05_Enzimas (1)

Universidad Finis Terrae Bioquímica II Facultad de Medicina Escuela de Medicina

Dr. QF. Mario Avila Garrido 1

TEMA 5

ENZIMAS

1. Introducción 2. Las enzimas como catalizadores 3. Nomenclatura y clasificación de enzimas 4. Cofactores enzimáticos 5. Modelos de actuación de las enzimas 6. Cinética enzimática 7. Inhibición enzimática 8. Reacciones multisustrato 9. Regulación enzimática

1. Introducción La vida depende de la existencia de unos catalizadores muy potentes y altamente específicos denominados enzimas. De hecho, todos los pasos de todos los procesos metabólicos están catalizados por enzimas y la capacidad catalítica se considera, junto con la capacidad de autorreplicación, una de las características fundamentales de la vida. Con la excepción de un pequeño grupo de moléculas de RNA catalítico (los ribozimas), todas las enzimas conocidas son proteínas. El nombre de enzima ("en la levadura") no se empleó hasta 1877, pero mucho antes ya se sospechaba que ciertos catalizadores biológicos intervenían en muchos procesos. Así en 1850, Louis Pasteur concluyó que la fermentación de azúcar en alcohol por levaduras estaba catalizada por lo que llamó “fermentos”, que él consideraba inseparable de las células de levadura vivas. En 1897, Büchner, consiguió extraer las enzimas que catalizaban la fermentación alcohólica de las células de levadura, terminando así con la teoría vitalista. No obstante hubo que esperar hasta 1926, cuando Sumner consiguió purificar y cristalizar por primera vez una enzima, la ureasa, para demostrar su naturaleza proteica. En la actualidad se conocen más de 2000 enzimas diferentes, muchas de las cuales se han aislado en forma pura. Se utilizan potentes técnicas de purificación y secuenciación, técnicas de difracción de rayos X, RMN, etc., para conocer su estructura, y técnicas de mutagénesis dirigida para conocer más sobre su funcionalidad y sus mecanismos de actuación. 2. Las enzimas como catalizadores La función principal de las enzimas es actuar como catalizadores de las reacciones de los seres vivos; como tales catalizadores tienen ciertas características que vamos a estudiar a continuación. Todas las reacciones químicas tienen lugar porque cierta fracción de la población de moléculas reactantes poseen la suficiente energía como para alcanzar un estado activado, llamado estado de transición, en el que es muy elevada la



probabilidad de que se rompan o se establezcan enlaces para formar los productos. Este estado de transición reside en la cima de la barrera energética que separa los reactantes de los productos, como muestra la Figura 1. En ella se observa el diagrama de energía para una reacción química, no catalizada y catalizada, donde la energía libre de activación es la cantidad de energía necesaria para llevar todas las moléculas de un mol de sustancia, a una temperatura determinada, al estado de transición.

Existen dos métodos generales mediante los cuales puede acelerarse la velocidad de una reacción química. Uno de ellos es la elevación de la temperatura (ya que provoca un incremento en la velocidad de las moléculas); el otro consiste en utilizar un catalizador. El catalizador se combina con los reactantes de modo transitorio activándolos, produciendo un estado de transición de menor energía que en la reacción no catalizada. Una vez formados los productos el catalizador queda libre, y puede ser de nuevo utilizado. La Tabla 1 muestra una comparación de las energías de activación para la descomposición del peróxido de hidrógeno, en ausencia o presencia de un catalizador. En ella se puede apreciar cómo el catalizador enzimático baja aún más la barrera energética que ha de superarse desde el nivel de reactivos para alcanzar el estado de transición. Esta es una característica común de las enzimas. Su alto poder catalítico se debe en parte a su alta especificidad por los sustratos, la cuál puede ser absoluta para un único sustrato o relativa, cuando permite la reacción de compuestos diferentes pero con una estructura similar.

Figura 1. Evolución energética de una reacción química. Se observa la diferencia energética entre los estados de transición de las reacciones catalizada y no catalizada.



