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1 Técnicas para el análisis de actividad enzimática en suelos

Marisol Montejo Martínez, Cinthya Paulina Torres López, Ángeles Martínez Toledo, José Alfredo Tenorio López,

María del Rocío Cruz Colín, Fernando Rafael Ramos Morales y María del Carmen Cuevas Díaz

IntRoDucción

La calidad y la salud de los suelos se miden a través de distintos indicadores que evalúan su funcionamiento (Doran et al., 1999). Para medir la calidad, se con-sidera qué tan adecuadas son sus propiedades físicas y químicas para permitir el intercambio de gases, la retención de humedad y de nutrientes, la penetración de raíces, entre otros. Por su parte, para medir la salud del suelo se toma en cuenta la eficiencia de procesos como los ciclos de nutrientes y los flujos de energía. En este contexto, uno de los indicadores que se ha utilizado es la magnitud de la actividad de diferentes enzimas involucradas en los procesos antes mencionados.

Las enzimas son moléculas de naturaleza proteínica producidas por los seres vivos y que se encargan de acelerar reacciones químicas o hacer posibles aquellas reaccio-nes que de otra manera no se producirían. Dicho de otro modo, son catalizadores bio-lógicos que, al reducir la energía de activación necesaria para las reacciones, transfor-man las sustancias involucradas en el metabolismo celular (incluyendo el anabolismo o reacciones de construcción, y el catabolismo o reacciones de destrucción). La velo-cidad de la reacción catalizada por una enzima depende del pH, de la fuerza iónica, de la temperatura y de la presencia o ausencia de inhibidores (Burns, 1982). La mayoría de las enzimas actúan dentro de las células, pero algunas son extracelulares.

La actividad enzimática del suelo es importante porque refleja el estado en el que se encuentran sus poblaciones microbianas y su relación con la biolo-

20 métodoS ecotoxicológicoS para la evaluación de SueloS contaminadoS con hidrocarburoS

gía del suelo, la producción de biomasa, la degradación de contaminantes y la conservación de ecosistemas (Doran, 2002; Gianfreda y Ruggiero, 2006). En agricultura, la actividad enzimática y otros indicadores biológicos, como la bio-masa microbiana, se emplean como una medida de la fertilidad y del impacto de esta actividad en los suelos (García-Ruiz et al., 2008); en análisis ambiental, como un indicador de contaminación (Schinner et al., 1993), y en biotecnolo-gía, como medida de la eficiencia de los tratamientos biológicos para remediar suelos impactados por diferentes contaminantes, incluyendo los hidrocarburos (Margesin et al., 2000a).

La liberación de enzimas es un proceso constante y, aunque las plantas y ani-males intervienen, son los microorganismos los que contribuyen en mayor medida a este proceso, debido a su gran biomasa, su alta actividad metabólica y su corto ciclo de vida (Cerón y Melgarejo, 2005). Dicha liberación puede ocurrir por se-creción o por lisis celular cuando los organismos mueren (Joinville et al., 2004). De las enzimas liberadas, solo un pequeño porcentaje se encuentra estabilizado, lo cual permite que estas enzimas pueda soportar procesos que naturalmente ocurren en el suelo, como la desnaturalización abiótica, la adsorción, la inactivación o la degradación por proteasas.

En el caso de suelos contaminados con hidrocarburos, Wyszkowska y Kucharski (2000) han reportado una disminución de la actividad enzimática, en particular de ureasas, deshidrogenasas y fosfatasas. Una diferencia se presenta con las lipasas, las cuales muestran una gran actividad en suelo contaminado con hidrocarburos, probablemente porque intervienen más directamente en el proceso de biodegrada-ción de estos compuestos (Margesin, 2005).

En este capítulo se describen algunos métodos enzimáticos que son útiles para evaluar el comportamiento enzimático de suelos contaminados y biorremediados.

DeteRminación De la activiDaD enzimática uReasa

Fundamento del método

La ureasa es una exoenzima que cataliza la reacción de hidrólisis de la urea, el principal producto celular nitrogenado de la degradación de las proteínas y los ácidos nucleicos, el cual es más fácil de eliminar que otras formas de nitrógeno (como el amoniaco) porque es soluble en agua y menos tóxico (Science in School, 2008). En dicha reacción, la urea se rompe para formar dióxido de

técnIcas para el análIsIs de actIvIdad enzImátIca en suelos 21

carbono y amonio, como se describe en la siguiente reacción (Quintero-Lizaola et al., 2005):

H2NCONH

2 + H

2O 2NH

3 + CO

2

La ureasa se encuentra principalmente en semillas, microorganismos e inver-tebrados. En las plantas, es un hexámero (consiste en seis cadenas idénticas) y se encuentra en el citoplasma. En las bacterias, consiste en dos o tres subunida-des diferentes. Para su activación necesita unir dos iones de níquel por subunidad (Science in School, 2008). Su pH óptimo es 7.4, y su temperatura óptima 60 °C (Kandeler y Gerber, 1988).

Muchos animales excretan urea en la orina. Los microorganismos del suelo se alimentan de la orina del animal, produciendo ureasa para transformar la urea en amoniaco, que es entonces fácilmente accesible a las plantas. Por ello, la ureasa es abundante en el suelo (García et al., 2003). De esta manera, esta enzima participa en ciclo del nitrógeno, el proceso por el cual el nitrógeno de las proteínas y otros compuestos se recicla constantemente (Science in School, 2008). Además, como la urea es aplicada como fertilizante, es común encontrar esta enzima en suelos agrícolas.

