TRABAJAR CON

PROTEÍNASTÉCNICAS DE SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS

SEPARACIÓN Y PURIFICACIÓN

1º. ROTURA DE LAS CÉLULAS EXTRACTO CRUDO

2º.FRACCIONAMIENTO

3º. DIALISIS

CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA DIFERENCIAS EN LA CARGA,TAMAÑO Y AFINIDAD DE UNIÓN.

CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA

CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO

EJEMPLO CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO CATIÓNICO

EXPLICACIÓN

FACTORES DE RESOLUCIÓN ( LONGITUD ,VELOCIDAD ,TIEMPO)

CONCLUSIÓN

CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR

(FILTRACIÓN GEL)

APROVECHA

MÉTODO

CONCLUSIÓN

CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD

APROVECHA

MÉTODO

HPLC BOMBAS DE ALTA PRESIÓN QUE ACELERAN EL PROCESO

MATERIALES DE MEJOR CALIDAD QUE SOPORTAN LA PRESIÓN

HPLC

ELECTROFORESIS

¿Para qué sirve?

Análisis de pureza

Determinación de la masa molecular de proteínas,

Verificación de la concentración de proteínas,

Detección de proteólisis e

Identificación de proteínas inmunoprecipitadas, para

Conocer el punto isoeléctrico,

El nº de cadenas polipeptídicas

Identificación y secuenciación de proteínas.

• Equipo necesario:

• Fuente de poder

• Cámara/cubeta: puede ser horizontal o vertical.

• 2 electrodos

Factores que influyen en la velocidad de migración:

Voltaje aplicado

La carga neta de la proteína

El tamaño y forma de la proteína

La porosidad del gel

Y la densidad, temperatura y fuerza iónica del medio

Preparación:

Tampón de carga:

Buffer

Gel

Fundamento de la técnica :Hacer pasar corriente por la celda Las biomoléculas empezaran a moverse El resultado son una serie de bandas

FACTORES QUE INFLUYEN EN LA ELECTROFORESIS

• FUERZA IÓNICA DEL MEDIO Y CARGA NETA DE LA PROTEÍNA

• MASA MOLECULAR

• VOLTAJE

• POROSIDAD DEL GEL

• TIEMPO DE DURACIÓN

LECTURA DE RESULTADOS

Proteínas Colorantes orgánicos (rojo Ponceau y azul brillante de Coomassie)Ácidos nucléicos sustancias fluorescentes que aumentan la sensibilidad(Bromuro de etidio)

TÉCNICAS ESPECIALES

Isoelectroenfoque Electroforesis bidimensional Electroforesis de campo pulsante Electroforesis preparativa Inmunoelectroforesis Electroforesis capilar