Transcripción en eucariotas En eucariotas, la regulación de la transcripción puede darse en cada etapa al contraste con procariotas que solo podía regularse en la iniciación.

La transcripción de un gen eucariota codificante de proteínas es precedida por:

Decondensación sitio específica del locus (región donde está el gen que se quiere expresar)esto permite el acceso al DNA.

Remodelado del nucleosoma se libera a la región de los nucleosomas por desplazamiento de histonas.

Modificación de histonas (química)

Unión de activadores transcripcionales y

coactivadores a enhancers y promotores forman complejo DNA-proteínas.

Posicionado de la maquinaria basal de

transcripción al promotor.

Para todo esto se necesitan maquinarias proteicas específicas. La condensación en los nucleosomas provoca un gran impedimento transcripcional. La polimerasa por sí sola no puede desarmar el nucleosoma, debido a la diferencia de tamaños, por lo que requiere de una maquinaria específica compuesta por factores que disocian o hacen perder la inestabilidad a los nucleosomas.

Maquinaria transcripcional

RNApol I rRNA

Es responsable de la síntesis de RNA prerribosómico, que contiene el precursor de los RNAr (18S, 5,8S y 28S). La secuencia de su promotor varía mucho de una especie a otra. Esta enzima no es inhibida por el octapéptido cíclico llamado -amantina.

RNApol II mRNA

Su principal función es la síntesis de mRNA. Reconoce muchos promotores con algunas características en común como la secuencia TATA (cerca del -30, es decir, upstream respecto del sitio de inicio)

Características

12 subunidades. 53% de identidad (presentan exactamente los mismos aminoácidos en diferentes especies). Se pueden intercambiar alrededor de 10 subunidades.

Las 2 subunidades más grandes de la RNApol II son homólogas de las subunidades β y β´de la RNApol bacteriana.

La subunidad más grande de la RNApol II tiene un dominio carboxilo terminal (CTD) constituido por múltiples

repeticiones de una secuencia consenso de 7aa que es exclusivo de dicha polimerasa. El CTD puede estar altamente fosforilado en moléculas de serina o treonina, fenómeno que forma parte de la reacción de iniciación. D eleciones que remueven solo una fracción de las repeticiones del heptapéptido pueden ser letales.

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TFIIF se asocia a la RNApol II y ayuda a mantener alineado el extremo 3´-OH del transcripto naciente, por lo que previene

el retroceso de la enzima y permite una síntesis continua.

TBP presenta un importante papel en el posicionamiento de la RNA pol II al incio de la transcripción del gen.

ELONGATOR y FACT

Actúan sobre la cromatina. Elongator y FACT promueven la elongación del transcripto por la RNApol II, modificando los nucleosomas en vías de facilitar el pasaje de la enzima a lo largo de la cromatina.

Elongator está altamente conservada desde levaduras hasta humanos. Entre sus subunidades se encuentran Elp3

alargador, una histona Acetiltransferasa (HAT) del GCN5 relacionada con la familia N-Acetiltransferasa (GNAT). Posee actividad histona Acetiltransferasa: relaja la interaccion DNA-Histona por modificaciones covalentes de estas últimas en su N-terminal.

FACT promueve la elongación asociándose a las histonas H2A y H2B y removiéndolas del nucleosoma, permitiendo así el

desplazamiento completo del nucleosoma del DNA que se va a transcribir.

RNApol III tRNA

Produce tRNA y el rRNA 5S principalmente. Sus promotores están bien caracterizados: algunos están localizados dentro del propio gen, mientras que otros se encuentran en localizaciones hacia el sitio de inicio (hacia el lado 5´). La respuesta de esta enzima a la -amantina está poco conservada, en animales es inhibida solo por altos niveles del compuesto, pero en levaduras e insectos no es inhibida.

Islas CpG

El dinucleótido CpG es poco frecuente en genomas de vertebrados debido a que 5-metilcitosina puede transformarse

en timina (por desaminación) el cual no es reparado.

Rodean a los promotores de genes de expresión constitutiva donde no están metilados. Existen segmentos de ADN de 0.5–2 kbp que poseen una alta densidad de dinucleótidos CpG. El genoma humano contiene 29,000 islas CpG. En mamíferos la mitad de los promotores codificantes de proteínas están asociados con CpG. Las islas CpG carecen de TATA boxes, DPE o Inr. Se caracterizan por la presencia de múltiples sitios de iniciación de la transcripción que abarcan una región de 100bp

o más en donde puede comenzar. Presentan múltiples sitios de unión para el factor de transcripción Sp1. Su regulación se da por metilación: la metilación de una isla impide la activación de un promotor en su interior; la

unión de proteínas a pares CpG metilados provoca la represión.

