento en la degradacin del PPC del 65%, no solo comparando su estado sino
tambin con respecto al copolmero [4].
13
Por otro lado, la mezcla de poli [(R)-hidroxibutirato-co-(R)-hidroxivalerato)] con poli [(R)-
hidroxibutirato-alt-poli (oxido de etileno)] (HE) fue ensayada (Xu Li et al.). Se parti de la
idea de mejorar la miscibilidad del poli (oxido de etileno) mediante la inclusin de
segmentos de PHB con segmentos dentro de la matriz de PHBV y as optimizar las
propiedades mecnicas del copolmero.
Un estudio de calorimetra de barrido diferencial mostr que la interferencia de la
cristalizacin del PHBV permitira la alta miscibilidad del Oxido de Etileno (OE) en los
segmentos de HE. Tambin, se report la existencia de partculas hidrofbicas tanto en la
superficie como en el seno volumtrico del material, lo cual se puede mejorar con la mezcla
de HE.
En Colombia, tambin se han llevado a cabo investigaciones con respecto a los
Polihidroxialcanoatos. A travs de un grupo de investigacin de la Universidad Javeriana,
Marcela Franco- y colaboradores [5] aislaron 10 tipos de actinomicetos a travs de varias
muestras de suelo de la regin de Boyac. Estas cepas se cultivaron en dos tipos de medio;
la muestra que a travs del cultivo gener mas PHA (27.48% de rendimiento en peso seco)
fue la muestra o cepa 7F (que luego de pruebas bioqumicas se logr identificar como
Streptomyces subrutilus). Este estudio permiti mostrar que a pesar de que en los
actinomicetos las condiciones limitantes de nitrgeno no favorecen el crecimiento y la
produccin de PHA, en especies bacterianas como la identificada anteriormente, hay un
gran potencial, disponible en nuestros suelos. Solo requerira de un manejo diferente de los
factores nutricionales con respecto a los establecidos para la produccin de PHA en otras
bacterias para obtener resultados similares.
Al comparar las pruebas de tensin entre PHBV hidratado y PHBV/HE el primero se
mostr frgil mientras que el segundo, fue dctil. De hecho el esfuerzo a la ruptura se
increment en un 394 % con un contenido de HE del 15% en peso. Las conclusiones de
este estudio mostraron la excelente afinidad de las mezclas PHBV/HE con agua y se le
atribuy a la afinidad mostrada entre el PHB y HE en la matriz del PHBV. En la misma
14
investigacin se ensay la adicin de plaquetas de oxido de etileno, para ensartar en la
superficie de la pelcula segmentos de oxido de Polietileno (PEO) del HE [6].
Nano compuestos de polmeros entre el biodegradable Poli (3-hidroxibutirato) (PHB) y la
montmorillonita orgnica modificada Cloisite30B (30B) fueron sintetizados por la tcnica
de fundicin de disolvente; y degradados isotrmicamente a 230, 235, 240 y 245 C (Matko
Erceg, Tonka Kovacic, Ivka Klaric). De hecho la inclusin de 30B mejora la estabilidad
trmica del PHB y el efecto ms pronunciado se obtuvo en concentracin de 30B al 1% en
peso. De acuerdo a los resultados obtenidos la degradacin del PHB solo y la mezcla
PHB/30B se puede describir en dos regiones: la primera en donde aparece una prdida de
peso pequea, y la segunda, asignada como la etapa principal del mecanismo de
degradacin, donde la ms notoria prdida de peso tiene lugar. Los parmetros empricos
cinticos (E, A y g ()) del mecanismo de la degradacin fue objeto de esta investigacin
[7].
Es bien conocida la gran variedad de alternativas para cultivar y sintetizar
polihidroxialcanoatos a partir de un gran nmero de microorganismos. Aunque, es
pertinente anotar el gran impacto de las condiciones de cultivo y medio liquido en el tipo de
PHA sintetizado. Dentro del gran numero de estudios desarrollados recientemente
alrededor del mundo, cabe mencionar el realizado en Malasia con cidos orgnicos de
POME, sus siglas en ingls (Efluentes del Molino de Aceite de Palma) con el cual se han
hecho estudios donde perfilan a la digestin anaerobia de estos productos como potencial
fuente de Carbono que contribuira con la sntesis y produccin de polihidroxialcanoatos
(PHAs) [8].
Por otro lado, se encontraron investigaciones orientadas al comportamiento y
biodegradabilidad de los PHA`s: un polmero del acido 3-polihidroxibutrico y un
copolmero de PHA, especficamente de los cidos 3-polihidroxibutirico y 3-
polihidroxivalrico en ambientes costeros. Este hecho tuvo lugar en las costas del mar del
sur de China (Nha Trang, Vietnam), y segn los resultados arrojados por dicha
investigacin, factores como la forma del polmero, la tcnica de preparacin del PHA,
15
entre otros, afectan la biodegradabilidad ms en comparacin con la composicin de los
materiales. El ambiente salino favoreci a la degradacin de los mismos. Sin embargo, el
grado de cristalinidad se mantuvo invariable, es decir, tanto la fase amorfa como la
cristalina se desintegraron. Las especies degradadoras fueron identificadas y se destacaron
a Enterobacter sp. (4 cepas), Bacillus sp. y Gracilibacillus sp [9].
Llegando a una revisin ms particular, encontramos estudios con respecto al PHB
(Polihidroxibutirato), del cual hay un gran repertorio y se menciona la caracterizacin de
mezclas con PHA, y la correlacin con el transporte del agua a travs de la hidrofobicidad
de varios productos [BDPE (polietileno de baja densidad) y PA(poliamida)] (Yu.N.et al.).
Dicha investigacin comprendi el anlisis de la relacin PHB/BDPE para regular la
resistencia a la hidrolisis o biodegradacin a travs del control de la permeabilidad del
agua. La relacin entre el transporte de agua y la morfologa mostrara el impacto del
componente del polmero sobre la regulacin del flujo de agua en la matriz hidrofbica. El
estudio concluy que el uso de mezclas PHB/PA pueden constituir soluciones para el
diseo de matrices en el transporte de drogas en medicina [10].
De forma particular, existen estudios bien detallados con relacin al acido poli lctico
(PLA), uno de los polisteres naturales ms abordado en la actualidad. Con
modificaciones especificas de tipo superficial y volumtrica, se pueden precisar mejoras
considerables, en las propiedades mecnicas, fsicas y qumicas. Esta ltima resea marca
una lnea ms de investigacin con respecto a los polihidroxialcanoatos [11].
Redireccionando la idea de las mezclas con PHB, aqu se puede observar lo siguiente:
Se han hecho intentos fructferos para combinar al PHB con la celulosa acetato
butirato. Mediante una caracterizacin de la mezcla, se utilizan tcnicas de
calorimetra, espectroscopia, rayos X, entre otras para investigar el efecto de la
composicin (fraccin en peso de Celulosa Acetato Butirato (CAB)) y la
temperatura en comparacin con las relaciones intermoleculares, para definir las
propiedades mecnicas de tal mezcla. La cristalinidad es el factor que se modifica y
desarrolla a travs de los anlisis por espectroscopia con IR [12].
16
Una combinacin entre poli (-caprolactona) (PCL) y poli (3-hidroxibutirato-co-3-
hidroxivalerato) por tcnicas de fundicin de disolvente o electroespining.