Reacción Catalizador Temperatura ºC

Energía (Kcal/mol)

Descomposición de H2O2

Ninguno 20 18 Fe2+ 22 10

Catalasa 22 1,7 La especificidad de las enzimas es muy importante para los seres vivos. Cada célula contiene varios cientos de miles de compuestos diferentes, y existen muchas combinaciones posibles entre las reacciones químicas que estos compuestos pueden experimentar. Las enzimas cuidan de que tengan lugar, de manera específica, aquellas reacciones que son esenciales e indispensables para que la célula viva. Además de la especificidad y la alta eficiencia, otras dos características que diferencian a las enzimas de los catalizadores químicos, son que las enzimas pueden saturarse por sustrato y tienen capacidad para regular su actividad. 3. Nomenclatura y clasificación de las enzimas Muchas enzimas han sido designadas añadiendo el sufijo -asa al nombre del sustrato, es decir, la molécula sobre la cuál ejerce su actividad catalítica. Por ejemplo la ureasa cataliza la hidrólisis de la urea, y la arginasa cataliza la hidrólisis de la arginina (a urea y ornitina). Otras enzimas han recibido su nombre en función del tipo de reacción que catalizan; así la Gliceraldehído-3P-deshidrogenasa cataliza la oxidación del la Gliceraldehído-3P. Incluso algunas se conocen de hace mucho tiempo y mantienen su nombre, sin dar información alguna del sustrato o la reacción que catalizan (tripsina). No obstante existe una clasificación sistemática de las enzimas que las divide en 6 grandes grupos, cada uno de los cuales se divide a su vez en subclases:

1: Oxido-reductasas (reacciones de oxido-reducción) 2: Transferasas (transfieren grupos funcionales) 3: Hidrolasas (reacciones de hidrólisis), 4: Liasas (reacciones de adición a los dobles enlaces) 5: Isomerasas (reacciones de isomerización) 6: Ligasas (formación de enlaces con consumo de ATP).

A cada enzima se le asigna un número con cuatro componentes. Los tres primeros indican la clase, subclase y sub-subclase, respectivamente, y el último es un número de orden. Así, por ejemplo, la enzima alcohol deshidrogenasa, que cataliza la oxidación de etanol a acetaldehído, y por lo tanto pertenece al grupo 1, se designa como EC 1.1.1.1. La Tabla 2 muestra la clasificación internacional de las enzimas en los seis grupos antes citados.

Tabla 1 Descomposición enzimática del agua oxigenada. Comparación de las energías de activación para la descomposición del peróxido de hidrógeno, en ausencia o presencia de un catalizador



4. Cofactores enzimáticos La actividad de algunas enzimas depende solamente de su estructura como proteína, mientras que otras necesitan, además, uno o más componentes no proteicos, llamados cofactores. El cofactor puede ser un ion metálico o bien una molécula orgánica, llamada coenzima, aunque algunos enzimas necesitan de ambos. El cofactor puede estar fuertemente unido a la proteína (suele ser el ión metálico, aunque puede igualmente ser un coenzima) y recibe entonces el nombre de grupo prostético, o débilmente unido, por lo que en realidad actúa como un sustrato específico de la enzima (co-sustrato; suele ser una molécula orgánica, coenzima). La Tabla 3 muestra una relación de iones metálicos que actúan como cofactores de enzimas.

Tabla 2 Clasificación internacional de enzimas.

Tabla 3 Iones metálicos como cofactores.



La Tabla 4 muestra algunos de los coenzimas más habituales en la catálisis enzimática. El complejo enzima-cofactor catalíticamente activo recibe el nombre de holoenzima. Cuando se separa el cofactor, la proteína restante, que por sí misma es inactiva catalíticamente, se designa con el nombre de apoenzima.

HOLOENZIMA = APOENZIMA + COFACTOR

Tabla 4 Algunas coenzimas mayoritarias en catálisis enzimática.