La mayoría de las técnicas empleadas en la determinación de la ureasa cuan-tifican la liberación de amonio de un suelo incubado. Varias de ellas difieren en el uso de soluciones tampón o de tolueno (Tabatabai y Bremner, 1972; Cerón y Melgarejo, 2005). Otros métodos utilizan la urea residual para estimar la propia hidrólisis de este compuesto (Douglas y Bremner, 1970).

En este manual se describe el método de Tabatabai y Bremner (1972) porque es una técnica sencilla que puede realizarse con equipamiento y reactivos bási-cos de laboratorio. El método se basa en la determinación de amonio liberado en muestras de suelo incubado con solución de urea durante 2 h a 37 oC en presencia de tolueno, para inhibir el crecimiento de los microorganismos (Alef y Nannipieri, 1998; Quintero-Lizaola et al., 2005). Esta técnica es fácil de realizar y de bajo costo, y sus resultados varían de 12.98 a 336.7 μmoles NH

3/g h. Actualmente

existe un nuevo método para medir la actividad de la ureasa, el de Sinsabaugh et al. (2000), que es más rápido, pero más costoso.

En los últimos años los estudios sobre la ureasa se han dirigido a determinar la influencia de los parámetros biológicos y químicos sobre su actividad. Se ha encontrado que la correlación con la biomasa microbiana no es significativa, y que


esta enzima es afectada por los metales pesados, la concentración de oxígeno y la disponibilidad de nitrógeno en diferentes tipos de suelo (García et al., 2003). Los estudios realizados por Trasar-Cepeda et al. (2000) indicaron que existe sensibi-lidad a la contaminación por hidrocarburos y efluentes de taninos al determinar un índice de actividad del suelo con la inclusión de varias enzimas, como ureasas, fos-fomonoestereasas y ß-glucosidasa, así como la biomasa microbiana y el contenido de nitrógeno total.

Campo de aplicación

Esta técnica es útil para evaluar suelos contaminados con hidrocarburos, como diésel y petróleo, para suelos biorremediados, y también para medir la actividad enzimática en el ciclo del nitrógeno en suelos agrícolas y naturales.

Material y equipo

Bureta de 25 mLMatraces volumétricos de 10, 25, 50, 100 y 1000 mLPinzas para buretaPipetas volumétricas de 1, 5 y 10 mLSoporte universal

AutoclaveBalanza analíticaEstufa de incubaciónEquipo de destilación microkjeldhalMuflaPotenciómetro

Es necesario esterilizar el material en autoclave.

Reactivos

Ácido bórico (H3BO4) de 99.5 % de purezaÁcido sulfúrico (H

2SO

4) de 98 % de pureza

Agua destiladaAmortiguador TRIS (hidroxi metil aminometano) grado ultrapuro (≥ 99 %)Cloruro de potasio (KCl) grado analíticoEtanol de 95 % de purezaHidróxido de sodio (NaOH) de 98.7 % de purezaIndicador de rojo de metiloIndicador de verde de bromocresolÓxido de magnesio (MgO) grado analítico


Sulfato de plata (Ag2SO

4) grado analítico

Sulfato de amonio (NH4SO

4) grado analítico

Tolueno grado analíticoUrea de 99.9 % de pureza

Soluciones

Solución de ácido sulfúrico 0.005 M. Disolver 0.2 mL de ácido sulfúrico al 98 % en un matraz aforado que contenga 500 mL de agua destilada y aforar a 1000 mL.

Solución de amortiguador TRIS 50 mM pH 9. Disolver 6.1 g de TRIS en 700 mL de agua destilada, ajustar el pH a 9.0 con H2SO4 (0.2 M) y aforar con agua destilada a 1000 mL.

Solución de cloruro de potasio 2.5 M y sulfato de plata. Disolver 100 mg de Ag2SO4 y 188 g de KCl en 700 mL de agua destilada y aforar a 1000 mL con agua destilada.

Solución indicadora de ácido bórico. Disolver 0.066 g de verde de bromocresol y 0.033 g de rojo de metilo en etanol (95 %) y aforar a 100 mL. Tomar 10 mL de la solución indicadora y agregarlos en un matraz volumétrico de 500 mL. Mezclar 10 g de H3BO4 con 350 mL de agua destilada caliente hasta disolver perfectamente. Después, enfriar y añadir la solución al matraz. Agregar gota a gota la solución de NaOH0.05 M hasta observar un vire de color rosa a verde ligero. Finalmente, aforar con agua destilada.

Solución estándar de amonio. Disolver 0.234 g de NH4SO4 en agua destilada y diluir en 1000 mL. La concentración final de N-NH4 en esta solución es de 50 μg/mL.

Solución de hidróxido de sodio 0.05 M. Colocar 0.2 g de NaOH y adicionar 500 mL de agua destilada agitando lentamente y aforar a 1000 mL.

Solución de óxido de magnesio. Calentar 1 g de MgO por muestra de suelo a ana-lizar a 600-700 °C en mufla durante 2 h. Esperar a que disminuya la tempera-tura en la mufla y guardar en un desecador.

Solución de urea 0.2 M. Disolver 0.12 g de urea en 8 mL de amortiguador TRIS y aforar a 10 mL. Es necesario preparar la solución diariamente y guardar a 4 ºC.