(Costantino Del Gaudio et al.) mostr una gran superioridad en propiedades
mecnicas, especficamente, el modulo de elasticidad y resistencia a la traccin. As
mismo, el producto present una menor segregacin entre los dominios cristalinos
que se tradujo en las mejoras significativas [13].
Sin embargo, la mezcla de PHA`s no ha sido la nica opcin postulada. Una
alternativa para desarrollar las potencialidades de los biomateriales ha consistido en
la adicin de plastificantes, la gran mayora del tipo natural, y se han incorporado
en las tcnicas de preparacin por su baja toxicidad y buena compatibilidad. Todo
esto para solucionar una de las dificultades propias con los Polihidroxialcanoatos: la
fragilidad exhibida durante su termoformacin siendo las resinas ftlicas uno de
los plastificantes ms usados para esta aplicacin [14].
La necesidad de generar alternativas y soluciones a los problemas causados por
acumulacin y contaminacin por residuos, especficamente, del tipo plstico ha
llevado a explorar y encontrar nuevos materiales. Las enormes opciones de
investigacin y desarrollo con los Polihidroxialcanoatos, dentro de los biomateriales,
constituye un tema de investigacin e innovacin que cada vez siembra ms
expectativa.
17
4.2 ANTECEDENTES
La presencia de inclusiones sudonoflicas, al igual que del tipo lpidos, las cuales fueron
insolubles en cloroformo se observaron por primera vez en Azotobacter chrooccocum, en el
ltimo siglo. De igual manera en la bacteria Bacillus megaterium se presenciaron
inclusiones de composicin qumica similar y luego seran identificadas como poli (3-acido
hidroxibutrico) P (3-HB) por Lemoigne [15].
Para finales de 1950, ya se haban recopilado suficientes evidencias acerca de estudios del
gen Bacillus para poder sugerir que el P (3-HB) funcionaba como una fuente de reserva
intracelular de carbono y de energa de ese tipo de bacteria. En una revisin del rol y
regulacin de las reservas de energa en los polmeros obtenidos por microorganismos
publicados en 1973 P (3-HB), recibi su primera cobertura amplia como material de
almacenamiento bacteriano similar al almidn y el glucgeno.
Sin embargo, para este propsito las unidades de 3-hidroxibutirato se estimaban como el
nico constituyente hidroxialcanoato (HA) que formaba este polmero de reserva
microbiana. En 1974, Wallen and Rohwedder reportaron la identificacin de otro tipo de
hidroxialcanoatos distintos del 3HB. Entre las unidades de HA que se observaron en los
extractos de cloroformo de lodos activados, se encontraron 3 hidroxivalerato (3HV) y 3
hidroxihexanoato (3HHx), siendo estos los principales componentes en mayor y menor
proporcin, respectivamente. La siguiente dcada, tras la identificacin de heteropolmeros
en el anlisis de sedimentos marinos por cromatografa de gas capilar se revel la presencia
de 3HB y 3HV como componentes predominantes de las otras 11 unidades de HA [15].
Estos microorganismos son capaces de acumular polmeros distintivos como fuentes y/o
reservas futuras de carbn, nitrgeno y fosforo, en forma de inclusiones intracelulares. En
la figura 1, se muestra el recorrido histrico de los PHA`s [15].
18
Figura 1. Historia de PHA`s.
Fuente: Synthesis, structure and properties of polyhydroxyalkanoates: biological polyesters [16]
En 1995, segn estudios de Mas-Castelli et al. [16] se simularon a travs de Microcosmos
(herramienta computacional), las condiciones medioambientales encontradas en los
1900 Identificacin de
inclusiones sudonoflicas
1926 Identificacin de P (3HB)
1960 Determinacin de las
funciones de P (3HB)
Determinacin de las propiedades
de los grnulos nativos de P (3HB)
1974 Identificacin de 3-hidroxialcanoatos
1980 Produccin de PHA conteniendo unidades
de 3, 4,5-hidroxialcanoato
Produccin industrial de P (3HB-co-3HV)
1988 Clonacin de la biosntesis de genes de PHA
Produccin de PHA con bacteria recombinante
Produccin de PHA en plantas transgnicas
Biosntesis de PHA in VITRO
2000 Identificacin de las vas de conexin de la
biosntesis de PHA con las vas centrales
metablicas
1ra Etapa
2da Etapa
3ra Etapa
19
residuos plsticos; microorganismos fueron modelados para simular ecosistemas
microbianos, tal como el de la sulfureta (sedimentos anaerobios), los cuales, fueron
estudiados para accesar al potencial de degradacin de los PHA en condiciones naturales.
Este tipo de investigacin si bien mostr resultados favorables y comparables frente a
pruebas estndares realizadas con PHB, HB-HV (7%) y HB-HV (14%), los ambientes
anaerbicos y aerbicos son de especial cuidado e involucran condiciones de gran
incertidumbre y que a travs de mtodos estandarizados para evaluar el proceso de
degradacin, tales como, prdida de peso, crecimiento microbiano, distribucin de pesos
moleculares, entre otros garantizan mayor precisin y aproximacin de la capacidad de
degradacin de los PHA`s bajo condiciones ordinarias.
Asimismo, en 1998, Bernd H.A y sus colaboradores se interesaron en estudiar las enzimas
claves en la sntesis de PHA. Gracias a ello, en la actualidad 42 genes estructurales de
sintetasa de PHA de 38 bacterias diferentes han sido clonados, y se obtuvieran 30 genes de
secuencias de nucletidos. Las estructuras primarias de las 30 sintasas de PHA fueron
alineadas y analizadas con respecto a la alta conservacin de amino cido y caractersticas
bioqumicas [17].
La fiebre por los nuevos materiales ha tomado y arrojado nuevos mbitos de investigacin.
En 2001, inician la caracterizacin de PHA`s con mezclas; Se supona que el
comportamiento de cristalizacin, propiedades fsicas, y comportamiento de
biodegradabilidad de los polisteres microbianos en mezclas, eran significativamente
afectados por la naturaleza del conjunto de las mismas y dependan en s de su
biodegradabilidad [18].
Al mismo tiempo, pero de manera ms particular se evaluaron las correlaciones entre el
grado de cristalinidad, morfologa, temperatura vtrea, propiedades mecnicas y
biodegradacin de poli (3-hidroxialcanoato) PHA`s y sus mezclas. En gran medida, por ser
frgiles el homopolimero puro, PHB, y el copolimero puro (3-HBP-Co-HV) (88:12) se
busca mezclarlos con otros materiales para incrementar sus propiedades. La idea principal
fue desarrollar polmeros biodegradables de base PHB para mejorar propiedades
20
mecnicas, tales como fractura al stress (27-18 MPa), tensin (400-660%), resistencia al
impacto y estabilidad a largo plazo para as compararlos con PE, PP y PET [19].
De igual manera, se llev a cabo un trabajo encaminado al desarrollo y caracterizacin de
pelculas de mezclas de PHA con soportes. Estas pelculas elaboradas de mezclas de
polisteres mostraron que la elongacin a la fractura de las pelculas de la mezcla
PHBHHx/PHB se increment del 15% al 106% cuando el contenido de PHBHHx en la
mezcla se ampli del 40% al 60%. Los soportes hechos de PHBHHx/PHB consistan en un
60%p/p de PHBHHx mostrando un fuerte crecimiento y proliferacin de condrocitos
(clulas especializadas para el intercambio de nutrientes) en los materiales de fusin
escaneados bajo microscopio electrnico de barrido [20].