En las enzimas el cofactor puede actuar como centro catalítico primario, grupo puente para reunir el sustrato y la enzima ó agente estabilizante de la actividad enzimática (conformación). Por su parte cada uno de los coenzimas catalogados suele contener en su estructura, alguna vitamina (sustancias orgánicas que, en cantidades mínimas, son vitales para el funcionamiento de todas las células, y deben figurar en la dieta de algunas especies) o molécula derivada de ella. Los coenzimas actúan por lo general como transportadores intermedios de átomos específicos o de electrones. 5. Modelos de actuación de las enzimas Para explicar la actividad catalítica de las enzimas, se ha propuesto un mecanismo general, en dos etapas: En la primera etapa, la enzima (E) se une a la molécula de sustrato (S), para formar el complejo enzima-sustrato (ES). En una segunda etapa, el complejo se fragmenta dando lugar al producto (P) y a la enzima (E), que vuelve a estar disponible para reaccionar con otra molécula de sustrato. Por lo general, la molécula de enzima es mucho mayor que la del sustrato por lo que sólo una pequeña parte de la enzima está implicada en la formación del complejo; esta región que interacciona con el sustrato y en la que tiene lugar la reacción, se denomina sitio activo de la enzima. El sitio activo es una región tridimensional de la enzima con una distribución de los grupos única para posibilitar la unión a su sustrato específico. Dichos grupos del enzima no tienen por qué ser necesariamente consecutivos en la secuencia de la proteína y reciben el nombre de centros catalíticos. El modelo más conocido sobre el mecanismo de reacción de las enzimas es el de Fischer, quien propuso que la molécula de sustrato se adapta al centro activo de la enzima del mismo modo que lo haría una llave al encajar en una cerradura, es decir, que tienen una relación estructural complementaria (Figura 2). No obstante, esta hipótesis tiene ciertas limitaciones: si el centro activo posee una estructura prediseñada para el sustrato, en caso de que sea reversible el proceso dicho debería estar perfectamente diseñado para que también encaje el producto de la reacción. De la misma forma, la teoría de la llave-cerradura tampoco explica bien el fenómeno de la inhibición enzimática.

Figura 2. Modelos de acción enzimática. Modelo llave-cerradura de Fischer.



Otra hipótesis más aceptada actualmente es la del enzima flexible o de ajuste inducido (modelo de Koshland), que sugiere que el sitio activo no necesita ser una cavidad geométricamente rígida y preexistente, sino que dicho sitio activo debe tener una disposición espacial, precisa y específica, de ciertos grupos de la enzima que en presencia del sustrato se adaptan a su estructura cuando interaccionan con él (Figura 3). Independientemente del modelo, una vez formado el complejo enzima sustrato, mediante un mecanismo de distorsión, se activan los enlaces que hay que romper y se aproximan los grupos que hay que enlazar, favoreciendo la formación del producto resultante de la reacción catalizada y quedando la enzima libre para comenzar de nuevo el proceso catalítico. La Figura 4 muestra el caso de una enzima (carboxipeptidasa) que nos sirve para ilustrar el modelo de Koshland, en ella se puede ver como en el sitio activo, en el que se encuentran los centros catalíticos (Arg-145, Glu-270, tyr-248) y el cofactor (Zn), posee una conformación inicial que se modifica al interaccionar con el sustrato y formal el complejo [ES].

Figura 3. Modelos de acción enzimática. Modelo de ajuste inducido de Koshland.

Figura 4. Modelo de ajuste inducido de Koshland. Carboxipeptidasa.



6. Cinética enzimática. Los principios generales de la cinética de las reacciones químicas son aplicables a las reacciones catalizadas por las enzimas, en los seres vivos. No obstante, estas muestran (además del fenómeno de la especificidad, antes comentado) un rasgo característico que no se observa en los catalizadores no enzimáticos, se trata de la saturación por el sustrato, entendida en términos de ocupación de los centros activos de todas las moléculas de enzima.

Estudiar el efecto de la concentración de sustrato sobre la actividad de una enzima no es sencillo si pensamos que lógicamente la concentración del sustrato disminuye según avanza la reacción. Una simplificación en los experimentos cinéticos consiste en medir la velocidad inicial (Vo). Si el tiempo es suficientemente corto la disminución de sustrato será mínima y ésta podrá considerarse, por tanto, casi constante. La Figura 5 muestra el efecto de distintas concentraciones de sustrato sobre la velocidad inicial de la reacción catalizada por un enzima.