Procedimiento

Incubación de las muestras

Colocar 5 g de suelo en un matraz volumétrico de 50 mL, agregar 0.2 mL de to-lueno y 9 mL del amortiguador TRIS, mezclar perfectamente. Adicionar al matraz 1 mL de la solución de urea y mezclar, tapar el matraz e incubar por 2 h a 37 ºC (figura 1.1).

Una vez concluido el periodo de incubación, agregar 35 mL de solución de KCl-AgSO

42.5 M, agitar y dejar reposar la solución a temperatura ambiente durante 5

min. Aforar el contenido a 50 mL con KCl-AgSO4, con agitación.

figura 1.1. incubación de laS mueStraS de Suelo para determinar la actividad de la ureaSa

Controles

Los controles se preparan mediante el procedimiento descrito anteriormente, pero añadiendo 1 mL de la solución de urea 0.2 M después de haber agregado la solu-ción de KCl-AgSO

4 (Alef y Nannipieri, 1998; Quintero-Lizaola et al., 2005).

Estimación del amonio desprendido

Tomar 20 mL de la muestra incubada y verterlos en un matraz de destilación de 100 mL, agregar 0.2 g de MgO y destilar hasta colectar 20 mL en un matraz


Erlenmeyer (colocado a la salida del equipo microkjeldahl) con 5 mL de la solución indicadora del ácido bórico (figura 1.2).

Titular el destilado con H2SO

40.005 M. Cada 1 mL de H

2SO

4 0.005 M es equi-

valente a 70 μg de N-NH4.

figura 1.2. deStilación de mueStraS para eStimar el amonio deSprendido

Cálculos

La actividad de la ureasa en suelos se expresa en μg de N-NH4/g de suelo

seco por 2 h. Para obtener la actividad de cada muestra se utiliza la siguiente fórmula:

Au =

V(M - C) x 70

sh x s

s

Donde

Au = activudad de la ureasa, en

µg N - NH4

g de suelo sexo x 2h


M = volumen de H2SO

4 gastado en la muestra, en mL

C = volumen de H2SO

4 gastado en el control, en mL

70 = factor de conversión, en µg N - NH4

mL de H2SO

4

ss = peso en base seca de un gramo de suelosh = peso de suelo utilizado, en gV = volumen total de la suspensión, en mL

Ejemplo: cálculo de la actividad enzimática de la ureasa de una muestra de suelo en cuyo análisis se gastaron 6.0 mL de H2SO4. A su vez, en el blanco la can-tidad de H2SO4 requerido fue de 5.7 mL. Se consideró lo siguiente: a) que para tal análisis se utilizaron 5 g de suelo (sh); b) el peso en base seca de un gramo de suelo es 0.70 g (ss); y c) el volumen de la suspensión fue de 50 mL (V).

Au = 300

µg N - NH4

g de suelo seco x 2

Au =

(50)(6.0 - 5.7) x 70

5 x 0.7

Control de calidad

La reacción de la ureasa sigue un curso lineal hasta por 5 h; pasado este tiempo las soluciones no presentarán un resultado óptimo.

Todo el material debe encontrarse en condiciones estériles debido a que las enzimas ureasas son muy sensibles y puede haber respuestas de interferencia por factores diversos.

cuadro 1.1. reSumen de laS condicioneS recomendadaS para la prueba de la actividad en-zimática de la ureaSa

Duración de la prueba 3 h

Temperatura de incubación 37 °C


DeteRminación De la activiDaD enzimática De la lipasa


Las lipasas son enzimas ubicuas que se encuentran en prácticamente todos los se-res vivos. Juegan un papel esencial en la digestión, el transporte y el procesamiento de los lípidos (triglicéridos, ceras, grasas y aceites). Son importantes porque son responsables de disgregar las grasas de los alimentos para que puedan ser absorbi-das por los organismos. Son una subclase de esterasas que interviene en el catabo-lismo de las grasas y aceites, al romper y modificar los enlaces éster de los lípidos y sus derivados. Su reacción principal es la hidrólisis de acilglicéridos, es decir, la rup-tura del triacilglicerol a diacilglicerol y a monoacilglicerol, ácidos grasos y glicerol. Sin embargo, también participan en reacciones de síntesis y transesterificación de acilglicéridos y fosfoglicéridos. Estas enzimas pueden tener actividad intracelular o extracelular. Su actividad óptima se encuentra a temperaturas cercanas a los 30 °C, pH neutro y en presencia de aireación (Sánchez-Ferrer, 1998).

Además de la digestión de grasas, las lipasas en los microorganismos se encar-gan de la reconstitución celular y del metabolismo lipoprotéico, funciones esencia-les para su supervivencia y para el mantenimiento de su función ecológica como organismos descomponedores en los ciclos biogeoquímicos naturales. Sin embar-go, estas enzimas también han mostrado su utilidad en procesos industriales y en la biorremediación de suelos contaminados.