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Transcripción

Iniciación

1. La proteína TBP se une a TATA interactuando con el surco

menor del DNA por lo que curva la hélice (DNA acodado)

2. Una vez fijada TBP se une TFIIB (se une a la cara opuesta a

donde se está formando el complejo).

3. El complejo RNApol II-TFIIF dirige a la RNApol II hacia al

sitio de inicio.

4. Se une TFIIE y TFIIH y termina de formar el complejo

cerrado de pre iniciación. El factor TFIIH posee actividad quinasa sobre dominio c-terminal del heptapéptido y lo fosforila, y su actividad helicasa, que promueve el desenrollamiento del DNA cerca del sitio de inicio (requiere hidrólisis de ATP), permiten crear así el complejo abierto. La RNApol II y el DNA están “activados” y comienza la síntesis del transcripto utilizando ATP y NTPs.

Elongación

El TFIIF permanece asociado a la RNApolII durante toda la elongación. Durante esta etapa la actividad de la polimerasa está muy potenciada por proteínas denominadas factores de elongación.La RNA polimerasa II durante la elongación a cada paso de agregado de nucleótido oscila entre las conformaciones activa e inactiva (pausa). Lo hace de forma discontinua. En algunos sitios del molde de ADN, la RNApol “en pausa” es detenida, esa situación puede ser revertida sólo por factores de elongación (SII) que hacen que la transcripción sea continua. La detención y la pausa sería el resultado de un movimiento en retroceso (2 – 4 nt) de la enzima y de la burbuja de transcripción, y de reinicio de la síntesis. Se la puede llamar a esta: “actividad correctora de alineación”.

Terminación

Completado el transcripto, la transcripción finaliza por mecanismos poco conocidos. La RNApol II se desfosforila y recicla para estar disponible para iniciar otro transcripto.Ninguna de las 3 RNApol reconoce directamente a sus promotores. Un principio unificador es que los factores de transcripción tienen la responsabilidad primaria de reconocer los elementos de secuencia característicos de cualquier promotor en particular y sirven, a su vez, para unirse a la RNApol y posicionarla correctamente en el punto de inicio. El factor TBP es necesario en las tres RNApol.

Cuando el promotor a partir del cual se inicia la transcripción tiene la caja TATA y las secuencias INR se requiere de un factor de iniciación adicional, el TFIIA. Este se asocia al DNA al mismo tiempo que TBP y favorece el acodamiento del DNA. Se libera durante la elongación.

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Gen eucariota

Enhancer: elemento que aumenta la eficiencia de los

promotores permitiendo una mayor frecuncia de iniciación de la transcripción, para esto interactúan con múltiples proteínas activadoras formando un complejo conocido como amplificosoma. Varias proteínas se unen al enhancer produciendo una curva en el DNA que permite la estimulación del promotor a grandes distancias. La formación de este complejo se estabiliza por mútiples uniones proteína-proteína y proteína-DNA.

TATA box: es un promotor que se encuentra a una distancia aproximadamente de -25 -35 nucleótidos con respecto al

inicio de la transciprción. Los promotores cumplen la función de dirigir la policurva al inicio de la transcripción de genes que se encuentran paralelos a ellos. Estudios demostraron que si la secuencia TATA sufre una mutación, la eficiencia de la transcripción disminuye. Los nucleótidos que se encuentran entre la caja TATA y el +1 pueden variar sin que se modifique la función de TATA. si los genes no se ven alterados en su nivel de expresión, carecen de TATA box por lo tanto tienen promotores como islas CpG

+1: es el sitio de inicio de la transcripción. Este sitio puede estar inmerso en otro promotor llamado iniciador (inr). El inr

posee una citosina en -1 y una adenina en +1.

Exon: elemento que se transcribe y luego del proceso de maduración del pre-mRNA forman parte del mRNA maduro.

Intrón: son elementos que se transcriben y que durante el proceso de maduración del pre-mRNA son escindidos por lo

tanto, no forman parte del mRNA maduro.

Fin de la transcripción: en eucariotas es menos conocido el mecanismo que en bacterias (que se conoce como rho-

independiente y rho-dependiente) existen ciertas secuencias nucleotídicas que están vinculadas con la liberación del la RNA-pol.