No slo, la identificacin de genes es suficiente para hablar con propiedad de los PHA`s.
Estos polmeros en general se construyen de hidroxi-acil-CoA derivados por diferentes vas
metablicas. Dependiendo de su origen microbiano, los bioplsticos difieren en la
composicin de sus monmeros, estructura macromolecular y propiedades fsicas. Un
estudio precedente (2003) se llev a cabo, el cual se enfoc en la descripcin metablica en
el paso a paso de los genes en la biosntesis de determinados PHA`s, as como la
caracterizacin de los mismos (scl [cadena de longitud corta]-PHA; mcl [cadena de
longitud media]-PHA; lcl [cadena de longitud larga]-PHA) [21].
En contraste con, la sntesis de PHA en microorganismos, se desarrollaron ensayos
correspondientes a produccin de caucho (2003). El elastmero ms importante es el
caucho natural (cis-1,4-polisopreno). El caucho del rbol Hevea brasiliensis es hasta ahora
una fuente comercial relevante de este polmero, aunque hay muchas plantas capaces de
sintetizarlo. Los recientes avances en el anlisis de las vas de biosntesis de isoprenoides y
poli-isopreno han alentado a establecer estudios de obtencin de cauchos naturales en
bacterias. Estableciendo la funcionalidad de la biosntesis del cis-1,4-polisopreno en
bacterias, la cual, depende en primer lugar de las vas biosnteticas de isopreno, y en
segundo lugar, la polimerizacin del isopreno por un proceso de alto peso molecular de
preniltransferasa polisoprenoides. Luego, un amplio estudio se realiz para estimar la ruta
21
metablica para conseguir tal propsito. En conclusin, se demostr que a travs de fuentes
renovables de la agricultura, por fermentacin, es posible alcanzar la produccin de caucho
natural en otras especies de plantas modificadas genticamente, como Arabidopsis thaliana
[22].
A continuacin, en 2004, un estudio enfocado en el comportamiento trmico y mecnico
de algunos agro-materiales se llev a cabo. Varias formulaciones basadas en matriz de
almidn plastificado, variando la formulacin de la matriz, el contenido de relleno, longitud
de las fibras y la naturaleza de las mismas. A dichas mezclas se les someti a procesos de
moldeo por inyeccin y extrusin para luego ser caracterizadas. Finalmente, estos estudios
mostraron que la adicin de fibras de celulosa mejora la resistencia trmica de los nanos
compuestos.
Por otro lado, encontramos una investigacin que incluy la ingeniera del proceso de
biosntesis de PHA en la Escherichia coli recombinante, prestando mucha atencin a los
genes intervinientes en la biosntesis para la produccin de distintos tipos de PHA y
mejorar los rendimientos de obtencin. Adems, las vas metablicas inherentes a la E. coli
se disearon para proveer de manera eficiente monmeros de PHA a partir de fuentes
renovables de carbono, tales como los azcares y los cidos grasos. Los resultados
mostraron que para scl-PHA la biosntesis con E.coli fue satisfactoria con niveles de
produccin de 5 g/l*h. En cambio para los mcl-PHA e incluso otros copolmeros de PHA
la historia fue diferente, gracias a la esquematizacin y trazado de los precursores (genes)
de PHA en las rutas metablicas de los cidos grasos [23].
Los Polihidroxialcanoatos son biodegradables y termo procesables, y debido a este hecho,
exhiben oportunidades en el campo de los dispositivos mdicos convencionales y en la
ingeniera de tejidos (Biomdica). Los PHA`s mas destacados, PHB, copolmeros de poli
3-hidroxibutirato-co-3-valerato (PHBV), 4-hidroxibutirato (P4HB), 3-hidroxibutirato-3-
hidroxihexanoato (PHBHHx) y poli 3-hidroxioctanato (OPS) y sus compuestos se han
utilizado para desarrollar dispositivos como suturas, los dispositivos de reparacin, parches
de reparacin, cabestrillos, parches cardiovasculares, clavos ortopdicos, las barreras de
22
adhesin, dispositivos de regeneracin/ reparacin tisular guiada, de reparacin del
cartlago articular, las guas de los nervios, dispositivos de reparacin de tendones, los
andamios de la mdula sea, y vendas para heridas [24].
De modo que, materiales compuestos se prepararon con almidn de maz granular (CS) o
fcula de potasa (PS) con la resina de poli (ster amida) (PEA) con distintas fracciones
volumtricas hasta del 40%. Las propiedades de rendimiento de tensin fueron medidas a
velocidades de formacin entre 0.0017-0.05 s-1
. Los resultados mostraron un aumento en el
lmite de elasticidad de la mezcla CS-PEA conforme lo haca velocidad de deformacin y el
contenido en almidn. La velocidad de deformacin fue ms pronunciada con el
incremento en contenido de almidn. Efectos mixtos se distinguieron en las mezclas de PS-
PEA: a velocidades de deformacin bajas, el rendimiento a la tensin disminuy con el
aumento de la fraccin de almidn, mientras, aument a velocidades de deformacin altas.
Con esto, la inclusin de CS y/o PS en PEA genera mximos en la curva deformacin-
tensin. Demostrndose la efectividad de las inclusiones de PEA en PHA, de forma
particular, para mejorar sus caractersticas [25].
En consecuencia, se desarroll una preparacin de un nanocompuesto de caucho
natural/slica (NR/SiO2) mediante tcnicas de auto-montaje y de composicin de ltex. Los
resultados de tales estudios mostraron lo siguiente: SiO2 se distribua de manera
homognea en la matriz del NR en pequeos grupos de tamao mediano. Los
nanocompuestos, especficamente cuando la slica se encuentra distribuida de manera
uniforme, poseen una mayor resistencia trmica y propiedades mecnicas. Adems, este
tipo de productos polimricos representan un potencial para la fabricacin de productos
mdicos con altos rendimientos [26].
Seguidamente, se han hecho observaciones importantes acerca de las diferentes bacterias
productoras de PHA. Es el caso especfico de la Azotobacter sp. , quien, puede acumular
hasta un 90% en peso de PHA. Sin embargo, presenta una dificultad y es la produccin de
subproductos y microorganismos (alginato) los cuales disminuyen el rendimiento de
produccin. Para tal problema se han propuesto alternativas, una concreta, que cita la
23
manipulacin de especies para acomodar las rutas metablicas y conseguir resultados
ptimos. Una especie mutante para tal propsito, es la Azotobacter ps.mutante [27].
Por esta razn, en bsqueda de obtener ms perspectivas con respecto a los
Polihidroxialcanoatos se han realizado ensayos para analizar la trascendencia de la
exposicin a radiacin de dichos materiales frente al peso molecular, la biodegradacin y
cristalinidad. Tres especies de PHA fueron utilizadas: poli (- hidroxibutirato) y poli (-
hidroxibutirato-co--hidroxivalerato), y una mezcla comercial de poli (- hidroxibutirato) y
poli (-caprolactona). Las muestras se irradiaron en aire a diferentes dosis, con tasa de dosis
constante de 10 kGy/h (medida de irradiacin). El peso molecular se determin por
cromatografa lquida de alta resolucin, el porcentaje de cristalinidad mediante difraccin
de rayos X de gran ngulo y por espectroscopia infrarroja por reflectancia total atenuada, y
la biodegradacin por prdida de peso relativa de muestras dispuestas en medio basal con
sales minerales, inoculado con Streptomyces s. El aumento de la dosis absorbida produjo
desplazamiento de la distribucin de pesos moleculares hacia pesos menores, increment
del porcentaje de prdida de peso relativo durante la biodegradacin, y escasa variacin del
porcentaje de cristalinidad [28].