La medición de la actividad de la lipasa ha resultado útil para monitorear la bio-rremediación de suelos contraminados con hidrocarburos de petróleo, en particular con diésel (Margesin et al., 1999; Margesin et al.,2000b). Esta actividad aumenta con el incremento inicial del contenido de aceites pesados, debido a que es induci-da por los productos liberados durante la biodegradación y que actúan de sustrato

cuadro 1.1. continúa

Tiempo de incubación 2 h

Cantidad de suelo 50 g

Número de réplicas 3 o más

Respuesta a medir Amonio liberado

Control positivo Adición de urea posterior a la adición de KCl-Ag

2SO

4


para las diferentes enzimas hidrolasas, incluidas las lipasas. Se ha observado que esta actividad no aumenta en el caso de suelos contaminados con hidrocarbu-ros aromáticos policíclicos, pero sí en suelos contaminados con diésel (Mills et al., 1978; Margesin et al., 2000a).

Existen varios métodos para determinar la actividad de la lipasa, que inclu-yen los basados en titulación, los que detectan productos fluorescentes (Cooper y Morgan, 1981) y los colorimétricos, que usan cromógenos como los p-nitrofeni-lésteres (Shirai y Jackson, 1982). El método que aquí se describe es el colorimétri-co desarrollado por Margesin et al. (2002). En este método, el p-nitrofenilbutirato (p-NPB) actúa como sustrato, y la actividad catalítica de la lipasa se determina al cuantificar el p-nitrofenol (p-NP) producido por la hidrólisis del sustrato, a pH óptimo (7.25). La actividad de la lipasa se incrementa a medida que hay mayor contaminación por hidrocarburos (Margesin et al., 2002; Margesin, 2005). Esta técnica es rápida y sencilla, y no es costosa como los métodos fluorimétricos.


Esta técnica puede aplicarse a suelos contaminados con hidrocarburos, como diésel y petróleo, así como para controlar los procesos de biorremediación de suelos.

Material y equipo

Matraces aforados de 10, 25, 100 y 500 mLPipetas de 5 mLTubos de 10 mLTubos de ensaye de 10 mL

AutoclaveBalanza analíticaBaño maríaCentrífuga refrigeradaEspectrofotómetro UV-VIS

Es necesario esterilizar el material en autoclave.

Reactivos

Agua destiladaFosfato monobásico de sodio (NaH2PO4)Hidróxido de sodio (NaOH)p-nitrofenilbutirato (p-NPB) de 98 % de pureza


p-nitrofenol (p-NP) de 98 % de pureza2-propanol de 99.7 % de pureza

Soluciones

Solución amortiguadora de fosfatos 100 mM pH 7.25. Pesar 6 g de NaH2PO4 y disolverlos en 400 mL de agua destilada, ajustar el pH a 7.25 con una solución de NaOH 1N y aforar a 500 mL con agua destilada. Guardar en refrigeración a 4 °C durante 15 días.

Solución de hidróxido de sodio 1N. Disolver 4 g de NaOH en agua destilada (fría y previamente hervida) y aforar a 100 mL. La solución puede permanecer a temperatura ambiente durante 15 días.

Solución de p-nitrofenol (p-NP) 100 μg/mL. Disolver 2.5 mg de pNP en la so-lución amortiguadora de fosfatos y aforar a 25 mL con la misma solución. Guardar en refrigeración a 4 °C durante una semana. Antes de utilizarla, verifi-car que el pH de la solución sea de 7.25.

Solución de p-nitrofenilbutirato (p-NPB)100 mM. Tomar 175.8 μL equivalente a 209.2 mg de pNPB, disolver y aforar a 10 mL con 2-propanol. Guardar a -20 °C durante 15 días o preparar cada vez que se utilice.

Procedimiento

Incubación de la muestra y cuantificación del p-nitrofenol

Agregar en un tubo para centrífuga 0.1 g de suelo húmedo, adicionar 5 mL de la solución amortiguadora de fosfatos y preincubar en baño maría a 30 °C durante 10 min.

Posteriormente, adicionar 50 μL de solución de p-NPB, mezclar e incubar en baño maría a la misma temperatura durante 10 min. Inmediatamente después, colocar los tubos en un baño con hielo durante 10 min, con el objetivo de detener la reacción.

Centrifugar los tubos a 2000 rpm durante 5 min a una temperatura de 2 a 4° C. Enseguida, introducir los tubos en el baño de hielo, pipetear el sobrenadante y medir su absorbancia a 400 nm (Margesin, 2005). Si los valores de absorbancia son muy altos, diluir las muestras con la solución amortiguadora de fosfatos.


Preparación de la curva de calibración

Para cuantificar la actividad enzimática en función de la concentración de p-NP se utiliza la solución amortiguadora de fosfatos para mantener el pH en un valor óptimo.

Se preparan 5 muestras de 0.1 g de suelo en los tubos para centrífuga, los cuales tendrán concentraciones desde 25 hasta 125 μg de p-NP. A cada tubo se agregan las soluciones de p-NP y amortiguadora de fosfatos, como se muestra en el cuadro 1.2. Se agita cada uno de los tubos durante unos segundos en el vórtex.

cuadro 1.2. relación de reactivoS a adicionar

Número de muestra 1 2 3 4 5

mL de solución p-NP 100 μg/mL 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25

mL de solución amortiguadora de fosfatos

4.75 4.50 4.15 4.00 3.75

Concentración final de p-NP (μg) 25 50 75 100 125

Posteriormente, se incuban los tubos durante 10 min a 30 oC en baño maría. Terminado el tiempo de incubación, se centrifugan a 2000 g durante 5 min a una temperatura de 2 a 4oC. Inmediatamente después de haber centrifugado los tu-bos, se mide la absorbancia a 400 nm en el espectrofotómetro, utilizando como blanco los reactivos sin adición de estándar.