(Inr) es un elemento promotor que es funcionalmente similar a TATA box y puede actuar independientemente.

Dependiendo del espaciamiento entre ambos, varía cómo actúan, dado que pueden funcionar independientemente uno del otro o pueden influir en la acción del otro.

Espaciado TATA-INR y direccionalidad de la transcripción:

15-20 bp se mantiene el sinergismo pero el +1 lo dicta el TATA box 25-30 bp los dos elementos actúan sinérgicamente 30 bp actúan independientemente

TFIID interacciona específicamente con Inr La acción sinérgica de TATA y Inr correlaciona con la unión cooperativa de TFIID a los dos elementos.

TFIIA es indispensable para la unión de TFIID a Inr RNA polimerasa II reconoce ADN inespecíficamente, sin embargo posee una débil e intrínseca preferencia por secuencias de tipo Inr.

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DPE actúa conjuntamente con Inr. Su secuencia principal está localizada a 28-32 nt del A1 en el motivo Inr. Un promotor

dependiente de DPE contiene Inr y DPE.

Mutaciones en cualquiera de los dos elementos resultan en la pérdida de unión de TFIID y de actividad basal de transcripción.

Maduración del RNA

La RNApol II como plataforma

Mientras está elongando, la RNApol II funciona como una plataforma que coordina el procesamiento del mRNA y su exportación. Durante la elongación, al transcripto se asocian las enzimas necesarias para modificarlo y exportarlo.

El complejo de elongación de la RNA polimerasa II puede actuar como una plataforma que coordina el procesamiento y transcripción del mRNA y su exportación, dado que sobre el complejo se asocian las actividades enzimáticas necesarias para procesar y exportar el transcripto. Los factores de elongación también se asocian a esta plataforma y le abren camino a la RNApol o le ayudan a que realice una síntesis continua.

Procesamiento del RNA

Capping

Sucede cuando el transcripto posee una longitud de 25-30nt. Se añado un nucleótido de guanina modificado, el 7-metilguanosinatrifosfato al transcripto mendiante la unión 5-fosfato -5 fosfato.

Poliadenilación

Es la adición al extremo 3' de una cola poli-A, una secuencia larga de poliadenilato, es decir, un tramo de RNA cuyas bases son todas adenina. Su adición está mediada por una secuencia o señal de poliadenilación (AAUAAA), y una zona rica en G:C. Esta cola protege al ARNm frente a la degradación, aumentando su vida media en el citosol, de modo que se puede sintetizar mayor cantidad de proteína.

Splicing (Remoción de intrones)

Tipo I

El 3’ OH de la adenosina actua como nucleofilo y aca a al extremo 5’ del intrón. Luego el extremo 3’ OH del exón ataca al extremo 5’ del otro exón eliminando el intrón.

Para demostrarlo, se hace una síntesis química de RNA con las secuencias conocidas que hacen splicing y se demuestra su actividad enzimática intrínseca al eliminar posibles contaminantes de la reacción.

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Tipo II

El 2’ OH de la A del intro (está dentro de intro) actua como nucleófilo y ataca al extremo 3’ del exon generando un intermediaron en forma de lazo. El extremo 3’ del exon ataca al extremo 5’ del otro exon liberando al intron.

Que el splicing sea del tipo I o II depende del organismo

Tipo III

U1 se una al sitio de splicing, luego U2, se asocia al intrón que va a hacer el ataque nucleofílico. La adición de U4/U6 y U5 conduce a la formación del empalmosoma completo, forman un bucle y estimulan a que el OH de la A del interior del intrón haga el primer ataque nucleofílico al extremo del 5´del intrón. Luego de liberarse U1 y U4. El U-OH libre formado acata al otro extremo del intrón y lo libera, junto con U6, U5 Y U2.

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¿Cómo determinar el tamaño/PM del mRNA?

Northern Blot

1.º. Extraer el RNA utilziando DEPC que inhibe la función de las RNAsas2.º. Electroforesis en gel con un marcador de MPM marcado 3.º. Luego pasardo a una membrana 4.º. Hibridar con una sonda específica si tengo el en secuenciado y revelar

¿Cómo cuantificar los niveles de transcrpción?

Northern Blot

5.º. Extraer el RNA utilziando DEPC que inhibe la función de las RNAsas6.º. Electroforesis en gel7.º. Luego pasardo a una membrana 8.º. Hibridar con una sonda y revelar

IMPORTANTE: el estándar interno va a ser el gen de expresión constitutiva.