Hasta 2008, ya se haban ensayado varias mezclas de PHA con otro tipo de materiales y
entre ellos para estudiar el comportamiento de las propiedades mecnicas, qumicas y
elctricas. Dentro de esos intentos, se hace mencin de las mezclas de polihidroxibutirato-
hidroxivalerato (PHB-HV) con almidn de maz en los contenidos en almidn de 0%, 20%,
30%, 40% y 50% se prepararon por colada. En consecuencia, los valores del modulo de
Young, esfuerzo, deformacin a la ruptura por deformacin a la traccin y fuerza de
puncin disminuyeron al aumentar el contenido de almidn. En conclusin, se lleg a
afirmar que las mezclas eran incompatibles a nivel molecular debido a la ausencia de
interacciones, segn medidas de infrarrojo (IR) [29].
24
4.3 MARCO TERICO
4.3.1 Polihidroxialcanoatos (PHA`s)
Los PHA son polmeros naturales producidos por bacterias utilizados como reserva de
nutrientes. Los PHA han atrado la atencin de la comunidad cientfica debido a su fuerte
tendencia a ser biodegradables, sus propiedades fsicas y mecnicas, comparables, a las de
los plsticos derivados del petrleo (estos polmeros presentan propiedades desde plsticos
rgidos y quebradizos, hasta los semejantes al hule) y por ser producidos a partir de recursos
renovables [1].
Los polihidroxialcanoatos (PHA`s) son una familia de polisteres biolgicos pticamente
activos con unidades de monmero (R)-3HA. Los cidos 3-hidroxialcanoatos estn todos
en la configuracin R debido a la estereoespecificidad de la enzima polimrica, PHA
sintetasa [30].
Con respecto a los PHA`s, se puede destacar el carcter termoplstico y/o elastmero de
estos materiales. De acuerdo, a la longitud de cadena se pueden organizar en tres grandes
grupos: scl (siglas en ingls, Longitud de corto alcance)-PHA, mcl (siglas en ingls,
Longitud de medio alcance)-PHA y hcl (siglas en ingls, Longitud de largo alcance)-PHA
[31].
Son polmeros lineales en los cuales el grupo carboxilo de un monmero forma un enlace
tipo ster con el grupo hidroxilo del monmero siguiente. Los PHA se depositan de forma
intracelular como cuerpos de inclusin, por medio de sustratos compatibles y pueden llegar
a representar ms del 90% del peso seco celular [32]. De estos tres se destacan por su
mayor uso y aplicabilidad en la industria los scl-PHA, los cuales son clasificados como
termoplsticos, poseen un elongamiento a la ruptura menor a un 5% pero incorporndoles
unidades de 3HV al P3HB permite aumentar la maleabilidad y resistencia, alcanzndose
valores de elongamiento para ruptura cerca del 50% y estn tambin los mcl-PHA, los
cuales por tener menor cristalinidad y puntos de fusin menores son reconocidos como
elastmeros y poseen elongamiento a la ruptura mayor al 100% [33].
25
Los copolmeros de PHA, segn, algunas investigaciones son estructuras con las cuales se
obtienen mejores propiedades mecnicas, mejora la cristalinidad y temperatura de fusin.
Se pueden encontrar mezclas de copolmeros de PHB-PHB/V y HV (hidroxivalerato),
que al incorporarse a las cadenas principales de PHA`s les brinda mejor rendimiento en
propiedades como la maleabilidad y les da un carcter ms biodegradable.
Se han podido determinar aproximadamente 150 cidos hidroxialcanoicos, saturados,
insaturados, halgenos, aromticos, etc., incorporados a las cadenas principales de PHA
cambiando a su vez las propiedades fsicas del polmero. Estos cambios dependen en gran
medida a los tipos de sustratos suministrados, especificidad en la polimerizacin y las
diferentes rutas metablicas para la formacin de los monmeros [33].
Dentro del amplio grupo de polisteres biolgicos, el ms comn es P (3HB) Poli-3-
hidroxibutirato, con su produccin bien referenciada para un gran nmero de
microorganismos. No slo, es importante destacar la estructura isotctica perfecta con solo
la configuracin- (R), sino, tambin la orientacin de las fibras de la estructura cristalina
del P (3-HB) que han sido determinadas con rayos X [30].
Existe un amplio rango de aplicabilidad para los PHA y se pueden clasificar en dos grupos
principales:
Envases desechables biodegradables
rea farmacutica
Donde en cada rea se aprovecha las propiedades mecnicas y bajos costos de produccin.
Existe tambin un rea de investigacin en bioprocesos donde se realizan trabajos
investigativos con PHA y mezclas con materiales naturales como el caucho natural o Ltex.
Los materiales de PHA`s, exhiben propiedades similares a varios materiales elastmericos
y termoplsticos sintticos comnmente usados en la industria, como por ejemplo el
polipropileno y el caucho sinttico [34].
26
4.3.2. Polihidroxibutirato (PHB)
El Polihidroxibutirato es el primer miembro conocido de esta familia, tiene propiedades
mecnicas semejantes al polipropileno con la ventaja agregada de la biodegradabilidad. Sin
embargo, en la actualidad no es un material que pueda desplazar al polipropileno, pues su
diferencia de precio es muy grande [35]. A continuacin, en la figura 2 se exhibe la
estructura molecular del primer miembro de la familia de los Polihidroxialcanoatos. Se
puede observar la presencia del grupo ster del cido carboxlico en la cadena principal.
Figura 2. Estructura qumica del Polihidroxibutirato (PHB)
Fuente: Miscibilidad de Mezclas Polimricas de Polihidroxialcanoatos [35].
4.3.3 Produccin de PHB con microorganismos
Se han realizado investigaciones en busca de obtener un buen rendimiento de PHA a partir
de cepas bacterianas, los primeros procesos desarrollados para la produccin de PHA con
microorganismos se realizaron mediante procesos de fermentacin utilizando la bacteria
Ralstonia eutropha, la cual es capaz de producir Polihidroxibutirato (PHB) a partir de
glucosa, o Polihidroxibutirato-Valerato (PHBV) a partir de glucosa y propionato, sustratos
cuyo alto costo incida en el precio final del polmero obtenido [32].
A continuacin en la Tabla 1, se presenta un listado de los microorganismos existentes y su
rendimiento de sntesis de PHA, destacando
27
Tabla 1. Bacterias que acumulan PHA.
Bacteria % en peso seco
Ralstonia Eutropha 96
Rhodobacter 80
Azospirillum 75
Azotobacter 73
Methylocitis 70
Leptothrix 67
Pseudomonas 67
Baggiatoa 57
Rhizobium 57
Fuente: http/www.biopolymer.net
La produccin de PHA`s con microorganismos depende principalmente del tipo de factores
externos o ambientales en exposicin de las cepas, como temperatura, pH, cantidad de
oxgeno y nutrientes, entre otros. De los microorganismos referenciados existentes para
poder sintetizar PHA`s, la bacteria Azotobacter sp. Es la que despierta ms inters debido
a su alto rendimiento de conversin y bajo costo de cultivo.