En la cinética enzimática de la Figura 5 se distinguen tres fases:

• Para una concentración baja de sustrato, la velocidad de la reacción es directamente proporcional a la concentración del sustrato (relación lineal), la cinética es de primer orden.

• Para una concentración alta de sustrato, la velocidad de la reacción se hace

prácticamente constante e independiente de la concentración de sustrato, la cinética se considera de orden cero.

• Para concentraciones de sustrato intermedias la velocidad del proceso deja de ser

lineal, y a esta zona se la denomina de cinética mixta. Este comportamiento es característico de la mayoría de las enzimas y fue estudiado por Michaelis y Menten en 1913. La velocidad de una reacción catalizada nos indica la cantidad de sustrato consumido, o producto formado, por unidad de tiempo. En el Sistema Internacional se designa por “U” (unidad de actividad enzimática) y corresponde a los µmoles de sustrato consumidos en 1 min, o bien a los µmoles de producto formado en 1 min.

1 U ≡ µmol S/min ≡ µmol P/min

Figura 5. Cinética enzimática. Modelo de Michaelis-Menten.



La curva que expresa la relación entre la concentración de sustrato y la velocidad inicial tiene la misma forma para la mayoría de las enzimas; se trata de una hipérbola rectangular, cuya expresión algebraica viene dada por la Ec. Michaelis-Menten.

Los términos Vmax (velocidad máxima) y Km (constante de Michaelis) son dos parámetros cinéticos característicos de cada enzima, que pueden determinarse experimentalmente. La velocidad máxima se obtiene cuando la velocidad de reacción se hace independiente de la concentración de sustrato. Este valor depende de la cantidad de enzima que tengamos. La Km nos indica la concentración de sustrato a la cuál la velocidad de reacción es la mitad de la velocidad máxima, este parámetro es independiente de la concentración de enzima, y es característico de cada enzima según el sustrato utilizado (si tiene varios). La Km también indica la afinidad que posee la enzima por el sustrato, siendo ésta mayor, cuanto menor es la Km. Cuanto menor sea la Km menor será la cantidad de sustrato necesaria para alcanzar la mitad de la velocidad máxima, por lo que mayor será la afinidad del enzima hacia ese sustrato. La ecuación de Michaelis-Menten puede deducirse matemáticamente haciendo la aproximación del estado estacionario, según esta aproximación la concentración del complejo ES es constante en el estado estacionario y por lo tanto las velocidades de formación y destrucción del complejo ES son iguales. Además, asumimos que el paso limitante de la reacción es el segundo y por lo tanto la velocidad de la reacción es: Vo=K2 [ES].

Velocidad formación del complejo ES = Velocidad destrucción del complejo ES

K1[E][S]= K-1 [ES] + K2[ES]

K1[E][S]= (K-1 + K2 ) [ES]

La concentración de enzima libre será igual a la concentración total de enzima menos lo que está unido al sustrato. [E]=[ Et ]-[ES], así que:

K1[ Et ][S]- K1[ ES ][S] = (K-1 + K2 ) [ES]

K1[ Et ][S]= (K-1 + K2 + K1[S]) [ES]

Despejando [ES] se obtiene un término constante formado por las tres constantes e igual a la constante de Michaelis (Km). El término K1[ Et ] será precisamente la V (velocidad máxima) cuando todo el enzima esté unido al sustrato formado un complejo ES, o sea, cuando la enzima esté saturada por el sustrato, es decir:

K1[ Et ]=Vmax.



De modo que la forma final de la ecuación de Michaelis-Menten es: A partir de esta ecuación podemos explicar matemáticamente las tres fases de la curva de Michaelis.

• A baja [S] (es decir, si Km >>> [S]) el término Km+[S] podemos aproximarlo a la Km, quedando un expresión del tipo:

V = k’ [S] Esta es una cinética de primer orden, que se caracteriza por una variación lineal de la V respecto al tiempo.

• A altas [S] (es decir, Km<<<<[S]) despreciaríamos Km frente a [S], con lo que V = Vmax (que sería constante); la cinética es de orden cero y se habría alcanzado la saturación por sustrato.