Controles

Los controles para cada suelo que se analice se preparan de la misma manera que las muestras, pero sin adicionar suelo. Para ello se realizan cuando menos 3 réplicas en las que se agregan únicamente 5 mL de solución amortiguadora de fosfatos, se preincuban en baño maría a 30 °C durante 10 min y se continúa el mismo proce-dimiento que se usó para las muestras.

Cálculos

La actividad de la lipasa en suelos se expresa en μg de p-NP/g de suelo seco por 10 min. Los valores obtenidos de absorbancia en las muestras analizadas son interpo-


lados en la curva de calibración para obtener la concentración de p-NP. Para obte-ner la actividad de cada muestra se utiliza la siguiente fórmula (Margesin, 2005):

AL =

M - C

sh x s

c

Donde

AL = actividad de la lipasa, en µg p - NP

g de suelo seco x 10 min

M = concentración de p-NP de la muestra de suelo, en μgC = concentración de p-NP del control, en μgsh = peso del suelo (0.1 g)sc = peso del suelo seco, en g

Ejemplo. Cálculo de la actividad enzimática de la lipasa de una muestra de suelo que contiene 267.47 μg de p-NP. El control tiene una concentración de p-NP de 122.75 g, y el peso del suelo seco (s

c) es igual a 0.0766 g.

AL =

(267.47 - 122.75) µg p - NP

0.1 x 0.0788 g

AL = 18,892.87

µg p - NP

g de suelo seco x 10 min

Control de calidad

Se recomienda hacer la curva de calibración de p-NP en presencia de una mues-tra de suelo, debido a que el p-NP producido durante la reacción se adsorbe a esta matriz en diferentes proporciones dependiendo de las características del suelo.

Este bioensayo requiere de mantener el pH dentro de los límites de 7.2 a 7.3 debido a que el enlace éster de p-NPB es muy lábil.


cuadro 1.3. reSumen de laS condicioneS recomendadaS para la prueba de la actividad en-zimática de la lipaSa



Tiempo de incubación 10 min

pH 7.2 a 7.3


Control negativo Sin adición de suelo

Material de los recipientes de prueba Vidrio

DeteRminación De la activiDaD enzimática De la DeshiDRogenasa


Las enzimas deshidrogenasas pertenecen al grupo de las oxidorreductasas, es decir, a las enzimas que remueven electrones (oxidan) o añaden electrones (reducen) a varios sustratos (Ríos-Velázquez et al., 2008; Rodríguez-Zavala, 2006). La principal actividad de las deshidrogenasas es eliminar átomos de hidrógeno de la molécula del sustrato y transferirlos a un cofactor o coenzima (como algunas vitaminas o los nucléotidos NAD, NADP, FAD y FMN) que es reducido al recibir dichos átomos. De esta manera el sustrato queda oxidado y normalmente aparece con un doble enlace entre el oxígeno y el carbono, en las posiciones en las que antes estaba presente un grupo hidroxilo (OH) (Ríos-Velázquez et al., 2008).

Las deshidrogenasas están presentes en todos los seres vivos, en particular en levaduras y bacterias. Son claves en el metabolismo energético de las células, ya que participan en la glucólisis (degradación de la glucosa a piruvato), la fermenta-ción (degradación anaerobia de la glucosa para obtener energía en forma de ATP) y el ciclo de Krebs (ciclo subsiguiente a la glucólisis de donde se obtiene más ATP) (Ríos-Velázquez et al., 2008). Estas enzimas intervienen en los procesos de des-toxificación y en el metabolismo de la vitamina A (Ríos-Velázquez et al., 2008).

La actividad de la deshidrogenasa ha sido utilizada como un indicador de la actividad microbiana del suelo (Barajas-Aceves, 2008). La actividad de la deshi-


drogenasa es mayor en suelos anaeróbicos o en inundados en comparación a los suelos incubados en condiciones aerobias (Makoi y Ndakidemi, 2008; Subhani et al., 2001). La medición de esta actividad comprende distintos sistemas de enzi-mas, las cuales intervienen en procesos de deshidrogenación, representados por la siguiente reacción (Paolini, 2003):

XH2 + A X + AH

2

DondeXH

2 = compuesto orgánico (donador de hidrógenos)

A = aceptor de hidrógenos

Se ha encontrado una correlación positiva entre esta actividad y el conteni-do de hidrocarburos en el suelo. En una primera fase se observa un aumento de la actividad de las deshidrogenasas en el suelo como reflejo de la adaptación y el crecimiento exponencial de los microorganismos, debido a la disponibilidad de nuevas fuentes de carbono introducidas por los hidrocarburos. Posteriormente, y como una consecuencia de la biodegradación, esta actividad decrece cuando el contenido de hidrocarburos disminuye debido a una menor disponibilidad de los compuestos (Margesin, 2005).

En esta sección se describe el método de Casida (Casida et al., 1964; Casida, 1977; Barajas-Aceves, 2008), el cual se basa en el uso de una sal soluble, en este caso cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolium (TTC), como aceptor terminal de elec-trones. Después de incubar las muestras de suelo 24 h a 37 oC, esta sal es reduci-da formando trifeniltetrazoliumformazan (TPF) de color rojo. Una vez extraído el TPF con un disolvente como metanol o acetona, su concentración es cuantificada por colorimetría (Trevors, 1984; Alef y Nannipieri, 1998).