4.3.3.1 Generalidades del gnero Azotobacter sp.
Los microorganismos de este gnero comprenden bacterias con forma bacilar, reaccionan a
la tincin de Gram como Gram negativos (-), las clulas son ovoides, y miden
aproximadamente de 2m a 4m de dimetro, son aerobios pero algunos pueden vivir a
tensiones bajas de oxigeno [36].
En medios libres de nitrgeno con glucosa como nica fuente de carbono, las clulas
jvenes de diferentes especies presentan una forma bacilar con extremos redondeados. Las
colonias jvenes de estos microorganismos son generalmente lisas, opacas, poco convexas
y viscosas, tal como se ilustra a continuacin en la figura 3: en a) cultivo de azotobacter y
b) morfologa de la cepa.
28
Figura 3. A) Colonias de Azotobacter sp. en medio libre de nitrgeno. B) Morfologa de las
clulas de Azotobacter sp.
Fuente: Caracterizacin molecular de cepas nativas colombianas de Azotobacter spp. Mediante Anlisis de
restriccin del DNA Ribosomal 16S [36].
Bioqumicamente son catalasas y oxidasa positivos, reducen el nitrato, producen el sulfuro
de hidrogeno e hidrolizan almidn, las bacterias de este gnero fijan asimbiticamente
nitrgeno y son solubizadoras de fosfatos, adems, realizan procesos de biodegradacin de
plaguicidas como el endosulfan. Son quimio-organotrficas, utilizan para su crecimiento
azcares, alcoholes y sales inorgnicas. Son fijadoras de nitrgeno en vida libre, fijan al
menos 10 mg de N2 por gramo de carbohidrato consumido [36].
Requieren molibdeno para fijar nitrgeno que puede ser parcialmente reemplazado por
vanadio. La bacteria Azotobacter sp. es quimio-hetertrofo, utiliza como fuente de carbono
y energa una gran variedad de cidos orgnicos, azcares o sus derivados alcohlicos,
dentro de las sustancias que utilizan como fuente de carbono y energa se encuentra la
glucosa, fructosa, sucrosa, acetato, fumarato, piruvato, succinato, acetilmetilcarbinol y -
Oxoglutarato. Respecto a la fuente de nitrgeno pueden utilizar nitrato, sales de amonio y
aminocidos, sin embargo la adiccin de nitrato de potasio mejora la produccin de
biomasa. Su crecimiento es normal cuando se encuentra entre pH de 7.0-7.5, requiere una
29
temperatura ptima de 30C, susceptibles a pH cidos, altas concentraciones de NaCl y
temperaturas mayores a 35C [36].
Este tipo de bacteria aislada del suelo, puede utilizar sustratos econmicos y viables como
la sacarosa o melazas de caa, para producir PHB. En esta bacteria el polmero se obtiene
mediante un proceso de sntesis donde actan tres enzimas: una b-cetotiolasa, encargada de
condensar dos molculas de acetil-CoA para formar acetoacetil-CoA, una acetoacetil- CoA
reductasa, para convertir este compuesto en 3-hidroxibutiril-CoA, y una polimerasa, para
polimerizar los monmeros. Este camino metablico lo utilizan la mayora de las bacterias
productoras de PHB, tales como R. eutropha [32].
A continuacin se ilustra el proceso de la ruta metablica para la sntesis de PHB en la
Azotobacter sp. Figura 4.
Figura 4. Esquema de la sntesis de PHB en Azotobacter sp.
Fuente: Bioplsticos: una alternativa ecolgica.
La obtencin de PHB con Azotobacter sp. presenta problemas debido a la produccin de
alginatos, y de tal forma provoca dificultad en la bioseparacin de las clulas para obtener
PHB; adems se genera un cultivo ms viscoso y espeso; y este, a su vez, compite con la
sntesis de PHB por el sustrato suministrado al medio, afectando as el rendimiento de
obtencin de bioplstico.
30
4.3.3.2 Azotobacter vinelandii
Una posible solucin a esto sera conseguir una modificacin gentica de la Azotobacter sp.
tal como la Azotobacter vinelandii la cual puede acumular PHB hasta un 90% de su peso
seco, adems, puede sintetizar copolimero de PHB y PHV con sustratos de bajos costos y
es incapaz de producir alginato. En la Figura 5 se puede observar la diferencia de
produccin de PHB en una cepa no mutante y otra mutante de Azotobacter, donde se puede
observar una mayor produccin de grnulos de PHB y ms grandes, en comparacin con la
cepa original [1].
Fuente: Tomada de Contaminacin ambiental y bacterias productoras de plsticos biodegradables [1].
Azotobacter vinelandii es una bacteria polipoloide, es decir posee varias copias de su
cromosoma, es de tamao muy grande de 2 a 5 m, su morfologa caracterstica se
identifica a continuacin:
Figura 5. Izquierda: Grnulos de PHB (color claro) en cepa no mutante de la bacteria
Azotobacter. Derecha: Cepa mutante de la misma bacteria.
31
Figura 6. Pigmentacin verde-amarillo caracterstica de Azotobacter vinelandii.
Fuente:
4.3.4 El caucho natural (Ltex)
El ltex es una sustancia con un composicin de gran complejidad, puesto que entre sus
elementos constituyentes se encuentran gomas, aceites, azucares, sales minerales, protenas,
alcaloides, terpenos ceras, hidrocarburos, almidn, resinas, taninos y blsamos. Adems, la
cantidad de cada uno de estos compuestos que existe en el ltex vara ostensiblemente lo
que depende de una serie de factores, como la especie vegetal, la parte de la planta en la
que se encuentra, la poca del ao y el tipo de suelo sobre el que crece la planta [37].
Se puede definir al ltex de caucho como una suspensin coloidal acuosa, generalmente de
color blanquecino, segregada por la corteza de rboles laticferos al sufrir una herida en su
tronco, en esta sustancia el polmero se mantiene disperso en la fase acuosa continua de
forma relativamente estable [37].
El caucho natural (cis-1,4-polisopreno) es un producto vegetal procesado obtenido de la
savia de varios centenares de especies de rboles y plantas existentes en distintas partes del
mundo, en especial en el frica ecuatorial, el sudeste asitico y Sudamrica.
32
Figura 7. Estructura del ltex (cis- 1,4poliisopreno)
Fuente: Obtencin de un Material Compuesto de Matriz Elastomrica y de Fibra de Coco [37].
El ltex se obtiene practicando en la corteza del rbol del caucho una incisin en espiral. El
ltex se recoge en vasos colgados del rbol, bajo la incisin, y a continuacin se transfiere a
cubos transportados a las estaciones de procesamiento. Por lo general, se aade amonaco
como conservante. El amonaco rompe las partculas de caucho y produce un producto con
dos fases de aproximadamente un 30 - 40 % de parte slida. Este producto se concentra
hasta obtener un 60% de parte slida, obtenindose as un concentrado de ltex amoniacal
con un 1,6% de amonaco en peso. Con el fin de, evitar la coagulacin y la contaminacin,
se aade a este concentrado un conservante secundario, como el pentaclorofenato sdico, el
disulfuro de tetrametiltiuram, el dimetilditiocarbamato sdico o el xido de zinc.