• El tramo intermedio, en el que la [S] ≈ Km correspondiente a una cinética de orden

mixto y se ajusta a la ecuación de Michaelis. En muchos casos es de vital importancia conocer estos parámetros cinéticos. En principio, podrían obtenerse de forma poco rigurosa a partir de la curva de Michaelis Menten, pero existen métodos gráficos más fiables que facilitan el cálculo preciso de la Km y la Vmax. Los cálculos se hacen en base a transformaciones matemáticas de la ecuación de Michaelis; una de las expresiones más utilizadas es la representación de Lineweaver-Burk, también conocida como de dobles inversos (Figura 6). En esta forma de cálculo se representa 1/V frente a 1/S, obteniéndose una recta cuya intersección con el eje X es –1/Km y con el eje Y es 1/Vmax, siendo la pendiente Km/Vmax.

Figura 6. Cinética enzimática. Representación de Lineweaver-Burk.



7. Inhibición enzimática Existen sustancias que pueden impedir que la enzima desarrolle su actividad catalítica, ralentizando o paralizando la reacción enzimática. A estas sustancias se las denomina inhibidores enzimáticos. Teniendo en cuenta que las reacciones químicas en la célula están catalizadas por enzimas, es fácil intuir el papel de muchos inhibidores enzimáticos que actúan como fármacos, antibióticos o conservantes; otros pueden ser tóxicos, potentes venenos. Por ejemplo, la aspirina (acetilsalicilato) inhibe la enzima que cataliza el primer paso en la síntesis de prostaglandinas, implicadas en la producción del dolor. Se conocen dos tipos principales de inhibición: la reversible y a la irreversible. La primera implica una unión “no covalente” del inhibidor y, por lo tanto, siempre puede revertirse. En la inhibición irreversible, el inhibidor se une al enzima de forma “covalente” y permanente. Inhibición reversible: los distintos modelos de inhibición reversible implican todos la unión no covalente del inhibidor con la enzima, pero difieren en los mecanismos por medio de los cuales reducen la actividad enzimática y en la forma en que afectan a la cinética de la reacción. Entre ellos están la inhibición competitiva, la acompetitiva y la no competitiva.

• El inhibidor competitivo, es una sustancia similar en estructura al sustrato, con quien compite por el sitio activo de la enzima.

Como consecuencia, aunque la velocidad máxima no se altera, para alcanzarla sería

necesario poner más cantidad de sustrato en el medio de reacción, lo que se refleja en la correspondiente curva de Michaelis como un aparente aumento de la Km (la enzima en presencia del inhibidor perdería afinidad por el sustrato). La representación de dobles inversos (Figura 7) permite observar la variación de la Km. Figura 7. Inhibición competitiva. Cálculo de parámetros cinéticos mediante la representación de dobles inversos.



La eficacia de un inhibidor competitivo depende de su concentración respecto a la del sustrato. Si hay un exceso de inhibidor éste bloqueará los centros activos de las moléculas de enzima, resultando una inhibición total. No obstante, el proceso es reversible si se procura exceso de sustrato, que desplazaría totalmente al inhibidor.

• El inhibidor acompetitivo reacciona con la enzima en un punto distinto al centro activo, pero sólo en el caso de que ésta esté unida al sustrato formando el complejo ES; de esta forma impide que la enzima desarrolle su actividad catalítica.

Tanto la Vmax como la Km se alteran en la misma proporción, lo que se manifiesta en la representación de dobles inversos como rectas paralelas y por lo tanto con la misma pendiente (Figura 8).

Se observa cómo se produce, aparentemente, una disminución de la Vmax y un incremento de la Km.

Figura 8. Inhibición acompetitiva. Cálculo de parámetros cinéticos mediante la representación de dobles inversos.



• El inhibidor no competitivo puede combinarse tanto con la enzima libre como con el complejo enzima-sustrato, sin afectar al sitio activo de la enzima.