Con un contador de pixeles se comprueba la cantidad de estándar y de RNA

¿Cómo determinar el inicio de la transcripción (+1)?

(a) Se transcribe la secuencia de DNA del gen en estudio obteniéndose un mRNA (b) Utilizando la proteína codificada por dicho mRNA se diseña un primer usando su Nt y se hibrida el mRNA con la

sonda(c) Se realiza la retrotranscipción con NTP’s marcdos in vitro (d) Se obtiene el segmento de RNA con el primer + Nt marcado con un determinado PM.

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Para conocer el PM de dicho fragmento se utiliza el método de Sanger. En este método se usan los 4 tipos de NTPs y dioxiNTPs para producir fragmentos de diferentes largos que terminan en el dioxiNTP adicionado, de tal manera que en una electroforesis de alta definición (poliacrilamida) se pueden diferenciar los fragmentos por su tamaño y conocer cuál es el nucleótido en cada posición.

Si la banda aparece a la misma altura que A, +1 = A

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Regulación de la transcripción en eucariotasCaracterísticas importantes que distinguen la regulación de la expresión eucariota de la de bacterias:

1. El acceso a promotores eucarióticos está restringido por la estructura de la cromatina y la activación de la transcripción está asociada con múltiples cambios en la estructura de la cromatina en la región transcripta.

2. Los mecanismos de regulación positiva predominan sobre los de regulación negativa en eucariótas, porque el estado de transcripción basas es restrictivo y entonces los genes requiere de activación para ser transcriptos.

3. Tienen proteínas reguladoras de eucariotas son multiméricas, más grandes y complejas que las bacterianas.4. La transcripción en el núcleo eucariótico está separada espacialmente de la traducción citoplasmática.

Los mecanismos en los cuales se puede producir la regulación de la expresión genética en eucariotas a nivel Transcripcional están relacionados con:

1. Selección de gen que se transcribe.2. Tasa de expresión.3. Uso de promotores alternativos.

Secuencias de posible regulación en eucariotas son:

Promotor, Próximas al promotor, Enhancer (lejanas al promotor hacia 5´o hacia 3´) también llamadas secuencias intensificadoras, y Secuencias silenciadoras

El DNA de las células eucariotas no está libre, sino asociado a una masa proteica aproximadamente en igual cantidad, en la forma de cromatina. La capacidad de los factores de transcripción de interactuar con largos segmentos de DNA está regulada por el control de la estructura de dicha cromatina. Todas estas secuencias y proteínas regulan la estructura de la cromatina y la tasa de transcripción, dado que a ellas se une la maquinaria de transcripción y la mayoría de los factores de transcripción. Estos factores de transcripción tienen dos dominios, uno de unión al DNA y uno de trans-activación o dominio de activación simplemente. Su actividad se puede controlar:

En el momento de su síntesis, Por modificación covalente (como Fosforilación), Por unión a un ligando, Por unión a un inhibidor.

Las proteínas de unión a enhancers y de unión a promotor son las encargadas de interactuar con el DNA y doblarlo. Entre esas secuencias pueden existir “aisladores” que no dejan que se unan las proteínas. Activadores en enhancers o cerca del promotor y el complejo mediador son requeridos para activar la maquinaria Transcripcional.

Entonces el nivel de transcripción depende de mecanismos que proporcionan los cambios estructurales de la cromatina, llamados remodelación de la cromatina, y del estado del DNA, es decir:

Grado de acetilación de histonas Grado de metilación del DNA y de las histonas Grado de Fosforilación del DNA y de las histonas Posibilidad de remodelación de los nucleosomas del DNA. Esta requiere de complejos proteicos que mueven o

desplazan activamente los nucleosomas, hidrolizando ATP en el proceso.

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Activadores

Son proteínas modulares compuestas por diferentes dominios funcionales bien definidos: un dominio de unión al DNA que interactúa con secuencias específicas del DNA y un dominio de activación que interactúa con otras proteínas para estimular la transcripción de un promotor ya sea lejano o cercano. Los dominios de unión al DNA puede clasificarse según varios tipos estructurales; en la mayoría de activadores y represores bacterianos, las hélices del dominio de fijación están orientadas de tan modo que se ubican en el surco mayor de DNA; en eucariotas, se pueden clasificar según su dominio de fijación en proteínas de:

Homeodominio (Bzip) Dedos de zinc Hélice alada Cremallera de leucina Hélice-bucle-hélice (HLH) Hélice-vuelta-hélice (HTH)

Los dominios de activación funcionan a través de interacciones proteína-proteína con factores unidos al promotor o con enzimas, es decir, que pueden interaccionar directamente con la maquinaria de transcripción activándola, o con enzimas HAT que descondensan el DNA y permiten iniciar la transcripción abriendo el DNA localmente.