Esta técnica es fácil de realizar y sus resultados son confiables; sin embargo, tiene las desventajas de que algunos de los reactivos que requiere no son fáciles de adquirir y de que, comparado con el método del iodonitrotetrazolioformazán (INT), el TTC es menos soluble en agua y puede reducirse en presencia de grandes cantidades de oxígeno (Von Mersi y Schinner, 1991).



La actividad de la deshidrogenasa es utilizada para monitorear los suelos conta-minados con hidrocarburos de petróleo, como el diésel, y durante los procesos para su biorremediación.

Material y equipo

Embudos de separación Balanza analítica

Matraces aforados de 50 y 100 mL Espectrofotómetro UV-VIS

Papel aluminio Estufa de incubación

Pipetas graduadas de 1, 5 y 10 mL Vórtex

Tubos de ensayo de 16 x 150 mm

Reactivos

Acetona o metanol grado analíticoÁcido clorhídrico grado analíticoAgua destiladaAmortiguador TRIS (hidroxi metil aminometano) grado ultrapuro (≥ 99 %)Carbonato de calcio (CaCO3) grado analíticoCloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) de 98 % de pureza1,3,5-trifenilformazano (TPF) de 98 % de pureza

Soluciones

Solución de ácido clorhídrico 0.2 M. Disolver 8.14 mL de ácido clorhídrico al 38 % en un matraz aforado que contenga 250 mL de agua destilada y aforar a 500 mL.

Solución amortiguadora de TRIS pH 7.6. Disolver 12.1 g de TRIS en 700 mL de agua destilada, ajustar el pH a 7.6 con HCl

(0.2 M) y aforar con agua destilada a 1000 mL.Solución de 1,3,5-trifenilformazano (TPF). Disolver 50 mg de TPF en 80 mL de

metanol (o acetona) y aforar a 100 mL con el mismo disolvente.Solución de cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) al 3% (en peso/volumen).

Disolver 3 g de cloruro de 2,3,5-TTC en 75 mL de agua destilada y aforar a 100 mL.


Procedimiento

Incubación de las muestra

Se pesan, por separado, tres porciones de suelo de 2 g cada una y se colocan en tubos de ensayo forrados con papel aluminio (ya que el TTC y el TPF son sensibles a la luz). A cada tubo se le adicionan 0.0335 g de CaCO

3, 0.5 mL de la solución

de TTC al 3 % y 1.75 mL de agua destilada. Los contenidos son mezclados en el vórtex. Los tubos son incubados durante 24 h a 37 oC. Todo este procedimiento debe realizarse con luz difusa.

Extracción y medición del 1,3,5-trifenilformazano

Al finalizar la incubación, el TPF formado por la reducción del TTC se extrae en un embudo de separación con 5 mL de metanol (figura 1.3), agitando durante 5 minutos. Después, se filtra. Este procedimiento se repite añadiendo metanol hasta llegar a un volumen de 40 mL. El extracto total se deposita en un matraz de 50 mL para aforar. Se analizan las muestras en el espectrofotómetro a una longitud de onda 485 nm, usando metanol como blanco.

figura 1.3. extracción de 1,3,5-trifenilformazano (tpf)


Preparación de la curva de calibración de 1,3,5-trifenilformazano

Se toman 0, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0 y 4.0 mL de la solución de TPF en matraces volu-métricos de 50 mL. Se adicionan 8.3 mL de solución de amortiguador TRIS pH 7.6 a cada matraz y se aforan con metanol (o acetona) a 50 mL. Las concentraciones finales que se obtienen son 0, 5, 10, 20, 30 y 40 μg TPF/mL. Se lee en espectro-fotómetro a una longitud de onda de 485 nm.

Controles

Los controles se preparan con 5 mL de solución amortiguadora TRIS sin adicionar TTC, y se tratan igual que las muestras.

Cálculos

La actividad de la deshidrogenasa en suelos se expresa como μg TPF/g suelo por día. Los valores obtenidos de absorbancia en las muestras analizadas son interpolados en la curva de calibración para obtener la concentración del TPF. Como blanco se utilizan los controles de suelo. Para obtener la actividad de cada muestra se utiliza la siguiente fórmula:

AD =

V {[TPF]M

- [TPF]C}

sc

Donde:

AD = actividad de la lipasa, en

µg TPF

g de suelo seco x d[TPF]M = concentración de TPF en la muestra de suelo, en μg/mL[TPF]C = concentración de TPF en la muestra de suelo, en μg/mLsc = peso del suelo en base seca de 1 g de suelo húmedo, en gV = volumen de metanol (o acetona) adicionado a la suspensión, en mL


Ejemplo

Cálculo de la actividad enzimática de la deshidrogenasa de una muestra de suelo cuyo análisis reporta que contiene 2.72 μg TPF/mL. Para este cálculo se con-sidera los siguiente: a) el peso seco de 1 g de suelo sin secar es 0.6634 g; b) la concentración de TPF del blanco es 0.82 μg TPF/mL; y c) el volumen de metanol adicionado a la suspensión fue de 40 mL.

AD = 114.56

µg TPF

g de suelo seco x d

Control de calidad

Este método no debe utilizarse en suelos contaminados con cobre, ya que este elemento puede inhibir la actividad de la deshidrogenasa, por reducción de la ab-sorbancia de TPF (García et al., 2003). El TTC puede ser tóxico para los microor-ganismos (Howard, 1972).

