Post on 24-Jan-2016
Una nueva proteína de U2 snRNP de Una nueva proteína de U2 snRNP de levadura, Snu17p, es requerida para levadura, Snu17p, es requerida para el primer paso catalítico del el primer paso catalítico del splicing splicing y para la progresión del ensamblaje y para la progresión del ensamblaje
del spliceosomadel spliceosoma
Matías Blaustein, Diego Pafundo, Ignacio SchorMatías Blaustein, Diego Pafundo, Ignacio Schor
Gottschalk A., Bartels C., Neubauer G., Lührmann R., Gottschalk A., Bartels C., Neubauer G., Lührmann R., Fabrizio P.Fabrizio P.
Traído a ustedes por:Traído a ustedes por:
SpliceosomaSpliceosoma:
Asociación ordenada de 5 snRNAs (U1, U2, U4, U5 y U6) y proteínas.
• 7 proteínas Sm, comunes a todos los snRNPs
• Un set de proteínas Sm-like (Lsm)
• Otras
Secuencia de Secuencia de eventoseventos
Apareamientos y rearreglos entre los snRNAs Apareamientos y rearreglos entre los snRNAs y el pre-mRNAy el pre-mRNA
Muchas proteínas pueden estar involucradas en estos switches… Por ejemplo:
Prp28p Mediador potencial del switch U1 U6 del pre-mRNA
Tiene un dominio DEAD-box ATPasa.
¿Desenrrollamiento del duplex RNA-RNA?
Caracterización de las proteínas del Caracterización de las proteínas del spliceosoma:spliceosoma:
• genética (en levaduras)
• bioquímica (en varios sistemas)
Así se encontraron muchas proteínas en levaduras homólogas a las proteínas involucradas al splicing en
metazoos.
¿Qué pasa con la snRNP U2...?¿Qué pasa con la snRNP U2...?
• Se sabe poco del complejo de levaduras, porque es difícil de purificar.
• Se caracterizaron 9 proteínas de este complejo en humanos.
• Todas tienen homólogos en levaduras (por búsqueda de secuencias).
¿Qué se hace en este ¿Qué se hace en este paperpaper…?…?Caracterización de una nueva proteína asociada al splicing:
Snu17p
¿De dónde salió Snu17p?¿De dónde salió Snu17p?
Purificación parcial del tri-complejo snRNP [U4/U6.U5] por cromatografía de afinidad y gradiente de glicerol
Espectroscopía de masa
Búsqueda en base de datos
28 proteínas asociadas con el tri-complejo
[U4/U6.U5]Dos proteínas del factor asociado a
U2 snRNPs, SF3b.
¡Snu17p!
¿Qué podemos saber de ¿Qué podemos saber de Snu17p?Snu17p?
11Snu17p tiene un motivo de reconocimiento de RNA (RRM)Snu17p tiene un motivo de reconocimiento de RNA (RRM)
Búsqueda de homólogos con BLAST de proteínas
50% de identidad con los primeros 120 aa de varias proteínas con RRM.
Búsqueda TBLASTN en base de datos de EST humanos
36% de identidad y 53% de similitud con EST AA314241
p14 podría ser la verdadera ortóloga de p14 podría ser la verdadera ortóloga de Snu17p en humanos Snu17p en humanos
Este EST corresponde a una proteína llamada p14 que:
• tiene tamaño similar a Snu17p
• se encuentra asociada a U2 snRNP en humanos
¿Está Snu17p ¿Está Snu17p asociada con alguna asociada con alguna
SnRNP?SnRNP?
Generación de una cepa de levaduras que expresa Snu17p-tag en vez del gen endógeno
Preparación de extractos de splicing
Inmunoprecipitación con IgG-agarosa
Lavado con concentraciones crecientes de sales
Extracción de RNA y Northern blot
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Snu17p es una proteína del snRNP U2Snu17p es una proteína del snRNP U2
¿Está Snu17p asociada con ¿Está Snu17p asociada con el spliceosoma durante el el spliceosoma durante el
splicingsplicing??
Extractos de splicing Pre-mRNAs de actina y de U3 marcados con 32P-UTP
Splicing in vitro
20´ 40´ 40´: inmunoprecipitación con IgG-agarosa
Electroforesis en gel desnaturalizante
Remoción:
33
Snu17p está asociada con el spliceosoma y en Snu17p está asociada con el spliceosoma y en particular con el catalíticamente activo durante el particular con el catalíticamente activo durante el
splicingsplicing in vitro in vitro
33
Snu17p está asociada con el spliceosoma y en Snu17p está asociada con el spliceosoma y en particular con el catalíticamente activodurante el particular con el catalíticamente activodurante el
splicingsplicing in vitro in vitro
33
Snu17p está asociada con el spliceosoma y en Snu17p está asociada con el spliceosoma y en particular con el catalíticamente activodurante el particular con el catalíticamente activodurante el
splicingsplicing in vitro in vitro
33
Snu17p está asociada con el spliceosoma y en Snu17p está asociada con el spliceosoma y en particular con el catalíticamente activodurante el particular con el catalíticamente activodurante el
splicingsplicing in vitro in vitro
¿Es esencial Snu17p para la ¿Es esencial Snu17p para la viabilidad celular?viabilidad celular?