Los factores de activación en general, modifican covalentemente la lisina 9 del N-terminal de la H3 por

acetilación/metilación. Las histonas modificadas reclutan otras proteínas y los activadores remodelan el

nucleosoma.

Como se ha observado, las RNA polimerasas eucarióticas tienen poca o ninguna afinidad intrínseca por los promotores; el inicio de la transcripción es casi siempre dependiente de la acción de múltiples proteínas activadoras. La regulación es generalmente positiva, dado que el almacenaje del DNA en la cromatina consigue de manera efectiva que la mayoría de los promotores sea inaccesible, por lo que los genes están silenciados naturalmente. Se mejora la especificidad de la activación por regulación positiva, si las diversas proteínas regulatorias se unen a secuencias específicas del DNA para formar un complejo. El requisito de que múltiples proteínas se tengan que unir a secuencias específicas reduce mucho la probabilidad de una iniciación inadecuada.

Factores generales de transcripción (GTF) requeridos para la activación de la RNA polimerasa II:

Tres clases de proteínas están implicadas en la activación de la transcripción o actúan como auténticos activadores:

1. Factores de transcripción basal necesarios en cada promotor de la RNA polimerasa II.2. Transactivadores de unión al DNA que se unen a enhancers o a UAS y facilitan la transcripción.3. Co-activadores actúan indirectamente dado que no se unen directamente al DNA, sino que permiten la

conexión entre los transactivadores de unión al DNA y el complejo formado por la RNA polimerasa II y los factores de transcripción basal.

4. Proteínas represoras interfieren en la comunicación entre la RNA polimerasa II y los transactivadores.

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Se conoce como factores transactivadores (trans acting factors) a aquellas proteínas que interactúan directa o

indirectamente con elementos cis-acting. Pueden ser identificados por mapeo, estudios bioquímicos de interacción in vitro o empleando un sistema hibrido de levaduras. Los requisitos respecto a los transactivadores varían enormemente de un promotor a otro. Muchos transactivadores son sensibles a la unión de una molécula señal, proporcionando la capacidad de activar o desactivar la transcripción en respuesta a un cambio en el ambiente celular.

Estos factores se unen a enhancers lejanos a su sitio de acción, pero pueden funcionar a distancia porque en la mayoría de los casos, el DNA interpuesto puede formar un lazo de tal manera que los diferentes complejos proteicos pueden interaccionar directamente. La formación del lazo está facilitada por ciertas proteínas no histonas muy abundantes en el

DNA, llamadas proteína de alta movilidad HMG (movilidad electroforética en gel de poliacrilamida) que desempeñan un

papel estructural importante en la remodelación de la cromatina y en la activación de la transcripción.

Los co-activadores son complejos proteicos adicionales que interaccionan con la RNA polimerasa II y con los

transactivadores, mediando su unión. El co-activador mejor caracterizado es el TFIID, un complejo que incluye la TBP y al menos diez factores asociados a TBP (TAF). Otro co-activador es el complejo llamado mediador. Este se une fuertemente al dominio carboxilo-terminal de la RNA polimerasa II (CTD) y permite la interacción con factores transactivadores.

Los activadores pueden ser:

Activadores ubicuos Activadores tejido-especifico

Activadores de desarrollo Factores activadores por stress

Receptores hormonales Etc.

El proceso de activación y el modo de acción de los factores de transcripción responde a:

Represores

Son proteínas que se unen a secuencias específicas del DNA, ya sean cercanas o lejanas al promotor, y producen la represión de la transcripción a partir del mismo. Algunas proteínas regulatorias pueden actuar como activadores o como represores, dependiendo del gen que regulan. Los represores actúan, en parte, causando la desacetilación de extremos N-terminales de las histonas nucleosómicas. Cuando las histonas no están acetiladas, los factores de transcripción no pueden interaccionar con el DNA, dado que aumenta mucho la afinidad del DNA por la superficie nucleosómica. Por lo tanto, los represores son proteínas que se pueden unir al DNA en el gen que no se quiere expresar y otro dominio de la proteína puede reclutar enzimas como histonas desacetilaza que condensan el DNA e inhiben la transcripción.