Entre los diferentes tipos de caucho natural producidos en la actualidad se encuentran: Las
planchas estriadas ahumadas, el caucho de especificacin tcnica, los creps, el ltex, el
caucho natural epoxidizado y el caucho natural termoplstico. De estos, el de mayor
relevancia en la industria es el ltex de caucho natural, a causa de la mayor demanda de
productos para proteccin frente al virus del SIDA y a otros agentes patgenos transmitidos
por la sangre. Los concentrados de ltex se utilizan para la produccin de pegamentos,
tejidos de fondo de alfombras, espumas y productos como globos, guantes y preservativos.
El caucho natural epoxidizado se obtiene tratando el caucho natural con percidos y se
utiliza como alternativa a algunos cauchos sintticos [2].
33
4.3.5 Mezclas de PHB-caucho natural
El caucho natural es otra clase de polmero, el cual, en estado natural es elastmerico y
biodegradable. Las distintas clases de caucho pueden ser mezcladas con sustancias
polimricas tales como los PHB, PHB/V y sus copolmeros, para mejorar las propiedades
fsicas del caucho destacando el incremento en la temperatura de fusin (Tm) y mejora en
la propiedad de traccin mecnica, lo que le brinda la ductibilidad y dureza requeridas para
muchas aplicaciones plsticas [31].
Los cauchos como el ltex, epoxidizados y termoplsticos pueden ser mezclados en
distintas proporciones con PHA`s con el fin de obtener distintos tipos de biomateriales que
brindan propiedades nicas, las cuales pueden ser aprovechadas para aplicaciones de tipo
industrial, medicas y farmacuticas como por ejemplo, guantes de ltex ms duraderos y
resistentes, hule ms flexible y biodegradable, entre otras.
El uso de diferentes tipos de cauchos para ser mezclados con PHA`s pueden ayudar a
mitigar el impacto de dichos cauchos sobre el ambiente, pues una cadena de PHA unida a
la cadena principal de un caucho, brinda la ventaja de hacer al material biodegradable y
abre una puerta de posibilidades a nuevos materiales, con aplicaciones desde elastmeros
rellenos de PHA hasta caucho termoplstico reforzado [31].
34
5. METODOLOGA
5.1 TIPO DE INVESTIGACION
El presente proyecto es una investigacin cuantitativa de tipo experimental; puesto que se
establecen y analizan las relaciones causales con sus respectivos efectos entre variables, lo
cual arrojar xito o no de la misma. De igual forma, se adopta un diseo experimental lo
cual permiti relacionar las variables de pH, concentracin de producto, sustrato y biomasa
contra tiempo y concentracin de ltex y PHB para de esta manera obtener un nuevo
copolmero.
5.2 TECNICAS DE RECOLECCION DE INFORMACION
5.2.1 Fuentes de Informacin Primaria
Las fuentes primarias de este proyecto son los datos obtenidos por las pruebas
experimentales que se realizaron en los laboratorios de la Universidad de Cartagena, en el
edificio de Ingenieras en la dependencia de Tecnologas y Plantas pilotos partiendo de la
activacin del microorganismo, preparacin del inoculo, toma del tiempo de inhibicin y
por ltimo ensayo de fermentacin. Posteriormente se aplicaron mtodos analticos tales
como determinacin de la biomasa por centrifugacin, determinacin del crecimiento
celular, medicin del pH, mezcla con ltex y cuantificacin del copolmero.
5.2.2 Fuentes de Informacin Secundaria
La informacin suministrada para la sntesis de PHB y la mezcla ltex para la elaboracin
del copolmero ha sido a travs de artculos obtenidos de las bases de datos llamadas
35
Science Direct, EBSCOhost y del artculo PHArubber blends: Synthesis, characterization
and biodegradation.
5.3 Poblacin
En este proyecto la poblacin es infinita porque el crecimiento bacteriano se realiza por
fisin binaria (2n; n = ) por lo que, el cultivo bacteriano estar en crecimiento continuo.
Respecto al ltex, se toma como poblacin 4 kilogramos de ese mismo.
5.4 Muestra
El tamao del inculo debe ser el 10% del volumen de trabajo para la sntesis del PHB. La
muestra correspondiente al ltex es de 10 ml. se hace de acuerdo al rendimiento que
aproximadamente es del 90%.
5.5 Hiptesis
Si se adiciona PHB al ltex, se obtendr un copolmero.
Hiptesis Alternativa:
Si se adiciona PHB al ltex, no se obtendr un copolmero.
36
5.6 Variables
Variables dependientes: Concentracin de PHB, biomasa y sustrato (en el proceso de
obtencin del PHB), concentracin de copolmero, % (p/v) de copolmero, Yx/s, Y p/s,
productividad Biomasa, productividad PHB y productividad polmero extracelular.
Variables Independientes: Tiempo y concentracin del PHB en Ltex.
Variables intervinientes: pH y temperatura.
5.7 Operacionalizacin De Variables
Tabla 2. Definicin de Variables para Proceso de Fermentacin.
VARIABLE DEFINICION INDICADOR
Va
riab
les
Dep
end
ien
tes
Concentracin de PHB Cantidad de PHB por
litro de solucin. Gramos/Litro
Concentracin de Biomasa Cantidad de Biomasa
por litro de solucin. Gramos/Litro
Concentracin de
Bioplstico
Peso del Bioplstico
respecto al volumen
del ltex
Gramos Bioplstico/Litro
de ltex
% (p/v) de Bioplstico
Peso del Polmero
respecto al volumen de
ltex
Gramos Polmero/Litros
de ltex
Y x/s Rendimiento de
Biomasa
Gramos Biomasa/Gramos
Sustrato
Yi p/s Rendimiento
intracelular del PHB
Gramos PHB/Gramos
Sustrato
37
qp Velocidad de consumo
de Sustrato (h
-1)
Productividad Biomasa
Productividad de la
Biomasa por hora en
litro de solucin
(Gramos/Lh)
Productividad PHB
Productividad de PHA
por hora en litro de
solucin
(Gramos/Lh)
Clulas que se
producen durante la
fase exponencial
(h-1
)
Vari
ab
les
Ind
epen
die
nte
s Concentracin de PHB en
ltex
Cantidad de PHB por
ml de solucin. mg/ml
Tiempo Lapso necesario para
completar un volumen. Horas
Vari
ab
les
Inte
rvin
ien
tes Ph
Nivel de acidez y
alcalinidad pH
Temperatura
Contenido de la
energa interna de las
molculas.
C
Fuente: Mezcla Sinrgica entre Polihidroxibutirato (PHB) y Caucho Natural (Ltex) para obtener un
copolmero [48].
5.8 Diseo De Experimentos
Se plantea un diseo unifactorial en el cual el nico factor de inters es la proporcin de la
mezcla de PHB con caucho natural. Se realizaron 3 mezclas variando la concentracin de
38
PHB, en solucin de caucho natural. Las variables de respuesta que se evaluarn en las
muestras son las que se presentan en la tabla 2. La tabla 3, referencia los anlisis aplicados
a las mezclas sinrgicas preparadas.
Tabla 3. Relaciones de concentracin de la mezcla
Fuente: Mezcla Sinrgica entre Polihidroxibutirato (PHB) y Caucho Natural (Ltex) para obtener un
copolmero [48].