Al no unirse el inhibidor al sitio activo, no se afecta la afinidad de la enzima por el sustrato y en este caso la Km no se altera y la Vmax disminuye, como puede observarse en la representación de dobles inversos (Figura 9). En la inhibición irreversible, el inhibidor se une covalentemente a la enzima y la inactiva de manera irreversible. Casi todos los inhibidores irreversibles son sustancias tóxicas naturales o sintéticas. Se trata de sustancias que reaccionan con algún grupo funcional importante para la catálisis, bloqueándolo e impidiendo que la enzima desarrolle su actividad. En muchos casos la interacción se produce a través del sitio activo, impidiendo de manera irreversible que el sustrato ocupe su lugar; tal es el caso del gas Sarín, que inhibe irreversiblemente enzimas implicadas en la transmisión del impulso nervioso y su inhalación causa parálisis rápida de las funciones vitales. En la inhibición irreversible, cuando el inhibidor afecta al sitio activo se observaría una situación similar a la inhibición competitiva, una disminución de la Vmax y un aumento aparente de la Km, si bien el proceso sería completamente irreversible por sustrato, incapaz éste de desplazar al inhibidor del sitio activo. La inhibición enzimática por modificación covalente constituye además una importante forma de regulación metabólica, como veremos en próximos apartados.

Figura 9. Inhibición no competitiva. Cálculo de parámetros cinéticos mediante la representación de dobles inversos.



8. Reacciones multisustrato En este capítulo hemos estudiado reacciones del tipo S-P, un mecanismo relativamente simple con un solo sustrato que podría ajustarse a reacciones catalizadas por algunas enzimas (isomerasas, hidrolasas, algunas liasas) pero es importante tener en cuenta que la gran mayoría de las reacciones son multisustrato y suelen dar varios productos. Cuando una enzima une dos o más sustratos y libera múltiples productos, el orden de los pasos para a ser una característica importante del mecanismo de reacción. Hay distintos mecanismos que explican este tipo de reacciones, veamos varios casos en los que se utilicen dos sustratos S1 y S2 y se obtengan dos productos P1 y P2.

a) Unión ordenada de los sustratos: en este caso un sustrato debe unirse antes de que el segundo sustrato pueda unirse.

b) Unión aleatoria de los sustratos: en este caso cualquiera de los dos sustratos puede ser el primero en unirse a la enzima.

c) Mecanismo “ping-pong”: en este caso primero se une un sustrato, se libera el primer producto, y a continuación se une el segundo sustrato para así liberar el segundo producto.

9. Regulación enzimática Una característica que diferencia las enzimas de los catalizadores químicos convencionales es su capacidad para regular su propia actividad. Una enzima puede ser más o menos activa gracias a la existencia de distintos niveles de regulación:

• Nivel de síntesis: que haya más o menos moléculas de la enzima (ya lo veremos).

• Nivel de actividad: que las moléculas de enzima existentes estén más o menos activas. Puede llevarse a cabo por factores extrínsecos a la enzima, pH, Tª, [S], [I], o por factores intrínsecos a la propia enzima; en este caso hablamos de enzimas reguladoras, enzimas que por su propia naturaleza tienen mecanismos especiales de regulación. Están especializadas en regularse respondiendo de forma muy sensible a señales externas.

En la célula las enzimas operan en grupo, en rutas constituidas por varios pasos enzimáticos. En cada ruta hay al menos una enzima reguladora que determina la velocidad de toda la ruta. La modulación de las enzimas reguladoras ocurre mediante diferentes mecanismos: • Enzimas alostéricas. Funcionan mediante la unión reversible no covalente de compuestos

regulatorios llamados moduladores. El modulador puede ser una activador (modulación positiva) o un inhibidor (modulador negativo) y ser el propio sustrato de la reacción (alosterismo homotrópico) o ser otra sustancia (alosterismos heterotrópico). Normalmente se trata de enzimas multiméricas y normalmente el sito activo y el regulatorio se encuentran en distintas subunidades.

• Enzimas interconvertibles Por modificación covalente reversible, como por ejemplo por fosforilación/defosforilación o modificación redox.

• Mediante proteínas reguladoras que se unen a la enzima. • Mediante la eliminación proteolítica de pequeños segmentos peptídicos (esto es irreversible).

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