Represores que actuan bloqueando la capacidad de la cromatina para unirse a los activadores o inhibiendo a los activadores ya unidos en el DNA, según:

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a. Unión competitiva con el activador: compiten por el sitio de unión al DNA.

b. Interacción con el dominio de activación del activador unido: el represor se une al activador cercano, impidiéndole su función.

c. Interacción con factores de transcripción generales: compiten por el sitio de unión al factor de transcripción, de manera que el represor impediría el ensamblaje para formar el complejo de iniciación.

La metilación silencia la transcripción también por metilación de histonas, dado que eso lleva a condensar la cromatina, dejándola menos expuesta como molde.

¿Cómo identificar los dominios de activación y represión?

El factor de transcripción es una proteína que tiene dos dominios, uno de unión al DNA y un dominio de activación. Por lo tanto, esta proteína tiene en su secuencia dos regiones claramente diferenciadas en las cuales el N-terminal es cercano o coincide con parte del DBD y el C-terminal es parte o coincide con el dominio de activación. Según:

Para reconocer el dominio de unión al DNA se obtienen proteínas Gal4 truncadas (a partir de modificaciones en el DNA) y se las mezcla en una solución con DNA de doble cadena con una secuencia UAS (este DNA está marcado y actúa como sonda). Para ver si hay unión se puede realizar:

Filter Binding: el DNA unido a la proteína se une a un filtro en determinadas condiciones salidas. El DNA libre se pierde.

Retardo de movilidad electroforética en gel (EMSA)

Para reconocer el dominio de unión al DNA y el dominio de activación dentro de la proteína se debe realizar una medida de la actividad de un gen reportero, que actué mostrando si el dominio de activación es funcional y promueve la transcripción de dicho gen reportero. Un ejemplo de este sería: modificar la proteína cortando por ambos extremos de la

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misma o modificando su secuencia interior (de conexión entre dominios) y ver la unión al DNA y la actividad enzimática presente si el gen reportero utilizado fue el lacZ.

¿Cómo relacionar la acetilación de histonas con el nivel Transcripcional de un gen de interés?

Se realiza una detección por inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) y amplificación de la secuencia del gen de interés, según:

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Las etapas de la transcripción que pueden regularse

Desrepresión de la cromatina Unión de mas activadores, co-activadores, desplazamiento de represores Interaccion con TFIID y TFIIB Formación del complejo de preiniciación Isomerización del complejo cerrado en complejo abierto Paso de la iniciación abortiva a elongación Transcripción a través de nucleosomas Supresión del pausado y frenado (TFIIS) Terminación

Epigenética

Está “fuera de la genética convencional”. Se la define como: Modificación covalente del DNA o del core de las histonas que regulan la actividad genética, sin alterar la secuencia de DNA. Se puede transmitir después de la división celular a las células hijas. No se alteran las secuencias nucleotídicas, pero si se altera la expresión. Incluye la metilación del DNA y la modificación de las histonas. Son alteraciones heredables que no afectan a las secuencias nucleotídicas del DNA.

Las características asociadas con la cromatina transcripcionalmente activa e inactiva son:

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Las modificaciones epigenéticas son los cambios en la configuración de la cromatina: formación de heteocromatina por mecanismos de metilación del DNA y mecanismos de metilación y desacetilación de histonas (H3 y H4). Tipo de modificaciones epigenéticas incluyen:

1. Regulación de la actividad Transcripcional por metilación de islas CpG.2. Metilación de histonas.3. Silenciamiento de regiones centroméricas, teloméricas y zonas del DNA con secuencias altamente repetidas.4. Inactivación del cromosoma X.5. Imprinting.

Metilación del DNA

Las funciones de la metilación no solo incluyen la regulación de la expresión genética, sino también que evitan la retrotransposición. Es llevada a cabo por DNA metil-transferasas (DNMT) que pueden metilar de novo y/o mantener la metilación ya existente. Estas DMT son específicas del DNA que metilan: no metilado o hemi-metilado.

