Ventajas de la

quimioluminiscencia en el

diagnóstico de las

enfermedades autoinmunes

Actualización en Autoinmunidad: nuevas tecnologías en

el laboratorio

10/25/2016

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

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Historia de los inmunoensayos

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1950 1960 1970 1980 1990 2000 2010

1977

Premio Nobel

R. Yalow &

S. Berson

1950s

RIA & Latex

Yalow & Berson

Singer & Plotz

Rosalyn Sussman Yalow

1971

ELISA

P. Perlmann &

E. Engvall

A. Schuurs &

B. van Weemen

Eva Engvall

1983

Quimio-

luminiscencia

A. Campbell

& Ashok Patel

Quimioluminiscencia en Química Clínica

A. Campbell & Ashok Patel

En autoinmunidad

2011

BIO-FLASH

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Tipos de inmunoensayo

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• Los tipos de inmunoensayo comerciales más comunes

• Factores diferenciales: - Revelado (colorimétrico, fluorescencia, quimioluminiscencia, …)

- Fase sólida (placa, micropartícula, …)

ELISA / FEIA Fluorescencia Quimioluminiscencia

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Tipos de inmunoensayo

• Selección del inmunoensayo en función del rango de

medida

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INMUNOFLUORESCENCIA

NEFELOMETRIA

TURBIDIMETRIA POTENCIADA POR LATEX

TURBIDIMETRIA

ELISA

QUIMIOLUMINESCENCIA (CMIA)

1 pg/mL 1 ng/mL 1 µg/mL 1 mg/mL

Concentración de analito

RIA

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¿Que es la quimioluminiscencia?

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Reacción quimioluminiscente

• Emisión de luz generada a partir de una reacción química,

generalmente dentro del espectro visible (380 - 780 nm)

• Dependiendo de la cinética de la emisión de luz: - Flash: emisión rápida llegando al pico en décimas de segundo y

decayendo en pocos segundos (Acridinio, Derivados del luminol…)

- Glow: emisión lenta, llegando al máximo en minutos y

manteniéndose estable por cerca de una hora (dioxetanos)

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0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5

Un

idad

es

Re

lati

vas

de

Lu

z (

RLU

s)

Tiempo (s)

Flash

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

0 5 10 15 20 25 30 35

Un

idad

es

Re

lati

vas

de

Lu

z (

RLU

s)

Tiempo (min)

Glow

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Reacción quimioluminiscente

• Ejemplo de reacción: isoluminol

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Isoluminol

Tautomerización

Peróxido cíclico 3-aminoftalato

en estado excitado

Forma ceto Forma enol

Luz

H2O2 + NaOH

+ catalizador

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Ensayos CMIA: “Chemiluminescent

Microparticle Immunoassay”

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Esquema de ensayo CMIA

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Microparticulas 20 µL

Tampón Ensayo 80 µL

Muestra

Disp. & Mix

Incubación 10 min

Conjugado 150 µL

Disp. & Mix

Incubación 10 min

Aspirar

Dispensar 600 µl x 4

Aspirar x 4

MagWash

Aspirar

Dispensar 600 µl x 4

Aspirar x 4

MagWash

T1 (NaOH) 200 µl

T2 (H2O2) 200 µl

Disp. & Lectura

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Resultado

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• La luz (RLU) es directamente proporcional a la cantidad de

analito. Se interpolan las RLU en una curva de calibración de

concentración conocida

NaOH + catalizador

Peróxido

RL

U

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La fase sólida

• Partículas paramagnéticas de

entre 1 – 3 µm de gran

homogeneidad.

• Sólo en presencia de un campo

magnético son atraídas. No

presentan magnetismo

residual.

• Ofrecen gran versatilidad al

permitir ser funcionalizadas

con un gran número de

grupos químicos reactivos

• Unión antígeno-anticuerpo

en fase líquida. © B

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La fase sólida

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OH C

O

NH2

CH3

O

O

O S

CH2 CH CH2 O

O

Cobalt-based -

Streptavidin -

Protein A -

Protein C -

Anti-mouse IgG -

Grupos epoxi, carboxilo, tosilo

y amino son ejemplos de

funciones químicas para unir

covalentemente a las partículas

paramagnéticas el antígeno o

anticuerpo de interés. Su

orientación será al azar.

Ag o Ab con colas de histidina o biotiniladas

pueden inmovilizarse a partículas

magnéticas basadas en cobalto o

estrepavidina. Los Ab y mAb de ratón

pueden unirse a las partículas magnéticas

vía proteínas A/C o anti-IgG de ratón de una

manera más orientada.

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La fase sólida - Comparativa

Pocillos ELISA, ELFIA

Partículas paramagnéticas CMIA

Mayor superficie total

• Diámetro de partícula 1-3 µm

Lavado por separación magnética y aspiración

Gran versatilidad en unión covalente a múltiples grupos funcionales

Menor tiempo de incubación. Captura más rápida <10 minutos

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Menor superficie total

• ~2.5 cm2

Lavado por aspiración

Mayoritariamente unión por adsorción

Mayor tiempo de incubación

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El Conjugado

• Hay un abanico de compuestos quimioluminiscentes

usados para marcar los conjugados. Los productos

QUANTA Flash usan un derivado del isoluminol:

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Vía una unión amida (o pseudo-peptídica), el Ag o Ab (R) se une a la molécula

aminobutiletilisoluminol separado por un espaciador, lo que reduce el efecto pantalla

(quenching) de la proteína

N-(4-Aminobutil)-N-etilisoluminol

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Fotomultiplicador (PMT)

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• SPAD – Single Photon Avalanche Detector

• Gran rango dinámico (107)

• Capaz de detectar pocos fotones

• Mínimo ruido de fondo, mayor sensibilidad

• La luz es directamente proporcional a la cantidad de analito

NaOH + catalizador

Peróxido

RL

U

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Ventajas del CMIA

• Linealidad del ensayo significativamente superior (Rango

analítico).

• Mayor sensibilidad analítica (Límite de detección y Límite

de cuantificación).

• Mayor especificidad.

• Mejor precisión.

• Reacción significativamente más rápida.

• Mayor versatilidad en la unión de proteínas.

• Mayor automatización.

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Sumario

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