Tabla 4. Propiedades a evaluar
Fuente: Mezcla Sinrgica entre Polihidroxibutirato (PHB) y Caucho Natural (Ltex) para obtener un
copolmero [48].
5.9 Determinacin del Crecimiento Bacteriano
Se tom una muestra de 2000 l en una celda de vidrio y se midi como blanco en un
espectrofotmetro (Lobomedic UV-Vis Scanning Spectrophotometer Spectro UV-265) a
500 nm, arrojando una densidad ptica (OD) de 0.73, luego se inoculo con el 10% del
volumen inicial que era de 200 ml (20 ml) de medio pre crecido por 24 h y as evitar la
fase de latencia, el cual presentaba una concentracin de biomasa de 0.6625 g/l (peso
Prueba (mg) Polihidroxibutirato (PHB) (ml) CAUCHO NATURAL (Ltex)
1 0 10
2 5 10
3 10 10
Ensayo Mtodo Equipo
Estabilidad trmica. RAMPA DSC
Traccin Mecnica. ESTIRAMIENTO TEXTURMETRO
Espectrometra IR. ATR NICOLET MAGNA 50
39
hmedo), una vez inoculado, se toma otra muestra de 2000 l en una celda de vidrio y se
mide de nuevo el OD, el cual fue de 0.75 por lo que la diferencia con el OD del blanco
refleja la concentracin en ese tiempo 0. Luego, el medio se dejo fermentando en una
plancha automtica con agitacin constante de 225 rpm, temperatura constante de 30C por
48 h. Se tomaban muestras de 2000 l y se media el OD para as poder realizar la curva de
fermentacin y determinar el tiempo ptimo de mayor produccin de PHB. En la siguiente
grfica se reflejan esos resultados [40].
5.10 Caracterizacin del polmero
El polmero se caracteriz por espectrofotometra de UV a 235 nm en una solucin de 1.5
ml de H2SO4 [98%], siguiendo la tcnica de Law and Slepecky [40] tal como se describe a
continuacin:
Se tomo como blanco H2SO4 concentrado, y luego se diluyo el polmero en el cido, y se le
calculo su OD, que fue de 0.9984.
Siguiendo la ecuacin 1:
(Ec. 1)[42]
Para obtener la concentracin en g/ml se divide entre 100 puesto Law y Slepecky
realizan el anlisis a 235 m
5.11 Texturmetro (Prueba de Traccin Mecnica)
Para esta prueba se elaboraron moldes con dimensiones de 0.04 m de ancho, 0,053 m de
largo y un espesor de 0,003 m, que luego se sometieron a una fuerza de jalonamiento, que
40
permiti calcular las magnitudes, para una muestra de ltex y la mezcla ltex-PHB (10:10
P/V).
5.12 Procesamiento De La Informacin
El procesamiento de la informacin de este proyecto, se llev a cabo durante 1 ao, en
donde se encontr informacin que sirvi para la mejor eleccin de los mtodos a utilizar
en la obtencin del copolmero, de igual manera, se cont con la colaboracin de expertos,
los cuales ofrecieron su apoyo incondicional.
41
6. RESULTADOS
6.1 Diagrama de flujo del proceso
Figura 8. Diagrama de flujo del proceso de obtencin del copolmero Ltex-PHB.
Fuente: Mezcla Sinrgica entre Polihidroxibutirato y Caucho Natural para obtener un copolmero [48].
42
La figura 8 presenta esquemticamente, las etapas llevadas a cabo para el cumplimiento de
los objetivos del proyecto, iniciando desde la activacin de la cepa, hasta la caracterizacin
de las mezclas sinrgicas (anlisis DSC y Texturmetro), destacando Preparacin del medio
de cultivo, del precrecido, del medio de fermentacin, la extraccin de biomasa, extraccin
del PHB, preparacin de las mezclas PHB-ltex y caracterizacin de las muestras.
Se establecieron las condiciones ptimas del proceso para la extraccin del
Polihidroxibutirato, adems se fijaron parmetros de pH, temperatura, fuentes de
hidrogeno, fsforo, potasio, nitrgeno y oxigeno, a concentracin homognea
mediante agitacin, todo esto para el mantenimiento y crecimiento adecuado de la
bacteria Azotobacter vinelandii utilizada en la sntesis del PHB; as mismo se llev
a cabo la extraccin e implementacin de las operaciones unitarias de secado y
preservacin del ltex en amoniaco a temperatura inferior a 17C.
6.1.1 Materiales y equipos
En el desarrollo del proyecto se utilizaron los siguientes equipos:
Cmara de flujo laminar (Forma Scientific).
Incubadora (Memmert 854 Schwabach).
Autoclave. (GEMM Sturdy SA-300 H)
Plancha con control de agitacin magntica y temperatura (Thomson Itester IT-09)
Texturometro (Shimadzu EZ-S)
Calormetro diferencial de barrido DSC (Q200 V24.4 Build 116)
Espectrofotmetro (Lobomedic UV-Vis Scanning Spectrophotometer Spectro UV-
265)
Bao trmico (Water Batch GEMMY Co. Modelo YCW-010E)
Microscopio (Leica M205 A).
pH-metro (CG 840 B SCHOTT).
Balanza analtica (Explorer-OHaus Corporation SN E0341119042329).
Refrigerador (Refrigerador whirlpool 13 p3 nuevo).
43
Centrifuga (Universal Modelo PLC-012 E).
De igual manera se utilizaron los materiales listados a continuacin:
Erlenmeyer.
Cajas de petri.
Tubos de ensayo.
Pipetas graduadas y no graduadas.
Beakers.
Agitador magntico.
Mechero de alcohol.
6.1.2 Preparacin del medio de cultivo
Se realiz la activacin de la cepa liofilizada segn indicaciones del CECT (Centro Espaol
de Cultivos Tipo) (Anexo A). Se re-suspende el lifilo con ayuda de una pipeta Pasteur en
el medio liquido esterilizado anteriormente en autoclave a 121C. El medio Norris, fue el
medio adecuado para la conservacin de la cepa, con pH 7.2 ajustado con HCl [0.25 M] y
por recomendaciones del CECT debe estar libre de nitrgeno. Se prepar un medio de 200
ml y su contenido se detalla a continuacin:
K2HPO4 0.2 g
MgSO4.7H2O 0.04 g
CaCO3 0.2 g
NaCl 0.04 g
FeSO4.7H2O 0.02 g
Na2MoO4.2H2O 1.00 mg
Agar en polvo (solo para medio slido) 3.00 g
Glucosa anhidra 2.00 g
Agua para medio 200 ml [38]
44
Despus, se procede a inocular en medio slido y lquido todo el contenido de la muestra,
finalmente, se ajusta el pH a 7.2 con HCl [0.25 M], se realiz la incubacin por 72 horas de
cada uno de los medios a temperatura de 30C.
6.1.3 Caracterizacin bacteriana
Para la identificacin de las paredes bacterianas, se aplic la tcnica de tincin de Gram y
de esta manera se comprob que la cepa es Gram (-), la morfologa observada de la cepa es
en forma de bacilo (Anexo B). En la tabla 4, se detallan las condiciones de crecimiento, y
las propiedades fsicas del cultivo con Azotobacter vinelandii.