La metilación del DNA actúa como un represor. Los nucleótidos metilados son las citosinas seguidas de una guanina, en lo que se conoce como islas CpG, según:

C p¿G→

GpC¿

←

Las islas CpG son segmentos de 200-2000 pb con una alta concentración de dinucleótidos CpG ubicadas en el extremo 5

´de los genes. Muchas de estas secuencias son parte de sitios de unión a factores de transcripción como Sp1. El 56% de los genes humanos tienen islas de este tipo cercanas al extremo 5´, siendo aproximadamente 45.000 islas en este genoma (la mitad en genes housekeeping). De acuerdo al grado de metilación de estas secuencias, a los genes se los pueden clasificar en:

Housekeeping genes permanecen no metilados por lo que se expresan en todos los tejidos. Genes tejido-específicos permanecen no metilados SOLO en tejidos donde deben expresarse.

En estas islas se metila la citosina de dinucleótidos 5´-CG-3´. Y estas citosinas metiladas son reconocidas por proteínas que reclutan histonas desacetilasas. Altos niveles de CG metilados se acosian a bajos niveles de histonas acetiladas y viceversa.

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Altos niveles de histonas acetiladas se encuentran en genes que se transcriben activamente, por lo que las islas CpG metiladas suprimen la expresión génica si se encuentra en zonas promotoras. Los patrones de metilación pueden variar de un tipo celular a otro.

Demostración de la metilación en secuencias de DNA:

Para ver si el DNA está metilado se pueden usar enzimas de restricción que reconocen una secuencia específica cuando esta está o metilada o sin metilar. De acuerdo al estado del DNA se obtendrán diferentes patrones de corte, según:

Mantenimiento de la metilación del DNA:Cuando la célula se divide, el DNA de la misma se replica para dar lugar a dos copias exactas por un mecanismo semiconservativo. Esto significa que cada nueva molécula de DNA se encontrará hemi-metilada (semi-metilada – una cadena sí y una no). La metilación de la nueva cadena se lleva a cabo rápidamente por DNMT que copian el patrón de metilación de la cadena de DNA ya existente.

Metilación como bloqueante de la transcripción:La metilación bloquea los sitios de unión para factores de transcripción, impidiendo el reconocimiento por los mismos y la transcripción del gen adyacente. También influye en el promotor, según:

Promotores metilados genes no activos. Promotores no metilados genes activos.

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Cuando las proteínas regulatorias se encuentran unidas al DNA este no puede ser metilado, pero si transcripto. Cuando estas proteínas no están, el DNA esta libre para ser metilado por DNMT y queda expuesto a la unión con proteínas que reconocen las citosinas metiladas. Estas proteínas se unen e impiden que lo haga la maquinaria de transcripción, impidiendo el proceso. Cuanto mayor sea el grado de metilación se correlaciona con una menor o no transcripción del gen adyacente.

Las proteínas que se unen bloquean la unión de factores de transcripción y actúan como sitios de reconocimiento para histonas desacetilasas.

Metilación de histonas

Las histonas pueden ser metiladas en sus extremos N-terminales. La metilación de las mismas produce el silenciamiento de los genes de la zona en relación.

Modificaciónes post-traduccionales

Estas moléculas pequeñas efectoras pueden ser intracelulares o provenientes del ambiente, en mecanismos de señalización de diferentes tipos. En última instancia, estas pequeñas moléculas desarrollan una cascada de señalización y terminan por regular y modificar la transcripción, por diferentes vías según el receptor con el cual interaccionan.

Señales pueden llevar a cambios en la expresión genética. Hay dos tipos de receptores:

GPCR: receptores asociados a proteínas G. RTK: receptores con actividad tirosina-quinasa intrínseca.

Hormonas esteroideas

La actividad de muchos factores transcripcionales está regulada por hormonas, que funcionan como señales extracelulares. Una clase de hormonas comprende pequeñas moléculas liposolubles que pueden difundirse a través de la membrana plasmática y nuclear. Se unen a factores específicos dentro de las células y los regulan. Todas estas hormonas liposolubles son transportadas en el torrente sanguíneo por proteínas y llegan a las células, donde atraviesan la membrana plasmática y se unen a receptores que pueden ser citosólicos o nucleares. Estos receptores suelen tener tres dominios:

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1. Una región N-terminal de longitud variable relacionada con la maquinaria de transcripción, que puede ser un dominio de activación (AD)

2. Un dominio de unión al DNA (DBD) ubicado en el centro de la proteína,3. Un dominio de unión a hormonas en el extremo C-terminal. Este dominio actúa como un dominio de represión en

ausencia del ligando.

Ejemplos:

Es frecuente que un mismo factor de transcripción controle un gran número de genes. Esto se debe a la existencia de elementos de respuesta para ese factor en los promotores o potenciadores de esos genes. Ejemplos:

HSE: elementos de respuesta a choque térmico. GRE: elemento de respuesta a glucocorticoides. SER: elementos de respuesta al suero.