La lectura debe realizarse en oscuridad o luz difusa para evitar que los resulta-dos se alteren.

cuadro 1.4. reSumen de laS condicioneS recomendadaS para la prueba de la actividad enzi-mática de la deShidrogenaSa


Luz Difusa u oscuridad




Control negativo 5 mL de TRIS, sin adición de TTC

Cuantificación Espectrofotométrica 485 nm



DeteRminación De la activiDaD enzimática De la catalasa


Durante los procesos biológicos (metabolismo) se generan especies químicas conocidas como radicales libres, los cuales se caracterizan por presentar un electrón desapareado y por ser muy reactivas. Entre estos radicales, las espe-cies reactivas derivadas del oxígeno (EROS) resultan de gran interés debido a su estructura birradical y al gran número de procesos que las generan y en los que pueden verse involucradas. Las principales EROS son el anión superóxido (O

2-), el radical hidroxilo (OH), el oxígeno singlete y el peróxido de hidroge-

no (también llamado agua oxigenada) (H2O

2). Estas especies oxidantes están

implicadas en el daño celular que se ha asociado con el desarrollo de cáncer, enfermedades inflamatorias, senectud celular y enfermedades neurodegenera-tivas, entre otros procesos patológicos. En los organismos existe un sistema de protección antioxidante formado por enzimas y compuestos de bajo peso molecular. Una de las enzimas que intervienen en esta protección y en el man-tenimiento del balance oxidante/antioxidante es la catalasa (UACH, 2009).

La catalasa forma parte de los sistemas de destoxificación de las células ani-males y vegetales, y de bacterias aerobias y anaerobias facultativas. La reacción específica que cataliza es la ruptura del H

2O

2 para formar agua y oxígeno. El H

2O

2

se forma en el transporte de electrones de la cadena respiratoria y en ciertas reac-ciones de hidroxilación y oxigenación (Alef y Nannipieri, 1998).

La catalasa se relaciona con la actividad microbiana del suelo por ser una enzi-ma intracelular presente en microorganismos aerobios y en la mayoría de los anae-robios facultativos.

Se han empleado muchos métodos para determinar la actividad de la catalasa, los cuales miden la cantidad de oxígeno liberado (O

2) o el H

2O

2 remanente. El

oxígeno puede cuantificarse por volumetría de gases o cromatografía de gases. El H

2O

2 se determina por volumetría o colorimetría (García et al., 2003).

En esta sección se describe el método de Johnson y Temple (1964) descrito por García et al., (2003), que mide el H

2O

2 residual, para lo cual se adiciona una

cantidad determinada de H2O

2 al suelo incubando a 20 °C durante un tiempo de-

terminado en el que actúa la enzima, según la siguiente reacción:

2H2O

2 2H

2O + O

2


El H2O

2 residual se valora con permanganato potásico. Esta valoración se basa

en la reducción del permanganato potásico por el H2O

2 en solución ácida, según la

siguiente reacción:

5H2O

2 + 2MnO

4- + 6H+ 5O

2 + 2Mn++ + 8H

2O


Este ensayo es aplicable a suelo contaminado con hidrocarburos (como petró-leo o diésel) y a suelo biorremediado.

Material y equipo


Luz Difusa u oscuridad




Control negativo 5 mL de TRIS, sin adición de TTC



Reactivos

Ácido sulfúrico (H2SO

4) al 98 % de pureza

Agua destiladaPermanganato de potasio (KMnO

4) grado analítico

Peróxido de hidrógeno (H2O

2) al 30 % de pureza

Oxalato de sodio grado analítico

Soluciones

Solución de ácido sulfúrico 1.5 M. Se depositan 82.6 mL de H2SO4 de 98 % en matraz aforado y se lleva a 1000 mL.

Solución de permanganato de potasio 0.01 M. Se pesan 1.5804 g de KMnO4 y se


depositan en un matraz Erlenmeyer. Se adicionan 400 mL de agua destilada, agitando con agitador magnético y calentando hasta su disolución completa. Se deja enfriar, se filtra y se afora a 1 000 mL utilizando un matraz aforado. Se guarda en frasco ámbar. La solución se debe valorar cada vez que se utilice con oxalato de sodio para conocer su normalidad.

Solución de peróxido de hidrógeno 1:100. Se toma una alícuota de 1 mL de H2O2 (agua oxigenada) al 30 %, se afora a 100 mL. Esta solución debe prepararse inmediatamente antes de su uso.

Procedimiento

Pesar 0.5 g de suelo (tamizado en una malla con tamaño de poro < 2 mm) y depositarlo en un matraz Erlenmeyer, agregar 40 mL de agua destilada, tapar el matraz y agitar por 30 min en agitador rotatorio (a una velocidad aproximada de 30 vueltas por min).

Transcurrido el tiempo, adicionar 5 mL de la solución de H2O

2 (1:100), tapar

nuevamente y agitar por 10 min. Añadir 5 mL de la solución de H2SO

41.5 M con

la finalidad de parar la reacción enzimática y estabilizar el H2O

2 remanente; poste-

riormente se filtra.