Tabla 5. Caractersticas de las colonias de cultivo [39]
Medio Medio libre de nitrgeno (Medio Norris)
pH 7.2
Tiempo de
Cultivo 72 horas
Temperatura 30
Superficie Cerosa
Densidad Opaca
Consistencia Mucoide
Forma Fusiforme
Elevacin Convexa
Borde Entero
Pigmentacin Verde-Amarillo
6.2 Fermentacin y obtencin del PHB
Se prepar el medio Norris con un volumen de trabajo de 200 ml para el pre-crecido o
semilla, con esterilizacin previa e incubacin por 24 horas, tomando un inoculo de
bacteria activada previamente en medio Norris slido y aadindole dos fuentes extra de
45
nitrgeno, 0.1 g de extracto de levadura y 0.2 g de peptona, con el fin de obtener un mayor
rendimiento.
Para determinar el tiempo adecuado de produccin de polmero se realizaron 6 ensayos
para describir la cintica de crecimiento en el proceso de fermentacin, para lo cual se
prepara medio Norris Modificado de 400 ml con los siguientes componentes:
1.2 g Glucosa,
0.46 g Acetato de amonio,
0.04 g peptona,
0.08 g MgSO4.2H2O,
5.2 mg citrato frrico,
1 mg Na2MoO4
Agua para medio 400 ml [38]
Se prepar un buffer de sales de fosfato (9.2 mg K2HPO4-0.024 g KH2PO4) con el
objetivo de mantener el pH a 7.5, el cual se ajust con una solucin de NaOH 1 M y
se esteriliz en autoclave a 121C a 15 lbf/ cm2
por 15 min [40].
6.3 Determinacin del Crecimiento Bacteriano
En la tabla 6, se reflejan los resultados de Densidad ptica (D.O.) aplicados en el proceso
de fermentacin. Se observ un aumento de esta variable, conforme pas el tiempo,
obedeciendo este comportamiento al crecimiento de la bacteria, como resultado de los
nutrientes en el caldo de cultivo.
46
Tabla 6. Resultados D.O. para la Biomasa
Luego de tener los datos dentro del rango requerido, se procede a graficar:
Figura 9. Curva de Crecimiento para la Cintica con Azotobacter vinelandii.
y = -1E-05x3 + 0,0002x2 + 0,0428xR = 0,9903
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
0 10 20 30 40 50
OD
t(h)
Cinetica Azotovacter v.
Datos experimentales
Polinmica (Datos experimentales)
47
Fuente: Mezcla Sinrgica entre Polihidroxibutirato (PHB) y Caucho Natural (Ltex) para obtener un
copolmero [48].
La Figura 9 muestra, que cuando se realiza la fermentacin con previa inoculacin, la fase
de adaptacin, donde los microorganismos comienzan adaptarse al medio (fase de
latencia) se minimiza, mantenindose el crecimiento exponencial, hasta aproximadamente
las 45 h, tiempo en el cual se da la mayor produccin de PHB, considerndose el producto
obtenido como el metabolito secundario.
Para tener datos ms claros, se realiz un ajuste polinomial de grado 3 que describe muy
bien el comportamiento de la cintica, el cual se describe en la Figura 10:
Figura 10. Curva ajustada Cintica de Crecimiento Azotobacter v. OD vs. Tiempo.
Fuente: Mezcla Sinrgica entre Polihidroxibutirato (PHB) y Caucho Natural (Ltex) para obtener un
copolmero [48].
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
OD
t(h)
Grafica ajustada Azotobacter v
Datos de cinetica
48
Esto demuestra que el tiempo de mayor produccin de PHB, a las condiciones de trabajo de
pH 7.5, agitacin a 225 rpm es de 45 a 48 horas.
6.4 Extraccin de la Biomasa y del Polmero
Una vez determinado el tiempo ptimo de fermentacin, se realiza la extraccin del PHB,
y se procede de la siguiente manera: Cumplidas las 48 h de fermentacin, se centrifugaron
los 400 ml a 3200 rpm por 15 min en tubos de ensayo con muestras de 10 ml; despus, se
calcul la concentracin en base hmeda de biomasa, la cual fue de 8.2 g/l.
Luego se realiz un proceso de digestin (Anexo C) con solucin hipoclorito de sodio-
cloroformo (30-70%, respectivamente) por una (1) hora y 30 min sin agitacin, para cada
muestra de 1 mg se adicion 4.5 ml de solucin. Una vez completado el proceso, se
centrifugaron las muestras a 3200 rpm por 15 min, formndose tres fases: la superior, de
hipoclorito; la intermedia, restos celulares; y la inferior, solucin de cloroformo y PHB
[40].
La fase superior se retir con pipeta; la fase media y la fase inferior se filtraron, separando
los restos celulares de la solucin de cloroformo-PHB; recolectando esta solucin en cajas
de petri. Una vez se recoga el volumen total de la solucin cloroformo-PHB, se calentaba
la caja de petri a temperatura constante (70C) en una plancha de calentamiento para
evaporar el cloroformo y concentrar el PHB. Secado el polmero, se pes y obtuvo una
masa total de 110.2 mg de polmero [40].
Este procedimiento se repiti para distintas concentraciones de inoculo, del 1%, 2% y 10 %
del volumen total de 200 ml del medio precrecido por 24 horas, (0.027 g/L, 0.053 g/L y
0.6625 g/L) obtenindose distintas cantidades de polmero (0.044 g/L, 0.055 g/L y 0.28
g/L) respectivamente, tal como se muestra en la siguiente grafica:
49
Figura 11. Produccin de polmero y Biomasa a distintas concentraciones de inoculo.
Fuente: Mezcla Sinrgica entre Polihidroxibutirato (PHB) y Caucho Natural (Ltex) para obtener un
copolmero [48].
De la Figura 11, se determina que la mxima cantidad de polmero (110.2 mg) se obtiene
con una concentracin de inoculo de 0.6625 g/L
6.5 Caracterizacin del polmero
Siguiendo la ecuacin 1, se calcula la concentracin de PHB:
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0,027 0,053 0,6625
g/L
Inculo g/L
PHB (g/L)
Biomasa (g/L)
50
(Ec. 1)[42]
Para obtener la concentracin en g/ml se divide entre 100 puesto Law y Slepecky
realizan el anlisis a 235 m
Constante o Coeficiente de extincin de cido crtonico: 5.21
Densidad del polmero: 1250 mg/ml
Volumen del polmero: 0.014 ml
Volumen de Solucin: 1.5 ml
OD235 nm : 0.9984
[PHB]=5.57 g/ml
Lo cual est muy cercano a los valores dados por Law y Slepecky para caracterizacin de
PHB por espectrofotometra UV.
Figura 12. Curva Patrn de caracterizacin de PHB, mtodo Law and Slepecky.
Fuente: Assay of Poly--Hydroxybutyric Acid [41].
Utilizando la figura 12, la cual, corresponde a la curva de calibracin para la relacin de la
absorbancia con la concentracin de PHB, se ilustra que para un OD de 0.998 a 235nm y
51
extrapolando se tiene que la funcin que describe la grafica es: Y=0.19X. Para Y=0.9984, se
obtiene una concentracin de 5.25 g/ml dato muy cercano al valor obtenido de 5.57 g/ml, por
ende se demuestra que efectivamente se ha obtenido PHB, como se observa en la Tabla 7.
Tabla 7. Comparativo Concentracin de PHB.
Concentracin de Polmero Obt