La unión de una hormona a un receptor nuclear regula su actividad como factor de transcripción. En presencia del ligando, el dominio de fijación hormona-dependiente sufre un cambio conformacional, que le permite dirigir la hiperacetilación de las histonas. Luego el dominio de activación N-terminal probablemente interactúa con factores adicionales y estimula el armado cooperativo del complejo de iniciación. Los elementos de respuesta son secuencias en el DNA al que se pueden unir estos receptores nucleares, de manera que actúan como receptores y como factores de transcripción a la vez. Dentro del modelo de activación de genes hormonas dependientes, se encuentra el ejemplo del receptor de glucocorticoide, el cual responde a:

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Experimento que demuestra la translocación del GR al núcleo:

siRNA

Se los denominan pequeños RNA de interferencia y se utilizan para el silenciamiento de genes. Actúa en un proceso de regulación de la expresión génica eucariota, dado que inhiben la traducción de los mRNA existentes de los cuales son complementarios.

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Este silenciamiento se puede realizar por tres procesos:

1. Agregando construcciones plasmídicas que den lugar a mRNA complementarios a los mRNA celulares normales, de manera que formen mRNA de doble cadena y no puedan ser traducidos.

2. Agregando RNA de doble o simple cadena en la célula, los cuales actuarán directamente inhibiendo la traducción por unión por complementariedad a los mRNA celulares.

3. Análisis por secuenciación del gen a silenciar, clonado de una parte del mismo y amplificado por PCR, obteniendo construcciones que dan lugar a mRNA con pequeñas partes de doble cadena.

Gráficamente seria:

Proceso 1:

Proceso 2:

RISC utiliza la hebra antisense del siRNA como guía para seleccionar su sustrato: el mRNA complementario de la hebra de siRNA presente en el complejo. A continuación, RISC* promueve el corte y posterior destrucción del mRNA diana,

provocando la supresión de la expresión del gen. Parte del RNA degradado durante este proceso se puede utilizar como molde para sintetizar más siRNA de doble cadena y continuar con la inhibición de la traducción.

Proceso 3:

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En geles de poliacrilamida de extracciones del RNA total, se pudo observar que naturalmente se sintetizaban RNA pequeño de unos 100 pb. Este constituye un sistema natural que se usa en las células eucariotas para regular su expresión de genes y la cantidad de mRNA que se va a traducir. El complejo efector es fundamental para el silenciamiento.

DNA nuclear→ ExpresanaturalmentesiRNA de simple cadena

→Estos setransportanalcitoplasma

→ Bloqueanlaexpresión de ciertos genesporunión consusmRNAcaracterísticos

Degradación de mRNA celulares

La expresión de genes está regulada en muchos niveles. Un factor crucial en la expresión génica es la concentración celular el mRNA. La concentración de cualquier molécula depende de dos factores: su velocidad de síntesis y su velocidad de degradación. Cuando la síntesis y degradación de mRNA están equilibradas, su concentración permanece estacionaria. Un aumento en la velocidad de síntesis o de su degradación conduce a la acumulación o a la desaparición del mRNA. Las vías de degradación garantizan que los mRNA no se acumulen en la célula y no dirijan la síntesis de proteínas innecesarias.

Las tasas de degradación de los mRNA de los diferentes genes eucariotas varían ampliamente. Los productos génicos que solo son necesarios durante un breve lapso de tiempo pueden tener mRNA con vidas medias de orden de minutos o incluso segundos. Los productos genéticos que se necesitan constantemente tienen mRNA estables que duran muchas generaciones celulares. La vida media del mRNA de vertebrado son 3 horas, con recambio del mRNA de unas diez veces por generación celular. La vida media de los mRNA bacterianos es de solamente 1,5 minutos, tal vez a causa de exigencias en la regulación.

El RNA es degradado por ribonucleasas presentes en todas las células, normalmente en dirección 5´3´, aunque hay exorribonucleasas que actúan en dirección 3´5´. Los mRNA estables tienen una secuencia en los extremos 3´que impiden la acción de estas enzimas. En las células eucarióticas, la cola poli A en el extremo 3´es sumamente importante para la estabilidad de muchos mRNA, dado que una de las vías principales de degradación en estas células consiste en el acortamiento de la cola poli A, seguido de la eliminación del casquete 5´y de la degradación 5´3´.

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