Medición del peróxido de hidrógeno remanente

Se toma una alícuota de 25 mL del filtrado de cada muestra y se titula lentamente con la solución de KMnO

4 0.01M, con agitación (con agitador magnético). Para

llegar al vire se debe ser muy observador, ya que las primeras gotas del permanga-nato se decoloran lentamente pero luego la reacción se hace más rápida. El punto final de la valoración lo señala la aparición del primer color rosa permanente.

Controles

Los controles se preparan sustituyendo los 5 mL de H2O

2 por un volumen igual de

agua destilada y se adicionan al suelo; se procede de la misma forma que para las muestras problema.

También se prepara un blanco con 40 mL de agua destilada, 5 mL de H2O

2

(1:100) y 5 mL de H2SO

41.5 M. A este blanco no se le adiciona suelo, pero sí


H2O

2. Sirve para indicar la cantidad de H

2O

2 que podría poseer la muestra como

remanente al final de la incubación, si la actividad de la catalasa fuese nula. Se ob-tiene una solución de peróxido 8.8 mM (con 0.44 mmoles de H

2O

2).

El procedimiento de titulación es igual, tanto para los controles como para el blanco. La concentración inicial del H

2O

2 que se añade al suelo se determina por la

valoración con la solución de KMnO4 0.01M del blanco sin suelo y con H

2O

2.

Cálculos

Para calcular la actividad de la catalasa del suelo, se emplea la siguiente fórmula:

AC =

[B - (M - C)] x N x V x 1

SS

Donde

AC = actividad de la catalasa, en

mmoles de H2O

2 consumidos

g de suelo seco x hB = cantidad de KMnO

4 (en mL) gastados en la valoración del blanco sin suelo

y con H2O

2

M = cantidad de KMnO4 (en mL) gastados en la valoración de las muestras

C = cantidad de KMnO4 (en mL) gastados en la valoración del control corres-

pondiente a cada muestra de sueloN = normalidad exacta de la solución de KMnO

4

0.5 = valor constante que procede del cálculo para conocer los mg de H2O

2 que

reaccionan con el KMnO4 [peso molecular del H

2O

2 (34 dividido por estado de

oxidación de (2)] y del cálculo para obtener la cantidad de H2O

2 en mmoles (1/

peso molecular del H2O

2)

V = factor de dilución; en este caso es 50 mL/25 mLs

s = factor relativo a la cantidad de suelo seco utilizado (aquí se toma una

muestra de 0.5 g de suelo húmedo y se pone a secar en la balanza de humedad. Al final se reporta el peso que corresponde en suelo seco y ese valor es al que se refiere G)

t = factor de tiempo (6) porque son 10 minutos; se reporta hora (60/10 =6)


Ejemplo

Cálculo de la actividad enzimática de la catalasa de una muestra de suelo de la cual se tienen los siguientes datos:B = 10.4 mL de KMnO

4

M = 10.7 mL de KMnO4

C = 0.1 mL de KMnO4

N = 0.0145 NV = 2G = 0.3770 g de suelo seco

Al sustituir en la fórmula se obtiene el siguiente resultado:

AC = 0.2076

mmoles de H2O

2 consumidos

g de suelo seco x h

Control de calidad

En esta técnica enzimática el color rosa pálido indica el viraje. Ya que el H2O

2

es muy inestable y la muestra antes de titular es de color transparente, se debe finalizar la titulación en cuanto aparezca el primer color rosa permanente du-rante la titulación.

cuadro 1.5. reSumen de laS condicioneS recomendadaS para la prueba de la actividad en-zimática de la catalaSa



Control negativo 5 mL de agua destilada sustituyen a 5 mL de H

2O

2

Blanco de prueba Sin suelo pero con H2O

2

Cuantificación Permanganimetría





consiDeRaciones geneRales paRa el contRol De caliDaD en los métoDos enzimáticos

Para garantizar resultados reproducibles en los métodos descritos en este capí-tulo, deben atenderse las siguientes consideraciones:

La limpieza del material de vidrio y su protección del polvo son muy impor-tantes para evitar interferencias. Se recomienda lavar el material de vidrio con un detergente no iónico.

Con la finalidad de asegurar un buen procedimiento, los materiales para las determinaciones enzimáticas se deben separar. Los recipientes de prueba deben ser resistentes a las reacciones y no deben adsorber el sustrato o los productos generados en la reacción.

Cada técnica debe realizarse de acuerdo con el procedimiento descrito ya que si se cambian algunos valores, como por ejemplo la concentración del sustrato, se pueden obtener resultados incorrectos.

En cuanto a la utilización de solución tampón o amortiguadora, existen dife-rencias según los métodos; algunos autores (Kandeler y Gerber, 1988; Von Mersi y Schinner, 1991) no utilizan ninguna, pero otros sí la utilizan para ajustar el pH del suelo (Sinsabaugh et al., 2000). En la mayoría de los métodos enzimáticos descritos la solución amortiguadora empleada es la que se añade al suelo antes de su incubación. Cualquier cambio de tipo o concentración de tampón puede afectar los resultados, por lo cual deben comprobarse los efectos que el cambio tendría sobre la actividad enzimática.

La temperatura y el tiempo de incubación deben ser los indicados para cada técnica, usualmente 37° C. El incremento de la temperatura aumenta la velocidad de reacción; sin embargo, si esta llega a ser muy alta, las enzimas pueden desna-turalizarse. Si el tiempo no es correcto se obtendrían resultados erróneos porque la relación de actividad por unidad de tiempo cambiará (García et al., 2003).

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