Knockout de SNU17 en una línea diploide, reemplazando por el marcador HIS3
Luego de la esporulación, las 4 esporas son viables
Las dos esporas que llevan HIS3 tienen un crecimiento vegetativo 1,3 veces más lento que el wild
type a distintas temperaturas
¿Es requerido Snu17p para ¿Es requerido Snu17p para el el splicingsplicing??
Electroforesis en gel desnaturalizante
Primer extension
Extracción de RNA
4. A4. A
La deleción de Snu17p lleva a un La deleción de Snu17p lleva a un splicingsplicing del pre- del pre-mRNA defectivo mRNA defectivo in vivoin vivo
time
Extractos de splicing de cepas wt o snu17
Pre-mRNA de actina marcado con 32P-UTP
Splicing in vitro
Electroforesis en gel desnaturalizante
Remoción: 1´ 5´ 15´ 25´
GST-Snu17p
4. B4. B
La deleción de Snu17p lleva a la inhibición del La deleción de Snu17p lleva a la inhibición del splicingsplicing antes del primer paso catalítico antes del primer paso catalítico in vitroin vitro
¿Afecta la ausencia de Snu17p al ensamblaje del spliceosoma?
Pre-mRNA de actina marcado
+Extracto de levadura wt Extracto de levadura Snu17
Ensamblaje in vitro de spliceosomas (30°C)
Electroforesis en gel no Electroforesis en gel no desnaturalizantedesnaturalizante
Visualización de los complejos
0’ 10’ 20’
Heparina
5. A5. A
La ausencia de Snu17p produce La ausencia de Snu17p produce la acumulación de un complejo la acumulación de un complejo
inusual X.inusual X.
¿Cuál es la composición del ¿Cuál es la composición del complejo X?complejo X?
Extracto de levadura wt Extracto de levadura Snu17
Splicing in vitro con pre-mRNA de actina. Tratamientos:
•Mock
•Degradando U6 snRNA
•EDTA
Electroforesis no desnaturalizante
Hibridar con sondas de actina y de todos los snRNAs
0’ 5’ 20’Heparina
66
66
!!!!!!
La estructura de U2 snRNP se encuentra La estructura de U2 snRNP se encuentra comprometida en ausencia de Snu17pcomprometida en ausencia de Snu17p
66
!!!!!!
U1 snRNP es parte del complejo X, incluso U1 snRNP es parte del complejo X, incluso habiendo tratado con heparina.habiendo tratado con heparina.
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U5 y U4 no se detectan bien U5 y U4 no se detectan bien por el método anterior...por el método anterior...
Extractos de splicing de cepas wt o snu17
Pre-mRNA de actina biotinilado
Splicing in vitro
5L
RNA total
120L
Heparina
Gradiente de glicerol
15 fracciones de la región 40S
Se purifica c/u por afinidad con
streptavidina-agarosaRNA purificado
Northern blot
77
Este experimento independiente refuerza la conclusión Este experimento independiente refuerza la conclusión de que el complejo X contiene todos los snRNPs de que el complejo X contiene todos los snRNPs
ConclusionesConclusiones
•Snu17p es llamada a partir de aquí ha ser tenida en cuenta como pilar de U2 y resulta ser claro componente del spliceosoma, al menos hasta el segundo paso catalítico del célebre y fundamental proceso de splicing.
•La falta de presencia de Snu17p trae aparejada una formidable reducción del splicing in vitro. La mentada reducción es debida directamente a la falta de presencia de Snu17p, ya sea porque Snu17p es parte activa del extraordinario proceso de splicing o bien porque es menester su presencia para la correcta conformación y funcionamiento de U2.
•In vivo, si bien la falta de presencia de Snu17p produce un fenotipo de crecimiento poco veloz y por demás evidentes defectos en el majestuoso fenómeno de splicing, el efecto es menos drástico. Esto bien puede explicarse por la estabilización de U2 en las condiciones predominantes en el entorno fisiológico aún en ausencia de esta antaño ignota proteína.
•La ausencia de Snu17p conlleva la formación de un ignominioso, lindante con lo impúdico complejo que alberga en su seno a U2, U6, U5 e incluso a los usualmente esquivos U4 y U1. Esto puede deberse a una conformación harto aberrante de U2 que no tiene a bien desplazar a U1. Snu17p recombinante revierte la formación del esotérico complejo X y restaura el magnánimo y fastuoso prodigio, conocido como splicing.
•Se puede colegir que la proteína p14 sería la contraparte funcional de Snu17p en el spliceosoma humano (por identidad, similar talla y porte y por permanecer asociado a U2).
•La falta de Snu17p, en marcado contraste con otras proteínas de U2, permite la acción y efecto de incorporar U2 al prespliceosoma y del tri-snRNP [U4/U6.U5] inhibiendo la progresión del ensamblaje antes de la liberación de U1 y luego de la incorporación del tri-snRNP. Notablemente, esto sentaría un hito para el perfeccionamiento de una herramienta idónea para el aislamiento de spliceosomas totalmente ensamblados, detenidos, congelados y acorralados antes del primer paso catalítico del excepcional mecanismo de splicing.
Fin